Антитела со встроенным в легкие цепи гистидином и генетически модифицированные отличные от человека животные для их получения

Антитела со встроенным в легкие цепи гистидином и генетически модифицированные отличные от человека животные для их получения

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Ссылка на родственные заявки

По настоящей заявке испрашивается приоритет в соответствии с 35 U.S.C. §119(е) предварительной заявки на выдачу патента США №61/611950, поданной 16 марта 2012 г., и предварительной заявки на выдачу патента США №61/736930, поданной 13 декабря 2012 г., полное содержание обеих включено в настоящий документ посредством ссылки.

Область техники, к которой относится настоящее изобретение

Предусмотрено генетически модифицированное отличное от человека животное (например, грызун, например, мышь или крыса), которое экспрессирует антитела, способные связываться с антигеном зависимым от pH образом. Предусмотрен способ получения модификаций вариабельной области легкой цепи иммуноглобулина отличного от человека животного, причем модификации включают в себя мутагенез остатков в гене вариабельной области легкой цепи, например, нуклеотидов, которые кодируют одну или несколько аминокислот в определяющей комплементарность области (CDR), для облегчения in vivo экспрессии антител, содержащих домены легкой цепи, которые проявляют зависимое от pH связывание с антигенами. Также предусмотрены способы получения антител с зависимым от pH связыванием антигена.

Предшествующий уровень техники настоящего изобретения

Антитела, как правило, содержат гомодимерный компонент тяжелой цепи, причем каждый мономер тяжелой цепи связан с идентичной легкой цепью. Антитела, содержащие гетеродимерный компонент тяжелой цепи (например, биспецифические антитела), желательны в качестве терапевтических антител. Но получение биспецифических антител, содержащих подходящий компонент легкой цепи, который может удовлетворительно ассоциировать с каждой из тяжелых цепей биспецифического антитела, оказалось проблематичным.

Согласно одному подходу легкая цепь может быть выбрана с помощью обзора статистики использования всех вариабельных доменов легкой цепи, идентифицирующего наиболее часто используемую легкую цепь в антителах человека и образующего пару этой легкой цепи in vitro с двумя тяжелыми цепями различной специфичности.

Согласно другому подходу легкая цепь может быть выбрана в результате наблюдения последовательностей легкой цепи в библиотеке фагового дисплея (например, библиотека фагового дисплея, содержащая последовательности вариабельной области легкой цепи человека, например, библиотека scFv человека) и выбора наиболее широко используемой вариабельной области легкой цепи из библиотеки. Легкая цепь может быть исследована на двух разных представляющих интерес тяжелых цепях.

Согласно другому подходу легкая цепь может быть выбрана путем анализа библиотеки фагового дисплея вариабельных последовательностей легкой цепи с использованием вариабельных последовательностей тяжелой цепи обеих представляющих интерес тяжелых цепей в качестве зондов. Легкая цепь, которая ассоциирует с обеими вариабельными последовательностями тяжелой цепи, может быть выбрана в качестве легкой цепи для тяжелых цепей.

Согласно другому подходу кандидатная легкая цепь может быть выровнена с родственными тяжелым цепям легкими цепями, и модификации в легкой цепи получают для более близкого соответствия характеристик последовательностей, общих для родственных легких цепей обеих тяжелых цепей. Если шансы иммуногенности должны быть сведены к минимуму, модификации предпочтительно приводят к последовательностям, которые присутствуют в известных последовательностях легкой цепи человека, таким образом, что протеолитический процессинг вряд ли будет производить эпитоп Т-клеток, основанный на параметрах и способах, известных в настоящей области техники для оценки вероятности иммуногенности (т.е., in silico, а также в мокрых анализах).

Все вышеперечисленные подходы основываются на способах in vitro, которые включают в себя ряд априорных ограничений, например, идентичность последовательности, способность ассоциировать со специфичными предварительно выбранными тяжелыми цепями и т.д. Существует необходимость в настоящей области техники в композициях и способах, которые не основываются на манипулировании условиями in vitro, но которые вместо этого применяют более биологически чувствительные подходы к созданию эпитопсвязывающих белков человека, которые включают общую легкую цепь.

