Способ получения трехмерных структур, используемых для детекции, выделения или подсчета микроорганизмов

Способ получения трехмерных структур, используемых для детекции, выделения или подсчета микроорганизмов

Реферат

Настоящее изобретение относится к области микробиологии, в частности к детекции и идентификации микроорганизмов в различных средах и образцах.

Известно значительное число обычных культуральных сред и способов детекции и идентификации микроорганизмов, основные недостатки которых заключаются в длительном периоде инкубации образца (в течение по меньшей мере 18-24 часов) наряду с громоздкой манипуляцией, поскольку в ее ходе прибегают к различным средам для выделения, обогащения и идентификации бактерий и дрожжей.

Были предложены некоторые решения для уменьшения времени идентификации, такие как использование сред с хромогенными и флуорогенными субстратами, которые являются точно так же слишком медленными для нужд идентификации на основании доступности.

Использование керамических материалов, включая наноструктурированные материалы, было в основном нацелено на концентрирование микроорганизмов в образцах для их дальнейшей идентификации и для их детекции или идентификации с моноклональными антителами или фрагментами генетических структур, связавшихся с наноструктурами (Integration of hydroxyapatite concentration of bacteria and seminested PCR to enhance detection of Salmonella typhimurium from ground beef and bovine carcass sponge samples. Elaine D. Berry and Gregory R. Siragusa. United States Department of Agriculture Agricultural Research Service 2. Roman L. Hruska U.S. Meat Animal Research CenterClay Center, NE 689330166. Принята к публикации 15 февраля 1999), (Method of manufacturing hydroxyapatite and uses therefore in delivery of nucleic acid. Публикация заявки на патент США US 20080095820).

С другой стороны, взамен использовали силикатные наночастицы для ингибирования роста микроорганизмов. (Composition comprising aluminum silicates and silver nanoparticles as bactericides. Заявка на патент WIPO WO/2011/128488).

В патенте США US 6596505 В2 от 2003 Ceri и др. предложено устройство и способы для проверки эффекта материалов и поверхностей на образование биопленок. Способ включает использование гидроксиапатита и сред для культивирования для образования биопленок и дальнейшее определение характеристик этих микроорганизмов. В способе не рассматривается одноступенчатая идентификация и в его случае необходимы присоединения для образования биопленок, таким образом он неполностью подходит для целей идентификации, поскольку хорошо известно, что метаболические характеристики микроорганизмов и их устойчивость к противомикробным средствам меняются при образовании биопленок.

В изобретении Hatzmann M.J. и др. (WO 2009/067012 А2) заявлен способ детекции микроорганизмов в различных жидких материалах и в нем предусматривается концентрирование микроорганизмов в устройстве вроде фильтра, которое соединено с другими устройствами и фильтр которого формируют гидроксиапатитная структура, среда для культивирования и хромогенные и флуорогенные субстраты. Основными недостатками этого способа является то, что для детекции загрязнения требуется фаза концентрирования образца, что он применим только к жидким образцам, что для него необходимо добавочное оборудование и что ответ в виде идентификации не является ни быстрым, ни точным для многих микроорганизмов, поскольку он основан на детекции глюкуронидазной или галактозидазной активности.

Вкратце, недостатки способов, описанных выше в научной литературе и патентных документах, заключаются в том, что:

- Не все микроорганизмы (такие, как E. coli O157: Н7) присоединяются к наночастицам и не все микроорганизмы, которые присоединяются, можно выделить в пределах приемлемого периода времени для их дальнейшей идентификации.

- Адгезия микроорганизмов зависит от их концентрации в образце; чем ниже концентрация, тем меньше адгезия.

- В большинстве способов необходимо отделение микроорганизмов от структур для их дальнейшей идентификации, для которой требуются дополнительные стадии, такие как центрифугирование, для которого в свою очередь требуется использование дополнительного оборудования и которое подвергает выделенные микроорганизмы внешнему загрязнению или использованию центрифуг в асептических условиях.

- В случае тех изобретений, в которых предусматривается эта дополнительная фаза, требуются среды для культивирования, чтобы выделить микроорганизмы для их дальнейшей идентификации при помощи различных иммуноферментных способов или других молекулярных методов.

