Хроматографические матрицы, содержащие новые лиганды на основе белка a staphylococcus aureus

Хроматографические матрицы, содержащие новые лиганды на основе белка a staphylococcus aureus

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Родственные заявки

По настоящей заявке испрашивается приоритет в соответствии с предварительной заявкой на выдачу патента США №61/494701, поданной 8 июня 2011 года, включенной в настоящий документ при помощи ссылки в ее полном объеме.

Область техники, к которой относится настоящее изобретение

Настоящее изобретение относится к хроматографическим матрицам, содержащим лиганды на основе одного или нескольких доменов связывающихся с иммуноглобулином белков, таких как белок A (SpA) Staphylococcus aureus, а также способам их применения.

Предшествующий уровень техники настоящего изобретения

Применяемые в аффинной хроматографии лиганды, как правило, придают свойство высокой селективности к целевой молекуле, таким образом приводя к высокому выходу, высокой чистоте и быстрой и экономичной очистке целевых молекул. Реагенты на основе белка A Staphylococcus aureus и хроматографические матрицы нашли широкое применение в области аффинной хроматографии для захвата и очистки антител и Fc-содержащих белков, а также в способах выявления антител в аналитическом масштабе по причине их способности связывать IgG без существенного влияния на аффинность иммуноглобулина к антигену.

Соответственно, были разработаны различные содержащие лиганды на основе белка A реагенты и среды, и они коммерчески доступны, например, ProSep®-vA High Capacity, ProSep® vA Ultra и ProSep® UltraPlus (MILLIPORE) и Protein A Sepharose™, MabSelect™, MabSelect Xtra™, MabSelect SuRe™ (GE HEALTHCARE), MabSelect SuRe™ LX и Poros MabCapture A™ (LIFE TECHNOLOGIES).

Для того чтобы сохранить селективность хроматографических лигандов, в том числе связанных с твердыми подложками лигандов, таких как связанный с хроматографическими матрицами SpA, матрицы необходимо очищать, и, как правило, их очищают в кислых или основных условиях, например, при помощи гидроксида натрия (NaOH). Например, стандартный способ, который применяют для очистки и восстановления матрицы, представляет собой протокол очистки без разборки (CIP) с применением основания, который, как правило, предусматривает обработку связанной с лигандами матрицы посредством NaOH в концентрации, которая варьирует в диапазоне от 0,05 М до 1 М, что в результате дает pH в диапазоне 12,7-14,0. Как правило, проведение с матрицей для аффинной хроматографии повторных циклов CIP со временем приводит к значительной потере связывающей способности матрицы с целевой молекулой, в результате чего при осуществлении способа необходимо большее количество зачастую очень дорогих лигандов, которые связываются с матрицами. Это как не экономично, так и не желательно, поскольку приводит к тому, что способ очистки становится затратным, а также длительным.

Краткое описание настоящего изобретения

Ранее в данной области техники были описаны хроматографические матрицы на основе белка A, у которых, судя по всему, наблюдают уменьшенную потерю связывающей способности по отношению к целевой молекуле после обработки основными условиями. См., например, публикацию заявки на выдачу патента США №20100221844, в которой описаны матрицы для аффинной хроматографии, включающие B или Z домены дикого типа (д.т.) SpA с многоточечным прикреплением к матрице, у которых наблюдают до 95% от начальной связывающей способности даже после воздействия 0,5 М NaOH в течение 5 часов или дольше. Также, в публикации заявки на выдачу патента США №20100048876 описана хроматографическая матрица, включающая домен С дикого типа SpA, а также домен С, содержащий делецию аминокислотных остатков 3-6, у которой, судя по всему, наблюдают до 95% от изначальной связывающей способности после воздействия 0,5 М в течение 5 часов. Эти лиганды иммобилизированы с помощью одноточечного прикрепления по цистеину к матрице. Кроме того, были описаны хроматографические матрицы, которые включают домены белка А, содержащие мутации в одном или нескольких аспарагиновых остатках белка, причем у матриц, судя по всему, наблюдают сниженную потерю связывающей способности по отношению к SpA дикого типа после воздействия основными условиями, и, судя по всему, они иммобилизированы посредством одноточечного прикрепления к матрице. См., например, патент США №6831161.

