Мультивалентная вакцина против рака молочной железы

Мультивалентная вакцина против рака молочной железы

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

По настоящей заявке в соответствии с 35 U.S.C. §119 испрашивается приоритет временной заявки США, имеющей серийный номер No. 61/624680, поданной 16 апреля 2012 года, полное содержание которой включено в настоящее описание в качестве ссылки.

ВКЛЮЧЕНИЕ В КАЧЕСТВЕ ССЫЛКИ ПОДАННОГО В ЭЛЕКТРОННОЙ ФОРМЕ МАТЕРИАЛА

Приведено в качестве ссылки полное содержание машиночитаемого списка последовательностей, поданного одновременно с настоящей заявкой и обозначенного следующим образом: один ASCII (текстовый) файл 6222 байт, названный «PCT seq list_ST25.txt», созданный 15 апреля 2013 года.

ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Рак молочной железы является второй наиболее распространенной причиной смерти от рака среди женщин. В настоящее время предотвращение рака молочной железы преимущественно включает в себя снижение модифицируемых факторов риска, включая раннюю детекцию посредством медицинского осмотра и маммограмм, избегание не являющейся необходимой гормональной терапии после менопаузы, снижение употребления алкоголя, снижение массы тела, увеличение физической активности и генетическое тестирование мутаций генов, определяющих чувствительность к раку молочной железы типа 1 и типа 2 (BRCA1 и BRCA2 соответственно). Более агрессивные способы для подверженных высокому риску пациентов включают в себя химиопрофилактику с помощью тамоксифена, ралоксифена и ингибиторов ароматазы, так же, как профилактическую двустороннюю мастэктомию и оофорэктомию.

Несмотря на значительный риск для здоровья рака молочной железы и недостаточность профилактических мер, иммунотерапия рака молочной железы не разработана в качестве неотъемлемой части стандарта лечения. Для опухолеспецифических антигенов в качестве мишеней для противораковой вакцинации долгое время получали менее чем оптимальные результаты. Общей целью противораковой вакцинации традиционно являлась бустер-стимуляция латентного иммунного ответа на опухолеспецифические антигены. Способы включали в себя способы на основе клеток, включающие в себя иммунизацию цельными аутологичными или аллогенными опухолями, так же, как способы на основе антигенов, включающие в себя иммунизацию белками или пептидами со сверхэкспрессией в опухолях и пониженной экспрессией в нормальных тканях. Рецептор 2 эпидермального фактора роста человека (HER2) и муцин (MUC1) являются преобладающими антигенами, используемыми в исследованиях вакцин против рака молочной железы человека. Хотя вакцинации с использованием этих антигенов могут показывать эффекты уменьшения опухоли, ни один антиген не обеспечивает специфичности для какой-либо ткани или опухоли, поскольку оба экспрессируются во множестве нормальных тканей и опухолей. Таким образом, отсутствие наследственной тканеспецифичности нацеленного на HER2 и MUC1 иммунитета может в конечном счете приводить к значительным системным аутоиммунным последствиям при проявлении сильного иммунного ответа.

Полноценная аутоиммунная атака, достаточная для индукции направленного поражения молочной железы, может обеспечивать эффективную терапию против развившихся злокачественных новообразований молочной железы, если антиген-мишень конститутивно экспрессируется в опухолях молочной железы. Более того, если выбранный антиген-мишень экспрессируется в нормальной ткани молочной железы в условиях, которые можно легко устранить, тогда вакцина может обеспечивать безопасную и эффективную защиту против развития рака молочной железы.

Альфа-лактальбумин (α-лактальбумин) человека представляет собой экспрессируемый в определенных условиях, специфический для молочной железы связанный с дифференцировкой белок, обнаруженный в большинстве злокачественных новообразований молочной железы. Экспрессия α-лактальбумина, как неотъемлемого связанного с дифференцировкой белка, вовлеченного в регуляцию биосинтеза лактозы, является специфической для молочной железы, и его экспрессия и синтез зависят от условий лактации. α-Лактальбумин человека также конститутивно экспрессируется в большинстве опухолей молочной железы, является специфическим для молочной железы и является достаточно иммуногенным для индукции эффективного провоспалительного иммунного ответа. Таким образом, иммунизация против α-лактальбумина человека предлагает безопасный и эффективный способ вакцинации для предотвращения рака молочной железы.

Обширные исследования авторов настоящего изобретения с использованием иммунизации α-лактальбумином в моделях опухолей на мышах показали его значительный потенциал для ингибирования роста опухолей молочной железы, особенно при введении в профилактических условиях или на ранней стадии в ходе роста опухоли молочной железы. На основании этих исследований с α-лактальбумином заявители разработали систему принципов для отбора иммунотерапевтических мишеней для вакцинации и предотвращения рака молочной железы, а именно: 1) антиген должен является конститутивно сверхэкспрессированным в большинстве опухолей-мишеней; 2) экспрессия антигена-мишени в нормальной ткани должна являться зависимой от условий; и 3) условие, определяющее экспрессию антигена-мишени в нормальной ткани, должно являться легко устранимым. При этих необходимых условиях связанные с лактацией белки, характеризующиеся экспрессией, ограниченной функциональным состоянием молочной железы и зависимой от него, выделяются в качестве идеальных мишеней-кандидатов для профилактической вакцинации против рака молочной железы.