- В способах, охраняемых изобретениями, описанными до сих пор здесь, идентификация основывается на механизмах идентификации, которые прибегают к моноклональным антителам, которые являются очень чувствительными к температурам и имеют очень короткий срок эксплуатации или в которых используются методы обнаружения фрагментов ДНК или РНК, для которых требуется дополнительное оборудование, которое может быть недоступным по цене для небольших лабораторий или лабораторий, имеющих ограниченные средства.

- По этой причине ускоренный рост микроорганизмов в низких концентрациях очень трудно идентифицировать и может быть даже недетектируемым, или большие объемы образца должны быть подвергнуты фильтрованию для детекции этих низких концентраций.

- В случае некоторых изобретений, в которых предусматривается контактирование микроорганизмов с нано- или микроструктурами и со средами для культивирования, последние не являются выбранными, в частности, из-за их способности к стимулированию быстрого роста, и микроорганизмы в низких концентрациях не детектируются или их детекция происходит слишком поздно, что касается диагностических нужд.

- Те питательные основы, существующие на международных рынках, которые были выбраны для использования в средах для культивирования, не способны к стимулированию образования ферментов, чтобы увеличить биомассу в пределах сокращенного периода времени, поскольку они не способны сократить латентную фазу роста микроорганизмов.

- На схожих структурах, основанных на нанопористых материалах или сформированных агрегированными наночастицами, широкий ряд микроорганизмов, таких как дрожжи, грибы, грамположительные и грамотрицательные бактерии, микробактерии нанобактерии, не детектируется за один раз.

- В случае большинства запатентованных способов необходимо применение образца в жидком состоянии и, кроме того, необходимо концентрирование с помощью фильтрации и они не включают выделение микроорганизмов, суспендированных в воздухе, других газах или в твердых образцах.

- Некоторые природные глины, такие как цеолит, белая фарфоровая глина/каолит и другие, за счет своего собственного минерального соединения становятся ингибиторами большинства микроорганизмов, по этой причине их не используют для стимулирования роста, а скорее используют для его ингибирования.

- Никакой способ, описанный до сих пор, не гарантирует простое, быстрое выделение, детекцию и подсчет множества микроорганизмов, которые могут встречаться в концентрациях всего лишь 1 КОЕ/объем образца и в пределах сокращенного периода времени.

Цель этого изобретения заключается в выдвижении способа детекции, выделения и подсчета множества микроорганизмов в различных образцах.

Новизна этого изобретения заключается в следующем:

- В способе предусматривается интенсивное и ускоренное развитие и образование клеточных и ферментных структур благодаря комбинации эффектов, никогда не описываемых ранее - ни в научной литературе, ни в патентной документации. Эти эффекты в основном достигаются: а) благодаря использованию питательных веществ, специально полученных при помощи оригинальных способов, которые сокращают скрытую фазу роста и активируют фазу ускорения роста; b) ускорению ферментативных процессов, которые деградируют субстраты-индикаторы, посредством предоставления ионов, которые могут содержать трехмерные структуры глин или керамических материалов; с) механическому эффекту адгезии глиняных или керамических структур, которые включают комбинации или полости различных размеров, которые захватывают, удерживают или вмещают микроорганизмы самых различных размеров, колеблющихся от нанометров до колоний длиной несколько сантиметров, и нитчатые структуры грибов, гиф или спор и/или других стадий, служащих для размножения; d) эффекту увеличения уже увеличенной поверхности контакта, которая обеспечивается нано- и микроструктурами, которые значительно увеличивают скорость ферментативного расщепления маркеров на твердой фазе; е) эффекту загрузок, который могут вносить ионы на поверхности трехмерных структур, включая глиняные структуры, или от ингредиентов питательных веществ, которые могут увеличить адгезию клеток; и в общем в отличие от всех предшествующих решений это изобретение не основано на выделении, детекции и идентификации микроорганизмов только согласно адгезии к структурам (концентрировании).

- Это - первый раз, когда глины или керамические материалы, такие как цеолит, бентонит и каолинит, среди прочего, могут использоваться в природном виде для демонстрации бактерицидной, фунгицидной или бактериостатической активности без необходимости химической модификации для стимулирования роста микроорганизмов, поскольку их ингибиторный эффект, вызванный естественным присутствием на них «токсичных» для микроорганизмов ионов, устраняется благодаря абсорбции или адсорбции питательных смесей, специально разработанных для каждого вида образца и трехмерной структуры. Предшествующие применения этих глин были нацелены на устранение бактерий.