Кроме того, терапевтические антитела, например, биспецифические терапевтические антитела, характеризуются некоторыми ограничениями в том, что они часто требуют высоких доз для достижения желаемой эффективности. Отчасти это связано с тем фактом, что комплексы антитело-антиген поглощаются в эндосомы, и нацеливаются на лизосомальную деградацию в процессе, называемом мишень-опосредованный клиренс. Таким образом, существует необходимость в настоящей области техники в способах и композициях, которые приводят к более эффективной рециркуляции антител, например, рециркуляции биспецифических антител, и предупреждают деградацию антител путем способствования диссоциации комплексов антитело-антиген в эндосомальном компартменте без снижения специфичности и аффинности антитела к антигену.

Краткое раскрытие настоящего изобретения

Согласно одному аспекту предусмотрена биологическая система для получения антитела или вариабельного домена антитела, который связывается с антигеном-мишенью при нейтральном значении pH, но проявляет сниженное связывание с тем же антигеном при кислом значении pH (например, pH 5,0-6,0). Биологическая система содержит отличное от человека животное, например, грызуна (например, мышь или крысу), которое содержит реаранжированную последовательность легкой цепи (например, реаранжированные V-J), которая содержит одну или несколько модификаций гистидина. Согласно различным аспектам одна или несколько модификаций гистидина находятся в кодоне CDR3 легкой цепи. Согласно различным аспектам отличное от человека животное содержит человеческий или гуманизированный локус тяжелой цепи иммуноглобулина. Согласно различным аспектам отличное от человека животное содержит замещение эндогенных вариабельных генных сегментов отличной от человеческой тяжелой цепи одним или несколькими сегментами V_H, D_H и J_H тяжелой цепи человека, причем человеческие сегменты функционально связаны с отличной от человеческой константной областью иммуноглобулина. Согласно различным аспектам предусмотрены отличные от человека животные с универсальными легкими цепями, содержащими вариабельные домены легкой цепи с заменами негистидиновых остатков на остатки гистидина. Согласно различным аспектам эти отличные от человека животные с универсальными легкими цепями с модификациями гистидинов (например, грызуны, например, мыши) относятся к мышам с гистидин-универсальной легкой цепью, гистидин-ULC мышам или HULC мышам.

Таким образом, согласно одному аспекту в настоящем документе предусмотрено генетически модифицированное отличное от человека животное, которое содержит в своей зародышевой линии локус легкой цепи иммуноглобулина, который содержит единственную реаранжированную генную последовательность вариабельной области легкой цепи иммуноглобулина человека, содержащую последовательности сегментов V_L и J_L человека, причем единственная реаранжированная последовательность вариабельной области легкой цепи иммуноглобулина человека содержит замену по меньшей мере одного негистидинового кодона на гистидиновый кодон. Согласно одному варианту осуществления единственная реаранжированная последовательность вариабельной области иммуноглобулина человека функционально связана с генной последовательностью константной области легкой цепи иммуноглобулина. Согласно одному варианту осуществления генная последовательность константной области легкой цепи иммуноглобулина представляет собой отличную от человеческой генную последовательность константной области легкой цепи иммуноглобулина. Согласно одному варианту осуществления отличная от человеческой генная последовательность константной области легкой цепи иммуноглобулина представляет собой эндогенную генную последовательность константной области легкой цепи иммуноглобулина. Согласно одному варианту осуществления отличное от человека животное не содержит функциональную нереаранжированную вариабельную область легкой цепи иммуноглобулина. Согласно одному варианту осуществления локус легкой цепи иммуноглобулина находится в эндогенном отличном от человеческого локусе легкой цепи иммуноглобулина.

Согласно одному варианту осуществления животное дополнительно содержит в своей зародышевой линии локус тяжелой цепи иммуноглобулина, который содержит нереаранжированную генную последовательность вариабельной области тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащую сегменты V_H, D_H и J_H человека, функционально связанные с генной последовательностью константной области тяжелой цепи иммуноглобулина. Согласно одному варианту осуществления генная последовательность константной области тяжелой цепи иммуноглобулина представляет собой отличную от человеческой генную последовательность константной области тяжелой цепи. Согласно одному варианту осуществления отличная от человеческой генная последовательность константной области тяжелой цепи представляет собой эндогенную генную последовательность константной области тяжелой цепи иммуноглобулина. Согласно одному варианту осуществления локус тяжелой цепи иммуноглобулина находится в эндогенном локусе тяжелой цепи иммуноглобулина.