Несмотря на то, что у вышеупомянутых матриц для аффинной хроматографии, судя по всему, наблюдают сниженную потерю связывающей способности в отношении целевой молекулы после воздействия щелочными условиями, у некоторых из этих матриц, судя по всему, наблюдают большую степень фрагментации лиганда, которую, например, видно с помощью SDS-PAGE и/или эксклюзионной хроматографии (SEC), после воздействия щелочными условиями. Такая фрагментация является нежелательной, поскольку большая степень фрагментации лиганда дает меньшие размеры присутствующего лиганда, которого сложнее удалить и отделить от целевой молекулы, что, таким образом, повышает вероятность того, что такие потенциально иммуногенные фрагменты будут совместно очищаться с терапевтической целевой молекулой. Кроме того, большая степень фрагментации приводит к повышенной потере связывающей способности матрицы в отношении целевой молекулы.

Настоящее изобретение относится к лигандам для аффинной хроматографии и включающим их матрицам, причем лиганды в своей основе представляют собой один или несколько доменов белка A (SpA) Staphylococcus aureus с делецией от N-конца, начиная с положения 1 или положения 2 в домене. У этих лигандов и матриц наблюдают сниженную фрагментацию при применении в очистке, о чем свидетельствуют результаты методик SDS-PAGE и/или SEC, по сравнению с некоторыми описанными ранее лигандами, таким образом делая их более привлекательными и рентабельными кандидатами для применения в аффинной хроматографии.

В соответствии с одним аспектом настоящее изобретение относится к матрицам для аффинной хроматографии, которые содержат один или несколько доменов B SpA с делецией, один или несколько доменов С SpA с делецией или один или несколько доменов Z SpA с делецией, причем один или несколько доменов прикреплены к твердой подложке.

В соответствии с одним вариантом осуществления матрица для аффинной хроматографии по настоящему изобретению содержит прикрепленный к твердой подложке лиганд, причем лиганд содержит один или несколько доменов B белка A (SpA) Staphylococcus aureus, причем по меньшей мере один домен В содержит делецию по меньшей мере 3 последовательных аминокислот с N-конца. В соответствии с другим вариантом осуществления матрица для аффинной хроматографии по настоящему изобретению содержит прикрепленный к твердой подложке лиганд, причем лиганд содержит один или несколько доменов С белка A (SpA) Staphylococcus aureus, причем по меньшей мере один домен С содержит делецию по меньшей мере 3 последовательных аминокислот с N-конца.

В соответствии с еще одним вариантом осуществления матрица для аффинной хроматографии по настоящему изобретению содержит прикрепленный к твердой подложке лиганд, причем лиганд содержит один или несколько доменов Z белка А (SpA) Staphylococcus aureus, причем по меньшей мере один домен Z содержит делецию по меньшей мере 3 последовательных аминокислот с N-конца.

В соответствии с другими вариантами осуществления матрица для аффинной хроматографии по настоящему изобретению содержит прикрепленный к твердой подложке лиганд, причем лиганд содержит два или более доменов В, два или более доменов С, или два или более доменов Z, или любую комбинацию доменов В, С и Z, причем по меньшей мере один из доменов В, С или Z содержит делецию по меньшей мере 3 последовательных аминокислот с N-конца.

В соответствии с различными вариантами осуществления по настоящему изобретению к твердой подложке прикреплены несколько центров на каждом лиганде (т.е. многоточечное прикрепление).

В соответствии с различными вариантами осуществления по настоящему изобретению у лиганда наблюдают сниженную фрагментацию, по результатам SDS-PAGE или эксклюзионной хроматографии (SEC), по сравнению с его аналогом д.т. после воздействия на лиганд или содержащую лиганд матрицу 0,5 М NaOH в течение по меньшей мере 5 часов.

В соответствии с некоторыми вариантами осуществления по настоящему изобретению лиганд содержит делецию 3 аминокислот с N-конца, делецию 4 аминокислот с N-конца или делецию 5 аминокислот с N-конца, причем к твердой подложке прикреплены несколько центров на лиганде, таким образом формируя матрицу для аффинной хроматографии.

В соответствии с конкретным вариантом осуществления лиганд имеет аминокислотную последовательность, изложенную в любой из SEQ ID NO: 13-42, SEQ ID NO: 55-84 и SEQ ID NO: 93-94.

В соответствии с другим вариантом осуществления лиганд по настоящему изобретению имеет следующую структуру: [(X)_n, (Y)_m]_n+m, где X представляет собой домен В, домен Z или домен С SpA, n представляет собой число доменов, варьирующее в диапазоне от нуля до (m-1), Y представляет собой домен В, или домен Z, или домен С SpA по меньшей мере с 3 удаленными с N-конца последовательными аминокислотами, и m представляет собой число доменов Y, варьирующее в диапазоне от одного до восьми, причем к твердой подложке (например, хроматографической матрице) прикреплены несколько центров на лиганде.