- Нет предшествующих решений комбинирования стимуляции роста на природных или искусственных глинах с субстратами, поскольку в предшествующих решениях, в которых используются хромогенные и флуорогенные субстраты, детекцию или идентификацию выполняют исключительно на основе действия указанных субстратов в присутствии повышенных концентраций клеток наряду с тем, что, с другой стороны, предшествующие решения, использованные для стимуляции роста грибов или бактерий на глинах или керамических материалах, не предназначены для идентификации или подсчета, а вместо этого для увеличения концентрации клеток.

- Это - первый раз, когда в одном и том же способе анализа или в отдельном или составном устройстве используют множество природных или искусственных глин или керамических материалов, при этом каждые из них вносят различные виды ионов, которые работают избирательно в качестве катализаторов ферментативных реакций, специфических для вида, рода или группы микроорганизмов, которые, вместе с питательными веществами и факторами роста, привносимыми питательными формулами, выбраны специально для поддержки короткого периода скрытой фазы и для ускорения роста микроорганизмов и которые неожиданно позволили детектировать, выделить и/или подсчитать множество микроорганизмов по отдельности или внутри одного и того же образца за такой короткий период, как 60-90 минут, который никогда не достигался с помощью хромогенных и флуорогенных способов идентификации микроорганизмов.

- Неожиданно, некоторые микроорганизмы, такие как конкретные виды Pseudomonas, продемонстрировали характеристики, которые обычно не проявляются на определенных средах; например, при использовании обожженной и очищенной кремнистой земли с питательным веществом Pseudomonas проявляла флуоресценцию спустя всего лишь 120 минут, тогда как на оставшихся без изменения средах для культивирования, которые содержат это вещество, флуоресценция появляется только спустя 18 часов.

- Впервые неожиданно обнаружено, что при уменьшении размера полостей, в частности размера пор трехмерных структур тестируемых устройств, и, таким образом, при увеличении поверхности контакта и доступности загрузок на поверхность ускорялась ферментативная реакция расщепления субстратов и бактерии можно было детектировать на по меньшей мере 60 минут раньше, чем в случае схожих структур, содержащих то же питательное вещество и для того же микроорганизма, но с большими размерами полостей.

- В вариантах способа, в которых предусматривается использование трехмерных структур с питательными формулами, специфическими субстратами-индикаторами и противомикробными средствами в различных параллельных комбинациях в качестве части вышеупомянутых устройств было возможным определение их чувствительности к противомикробным средствам наряду с детекцией микроорганизмов одношагово.

- Впервые были объединены ферментативные гидролизаты водорослей Spirulina platensis, Saccharomyces cerevisiae и Torula, экстракт из сладкого картофеля, экстракт из помидоров, полученный с использованием папаина гидролизат ткани бычьего сердца и бычьей крови, ферментативные гидролизаты лактоальбумина из сычужной сыворотки, ферментативные гидролизаты или продукты кислотного гидролиза казеина пахты и гидролизат или автолизат Eudrillus eugeniae с природными или искусственными трехмерными структурами, что неожиданно сократило период скрытой фазы роста микроорганизмов.

- Загрязнения образцов, такие как суспендированные твердые частицы в воде, которые мешают детекции и количественному определению микроорганизмов, можно было исключить на той же фазе детекции способа.

- Смогли получить очень универсальный способ, который с одной или множеством объединенных единиц позволяет осуществлять детекцию, рекуперацию и/или подсчет самых разнообразных микроорганизмов в различных типах образцов из газа, жидкости, твердых тел, гелей и зон жизни с уровнями загрязнения, составляющими менее чем 1 КОЕ/единицу образца; вплоть до 10⁹ КОЕ/единицу образца без мешающего действия загрязнения образцов.

Преимущества этого способа заключаются в том, что:

- Все жизнеспособные микроорганизмы можно детектировать, выделить и/или пересчитать за один раз, поскольку принципы способа обеспечивают все условия, необходимые для этой цели.