Согласно одному варианту осуществления замена по меньшей мере одного негистидинового кодона на гистидиновый кодон происходит в нуклеотидной последовательности, кодирующей определяющую комплементарность область (CDR). Согласно одному варианту осуществления замена по меньшей мере одного негистидинового кодона на гистидиновый кодон происходит в нуклеотидной последовательности, кодирующей CDR3. Согласно одному варианту осуществления замена представляет собой замену одного, двух, трех, четырех или более кодонов CDR3. Согласно одному аспекту единственная реаранжированная последовательность вариабельной области легкой цепи иммуноглобулина человека, находящаяся в локусе легкой цепи иммуноглобулина, происходит из генного сегмента Vκ1-39 или Vκ3-20 человека. Согласно одному варианту единственная реаранжированная вариабельная область легкой цепи иммуноглобулина человека происходит из реаранжированной генной последовательности Vκ1-39/Jκ5 или Vκ3-20/Jκ1. Согласно одному варианту осуществления единственная реаранжированная вариабельная область легкой цепи иммуноглобулина человека происходит из реаранжированной генной последовательности Vκ1-39/Jκ5, и генная последовательность Vκ1-39/Jκ5 содержит замену по меньшей мере одного негистидинового кодона на гистидиновый кодон, разработанный для экспрессии гистидина в положении, выбранном из 105, 106, 108, 111 и их комбинации. Согласно другому варианту осуществления единственная реаранжированная вариабельная область легкой цепи иммуноглобулина человека происходит из реаранжированной генной последовательности Vκ3-20/Jκ1, и генная последовательность Vκ3-20/Jκ1 содержит замену по меньшей мере одного негистидинового кодона на гистидиновый кодон, разработанный для экспрессии гистидина в положении, выбранном из 105, 106, 107, 109 и их комбинации.

Согласно одному аспекту описанное в настоящем документе отличное от человека животное содержит популяцию В-клеток в ответ на представляющий интерес антиген, которая обогащена антителами, которые проявляют снижение диссоциационного периода полувыведения (t_1/2) при кислом значении pH, по сравнению с нейтральным значением pH по меньшей мере приблизительно в 2 раза, по меньшей мере приблизительно в 3 раза, по меньшей мере приблизительно в 4 раза, по меньшей мере приблизительно в 5 раз, по меньшей мере приблизительно в 10 раз, по меньшей мере приблизительно в 15 раз, по меньшей мере приблизительно в 20 раз, по меньшей мере приблизительно в 25 раз или по меньшей мере приблизительно в 30 раз. Согласно одному варианту осуществления снижение t_1/2 при кислом значении pH, по сравнению с нейтральным значением pH, происходит приблизительно в 30 или более раз.

Согласно одному варианту осуществления животное экспрессирует антитело, содержащее вариабельный домен легкой цепи иммуноглобулина человека с заменой по меньшей мере одного негистидинового остатка на остаток гистидина в аминокислотном положении, кодируемом по меньшей мере одним кодоном, замененным в генной последовательности вариабельной области легкой цепи иммуноглобулина. Согласно одному варианту осуществления животное экспрессирует антитело, которое сохраняет замену по меньшей мере одного негистидинового остатка на остаток гистидина в экспрессированном вариабельном домене легкой цепи иммуноглобулина человека, несмотря на соматические гипермутации.

Согласно одному варианту осуществления отличное от человека животное представляет собой млекопитающее. Согласно одному варианту осуществления млекопитающее представляет собой грызуна, например, крысу или мышь. Согласно одному варианту осуществления отличное от человека животное представляет собой мышь. Таким образом, согласно одному аспекту в настоящем документе предусмотрена генетически модифицированная мышь, содержащая в своей зародышевой линии локус легкой цепи иммуноглобулина, который содержит единственную реаранжированную генную последовательность вариабельной области легкой цепи иммуноглобулина человека, содержащую последовательности сегментов V_L и J_L человека, причем единственная реаранжированная последовательность вариабельной области легкой цепи иммуноглобулина человека содержит замену по меньшей мере одного негистидинового кодона на гистидиновый кодон. Согласно одному варианту осуществления мышь не содержит функциональную нереаранжированную вариабельную область легкой цепи иммуноглобулина.