На основании значительного противоопухолевого ответа, достигнутого посредством вакцинации α-лактальбумином в отсутствие побочного воспаления нормальных тканей, заявители заключают, что мультивалентная вакцина, содержащая два или более связанных с лактацией белка-кандидата, может существенно улучшать эффективность вакцинации против опухолей молочной железы. Улучшения противоопухолевого эффекта с использованием способа мультивалентной вакцинации можно достигать на двух уровнях: 1) посредством увеличения силы иммунного ответа против возникающей опухоли благодаря активации большего репертуара T-клеток, содержащего множество линий T-клеток, узнающих более одной опухолеспецифической мишени; 2) посредством покрытия более широкого диапазона опухолей, включая опухоли, не экспрессирующие белок, на который нацелен способ моновалентной вакцинации, такой как α-лактальбумин. Кроме того, мультивалентная вакцина может обладать потенциалом для нацеливания на опухоли с утратой или понижающей регуляцией экспрессии одного или нескольких белков или приобретенной попеременной экспрессией белков из-за дисрегуляции транскрипции в ходе их постепенного изменения от нормы до диспластической стадии, до стадии карциномы in situ, до инвазивной и до метастазирующей стадий постепенного изменения опухоли молочной железы. Иными словами, способ мультивалентной вакцины может оказывать большее направленное на множество мишеней иммунологическое давление как на опухоли на ранних стадиях, так и на развивающиеся опухоли. Он может таким образом покрывать большее разнообразие опухолей и увеличивать эффективность профилактики, так же, как обеспечивать более эффективную терапию посредством снижения вероятности избегания опухолью и возникновения устойчивости к вакцине.

КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Заявители идентифицировали 4 зависимых от лактации белка-кандидата, а именно α-лактальбумин, αS1-казеин, β-казеин и κ-казеин. Каждый из белков характеризуется сверхэкспрессией в опухолях молочной железы мыши 4T1 и во многих опухолях молочной железы человека, так же, как изолированной экспрессией, ограниченной только лактирующей мышью и тканями молочной железы человека. В соответствии с одним из вариантов осуществления каждый из этих белков используют для индукции иммунной защиты против развития рака молочной железы в отсутствие какого-либо побочного повреждения нормальной ткани молочной железы, так же, как других нормальных тканей, включая головной мозг, сердце, легкое, почку, печень, селезенку, желудок, кишечник, матку, яичники и мочевой пузырь.

В соответствии с одним из вариантов осуществления, изобретение относится к мультивалентной антигенной композиции, содержащей два или более иммуногенных полипептида человека, выбранных из связанных с лактацией белков человека. В одном варианте осуществления связанные с лактацией полипептиды выбраны из группы, состоящей из полипептида, содержащего фрагмент из 15 аминокислот α-лактальбумина (SEQ ID NO: 1), полипептида, содержащего фрагмент из 15 аминокислот αS1-казеина (SEQ ID NO: 2), полипептида, содержащего фрагмент из 15 аминокислот β-казеина (SEQ ID NO: 3), полипептида, содержащего фрагмент из 15 аминокислот κ-казеина (SEQ ID NO: 4), полипептида длиной по меньшей мере 20 аминокислот, обладающего 90% идентичностью последовательности с аминокислотной последовательностью, содержащейся в SEQ ID NO: 1, полипептида длиной по меньшей мере 20 аминокислот, обладающего 90% идентичностью последовательности с аминокислотной последовательностью, содержащейся в SEQ ID NO: 2, полипептида длиной по меньшей мере 20 аминокислот, обладающего 90% идентичностью последовательности с аминокислотной последовательностью, содержащейся в SEQ ID NO: 3, и полипептида длиной по меньшей мере 20 аминокислот, обладающего 90% идентичностью последовательности с аминокислотной последовательностью, содержащейся в SEQ ID NO: 4. Мультивалентная антигенная композиция может, как правило, дополнительно содержать фармацевтически приемлемый носитель, пригодный для введения пациенту-человеку. В одном варианте осуществления мультивалентная антигенная композиция может содержать три различных связанных с лактацией полипептида человека и в следующем варианте осуществления мультивалентная антигенная композиция может содержать четыре различных связанных с лактацией полипептида человека.