- Предложенный способ способен детектировать и/или выделить все микроорганизмы независимо от того, присоединены ли они к структуре или нет, в отличие от предшествующих этому изобретению решений, которые не гарантируют, что все микроорганизмы (такие, как Е. coli O157: Н7) будут присоединены к наноструктурам, а также не гарантируют то, что присоединенные микроорганизмы могут быть выделены в пределах приемлемого периода времени для их дальнейшей идентификации.

- Поскольку этот способ не основан только на адгезии жизнеспособных микроорганизмов к структурам устройства, детектируют все микроорганизмы-мишени, присутствующие в образце, даже в низких концентрациях, или исходя из их спор, гиф или других стадий, служащих для размножения, и это достигается в отличие от предшествующих способов, в которых адгезия микроорганизмов зависит от их концентрации в образце (чем ниже концентрации, тем меньше адгезия).

- Способ, предусматриваемый в этом изобретении, позволяет детектировать, выделить и/или пересчитать микроорганизмы независимо от первоначальных характеристик структур, их ионов или их рН в отличие от некоторых из вышеотмеченных патентов, в которых адгезия микроорганизмов к их структурам с целью их концентрирования и последующей идентификации осуществляется благодаря ионной активности на поверхности тех структур, которые взаимодействуют с клетками микроорганизмов, так что, если образец, содержащий микроорганизмы, содержит вещества, которые могут мешать этим ионам или захватывать их, или если их рН оказывает влияние на них, правильные и своевременные детекция, идентификация или количественное определение могут не достигаться.

- В случае предложенного изобретения не требуются какие-либо дополнительные стадии детекции, концентрирования образцов, особые асептические условия или обязательное оборудование, а значит оно само отличается от предшествующих описаний, поскольку в случае большинства из них необходимо отделение микроорганизмов от структур для их дальнейшей идентификации, которая включает дополнительные стадии, такие как центрифугирование, для которого требуется дополнительное оборудование (центрифуги) и которое подвергает выделенные микроорганизмы внешнему загрязнению или использованию центрифуг в асептических условиях.

- Новый способ является простым, дешевым, детекция не занимает много времени и не требует дополнительных технологических методов в отличие от других описанных изобретений, в которых предусматривается одна или более дополнительных фаз, требуется отделение сред для культивирования от структур, чтобы выделить микроорганизмы для их последующей идентификации при помощи различных способов, в том числе иммуноферментных способов или других молекулярных методов идентификации, и это делает их более дорогими и технически сложными.

- Способ, описанный в этой заявке на патент, осуществляют без риска и в различных лабораторных условиях и условиях окружающей среды, и он является очень стабильным, поскольку реагенты, препараты и питательные вещества, как только они внедрены в трехмерные структуры, являются очень стабильными при температуре окружающей среды и влажности в лаборатории, что представляет значимое отличие от способов, ранее упоминаемых в научной и патентной литературе, поскольку, как правило, детекция основывается на механизмах с использованием моноклональных антител, которые являются очень чувствительными к температурам, или для нее используются методы обнаружения фрагментов ДНК или РНК, для которых требуется дополнительное оборудование, которое может быть слишком дорогим для небольших лабораторий или лабораторий, имеющих ограниченные средства.

- Выполнение способа является очень стабильным, а значит оно позволяет выполнять каждую стадию с удлиненными периодами между ними в необходимых случаях, поскольку, как было ранее отмечено, после абсорбции питательных формул трехмерными структурами с нано- и микрополостями и после удаления растворителя устройства являются очень стабильными до изменений температуры и влажности и, следовательно, могут использоваться безопасно на протяжении длительных периодов. Этот эффект обусловлен тем, что твердые вещества питательных формул имеют очень низкую степень влажности, и остаточная влажность подвергается силам адсорбции поверхностей полостей, которые формируют устройство, и, таким образом, является недоступной для биологических или биохимических реакций распада до добавления второго растворителя или образца.

- В этом изобретении описывается способ с очень низким пределом детекции на единицу образца используемых питательных веществ (ниже чем 1 КОЕ), что означает, что можно детектировать и выделить вид микроорганизма в очень низких концентрациях, таким образом способствуя их идентификации и/или подсчету, и в отличие от других описанных процедур уровня техники в нем не требуются большие объемы образцов или высокие концентрации засева.