В соответствии с некоторыми вариантами осуществления по настоящему изобретению лиганд содержит два домена В, или два домена Z, или два домена С SpA, или один домен В и один домен С, или один домен В и один домен Z, или один домен С и один домен Z, причем по меньшей мере один домен В, или по меньшей мере один домен Z, или по меньшей мере один домен С включает делецию трех последовательных аминокислот с N-конца, или делецию четырех последовательных аминокислот с N-конца, или делецию пяти последовательных аминокислот с N-конца. Понятно, что различные домены могут быть расположены в любом порядке.

В соответствии с другим вариантом осуществления лиганд по настоящему изобретению содержит три домена В, или три домена Z, или три домена С, или любую комбинацию доменов В, С или Z в любом порядке, причем по меньшей мере один домен В, или по меньшей мере один домен Z или по меньшей мере один домен С содержит делецию трех последовательных аминокислот с N-конца, или делецию четырех последовательных аминокислот с N-конца, или делецию пяти последовательных аминокислот с N-конца.

В соответствии с еще одним вариантом осуществления лиганд по настоящему изобретению содержит четыре домена В, или четыре домена Z, или четыре домена С, или любую комбинацию доменов В, Z или С в любом порядке, причем по меньшей мере один домен В, или по меньшей мере один домен Z, или по меньшей мере один домен С содержит делецию трех последовательных аминокислот с N-конца, или делецию четырех последовательных аминокислот с N-конца, или делецию пяти последовательных аминокислот с N-конца.

В соответствии с еще одним вариантом осуществления лиганд по настоящему изобретению содержит пять доменов В, или пять доменов Z, или пять доменов С, или любую комбинацию доменов В, Z или С в любом порядке, причем по меньшей мере один домен В, или по меньшей мере один домен Z, или по меньшей мере один домен С содержит делецию трех последовательных аминокислот с N-конца, или делецию четырех последовательных аминокислот с N-конца, или делецию пяти последовательных аминокислот с N-конца.

В соответствии с еще одним вариантом осуществления лиганд по настоящему изобретению содержит шесть доменов В, или шесть доменов Z, или шесть доменов С, или любую комбинацию доменов В, Z или С в любом порядке, причем по меньшей мере один домен В, или по меньшей мере один домен Z или по меньшей мере один домен С содержит делецию трех последовательных аминокислот с N-конца, или делецию четырех последовательных аминокислот с N-конца, или делецию пяти последовательных аминокислот с N-конца.

В соответствии с еще одним вариантом осуществления лиганд по настоящему изобретению содержит семь доменов В, или семь доменов Z, или семь доменов С, или любую комбинацию доменов В, Z или С в любом порядке, причем по меньшей мере один домен В, или по меньшей мере один домен Z, или по меньшей мере один домен С содержит делецию трех последовательных аминокислот с N-конца, или делецию четырех последовательных аминокислот с N-конца, или делецию пяти последовательных аминокислот с N-конца.

В соответствии со следующим вариантом осуществления лиганд по настоящему изобретению содержит восемь доменов В, или восемь доменов Z, или восемь доменов С, или любую комбинацию доменов В, Z или С в любом порядке, причем по меньшей мере один домен В, или по меньшей мере один домен Z, или по меньшей мере один домен С содержит делецию трех последовательных аминокислот с N-конца, или делецию четырех последовательных аминокислот с N-конца, или делецию пяти последовательных аминокислот с N-конца.

Кроме того, настоящее изобретение относится к способам применения матриц для аффинной хроматографии. Соответственно, настоящее изобретение относится к способу аффинной очистки одной или нескольких целевых молекул (например, иммуноглобулинов или Fc-содержащих белков) из образца, причем способ включает следующие этапы: (а) получение образца, содержащего одну или несколько целевых молекул (например, иммуноглобулинов или Fc-содержащих белков); (b) контактирование образца с матрицей по настоящему изобретению в таких условиях, чтобы одна или несколько целевых молекул (например, иммуноглобулины или Fc-содержащие белки) связались с матрицей; и (с) выделение одной или нескольких связавшихся целевых молекул (например, иммуноглобулинов или Fc-содержащих белков) путем элюирования в подходящих условиях, таких как, например, подходящий pH.

В соответствии с некоторыми вариантами осуществления матрица для аффинной хроматографии по настоящему изобретению сохраняет по меньшей мере 95% от изначальной связывающей способности в отношении целевой молекулы через 5 часов, или через 10 часов, или через 15 часов, или через 20 часов, или через 25 часов, или через 30 часов инкубации в 0,5 М NaOH.

В соответствии с конкретным вариантом осуществления матрица для аффинной хроматографии по настоящему изобретению сохраняет по меньшей мере 95% от изначальной связывающей способности через 5 часов инкубации в 0,5 М NaOH.