В одном варианте осуществления изобретение относится к мультивалентной антигенной композиции, содержащей:

полипептид, содержащий фрагмент из 15 аминокислот α-лактальбумина (SEQ ID NO: 1), или полипептид длиной по меньшей мере 20 аминокислот, обладающий 90% идентичностью последовательности с аминокислотной последовательностью, содержащейся в SEQ ID NO: 1;

полипептид, содержащий фрагмент из 15 аминокислот αS1-казеина (SEQ ID NO: 2), или полипептид длиной по меньшей мере 20 аминокислот, обладающий 90% идентичностью последовательности с аминокислотной последовательностью, содержащейся в SEQ ID NO: 2;

полипептид, содержащий фрагмент из 15 аминокислот β-казеина (SEQ ID NO: 3), или полипептид длиной по меньшей мере 20 аминокислот, обладающий 90% идентичностью последовательности с аминокислотной последовательностью, содержащейся в SEQ ID NO: 3; и

полипептид, содержащий фрагмент из 15 аминокислот κ-казеина (SEQ ID NO: 4), или полипептид длиной по меньшей мере 20 аминокислот, обладающий 90% идентичностью последовательности с аминокислотной последовательностью, содержащейся в SEQ ID NO: 4.

В одном варианте осуществления изобретение относится к способу индукции специфического для связанного с лактацией белка иммунного ответа у пациента. Способ включает введение эффективного количества композиции, содержащей связанный с лактацией пептид, описанной в настоящем документе, пациенту. Композицию можно вводить либо профилактически до детекции злокачественной опухоли (например, в ответ на генетическое тестирование мутаций генов, определяющих чувствительность к раку молочной железы типа 1 и типа 2 (BRCA1 и BRCA2 соответственно)), или композицию можно вводить терапевтически (либо отдельно, либо совместно с другими видами противораковой терапии). В одном варианте осуществления изобретение относится к способу активации T-клеток человека, способных индуцировать специфический для ткани молочной железы воспалительный ответ у пациента-человека. Способ включает стадию контакта T-клеток с композицией, содержащей выделенные дендритные клетки человека, предварительно подвергнутые воздействию композиции, содержащей связанный с лактацией полипептид, описанной в настоящем документе.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Фиг. 1A-1C. Показана иммуногенность рекомбинантного α-лактальбумина мыши. Клетки лимфатических узлов оценивали через 10 суток после иммунизации самок мышей SWXJ α-лактальбумином, и показаны вторичные ответы, которые являются a) антигенспецифическими к рекомбинантному α-лактальбумину мыши, но не к рекомбинантному кохлину человека в диапазоне дозирования (см. фиг. 1A); b) вызванными у очищенных CD4+ и CD8+ T-клеток в ответ на 25 мг/мл α-лактальбумина (см. фиг. 1B); и c) соответствующими провоспалительному профилю цитокинов типа 1 с высокой продукцией IFNγ и IL-2 и низкой продукцией цитокинов типа 2, IL-4, IL-5 и лактальбумина (см. фиг. 1С). Все планки погрешностей показывают ±SEM.

Фиг. 2. Показан анализ ткани молочной железы в ходе аутоиммунно индуцированного повреждения молочной железы. Анализ ОТ-ПЦР с детекцией в реальном времени ткани лактирующей молочной железы показывает значимо повышенные уровни экспрессии IFNγ (p=0,001), но не IL-10 (p>0,10). Все планки погрешностей показывают ±SEM. Каждая * обозначает статистически значимое различие.

Фиг. 3A-3B. Показано, что вакцинация α-лактальбумином профилактически ингибирует рост опухолей молочной железы. Рост аутохтонных опухолей молочной железы является значимо ингибированным у мышей MMTV-neu в возрасте десяти месяцев, иммунизированных α-лактальбумином в возрасте восьми недель (p=0,0004; фиг. 3А). Рост трансплантированных опухолей 4T1 является значимо ингибированным после профилактической иммунизации α-лактальбумином за 13 суток до инокуляции опухоли (p=0,0006; Фиг. 3B). Все планки погрешностей показывают ±SEM. Каждая * обозначает статистически значимое различие.

Фиг. 4A-4C. Показано, что вакцинация α-лактальбумином лечит прижившиеся растущие трансплантированные опухоли молочной железы. Значимое ингибирование роста опухоли 4T1 происходит после иммунизации α-лактальбумином через 5 суток после инокуляции опухоли (p<0,01; фиг. 4A) и через 13 суток после инокуляции опухоли (p<0,01; фиг. 4B), но не через 21 сутки после инокуляции опухоли (p>0,10; 20 фиг. 4C). Все планки погрешностей показывают ±SEM. Каждая * обозначает статистически значимое различие.

Фиг. 5. Показано, что вакцинация α-лактальбумином лечит развившиеся растущие аутохтонные опухоли молочной железы. Значимое ингибирование (p<0,0006) роста необычайно агрессивных аутохтонных опухолей происходит после иммунизации α-лактальбумином трансгенных мышей MMTV-PyVT в возрасте 6 недель. Из-за массивного многоочагового роста опухоли, опухоли у мышей MMTV-PyVT являются пригодными для измерения только в одном направлении. Наибольшие измерения всех десяти опухолей MMTV-PyVT складывают для расчета общей опухолевой нагрузки в мм на каждые сутки.