- С помощью этого способа детектируют за один раз низкие концентрации (ниже чем 1 КОЕ/единицу образца) микроорганизмов различных видов, родов, групп и размеров благодаря контакту с теми питательными веществами и рыночными субстратами, которые специально отобраны для различных трехмерных структур с различными характеристиками; это осуществляется с тем отличием от концепций других авторов, что эти питательные вещества не являются специально выбранными по их способности к быстрой стимуляции роста в случае конкретных свойств структур и характеристик микроорганизмов, подвергаемых детекции, и, соответственно, в низких концентрациях некоторые из них не детектируются или их детекция занимает слишком много времени, что касается диагностических нужд.

- В одной и той же структуре в одно и то же время детектируется широкий ряд микроорганизмов, таких как дрожжи, мицелиальные грибы, грамположительные и грамотрицательные бактерии, микробактерии и нанобактерии; этот эффект не достигался ранее с помощью других процедур.

- Изобретение, описанное в этой заявке, позволяет на фоне одной и той же комбинации структура-питательное вещество-маркеры ферментативной активности детектировать, выделить и/или подсчитать те микроорганизмы, которые суспендированы в газах, например в воздухе, жидкостях или твердых образцах, что круто отличается от традиционных процедур, в которых используются средства, опоры, соединения и различные среды для культивирования в зависимости от типа образца, подвергаемого обработке, как в случае жидких образцов для анализа, при котором используют специальные среды и фильтрационные мембраны, изготовленные из ацетата или нитрата целлюлозы; однако в случае твердых образцов эти мембраны не используют, поскольку формулы этих сред имеют вариации, или даже размер пластины отличается.

- В соответствии с этим изобретением все виды природных глин, керамических материалов и фосфатов кальция могут селективно использоваться без ограничений, поскольку они объединены с питательными веществами и другими компонентами, которые нейтрализуют ингибиторный эффект, который может быть вызван некоторыми из ионов, которые они содержат, такие как цеолит, каолинит или бентонит, лишь упоминая три примера; это является основным отличием при использовании этих глин, предусмотренных в предшествующих решениях, в которых планируется их использование в качестве антибактериальных средств.

- Для целей этого способа (детекции, выделения и/или подсчета), для осуществления способа природные глины, которые первоначально проявляли бактерицидную, фунгицидную или бактериостатическую активности, могут использоваться с обходом без дополнительных затрат на очистку или химическую модификацию для стимуляции роста микроорганизмов благодаря их объединению с другими компонентами, описанными в предыдущем параграфе.

- Способ позволяет ингибировать некоторые нецелевые микроорганизмы или определить чувствительность или устойчивость к противомикробным средствам наряду с детекцией микроорганизмов в пределах очень короткого периода времени в случае любого вида, рода или группы микроорганизма, который присутствует в образце, благодаря объединению различных трехмерных структур с различными питательными веществами, маркерами ферментативной активности с отобранными противомикробными средствами.

- Новый способ является простым, дешевым и его можно легко приготовить в случае его производства.

Ниже приведено подробное описание настоящего изобретения.

В качестве предварительной стадии питательные вещества согласно изобретению выбирают из ряда смесей белков, углеводов, витаминов и минеральных веществ, которые подвергаются деградации посредством химических или ферментативных способов. Одну или более из этих питательных смесей, которые стимулируют рост микроорганизмов, готовят в водных растворах или растворах солей с концентрациями, составляющими 0,1-3 г/л, в которые засевают 0,1 мл микроорганизмов, которые предназначены для детекции, выделения или подсчета, в концентрации, составляющей 3×10⁸ КОЕ/мл, и которые инкубируют при желаемой температуре и давлении кислорода, измеряя кинетику роста микроорганизмов при помощи любого известного способа, предпочтительно определяя увеличение оптической плотности в динамике по времени. Выбирают те вещества, которые обеспечивают сокращение скрытой фазы роста, которая не превышает 60-120 минут в случае бактерий и 16 часов в случае дрожжей и мицелиальных грибов.