В соответствии с еще одним вариантом осуществления матрица для аффинной хроматографии по настоящему изобретению сохраняет по меньшей мере 95% от изначальной связывающей способности в отношении целевой молекулы через 25 часов инкубации в 0,1 М NaOH; по меньшей мере 85% от изначальной связывающей способности в отношении целевой молекулы через 25 часов инкубации в 0,3 М NaOH или по меньшей мере 65% от изначальной связывающей способности в отношении целевой молекулы через 25 часов инкубации в 0,5 М NaOH.

Иммуноглобулины, которые могут быть связаны различными описываемыми в настоящем документе лигандами, включают, например, IgG, IgA и IgM или любой химерный белок, содержащий антитело и любой фрагмент антитела, который может связываться с SpA.

Также настоящее изобретение относится к молекулам нуклеиновой кислоты, кодирующим различные описываемые в настоящем документе лиганды, а также клеткам-хозяевам, содержащим такие молекулы нуклеиновой кислоты. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления клетка-хозяин представляет собой прокариотическую клетку. В соответствии с другими вариантами осуществления клетка-хозяин представляет собой эукариотическую клетку.

В соответствии с некоторыми вариантами осуществления настоящее изобретение относится к матрицам на основе SpA для аффинной хроматографии, у которых наблюдают измененное (повышенное или пониженное) связывание с Fab-частью иммуноглобулина по сравнению с SpA-лигандами д.т., в то же время с сохранением способности связывать Fc-часть иммуноглобулина. В соответствии с одним вариантом осуществления у матрицы на основе SpA по настоящему изобретению наблюдают пониженное связывание с Fab-частью иммуноглобулина по сравнению с SpA д.т. В соответствии с конкретным вариантом осуществления хроматографическая матрица включает SpA-лиганд, который включает лизин в положении 29 вместо глицина (в случае доменов В и С SpA) или вместо аланина (в случае домена Z SpA).

Краткое описание чертежей

На фиг. 1 изображены выравнивания аминокислотных последовательностей для связывающих IgG доменов SpA дикого типа (д.т.), а также домена Z, представленного посредством SEQ ID NO: 1-6.

На фиг. 2 изображены схематические диаграммы плазмиды pET11a, кодирующей нуклеиновую кислоту, которая кодирует димерный лиганд с доменом Z с мутацией A29K, аминокислотная последовательность показана в SEQ ID NO: 85 (контроль), и плазмиды pET11a, содержащей последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующей димерный лиганд с доменом Z с мутацией A29K, а также второй домен, включающий делецию 4 последовательных аминокислот с N-конца, аминокислотная последовательность показана в SEQ ID NO: 78. Конструкции лиганда дополнительно включают последовательность His-метки на 3' конце.

На фигуре 3 показан окрашенный кумасси SDS-PAGE гель, полученный в результате анализа паттерна фрагментации свободных и иммобилизированных димерных лигандов Z и C с выдержкой в щелочи в 0,5 М NaOH в течение 25 часов и без нее. Описание различных дорожек геля SDS-PAGE представляет собой следующее. Дорожка 1: молекулярный маркер; дорожка 2: димерный лиганд с доменом Z без выдержки в щелочи (A29K без делеций, показан в SEQ ID NO: 85, который применяют в качестве контроля, и он включает His-метку); дорожка 3: контрольный димерный лиганд с доменом Z, подвергнутый выдержке в 0,5 М NaOH в течение 25 часов; дорожка 4: контрольный димерный лиганд с доменом Z, иммобилизированный на агарозной хроматографической смоле, которая подвергнута выдержке в 0,5 М NaOH в течение 25 часов; дорожка 5: димерный лиганд с доменом Z с делецией 4 последовательных аминокислот с N-конца второго домена (A29K, причем второй домен имеет делецию, показанную в SEQ ID NO: 78, и His-метку) без воздействия щелочью; дорожка 6: димерный лиганд с доменом Z SEQ ID NO: 78 с His-меткой, подвергнутый выдержке в 0,5 М NaOH в течение 25 часов; дорожка 7: димерный лиганд с доменом Z SEQ ID NO: 78 с His-меткой, иммобилизированный на агарозной хроматографической смоле и подвергнутый выдержке в 0,5 М NaOH в течение 25 часов; дорожка 8: димерный лиганд с доменом С без делеций, используемый в качестве контроля (аминокислотная последовательность, показанная в SEQ ID NO: 92, плюс наличие His-метки) без воздействия щелочью; дорожка 9: контрольный димерный лиганд с доменом С, подвергнутый выдержке в 0,5 М NaOH в течение 25 часов; дорожка 10: димерный лиганд с доменом С, иммобилизированный на агарозной хроматографической смоле и подвергнутый выдержке в 0,5 М NaOH в течение 25 часов; дорожка 11: димерный лиганд с доменом С с делецией от N-конца у второго домена (аминокислотная последовательность, показанная в SEQ ID NO: 35, плюс наличие His-метки); дорожка 12: димерный лиганд с доменом С SEQ ID NO: 35 плюс His-метка, подвергнутый выдержке в 0,5 М NaOH в течение 25 часов; и дорожка 13: димерный лиганд С SEQ ID NO: 35 плюс His-метка, иммобилизированный на агарозной хроматографической смоле и подвергнутый выдержке в 0,5 М NaOH в течение 25 часов.