Фиг. 6A-6C. Показано, что специфические для α-лактальбумина T-клетки индуцируют воспаление и цитотоксичность для опухоли. Для вторичных ответов на α-лактальбумин, как измерено посредством ELISA, показан провоспалительный фенотип типа-1, включающий в себя высокий уровень продукции IFNγ по сравнению с IL-5 и IL-10 (фиг. 6A). Анализ ELISPOT TIL показывает, что скорее CD4+, а не CD8+ T-клетки продуцируют IFNγ (фиг. 6B). Гибель культивированных клеток опухолей 4T1 ингибируют посредством обработки культивированных примированных α-лактальбумином LNC антителами, специфическими для CD8 мыши, что указывает на то, что CD8+ T-клетки опосредуют специфическую для 4T1 цитотоксичность (фиг. 6C).

Фиг. 7A-7D. Показано, что ингибирование роста опухоли посредством вакцинации α-лактальбумином опосредовано T-клетками. Перенос примированных α-лактальбумином LNC наивным мышам-реципиентам BALB/c в те же сутки, что и инокуляция опухолей 4T1, приводит к a) значимому ингибированию роста опухоли (p<0,0001; фиг. 7A); b) к значимому снижению встречаемости несущих опухоль мышей (p<0,03; фиг. 7B); и c) к значимому снижению конечной массы опухоли (p<0,0008; фиг. 7C). По сравнению с примированными овальбумином (OVA) LNC, значимое ингибирование роста опухоли происходит у наивных мышей после введения либо CD4+ T-клеток (p=0,002; фиг. 7D, левая панель), либо CD8+ T-клеток (p=0,003; фиг. 7D, правая панель), обогащенных отделением на магнитных бусинах от примированных α-лактальбумином LNC. Все планки погрешностей показывают ±SEM. Каждая * обозначает статистически значимое различие.

Фиг. 8. Показано примирование in vitro T-клеток из мононуклеарных клеток периферической крови (PBMC) человека с использованием полученных из крови дендритных клеток (DC) для тестирования доступности репертуара узнающих α-лактальбумин человека T-клеток. Примирование PMBC α-лактальбумином приводит к увеличенной частоте продуцирующих IFNγ T-клеток при последующем представлении α-лактальбумина (вторичный ответ).

Фиг. 9. Дифференциальная экспрессия связанных с лактацией белков в линиях клеток рака молочной железы человека. РНК, выделенную из линий клеток рака молочной железы человека, клеток SK-BR-3 и HCC1937 (ATCC, Manassas, VA), подвергали амплификации ОТ-ПЦР в течение 38 циклов с геноспецифическими праймерами. Для клеток трижды отрицательного рака молочной железы HCC1937, полученных из первичного злокачественного новообразования молочной железы, показана амплификация всех белков, за исключением β-казеина, в то время как HER2-положительные клетки рака молочной железы SK-BR-3, полученные из метастазирующей опухоли молочной железы, не экспрессировали α-лактальбумин, но экспрессировали все другие связанные с лактацией белки. Экспрессия гена домашнего хозяйства β-актина происходила во всех линиях клеток, но не после амплификации контрольного вектора авторов настоящего изобретения, разработанного для экспрессии только α-лактальбумина человека.

Фиг. 10A-10B. Иммуногенность очищенных связанных с лактацией белков у самок мышей BALB/cJ. Элюаты белка с аффинных колонок Ni-NTA подвергали электрофорезу в 10% полиакриламидном геле с Трис-HCl (см. фиг. 10A). В окрашенном Кумасси геле показаны полосы очищенного связанного с лактацией белка предсказанного размера в дорожках слева от каждого маркера белка kaleidoscope (см. Фиг. 10B). Через десять суток после иммунизации самок мышей BALB/cJ (n=3/группу) 100 мкг рекомбинантного α-лактальбумина мыши или рекомбинантного α-казеина мыши в CFA, дренирующие LNC тестировали по вторичным пролиферативным ответам (поглощению ³H-тимидина). Оба белка являлись высоко иммуногенными с антигенспецифическими вторичными ответами на α-лактальбумин (левая панель) и α-казеин (правая панель) и без ответов на контрольные антигены, OVA и лизоцим куриного яйца, где последний обладает значительной гомологией с α-лактальбумином.

Фиг. 11A-11B. Иммуногенное разнообразие очищенных связанных с лактацией белков в различных линиях мышей. Нормальных самок мышей из линий, представляющих разнообразные варианты гаплотипов (n=3/линию), иммунизировали 100 мкг рекомбинантного α-лактальбумина мыши (см. фиг. 11A) или рекомбинантного α-казеина мыши в CFA (см. фиг. 11B). Через десять суток дренирующие LNC тестировали по вторичным пролиферативным ответам (поглощению ³H-тимидина) на примирующий иммуноген. κ-казеин являлся более иммуногенным, чем α-лактальбумин у мышей BALB/cJ, все еще не вызывая ответа у мышей RIIIS/J, C3H/HeJ и FVB.