Некоторыми примерами питательных веществ, упомянутых выше, являются ферментативные гидролизаты водорослей Spirulina platensis, описанные в авторском свидетельстве на изобретение Кубы с №22310; экстракт из Saccharomyces cerevisiae, полученный при помощи ферментативного гидролиза, как описано в авторском свидетельстве на изобретение Кубы с №22221, и ферментативные гидролизаты кормовых дрожжей Torula (авторское свидетельство на изобретение Кубы с №22280), экстракт из сладкого картофеля, описанный в патенте Кубы с №23507; экстракт из помидоров (авторское свидетельство на изобретение Кубы с №22308); ферментативные гидролизаты ткани бычьего сердца (авторское свидетельство на изобретение Кубы с №22442), бычьей крови (авторское свидетельство на изобретение Кубы с №22208) и бычьей печени (авторское свидетельство на изобретение Кубы с №22220); ферментативные гидролизаты лактоальбумина из сычужной сыворотки (авторское свидетельство на изобретение Кубы с №22219), ферментативные гидролизаты или продукты кислотного гидролиза казеина пахты (авторские свидетельства на изобретение Кубы с №№22166 и 22089 соответственно) и гидролизат и автолизат Eudrillus eugeniae (авторское свидетельство на изобретение Кубы с №22381). Выбранные вещества растворяют или суспендируют в первом растворителе в количествах, находящихся в пределах от 1 до 50 г/л.

После выбора питательных веществ можно начинать осуществление способа, предложенного в этой заявке на патент (вторая фаза).

Ко всем из вышеуказанных веществ могут быть также добавлены другие коммерческие ферментативные гидролизаты или экстракты из растений или животных тканей, такие как пептоны и триптоны, или имеющиеся в продаже белковые экстракты из водорослей, микроорганизмов, овощей, ткани высших животных и их комбинации, такие как те, которые получены из говядины, мозгов и картофеля, среди прочего, в количествах, находящихся в пределах от 1 до 10 г/л.

Как только вещество приготовлено, может быть добавлено одно или более хромогенных, флуорогенных или биолюминесцентных соединений - маркеров ферментативной активности, специфических для одного или более видов, родов или групп микроорганизмов в количествах, составляющих от 0,01 до 2 г/л.

Некоторыми примерами этих маркеров для одного или более видов микроорганизмов могут быть: соединения, являющиеся производными фенола, паранитроанилина, индолила, метилумбеллиферила (MUG) для детекции активности галактозидазы, глюкуронидазы, декарбоксилазы, гликозидазы и фосфатазы, которые включают: 2-нитрофенил-β-D-галактопиранозид, 4-метилумбеллиферил-β-D-глюкуронид, 4-метилумбеллиферил фосфат и 4-метилумбеллиферил-β-D-глюкозид.

Примером этих маркеров для одного или более видов дрожжей и грибков в целом являются соединения, являющиеся производными метилумбеллиферила (MU) для активности фосфатазы Candida parapsilosis и Candida glabrata, которые включают 4-метилумбеллиферил фосфат (всегда в комбинации с трехмерными наноструктурами гидроксиапатитов или карбонатов из природных апатитов, к которым эти маркеры будут добавлены позднее), и производными метилкумарина для L-пролин-амидазы Candida albicans и Candida prapsilosis, которые включают L-пролин-метилкумарин (всегда в комбинации с трехмерными наноструктурами гидроксиапатитов или карбонатов из природных апатитов или обожженной и очищенной кремнистой землей, к которым эти маркеры будут добавлены позднее).

К смеси питательных веществ и маркеров ферментативной активности могут быть добавлены другие вещества, такие как активаторы или ингибиторы микроорганизмов, относящихся к определенным родам, видам или группам. Некоторые примеры этих веществ включают витамины, минеральные соли, альбумин, антибиотики, красители, краски, соли желчных кислот, бычью желчь, сахара и аминокислоты, такие как лактоза, сорбит, декстроза, триптофан, гистидин, метионин, D-L-фенилаланин, одноосновные фосфаты, двухосновные фосфаты. Также другие вещества, которые увеличивают растворимость маркеров ферментативной активности или проницаемость клеток микроорганизмов, могут быть добавлены в количествах, находящихся в пределах от 0,01 вплоть до 40 г/л.