Согласно одному варианту осуществления единственная реаранжированная генная последовательность вариабельной области легкой цепи иммуноглобулина в зародышевой линии мыши функционально связана с генной последовательностью константной области легкой цепи иммуноглобулина. Согласно одному варианту осуществления генную последовательность константной области легкой цепи иммуноглобулина выбирают из генной последовательности константной области легкой цепи иммуноглобулина крысы или мыши. Согласно одному варианту осуществления генная последовательность константной области легкой цепи иммуноглобулина представляет собой последовательность мыши. Согласно одному варианту осуществления локус легкой цепи иммуноглобулина находится в эндогенном локусе легкой цепи иммуноглобулина мыши.

Согласно дополнительному варианту осуществления мышь также содержит в своей зародышевой линии локус тяжелой цепи иммуноглобулина, который содержит переаранжированную последовательность вариабельной области тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащую сегменты V_H, D_H и J_H человека, функционально связанные с генной последовательностью константной области тяжелой цепи иммуноглобулина. Согласно одному аспекту генная последовательность константной области тяжелой цепи иммуноглобулина представляет собой генную последовательность константной области тяжелой цепи крысы или мыши. Согласно одному варианту осуществления генная последовательность константной области тяжелой цепи иммуноглобулина представляет собой последовательность мыши. Согласно одному варианту осуществления локус тяжелой цепи иммуноглобулина находится в эндогенном локусе тяжелой цепи иммуноглобулина мыши.

Согласно одному аспекту мышь содержит замену по меньшей мере одного негистидинового кодона на гистидиновый кодон, причем замена происходит в нуклеотидной последовательности, кодирующей CDR. Согласно одному варианту осуществления замена происходит в ко доне CDR3, например в одном, двух, трех, четырех или более кодонах CDR3. Согласно одному варианту осуществления локус легкой цепи иммуноглобулина мыши содержит единственную реаранжированную последовательность вариабельной области легкой цепи иммуноглобулина человека, полученную из генного сегмента Vκ1-39 или Vκ3-20 человека, например единственная реаранжированная последовательность вариабельной области легкой цепи иммуноглобулина происходит из реаранжированной генной последовательности Vκ1-39/Jκ5 или Vκ3-20/Jκ1. Согласно одному варианту осуществления единственная реаранжированная последовательность вариабельной области легкой цепи иммуноглобулина происходит из реаранжированной генной последовательности Vκ1-39/Jκ5, и генная последовательность Vκ1-39/Jκ5 содержит замещение по меньшей мере одного негистидинового кодона на гистидиновый кодон, разработанное для экспрессии гистидина в положении, выбранном из 105, 106, 108, 111 и их комбинации. Согласно одному варианту осуществления такое замещение разрабатывается для замещения гистидинов в положениях 105, 106, 108 и 111. Согласно другому варианту осуществления такое замещение разрабатывается для замещения гистидинов в положениях 106, 108 и 111.

Согласно другому варианту осуществления единственная реаранжированная последовательность вариабельной области легкой цепи иммуноглобулина происходит из реаранжированной генной последовательности Vκ3-20/Jκ1, и последовательность Vκ3-20/Jκ1 содержит замещение по меньшей мере одного негистидинового кодона на гистидиновый кодон, разработанное для экспрессии гистидина в положении, выбранном из 105, 106, 107, 109 и их комбинации. Согласно одному варианту осуществления такое замещение разрабатывается для замещения гистидинов в положениях 105, 106, 107 и 109 Согласно другому варианту осуществления такое замещение разрабатывается для замены гистидинов в положениях 105, 106 и 109.

Согласно одному варианту осуществления описанная в настоящем документе мышь содержит популяцию В-клеток в ответ на представляющий интерес антиген, которая обогащена антителами, которые проявляют сниженный диссоциационный период полувыведения (t_1/2) при кислом значении pH, по сравнению с нейтральным значением pH по меньшей мере приблизительно в 2 раза, по меньшей мере приблизительно в 3 раза, по меньшей мере приблизительно в 4 раза, по меньшей мере приблизительно в 5 раз, по меньшей мере приблизительно в 10 раз, по меньшей мере приблизительно в 15 раз, по меньшей мере приблизительно в 20 раз, по меньшей мере приблизительно в 25 раз или по меньшей мере приблизительно в 30 раз. Согласно одному варианту осуществления уменьшение t_1/2 при кислом значении pH, по сравнению с нейтральным значением pH, происходит приблизительно в 30 или более раз.