Фиг. 12A-12B. Повышенной экспрессии гена IFNg не возникало в каких-либо исследованных нелимфоидных тканях от нормальных, здоровых, нелактирующих мышей, иммунизированных прекратившими экспрессию связанными с лактацией белками. Через шесть недель после иммунизации α-лактальбумином (см. фиг. 12A) или κ-казеином (см. фиг. 12B) тотальную РНК от нормальных нелактирующих мышей анализировали по экспрессии гена IFNg посредством общепринятой ОТ-ПЦР. Экспрессия гена IFNγ не детектирована в каких-либо нелимфоидных тканях.

Фиг. 13. Эффективность мультивалентной вакцинации против связанных с лактацией белков для регуляции рака молочной железы. При сравнении с контрольной вакцинацией полным адъювантом Фрейнда (CFA), рост трансплантированных опухолей молочной железы 4T1 у самок мышей BALB/c являлся значимо ингибированным (P<0,01 во всех случаях) после иммунизации α-лактальбумином или α-казеином в качестве индивидуальных иммуногенов или после совместной иммунизации, как α-лактальбумином, так и α-казеином. Все вакцинации происходили за сутки инокуляции опухоли. Все планки погрешностей показывают ±SE.

Фиг. 14. Дифференциальная экспрессия связанных с лактацией белков при раке молочной железы человека. РНК, выделенную из линий клеток рака молочной железы человека, клеток SK-BR-3 и HCC1937 (ATCC, Manassas, VA), подвергали амплификации ОТ-ПЦР в течение 38 циклов с геноспецифическими праймерами. Для линии клеток трижды отрицательного рака молочной железы, полученных из первичного злокачественного новообразования молочной железы, показана амплификация как α-лактальбумина, так и α-казеина, в то время как HER2-положительные клетки рака молочной железы SK-BR-3, полученные из метастазирующей опухоли молочной железы, экспрессировали α-казеин, но не экспрессировали α-лактальбумин. Экспрессия гена домашнего хозяйства β-актина происходила в обеих линиях клеток, но не после амплификации контрольного вектора, разработанного для экспрессии только α-лактальбумина человека.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ

ОПРЕДЕЛЕНИЯ

При описании и заявлении в формуле изобретения следующую терминологию используют в соответствии с определениями, указанными ниже.

Как применяют в настоящем документе, термин «фармацевтически приемлемый носитель» включает в себя любой из общепринятых фармацевтических носителей, таких как раствор фосфатно-солевого буфера, вода, эмульсии, такие как эмульсия масло/вода или вода/масло, и различные типы увлажняющих средств. Термин включает в себя также любое из средств, одобренных регуляторным органом Федерального правительства США или перечисленных в Фармакопее США для использования у животных, включая человека.

Как применяют в настоящем документе, термин «лечение» включает в себя профилактику конкретного нарушения или состояния, или облегчение симптомов, связанных с конкретным нарушением или состоянием, и/или предотвращение или исключение указанных симптомов.

Как применяют в настоящем документе, «эффективное» количество или «терапевтически эффективное количество» лекарственного средства относится к нетоксичному, но достаточному количеству лекарственного средства для обеспечения желаемого эффекта. Например, одним из желаемых эффектов может являться предотвращение или лечение рака молочной железы. Количество, которое является «эффективным», может меняться от субъекта к субъекту, в зависимости от возраста и общего состояния здоровья индивидуума, способа введения и т.п. Таким образом, не всегда возможно указать точное «эффективное количество». Однако подходящее «эффективное» количество в любом индивидуальном случае может определить специалист в данной области с использованием общепринятых экспериментов.

Термин «парентеральный» обозначает не через пищеварительный тракт, но посредством некоторых других способов, таких как интраназальный, ингаляция, подкожный, внутримышечный, интраспинальный или внутривенный.

Как применяют в настоящем документе, «линкер» представляет собой связь, молекулу или группу молекул, связывающих два отдельных соединения друг с другом. Линкеры могут обеспечивать оптимальное расположение в пространстве двух соединений или могут дополнительно обеспечивать лабильную связь, позволяющую отделение двух соединений друг от друга. Лабильные связи включают в себя фотоотщепляемые группы, кислотолабильные группы, щелочно-лабильные группы и отщепляемые ферментами группы.

Как применяют в настоящем документе, термин «пациент» без дополнительного указания предназначен для включения любых теплокровных позвоночных домашних животных (включая, например, но без ограничения, скот, лошадей, кошек, собак и других домашних животных) и человека.