Если запланировано ингибирование некоторых микроорганизмов или определение чувствительности к противомикробным и противогрибковым средствам или к чистящим или дезинфицирующим растворам или для подтверждения конкретного бактерицидного или бактериостатического эффекта какого-либо вещества или продукта, соли, полимеры, натуральные растительные экстракты, жирные кислоты, сложные эфиры, бактерициды, бактериостатические средства, спирты, вещества с поверхностной активностью или их смеси в количествах, находящихся в пределах от 0,01 до 2 г/л, и/или антибиотики или противогрибковые средства в количествах, находящихся в пределах от 10 до 100 мкг/л, могут быть также добавлены к выбранному питательному веществу.

Выбранное питательное вещество вместе со специфическим маркером ферментативной активности и другими компонентами растворяют или суспендируют в первом растворителе в количествах, находящихся в пределах от 1 до 150 г/л.

Растворителем может быть дистиллированная или деионизированная вода, водные растворы солей (NaCl, фосфатные растворы, среди прочего), спирты и спиртовые растворы (например, 10% (часть/объем) раствор основного красителя - фуксина в этиловом спирте), растворы веществ, которые увеличивают растворимость маркеров ферментативной активности [например, диметилсульфоксид (DMSO)] или проницаемость клеток микроорганизмов.

После образования питательной смеси и ее растворения или суспендирования в первом растворителе вместе со специфическими маркерами ферментативной активности и другими компонентами их можно подвергнуть стерилизации при помощи любого известного способа за исключением тех соединений, которые содержат термолабильные вещества, которые нельзя стерилизовать нагреванием.

После образования питательной смеси и ее растворения или суспендирования в первом растворителе вместе со специфическими маркерами ферментативной активности и другими компонентами их можно привести в контакт с одной или более трехмерными структурами природных или искусственных глин или керамических материалов.

Эти трехмерные структуры могут быть предварительно подвергнуты стерилизации посредством любого известного способа.

Время контакта питательного вещества и других соединений, растворенных или суспендированных в первом растворителе, и трехмерной структуры глины или керамического материала находится, как правило, в пределах от 10 минут в случае нанометрических или субмикрометрических (<1000 нм) размеров вплоть до 60 минут в случае больших структур.

Эти структуры должны иметь удельную поверхность, равную 2×10³-6×10⁸ м²/м³, и сформированы множеством нано-, микро- и макрополостей или их комбинациями.

Эти глины и/или природные или искусственные керамические материалы выбирают из каолинита, галлоизита, диккита, накрита, хризолита, антигорита, лизардита, вермикулита, слюды, гекторита, сапонита, гидроталцита, мусковита, хлорита, диатомовой земли, бентонитов (монтмориллонита, сауконита, бейделлита, нонтронита), клиноптилотитов, гидроксиапатитов, цеолитов и фосфатов кальция или их комбинаций.

Кальций-фосфатные структуры, упомянутые в вышеприведенном параграфе, должны выбираться между метафосфатом [Са(РО₃)₂], моногидратом дигидрофостата кальция [Са(H₂PO₄)₂Н₂О], тетракальцием дигидрогенфосфатом (Ca₄H₂P₆O₂₀), гептакальцием фосфатом [Са₇(Р₅О₁₆)₂], пирофосфатом кальция (Ca₂P₂O₇ и Ca₂P₂O₇2H₂O), дикальцием фосфатом [CaHPO₄, CaHPO₄⋅2H₂O и Са(H₂PO₄)₂], трикальцием фосфатом [Са₃(PO₄)₂], октакальцием фосфатом [Са₈Н₂(PO₄)₆⋅5H₂O], лишенным кальция гидроксиапатитом [Ca₁₀-x(HPO₄)х(PO₄)₆-х(ОН)₂-х], гидроксиапатитом [Са₁₀(PO₄)₆(ОН)₂], тетракальцием фосфатом [Са₄₀(PO₄)₂], апатитом [Са₁₀(PO₄)₆(ОН,F,Cl,Br)₂], карбонатапатитом [Са₅(PO₄,CO₃)₃(ОН,F)] или их смесью.

Глины и/или природные или искусственные керамические материалы и фосфаты кальция могут иметь изоморфные замещения ионов катионами или быть предварительно функционализированы с помощью различных ионов, предпочтительно одновалентных, двухвалентных, трехвалентных или четырехвалентных, действующих в качестве катализаторов ферментов, таких как Na, K, Са, Mg, Р, Fe и Zn, образующих поверхностные слои или распределенных по всей их структуре.