Согласно одному варианту осуществления описанная в настоящем документе мышь экспрессирует популяцию антигенспецифических антител в ответ на представляющий интерес антиген, причем все антитела содержат (a) вариабельные домены легкой цепи иммуноглобулина, полученные из той же единственной реаранжированной генной последовательности вариабельной области легкой цепи человека, которая содержит замену по меньшей мере одного негистидинового кодона на гистидиновый кодон, и (b) вариабельные домены тяжелой цепи иммуноглобулина, полученные из репертуара сегментов V, D и J тяжелой цепи человека.

Также в настоящем документе предусмотрен отличный от человеческого локус, например, локус мыши, содержащий единственную реаранжированную генную последовательность вариабельной области легкой цепи иммуноглобулина человека, содержащую последовательности сегментов V_L и J_L человека, причем единственная реаранжированная генная последовательность вариабельной области легкой цепи иммуноглобулина человека содержит замену по меньшей мере одного негистидинового кодона на гистидиновый кодон. Согласно одному варианту осуществления локус содержится в зародышевой линии отличного от человека животного. Согласно одному варианту осуществления локус содержит единственную реаранжированную генную последовательность вариабельной области легкой цепи иммуноглобулина человека, полученную из генных сегментов Vκ1-39 или Vκ3-20 человека, например, полученную из реаранжированных генных последовательностей Vκ1-39/Jκ5 или Vκ3-20/Jκ1. Согласно одному варианту осуществления, при котором присутствующая в локусе единственная реаранжированная генная последовательность вариабельной области легкой цепи иммуноглобулина человека происходит из реаранжированной последовательности Vκ1-39/Jκ5, замена по меньшей мере одного негистидинового кодона на гистидиновый кодон разрабатывается для экспрессии гистидина в положении, выбранном из 105, 106, 108, 111 и их комбинации. Согласно другому варианту осуществления, при котором присутствующая в локусе единственная реаранжированная генная последовательность вариабельной области легкой цепи иммуноглобулина человека происходит из реаранжированной последовательности Vκ3-20/Jκ1, замена по меньшей мере одного негистидинового кодона на гистидиновый кодон разрабатывается для экспрессии гистидина в положении, выбранном из 105, 106, 107, 109 и их комбинации. Согласно различным вариантам осуществления описанные в настоящем документе отличные от человеческих локусы могут быть получены с использованием описанных ниже способов для получения генетически модифицированного отличного от человека животного.

Согласно еще одному аспекту в настоящем документе предусмотрен способ получения отличного от человека животного, которое содержит генетически модифицированный локус легкой цепи иммуноглобулина в своей зародышевой линии, причем способ предусматривает модификацию генома отличного от человека животного для удаления или приведения в нефункциональное состояние эндогенных сегментов V и J легкой цепи иммуноглобулина в локусе легкой цепи иммуноглобулина, и размещение в геноме единственной реанаржированной генной последовательности вариабельной области легкой цепи человека, содержащей замену по меньшей мере одного негистидинового кодона на гистидиновый кодон. Согласно одному варианту осуществления такой способ приводит к генетически модифицированному отличному от человека животному, которое содержит популяцию В-клеток, обогащенных антителами, обладающими зависимым от pH связыванием с представляющим интерес антигеном. Согласно одному варианту осуществления размещенная в геноме единственная реаранжированная последовательность вариабельной области легкой цепи иммуноглобулина человека происходит из генной последовательности Vκ1-39 или Vκ3-20, например, реаранжированной Vκ1-39/Jκ5 или Vκ3-20/Jκ1 человека. Таким образом, согласно варианту осуществления, в котором единственная реаранжированная последовательность вариабельной области легкой цепи иммуноглобулина человека происходит из реаранжированной Vκ1-39/Jκ5, замена по меньшей мере одного негистидинового кодона на гистидиновый кодон разрабатывается для экспрессии гистидина в положении, выбранном из 105, 106, 108, 111 и их комбинации. Согласно одному варианту осуществления, при котором единственная реаранжированная последовательность вариабельной области легкой цепи иммуноглобулина человека происходит из реаранжированной Vκ3-20/Jκ1, замена по меньшей мере одного негистидинового кодона на гистидиновый кодон разрабатывается для экспрессии гистидина в положении, выбранном из 105,106, 107, 109 и их комбинации.