ВАРИАНТЫ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ

В соответствии с одним из вариантов осуществления представлена мультивалентная антигенная композиция для индукции иммунного ответа у пациента. В одном варианте осуществления мультивалентную антигенную композицию вводят профилактически для предотвращения рака молочной железы. В одном иллюстративном аспекте композицию вводят нелактирующим женщинам, подверженным риску развития рака молочной железы. Альтернативно в одном варианте осуществления композицию вводят, необязательно, в сочетании с другими известными видами противораковой терапии для лечения рака молочной железы. В соответствии с одним из вариантов осуществления мультивалентная антигенная композиция содержит два или более связанных с лактацией белка или их антигенных фрагмента, включая, например, α-лактальбумин, αS1-казеин, β-казеин или κ-казеин.

В одном варианте осуществления описана мультивалентная вакцина против рака молочной железы человека, содержащая два или более иммуногенных связанных с лактацией полипептида. В одном варианте осуществления один из иммуногенных связанных с лактацией полипептидов содержит α-лактальбумин человека в соответствии с аминокислотной последовательностью. В одном варианте осуществления α-лактальбумин содержит последовательность:

KQFTKCELSQ LLKDIDGYGG IALPELICTM FHTSGYDTQA IVENNESTEY GLFQISNKLW CKSSQVPQSR NICDISCDKF LDDDITDDIM CAKKILDIKG IDYWLAHKAL CTEKLEQWLC EKL (SEQ ID NO: 1).

В соответствии с одним из вариантов осуществления представлена мультивалентная антигенная композиция, содержащая 2, 3 или 4 антигенных связанных с лактацией полипептидов. В одном варианте осуществления мультивалентная антигенная композиция содержит два или более пептида, выбранных из α-лактальбумина (SEQ ID NO: 1), αS1-казеина, β-казеина или κ-казеина человека, где последовательность αS1-казеина представляет собой:

RPKLP LRYPERLQNP SESSEPIPLE SREEYMNGMN RQRNILREKQ TDEIKDTRNE STQNCVVAEP EKMESSISSS SEEMSLSKCA EQFCRLNEYN 20 QLQLQAAHAQEQIRRMNENS HVQVPFQQLN QLAAYPYAVW YYPQIMQYVP FPPFSDISNP TAHENYEKNNVMLQW (SEQ ID NO: 2);

последовательность β-казеина представляет собой:

ALALARETIE SLSSSEESIT EYKQKVEKVK HEDQQQGEDE HQDKIYPSFQ PQPLIYPFVE PIPYGFLPQN ILPLAQPAVV LPVPQPEIME VPKAKDTVYT KGRVMPVLKS PTIPFFDPQI PKLTDLENLH LPLPLLQPLM QQVPQPIPQT LALPPQPLWS VPQPKVLPIP QQVVPYPQRA VPVQALLLNQ ELLLNPTHQI YPVTQPLAPV HNPISV (SEQ ID NO: 3); и

последовательность κ-казеина представляет собой:

EVQNQKQPAC HENDERPFYQ KTAPYVPMYY VPNSYPYYGT NLYQRRPAIA INNPYVPRTY YANPAVVRPH AQIPQRQYLP NSHPPTVVRR PNLHPSFIAI PPKKIQDKII IPTINTIATV EPTPAPATEP TVDSVVTPEA FSESIITSTP ETTTVAVTPP ТА (SEQ ID NO: 4).

В одном варианте осуществления мультивалентная антигенная композиция содержит полипептид из SEQ ID NO: 1 или полипептид, отличающийся от SEQ ID NO: 1 модификацией одной аминокислоты, и два или более полипептида, выбранных из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 и SEQ ID NO: 4, или полипептид, отличающийся от SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 и SEQ ID NO: 4 модификацией одной аминокислоты, где модификация аминокислоты представляет собой замену, делецию или вставку аминокислоты, или посттрансляционную модификацию аминокислоты. В одном варианте осуществления модификация одной аминокислоты представляет собой консервативную аминокислотную замену.

В одном варианте осуществления мультивалентная антигенная композиция содержит 2, 3 или 4 полипептида, выбранные из группы, состоящей из полипептида, содержащего фрагмент из 15 аминокислот α-лактальбумина (SEQ ID NO: 1), полипептида, содержащего фрагмент из 15 аминокислот αS1-казеина (SEQ ID NO: 2), полипептида, содержащего фрагмент из 15 аминокислот β-казеина (SEQ ID NO: 3), полипептида, содержащего фрагмент из 15 аминокислот κ-казеина (SEQ ID NO: 4), полипептида длиной по меньшей мере 20 аминокислот, обладающего 90% идентичностью последовательности с аминокислотной последовательностью, содержащейся в SEQ ID NO: 1, полипептида длиной по меньшей мере 20 аминокислот, обладающего 90% идентичностью последовательности с аминокислотной последовательностью, содержащейся в SEQ ID NO: 2, полипептида длиной по меньшей мере 20 аминокислот, обладающего 90% идентичностью последовательности с аминокислотной последовательностью, содержащейся в SEQ ID NO: 3, и полипептида длиной по меньшей мере 20 аминокислот, обладающего 90% идентичностью последовательности с аминокислотной последовательностью, содержащейся в SEQ ID NO: 4. В одном варианте осуществления антигенная композиция дополнительно содержит фармацевтически приемлемый носитель.