Трехмерные структуры, упомянутые выше, выбирают из числа тех, размеры полостей которых соответствуют:

- нанополостям или частицам, предпочтительно со сморщенной поверхностью, с диаметрами или просветами вплоть до 200 нм для нано- и микробактерий;

- нано- и субмикрополостям с диаметрами или просветами от 5 нм до 1000 нм для бактерий с различными размерами;

- микрополостям с диаметрами или просветами от 1 мкм до 1000 мкм для дрожжевых бактерий и клеток;

- микро- и макрополостям с диаметрами или просветами, составляющими более чем 1 мкм и вплоть до 2 мм, для бактерий, дрожжей и мицелиальных грибов;

- комбинациям всех диаметров полостей и просветов от нано- вплоть до макро = 2 мм для ассортимента микроорганизмов.

Полости в структуре могут иметь вид пор, каналов, трубок, регулярных или нерегулярных мешков различных геометрических форм или их комбинаций или, если возможно, слоев или листов.

Трехмерные структуры могут формировать слой или пленку толщиной до 3 мм, в особенности при использовании для детекции, идентификации или подсчета микроорганизмов, используя метод мембранной фильтрации, или для детекции поверхностных микроорганизмов; или столб высотой вплоть до 10 см, в особенности, когда требуется подвергнуть фильтрации большие количества жидких суспензий микроорганизмов, которые могут встречаться в низких концентрациях, или когда различные зоны структур используются с различными маркерами ферментативной активности или с различными питательными смесями.

Могут также использоваться структуры в виде сфер или гранул диаметром до 10 мм; шестигранников или кубов, образующих набор тестовых сценариев с различными соединениями, или их можно добавить к образцу жидкости или суспензии, содержащему микроорганизмы.

Другим структурам придана форма цилиндров или трубок с очень маленьким диаметром (5 нм) для небольших аликвот, которые соединяют многие из этих трубок с образованием набора диаметром вплоть до 10 см, сходного с диметром чашки Петри, для тех тестов, в случае которых предусмотрен пересчет стандартов, для которых необходима такая поверхность.

Высота этих структур варьирует в зависимости от формы представления, используемой в способе, находясь в пределах от 5 нм для наноаликвот или микроаликвот, или в случае соединения многих из этих структур в подобный сэндвичу набор слоев, который может достигать высоты вплоть до 10 см.

Трехмерные структуры могут иметь вид волокон или сетей, которые удерживают микроорганизмы, делая возможным их детекцию.

Всякий раз, когда желательно, чтобы структуры детектировали и идентифицировали микроорганизмы во всем объеме образца, используют глины, которые способны к значительному разбуханию по своей природе или при добавлении желирующих веществ, которые заставляют их принимать форму емкости, вмещающей их.

Трехмерные структуры в соответствии с этим изобретением могут демонстрировать множество зон с различными пористостями, диаметрами или просветами нано-, микро- и макрополостей по всему их объему, длине или диаметру при распределении этих зон в виде градиента или в виде дифференцированных зон. Различные питательные вещества и маркеры ферментативной активности могут быть добавлены в каждую зону, по всей их структуре, длине или диаметру, таким образом распределяя по концентрическим зонам. Распределение соединений или сосредоточение одного или более из их компонентов можно обеспечить при помощи непрерывных или ступенчатых градиентов.

К этим структурам можно добавить вещества, которые вносят вклад в закрепление питательного вещества и выбранных маркеров ферментативной активности и других соединений в тех случаях, когда полагают, что жидкость образца может перетащить указанное питательное вещество. Некоторые из этих веществ могут включать альгинаты, такие как альгинат натрия; природные полисахариды, такие как пектин и хинин; аравийскую камедь и другие камеди; крахмалы, такие как кукурузный крахмал или крахмал сладкого картофеля, или пептизированные крахмалы; декстран и карбоксиметилцеллюлозу и другие полимерные производные; каррагенин или каррегенат натрия; агар, агарозу и искусственные полимерные производные; производные винилового спирта, а также полибутилен, полипропилен и поливинилпирролидон с различными молекулярными массами в количествах, находящихся в пределах от 0,01 до 0,5 г/г трехмерной структуры.

В том случае, когда удельная поверхность трехмерной структуры сост