Согласно другому аспекту в настоящем документе предусмотрен способ получения антитела, которое проявляет зависимое от pH связывание с представляющим интерес антигеном, предусматривающий (a) получение описанной в настоящем документе мыши (например, мыши, которая содержит в своей зародышевой линии локус легкой цепи иммуноглобулина, который содержит единственную реаранжированную последовательность вариабельной области легкой цепи иммуноглобулина человека, содержащую последовательности сегментов V_L и J_L, и замену по меньшей мере одного негистидинового кодона на гистидиновый кодон в своей реаранжированной последовательности вариабельной области легкой цепи), (b) иммунизацию мыши представляющим интерес антигеном и (c) отбор антитела, которое связывается с представляющим интерес антигеном с требуемой аффинностью при нейтральном значении pH, при этом демонстрируя сниженное связывание с антигеном при кислом значении pH. Согласно одному варианту осуществления способ приводит к получению антитела, которое проявляет t_1/2 при кислом значении pH и 37°C, составляющее приблизительно 2 минуты или менее. Согласно одному варианту осуществления способ приводит к получению антитела, которое проявляет снижение в диссоциационном периоде полувыведения (t_1/2) при кислом значении pH, по сравнению с нейтральным значением pH, по меньшей мере приблизительно в 2 раза, по меньшей мере приблизительно в 3 раза, по меньшей мере приблизительно в 4 раза, по меньшей мере приблизительно в 5 раз, по меньшей мере приблизительно в 10 раз, по меньшей мере приблизительно в 15 раз, по меньшей мере приблизительно в 20 раз, по меньшей мере приблизительно в 25 раз или по меньшей мере приблизительно в 30 раз.

Согласно другим аспектам в настоящем документе предусмотрены дополнительные способы получения антитела, которое проявляет зависимое от pH связывание с представляющим интерес антигеном. Один из таких способов предусматривает: (a) выбор первого антитела, которое связывается с представляющим интерес антигеном с требуемой аффинностью, (b) модификацию нуклеотидной последовательности легкой цепи иммуноглобулина первого антитела для получения замены по меньшей мере одного негистидинового кодона на гистидиновый кодон, (c) экспрессию тяжелой цепи иммуноглобулина первого антитела и модифицированной легкой цепи иммуноглобулина в клетке и (d) выбор второго антитела, экспрессируемого в клетке, которое сохраняет требуемую аффинность к представляющему интерес антигену при нейтральном значении pH и отображает сниженное связывание с представляющим интерес антигеном при кислом значении pH. Согласно одному варианту осуществления нуклеотидная последовательность легкой цепи иммуноглобулина первого антитела содержит единственную реаранжированную последовательность вариабельной области легкой цепи иммуноглобулина человека. Согласно одному варианту осуществления первое антитело получают от отличного от человека животного, например, мыши, содержащего последовательность легкой цепи иммуноглобулина, полученную из единственной реаранжированной последовательности вариабельной области легкой цепи иммуноглобулина человека, и модификацию легкой цепи иммуноглобулина выполняют в единственной реаранжированной последовательности вариабельной области иммуноглобулина человека. Согласно одному варианту осуществления первое антитело получают от отличного от человека животного, например, мыши, дополнительно содержащего последовательность тяжелой цепи иммуноглобулина, полученную из репертуара сегментов V_H, D_H и J_H человека. Согласно одному варианту осуществления единственную реаранжированную последовательность вариабельной области легкой цепи иммуноглобулина человека выбирают из генной последовательности Vκ1-39/Jκ5 и Vκ3-20/Jκ1. Согласно одному варианту осуществления, в котором единственная реаранжированная последовательность вариабельной области легкой цепи иммуноглобулина человека представляет собой Vκ1-39/Jκ5, модификацию в нуклеотидной последовательности легкой цепи иммуноглобулина первого антитела выполняют в кодоне CDR3 в положении, выбранном из 105, 106, 108, 111 и их комбинации. Согласно одному варианту осуществления, в котором единственная реаранжированная последовательность вариабельной области легкой цепи иммуноглобулина человека представляет собой Vκ3-20/Jκ1, модификацию в нуклеотидной последовательности легкой цепи иммуноглобулина первого антитела выполняют в кодоне CDR3 в положении, выбранном из 105, 106, 107, 109 и их комбинации.