В одном варианте осуществления антигенная композиция содержит полипептид, содержащий фрагмент из 8, 10, 15 или 20 аминокислот α-лактальбумина (SEQ ID NO: 1), или полипептид длиной по меньшей мере 20 или 40 аминокислот, обладающий 85%, 90%, 95% или 98% идентичностью последовательности с аминокислотной последовательностью, содержащейся в SEQ ID NO: 1, и полипептид, содержащий фрагмент из 8, 10, 15 или 20 аминокислот αS1-казеина (SEQ ID NO: 2), или полипептид длиной по меньшей мере 20 или 40 аминокислот, обладающий 85%, 90%, 95% или 98% идентичностью последовательности с аминокислотной последовательностью, содержащейся в SEQ ID NO: 2.

В одном варианте осуществления антигенная композиция содержит

полипептид, содержащий фрагмент из 8, 10, 15 или 20 аминокислот α-лактальбумина (SEQ ID NO: 1), или полипептид длиной по меньшей мере 20 или 40 аминокислот, обладающий 85%, 90%, 95% или 98% идентичностью последовательности с аминокислотной последовательностью, содержащейся в SEQ ID NO: 1, и

полипептид, содержащий фрагмент из 8, 10, 15 или 20 аминокислот β-казеина (SEQ ID NO: 3), или полипептид длиной по меньшей мере 20 или 40 аминокислот, обладающий 85%, 90%, 95% или 98% идентичностью последовательности с аминокислотной последовательностью, содержащейся в SEQ ID NO: 3.

В одном варианте осуществления антигенная композиция содержит

полипептид, содержащий фрагмент из 8, 10, 15 или 20 аминокислот α-лактальбумина (SEQ ID NO: 1), или полипептид длиной по меньшей мере 20 или 40 аминокислот, обладающий 85%, 90%, 95% или 98% идентичностью последовательности с аминокислотной последовательностью, содержащейся в SEQ ID NO: 1, и

полипептид, содержащий фрагмент из 8, 10, 15 или 20 аминокислот α-казеина (SEQ ID NO: 4), или полипептид длиной по меньшей мере 20 или 40 аминокислот, обладающий 85%, 90%, 95% или 98% идентичностью последовательности с аминокислотной последовательностью, содержащейся в SEQ ID NO: 4.

В одном варианте осуществления антигенная композиция содержит полипептид, содержащий фрагмент из 8, 10, 15 или 20 аминокислот α-лактальбумина (SEQ ID NO: 1), или полипептид длиной по меньшей мере 20 или 40 аминокислот, обладающий 85%, 90%, 95% или 98% идентичностью последовательности с аминокислотной последовательностью, содержащейся в SEQ ID NO: 1;

полипептид, содержащий фрагмент из 8, 10, 15 или 20 аминокислот αS1-казеина (SEQ ID NO: 2), или полипептид длиной по меньшей мере 20 или 40 аминокислот, обладающий 85%, 90%, 95% или 98% идентичностью последовательности с аминокислотной последовательностью, содержащейся в SEQ ID NO: 2;

и полипептид, содержащий фрагмент из 8, 10, 15 или 20 аминокислот β-казеина (SEQ ID NO: 3), или полипептид длиной по меньшей мере 20 или 40 аминокислот, обладающий 85%, 90%, 95% или 98% идентичностью последовательности с аминокислотной последовательностью, содержащейся в SEQ ID NO: 3.

В одном варианте осуществления антигенная композиция содержит

полипептид, содержащий фрагмент из 8, 10, 15 или 20 аминокислот α-лактальбумина (SEQ ID NO: 1), или полипептид длиной по меньшей мере 20 или 40 аминокислот, обладающий 85%, 90%, 95% или 98% идентичностью последовательности с аминокислотной последовательностью, содержащейся в SEQ ID NO: 1;

полипептид, содержащий фрагмент из 8, 10, 15 или 20 аминокислот αS1-казеина (SEQ ID NO: 2), или полипептид длиной по меньшей мере 20 или 40 аминокислот, обладающий 85%, 90%, 95% или 98% идентичностью последовательности с аминокислотной последовательностью, содержащейся в SEQ ID NO: 2; и

полипептид, содержащий фрагмент из 8, 10, 15 или 20 аминокислот κ-казеина (SEQ ID NO: 4), или полипептид длиной по меньшей мере 20 или 40 аминокислот, обладающий 85%, 90%, 95% или 98% идентичностью последовательности с аминокислотной последовательностью, содержащейся в SEQ ID NO: 4.