На фигуре 4 показана хроматограмма по результатам анализа SEC димерных лигандов Z и С, кратко описанных в приведенном выше описании фигуры 3. Ось х означает время удержания в минутах, причем меньшие молекулы имеют более длительное время удержания, чем время удержания для большей молекулы. Ось у представляет собой УФ-поглощение при 280 нм в мЕП. Факт уменьшенной фрагментации димерных лигандов с доменами Z и С с N-концевой делецией во втором домене после продолжительной выдержки в щелочи (т.е. 0,5 М NaOH выдержка в течение 25 часов) показан с помощью прямоугольников на хроматограмме, а наличие меньших фрагментов для димерных контролей с доменами Z и С показано с помощью стрелочек.

На фигуре 5 показан окрашенный кумасси гель SDS-PAGE, полученный в результате анализа паттерна фрагментации как свободных, так и иммобилизированных пентамерных лигандов с доменами Z с или без выдержки в щелочи в 0,5 М NaOH в течение 25 часов. Описание различных дорожек геля SDS-PAGE представляет собой следующее: дорожка 1: маркер молекулярной массы; дорожка 2: пентамерный лиганд с доменами Z с мутацией A29K и делецией 4 последовательных аминокислот с N-конца у всех кроме первого домена, аминокислотная последовательность которого изложена в SEQ ID NO: 84, без воздействия щелочью; дорожка 3: пентамерный лиганд с доменами Z SEQ ID NO: 84, подвергнутый выдержке в 0,5 М NaOH в течение 25 часов; дорожка 4: пентамерный лиганд с доменами Z SEQ ID NO: 84, иммобилизированный на агарозной хроматографической смоле и подвергнутый выдержке в 0,5 М NaOH в течение 25 часов; дорожка 5: пентамерный лиганд с доменами Z SEQ ID NO: 91, используемый в качестве контроля, который не был подвергнут выдержке в щелочи; дорожка 6: контрольный пентамерный лиганд с доменами Z, подвергнутый выдержке в 0,5 М NaOH в течение 25 часов; и дорожка 7: контрольный пентамерный лиганд с доменами Z, иммобилизированный на агарозной хроматографической смоле и подвергнутый выдержке в 0,5 М NaOH в течение 25 часов. Далее, дорожки 8, 9 и 10 относятся к результатам, наблюдаемым при аналогичной обработке rSPA, причем дорожка 8 представляет собой rSPA, который не был подвергнут какой-либо выдержке в щелочи; дорожка 9 представляет собой rSPA, подвергнутый выдержке в 0,5 М NaOH в течение 25 часов, и иммобилизированный rSPA, подвергнутый выдержке в 0,5 М NaOH в течение 25 часов. Полосы представляют фрагментацию, которая обозначена стрелочками.

Фигура 6 представляет собой хроматограмму, полученную по результатам анализа SEC пентамерных лигандов с доменами Z, кратко описанных в приведенном выше описании фигуры 5. Ось x означает время удержания в минутах, причем меньшие молекулы имеют более длительное время удержания, чем время удержания для большей молекулы. Ось y представляет собой УФ-поглощение при 280 нм в мЕП. Факт уменьшенной фрагментации в случае пентамерных лигандов с доменами Z с N-концевой делецией во всех, за исключением первого домена, после продолжительно выдержки в щелочи показан с помощью прямоугольников на хроматограмме, а наличие меньших фрагментов, наблюдаемых с контрольным пентамерным Z доменом, показано с помощью стрелки, указывающей на фрагменты. Кроме того, наблюдаемый для rSPA высокий уровень фрагментации также можно наблюдать с помощью SEC.