Согласно одному варианту осуществления способ получения антитела, которое проявляет зависимое от pH связывание с описанным в настоящем документе представляющим интерес антигеном приводит к антителу, которое проявляет снижение в диссоциационном периоде полувыведения (t_1/2) при кислом значении pH, по сравнению с нейтральным значением pH, по меньшей мере приблизительно в 2 раза, по меньшей мере приблизительно в 3 раза, по меньшей мере приблизительно в 4 раза, по меньшей мере приблизительно в 5 раз, по меньшей мере приблизительно в 10 раз, по меньшей мере приблизительно в 15 раз, по меньшей мере приблизительно в 20 раз, по меньшей мере приблизительно в 25 раз или по меньшей мере приблизительно в 30 раз. Согласно одному варианту осуществления способ получения антител приводит к антителу, которое проявляет t_1/2 при кислом значении pH и 37°C, равное приблизительно 2 минуты или менее.

Описанные в настоящем документе любые из вариантов осуществления и аспектов могут быть использованы в сочетании друг с другом, если не указано иное или не очевидно из контекста. Другие варианты осуществления будут очевидны специалистам в настоящей области техники при рассмотрении последующего описания.

Краткое описание графических материалов

На фиг. 1 показано аминокислотное выравнивание полученных из Vκ1-39 легких цепей человека из различных антигенспецифических антител (антитела А-К). Гистидиновые (Н) остатки, расположенные в каждой последовательности легкой цепи, выделены жирным шрифтом. Различные области легкой цепи (каркасная область и CDR) указаны выше выравнивания.

На фиг.2 показаны комбинации и расположение остатков гистидина, встроенных в области CDR3 человека полученных из Vκ1-39 легких цепей с помощью мутагенеза. Включены соответствующие последовательности нуклеиновых кислот. Гистидиновые остатки введены путем мутагенеза, и соответствующие остатки нуклеиновых кислот выделены жирным шрифтом. Аминокислотные позиции (105, 106 и т.д.) основаны на уникальной нумерации, описанной в Lefranc et al. (2003) Dev. Comp. Immunol. 27:55-77, а также ее можно найти на www.imgt.org.

На фиг. 3 показан уровень экспрессии антитела в нг/мл, обнаруженный в супернатантах клеток СНО, трансфицированных с нуклеиновыми кислотами, кодирующими пять (1-5) различных тяжелых цепей и полученными из Vκ1-39 легкими цепями, содержащими остатки гистидина, встроенные в указанных местах (смотрите ось Y) в CDR3.

Фиг. 4 представляет собой вестерн-блот, показывающий экспрессию отдельных антигенспецифических антител человека, содержащих легкие цепи со встроенным гистидином, в клеточных супернатантах СНО.

На фиг. 5А-5Е показаны кинетики связывания для определенных тяжелых цепей (1-5) из антигенспецифических антител, спаренных с различными легкими цепями со встроенным гистидином при нейтральном (7,4) и кислом (5,75) значениях pH. Показаны различные кинетические параметры, включающие в себя k_a, k_d, K_D и t_1/2. NB = нет связывания.

На фиг. 6 показаны кинетические параметры (K_D и t_1/2) для антител, содержащих исходную универсальную легкую цепь или универсальную легкую цепь с модификациями гистидина, спаренную с указанными тяжелыми цепями (2, 3 и 6). Гистидиновые замены приводят к сильной зависимости от pH в нескольких антителах. Гистидиновые замены были сделаны в CDR3, чтобы преобразовать последовательность ₁₀₅QQSYSTP₁₁₁ (SEQ ID NO: 3) в ₁₀₅HHSYSTH₁₁₁ (SEQ ID NO: 5). Обратите внимание, что NB = не обнаружено связывания (K_D>10 мкмоль).

На фиг. 7 показаны последовательность и свойства (% содержания GC, N, % ошибочно спаренных оснований, Tm) выбранных праймеров мутагенеза, используемых для встраивания остатков гистидина в CDR3 реаранжированной последовательности легкой цепи Vκ1-39/Jκ5 человека. SEQ ID NO для этих праймеров, используемые в списке последовательностей, включены в приведенной ниже таблице. F = прямой праймер, R = обратный праймер.