Фигура 7 представляет собой хроматограмму, полученную по результатам анализа SEC иммобилизированных пентамерных лигандов с доменами Z, кратко описанных в приведенном выше описании фигуры 5. Ось х означает время удержания в минутах, причем меньшие молекулы имеют более длительное время удержания, чем время удержания для большей молекулы. Ось y представляет собой УФ-поглощение при 280 нм в мЕП. Факт уменьшенной фрагментации в случае иммобилизированного пентамерного лиганда с доменами Z с N-концевой делецией во всех, за исключением второго домена, после продолжительно выдержки в щелочи, показан с помощью прямоугольника на хроматограмме, а наличие меньших фрагментов, наблюдаемых с контрольным пентамерным Z доменом, показано с помощью стрелки, указывающей на фрагменты. Кроме того, наблюдаемый для иммобилизированного rSPA высокий уровень фрагментации также можно наблюдать с помощью SEC.

Фигура 8 представляет собой хроматограмму, полученную по результатам анализа SEC свободных димерных лигандов с доменами Z после продолжительной выдержки в щелочи, причем лиганды включают N-концевую делецию первой одной (SEQ ID NO: 87), первых двух (SEQ ID NO: 88), первых трех (SEQ ID NO: 69) или первых четырех (SEQ ID NO: 78) у второго домена димерных лигандов. Ось х означает время удержания в минутах, причем меньшие молекулы имеют более длительное время удержания, чем время удержания для большей молекулы. Ось y представляет собой УФ-поглощение при 280 нм в мЕП. Факт уменьшенной фрагментации в случае димерных лигандов с первыми тремя или первыми четырьмя аминокислотами, удаленными с N-конца второго домена, после продолжительной выдержки в щелочи обозначен прямоугольниками. Наличие фрагментации, наблюдаемое после продолжительной выдержки в щелочи димерных лигандов без аминокислотных делеций (SEQ ID NO: 85), или с удаленной первой аминокислотой, или удаленными первыми двумя аминокислотами с N-конца второго домена показано с помощью стрелок, указывающих на наличие фрагментов на хроматограмме.

На фигуре 9 приведено сравнение сохраненных связывающих способностей иммобилизированных пентамерных лигандов с доменом С после повторного воздействия щелочью, причем один пентамерный лиганд включает N-концевую делецию 4 аминокислот в каждом домене, мутацию G29K в каждом домене, а также аланин, самую первую аминокислоту в пентамере (аминокислотная последовательность, показанная в SEQ ID NO: 93); и другого пентамерного лиганда, являющегося его эквивалентом д.т. с мутацией G29K (аминокислотная последовательность которого показана в SEQ ID NO: 95). Ось х представляет собой общее время воздействия на хроматографические матрицы 0,7 М NaOH за 16 циклов по 30 минут каждый. Ось y представляет собой процент сохраненной связывающей способности.

Подробное раскрытие настоящего изобретения

Настоящее изобретение относится к матрицам для аффинной хроматографии, которые включают лиганды на основе одного или нескольких доменов SpA, причем у лигандов, либо самих по себе, либо иммобилизированных на матрице, наблюдают уменьшенную фрагментацию при применении в способах очистки относительно соответствующих доменов д.т. SpA.

Ранее описанные иллюстративные хроматографические лиганды на основе SpA включают, например, описанные в публикации заявки на выдачу патента США №20100221844, в которой описаны хроматографические матрицы, которые включают домены В и Z SpA дикого типа, причем к хроматографической матрице прикреплено несколько центров на лиганде (т.е. многоточечное прикрепление); описанные в публикации заявки на выдачу патента США №20100048876, в которой описаны хроматографические лиганды на основе домена С SpA д.т., которые могут связывать Fab-части некоторых антител и являются связанными с нерастворимым носителем на отдельном центре с помощью концевой связывающей группы; и описанные в патенте США №6831161, в котором рассмотрены основанные на SpA основные хроматографические лиганды, причем были модифицированы один или несколько остатков аминокислоты аспарагин.

Как обсуждалось ранее, несмотря на то, что у этих лигандов наблюдают сниженную потерю связывающей способности после воздействия основными условиями, некоторые из этих лигандов характеризуются фрагментацией при применении в способе очистки, например, лиганды, описываемые в публикации заявки на выдачу патента США №20100221844, что очень нежелательно. Описываемые в настоящем документе лиганды, с другой стороны, являются намного более привлекательными кандидатами на очистку белка по сравнению с ранее описанными лигандами в том, что у них наблюдают уменьшенную фрагментацию после воздействия основными условиями в ходе осуществления протоколов регенерации и очистки без разборки (CIP), которые обычно используют в способах очистки белков.

Для того чтобы настоящее раскрытие можно было легче понять, сначала приведены определения некоторых терминов. Дополнительные определения изложены в подробном раскрытии.