На фиг. 8А-8В показана общая стратегия конструирования нацеливающих векторов для встраивания остатков гистидина в реаранжированную последовательность вариабельной области легкой цепи человека, полученной из вариабельной области Vκ1-39/Jκ5 для получения генетически модифицированной мыши, которая экспрессирует антитела, содержащие модифицированную легкую цепь человека. На фиг. 8C-8D показано введение нацеливающего вектора для замен ULC-Н105/106/108/111 в ES клетки и получения с ними гетерозиготных мышей; в то время как на фиг. 8E-8F показано введение нацеливающего вектора для замен ULC-Н106/108/111 в клетки ES и получения с ними гетерозиготных мышей. Диаграммы представлены не в масштабе. Если не указано иное, заполненные формы и сплошные линии представляют последовательность мыши, пустые формы и двойные линии представляют последовательности человека.

На фиг. 9 показаны титры антисыворотки против иммуногена от мышей, гетерозиготных по гистидин-универсальной легкой цепи (HULC) (с 4 заменами гистидина - HULC 1927 мыши; с 3 заменами гистидина - HULC 1930 мыши) и животных дикого типа при вторичном заборе крови.

Фиг. 10 представляет собой сравнение количества всех антигенположительных клонов и количества антигенположительных клонов, проявляющих чувствительное к pH связывание антигенов, полученные из гибридомных слияний из гетерозиготных HULC (1927 против 1930) и мышей дикого типа. На фигуре приведены данные для двух мышей для каждого типа мыши (ʺмышь 1ʺ и ʺмышь 2ʺ).

На фиг. 11А-11С показаны сенсограммы экспериментов связывания с помощью поверхностного плазмонного резонанса, в которых моноклональным антителам (АА, ВВ, СС, DD, НН, GG, NN и OO) или от гетерозиготных HULC, или мышей дикого типа было позволено ассоциировать с иммуногеном при нейтральном значении pH (pH 7,4) с последующим переходом в буфер с pH 7,4 или 6,0 на стадии диссоциации. Отдельные линии в каждом графике отражают реакции связывания при различных концентрациях соответствующих антител. Все эксперименты проводили при 25°C. Значения диссоциационного периода полувыведения (t_1/2) отмечены над соответствующими сенсограммами, и кратность изменения t_1/2 представлена справа от каждой сенсограммы. Антитела АА, ВВ, СС, DD, НН и GG были от гетерозиготных HULC 1927 мышей с использованием His-замещенной легкой цепи, NN - от гетерозиготной HULC 1927 мыши с использованием легкой цепи WT, и OO - от мыши WT (смотрите таблицу 4 для уточнения).

На фиг. 12 показаны положения остатков гистидина, встроенных в область CDR3 человека полученных из Vκ3-20 легких цепей с помощью мутагенеза. Гистидиновые остатки вводили путем мутагенеза, и соответствующие остатки нуклеиновых кислот выделены жирным шрифтом. Аминокислотные позиции (105, 106 и т.д.) основаны на уникальной нумерации, описанной в Lefranc et al. (2003) Dev. Comp. Immunol. 27:55-77, а также ее можно найти на www.imgt.org.

На фиг. 13 показаны последовательность и свойства (% содержания GC, N, % ошибочно спаренных оснований, Tm) выбранных праймеров мутагенеза, используемых для встраивания остатков гистидина в CDR3 реаранжированной последовательности легкой цепи Vκ3-20/Jκ1 человека. SEQ ID NO для этих праймеров, используемые в списке последовательностей, включены в приведенной ниже таблице. F = прямой праймер, R = обратный праймер.

На фиг. 14А-14В показана общая стратегия конструирования нацеливающих векторов для встраивания остатков гистидина в реаранжированную последовательность вариабельной области легкой цепи человека, полученной из вариабельной области легкой цепи Vκ3-20/Jκ1 для получения генетически модифицированной мыши, которая экспрессирует антитела, содержащие модифицированную легкую цепь человека. На фиг. 14С показано введение нацеливающего вектора для замен ULC-Q105H/Q106H/Y107H/S109H в ES клетки и получения с ними гетерозиготных мышей; в то время как на фиг. 14D показано введение нацеливающего вектора для замен ULC-Q105H/Q106H/S109H в клетки ES и получения с ними гетерозиготных мышей. Диаграммы представлены не в масштабе. Если не указано иное, заполненные формы и сплошные линии представляют последовательность мыши, пустые формы и двойные линии представляют последовательности человека.

Подробное описание настоящего изобретения

Определения

В настоящем изобретении предусмотрены генетически модифицированные отличные от человека животные (например, мыши, крысы, кролики, хомяки и т.д.), которые содержат в своем геноме, например, в своей зародышевой линии, нуклеотидную послед