I. Определения

Применяемый в настоящем документе термин "SpA," "белок А" или "белок А Staphylococcus aureus" относится к многодоменному белку массой 42 кДа, выделенному из бактерии Staphylococcus aureus. SpA связан со стенкой бактериальной клетки посредством его карбокси-концевым связывающимся с клеточной стенкой участком, называемым доменом X. На амино-концевом участке он содержит пять связывающихся с иммуноглобулином доменов, называемых Е, D, А, В и С (Sjodhal, Eur J Biochem. Sep 78(2):471-90 (1977); Uhlen et al., J Biol Chem. Feb 259(3): 1695-702 (1984). Каждый из этих доменов содержит примерно 58 аминокислотных остатков, и они характеризуются 65-90% идентичности аминокислотной последовательности.

Каждый из доменов Е, D, А, В и С у SpA обладает различными Ig-связывающими центрами. Один центр предназначен для Fcγ (константный участок IgG класса Ig), а другой предназначен для Fab части определенных молекул Ig (часть Ig, которая ответственна за распознавание антигена). Сообщалось, что каждый из этих доменов содержит Fab-связывающий центр. Отличная от Ig-связывающая часть SpA расположена на С-конце, и ее обозначают участок X или Х-домен.

Домен Z SpA представляет собой сконструированный аналог домен В SpA и содержит валин вместо аланина в положении 1 и аланин вместо глицинового остатка в положении 29 (Nilsson, et al., Protein engineering, Vol. 1, No. 2, 107-113, 1987.).

Клонирование кодирующего SpA гена описано в патенте США №5151350, полное содержание которого включено в настоящий документ при помощи ссылки в полном объеме.

Настоящее изобретение относится к матрицам для аффинной хроматографии, которые включают лиганды на основе SpA, причем у лигандов (как свободных, так и иммобилизированных лигандов) наблюдают уменьшенную фрагментацию, что видно по результатам SDS-PAGE и SEC, после регенерации и осуществления протоколов CIP, которые обычно используют в способе очистки белков.

В соответствии с некоторыми аспектами по настоящему изобретению аффинный лиганд содержит один или несколько доменов В, или один или несколько доменов Z, или один или несколько доменов С, или любые их комбинации, причем по меньшей мере один домен В, или по меньшей мере один домен Z, или по меньшей мере один домен С содержит делецию 3 последовательных аминокислот с N-конца, или 4 последовательных аминокислот с N-конца, или 5 последовательных аминокислот с N-конца, начиная с положения 1 или положения 2.

В соответствии с некоторыми вариантами осуществления по настоящему изобретению к хроматографической матрице прикреплены несколько центров аффинного лиганда (т.е. многоточечное прикрепление). В соответствии с конкретным вариантом осуществления настоящее изобретение относится к матрице для аффинной хроматографии, содержащей один или несколько прикрепленных к хроматографической матрице доменов В SpA, причем к матрице прикреплено несколько центров лиганда, и причем по меньшей мере один домен В имеет делецию 3 последовательных аминокислот с N-конца, или 4 последовательных аминокислот с N-конца, или 5 последовательных аминокислот с N-конца, начиная с положения 1 или с положения 2 последовательности домена В д.т.

В соответствии с другим вариантом осуществления настоящее изобретение относится к матрице для аффинной хроматографии, содержащей один или несколько прикрепленных к хроматографической матрице доменов Z SpA, причем к матрице прикреплено несколько центров лиганда, и причем по меньшей мере один домен Z имеет делецию 3 последовательных аминокислот с N-конца, или 4 последовательных аминокислот с N-конца, или 5 последовательных аминокислот с N-конца, начиная с положения 1 или положения 2 последовательности домена Z д.т.

В соответствии с еще одним вариантом осуществления настоящее изобретение относится к матрице для аффинной хроматографии, содержащей один или несколько прикрепленных к хроматографической матрице доменов С SpA, причем к матрице прикреплено несколько центров лиганда, и причем по меньшей мере один домен С имеет делецию 3 последовательных аминокислот с N-конца, или 4 последовательных аминокислот с N-конца, или 5 последовательных аминокислот с N-конца, начиная с положения 1 или положения 2 последовательности домена С д.т.

В соответствии с конкретным вариантом осуществления настоящее изобретение относится к стабильному в основных условиях лиганду для аффинной хроматографии, который включает пять доменов С SpA, причем каждый домен характеризуется мутацией G29K, а также 4 аминокислотами, удаленными с N-конца, начиная с положения 1, и пентамерной формой, характеризующейся дополнительным аланином в качестве первой аминокислоты, способствующей однородному посттрансляционному процессингу белка.

В соответствии с некоторыми вариантами осуществления описываемые в настоящем документе SpA-лиганды дополнительно включают замененный остаток аминокислоты глицин в положении 29 остатком аминокислоты лизин (в случае доменов В и С) или замененный остаток аминокислоты аланин в положении 29 остатком аминокислоты лизин (в случае домена Z).

Применяемый в настоящем документе термин "исходная молекула", или "эквивалент дикого типа (д.т.)", или "белок д.т.", или "домен д.т." предназначен для отсылки к соответствующему белку (SpA) или домену белка (например, доменам В, Z или С SpA) в его фактически нативной форме, которая, в целом, в настоящем документе использована в качестве контроля. Используемый в настоящем документе эквивалент-контроль д.т., который соответствует домену SpA в его фактически нативной форме, может иметь отличие по одной аминокислоте от соответствующего домена SpA для изменения связывания с Fab; тем не менее, в остальном является идентичным последовательности соответствующего домена д.т. У лигандов по настоящему изобретению наблюдают уменьшенную фрагментацию (в случае как свободных, так и иммобилизированных форм) по отношению к их эквивалентам д.т. (т.е. полностью д.т. или включающим мутацию, изменяющую связывание с Fab), о чем свидетельствуют эксперименты, рассматриваемые в настоящем документе в разделе Примеры. В соответствии с различными вариантами осуществления эквивалент д.т. лиганда на основании домена В или домена С по настоящему изобретению представляет собой домен В д.т. SpA или домен С д.т. SpA, аминокислотные последовательности которых изложены в SEQ ID NO: 3 и SEQ ID NO: 4, соответственно. В соответствии с определенными вариантами осуществления эквивалент д.т. лиганда на основании домена Z представляет собой аминокислотную последовательность домена Z, изложенную в SEQ ID NO: 6. В соответствии с определенными вариантами осуществления эквивалентом д.т. домена В, С или Z является практически идентичная последовательность упомянутого выше домена В, С или Z, за исключением мутации в положении 29 для изменения Fab-связывания домена. Соответственно, в соответствии с определенными вариантами осуществления эквивалент д.т. лиганда на основании домена В включает аминокислотную последовательность, изложенную в SEQ ID NO: 45 (G29K), эквивалент д.т. лиганда на основании домена С включает аминокислотную последовательность, изложенную в SEQ ID NO: 46 (G29K), и эквивалент д.т. лиганда на основании домена Z включает аминокислотную последовательность, изложенную в SEQ ID NO: 48 (A29K). Кроме того, в случае, если лиганд по настоящему изобретению включает несколько доменов, то соответствующий эквивалент д.т. будет включать такое же количество доменов, однако может включать мутацию для изменения связывания Fab. Соответственно, в соответствии с определенными вариантами осуществления эквивалент д.т. пентамерного лиганда с доменами С по настоящему изобретению включает аминокислотную последовательность, изложенную в SEQ ID NO: 95 или в SEQ ID NO: 96.

Термин "идентичность последовательностей" означает, что две нуклеотидные или аминокислотные последовательности при оптимальном выравнивании, как, например, при помощи программ GAP или BESTFIT с применением параметра штрафов за открытие гэпа по умолчанию, имеют по меньшей мере 70% идентичности последовательностей, или по меньшей мере 80% идентичности последовательностей, или по меньшей мере 85% идентичности последовательностей, или по меньшей мере 90% идентичности последовательностей, или по меньшей мере 95% идентичности последовательностей или более. Для сравнения последовательностей, как правило, одна последовательность выступает в качестве эталонной последовательности (например, исходная последовательность), относительно которой сравнивают тестируемые последовательности. При применении алгоритма сравнения последовательностей тестовые и эталонные последовательности вводят в компьютер, затем, в случае необходимости, задают координаты и задают параметры программы с алгоритмом для работы с последовательностями. С помощью алгоритма сравнения последовательностей затем рассчитывают процент идентичности последовательности(ей) для тестируемой последовательности(ей) относительно эталонной последовательности, исходя из заданных параметров программы.

Оптимальное выравнивание последовательностей для сравнения может быть проведено, например, при помощи алгоритма локальной гомологии Смита-Ватермана, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981), алгоритма выравнивания по принципу гомологичности Нидлмана-Вунша, J. Mol. Biol. 48:443 (1970), при помощи способа поиска по сходству Пирсона и Липмана, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988), при помощи компьютеризированных реализаций таких алгоритмов (GAP, BESTFIT, FASTA и TFASTA из пакета программного обеспечения Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Мэдисон, Висконсин) или пр