В одном варианте осуществления антигенная композиция содержит

полипептид, содержащий фрагмент из 8, 10, 15 или 20 аминокислот α-лактальбумина (SEQ ID NO: 1), или полипептид длиной по меньшей мере 20 или 40 аминокислот, обладающий 85%, 90%, 95% или 98% идентичностью последовательности с аминокислотной последовательностью, содержащейся в SEQ ID NO: 1;

полипептид, содержащий фрагмент из 8, 10, 15 или 20 аминокислот αS1-казеина (SEQ ID NO: 2), или полипептид длиной по меньшей мере 20 или 40 аминокислот, обладающий 85%, 90%, 95% или 98% идентичностью последовательности с аминокислотной последовательностью, содержащейся в SEQ ID NO: 2;

полипептид, содержащий фрагмент из 8, 10, 15 или 20 аминокислот β-казеина (SEQ ID NO: 3), или полипептид длиной по меньшей мере 20 или 40 аминокислот, обладающий 85%, 90%, 95% или 98% идентичностью последовательности с аминокислотной последовательностью, содержащейся в SEQ ID NO: 3; и

полипептид, содержащий фрагмент из 8, 10, 15 или 20 аминокислот κ-казеина (SEQ ID NO: 4), или полипептид длиной по меньшей мере 20 или 40 аминокислот, обладающий 85%, 90%, 95% или 98% идентичностью последовательности с аминокислотной последовательностью, содержащейся в SEQ ID NO: 4.

В одном варианте осуществления представлена мультивалентная вакцина, содержащая полипептид длиной по меньшей мере 20 аминокислот, обладающий 95% идентичностью последовательности с аминокислотной последовательностью, содержащейся в SEQ ID NO: 1;

полипептид длиной по меньшей мере 20 аминокислот, обладающий 95% идентичностью последовательности с аминокислотной последовательностью, содержащейся в SEQ ID NO: 2;

полипептид длиной по меньшей мере 20 аминокислот, обладающий 95% идентичностью последовательности с аминокислотной последовательностью, содержащейся в SEQ ID NO: 3; и

полипептид длиной по меньшей мере 20 аминокислот, обладающий 95% идентичностью последовательности с аминокислотной последовательностью, содержащейся в SEQ ID NO: 4.

В одном варианте осуществления полипептиды из антигенных композиций связаны друг с другом через связывающую группу. В одном варианте осуществления полипептиды связаны способом голова к хвосту (т.е. аминоконец одного полипептида связан с карбоксиконцом второго полипептида). В следующем варианте осуществления полипептиды связаны посредством аминокислотного линкера, и в одном варианте осуществления линкер представляет собой дипептид или трипептид. Как правило, связывающие аминокислоты выбраны из глицина и аланина, и в одном варианте осуществления полипептиды связаны с помощью линкера Gly-Gly или Ala-Ala-Ala.

Следует принимать во внимание, что связанные с лактацией белки после введения процессируются in vivo протеазами до меньших пептидных фрагментов, способных связываться с молекулами MHC класса I и/или MHC класса II на антигенпредставляющих клетках. Затем T-клеточные рецепторы узнают и связывают молекулу MHC, с которой связан пептид, образуя первичный сигнал, инициирующий иммунный ответ.

В одном варианте осуществления вакцина дополнительно содержит адъювант и фармацевтически приемлемый носитель. Как применяют в настоящем документе, термин «адъювант» относится к средству, стимулирующему иммунную систему и увеличивающему ответ на вакцину. Адъюванты для вакцин хорошо известны специалистам в данной области. Для иллюстрации, GPI-0100 является пригодным для вакцин адъювантом. Как применяют в настоящем документе, термин «носитель» относится к ингредиенту, отличному от активного компонента (компонентов) в составе. Выбор носителя может в значительной степени зависеть от таких факторов, как конкретный способ введения или применения, эффект носителя на растворимость и стабильность, и природа лекарственной формы. Фармацевтически приемлемые носители для полипептидных антигенов хорошо известны в данной области.

В одном варианте осуществления вакцину вводят профилактически для предотвращения рака молочной железы. В одном иллюстративном аспекте композицию вводят нелактирующим женщинам, подверженным риску развития рака молочной железы.

В одном варианте осуществления вакцину вводят для ингибирования распространения клеток опухоли. Вакцину можно вводить до или после детекции клеток опухоли молочной железы у пациента. Ингибирование распространения клеток опухоли следует понимать как относящееся к предотвращению возникновения, остановке, замедлению роста или уничтожению клеток опухолей.

В одном иллюстративном аспекте T-клетки иммунной системы человека активируют после введения иммуногенной композиции, содержащей α-лактальбумин, αS1-казеин, β-казеин и/или κ-казеин человека. Активированные T-клетки могут являться CD4+ и/или CD8+.

В одном варианте осуществления после введения вакцины, содержащей α-лактальбумин, αS1-казеин, β-казеин и/или κ-казеин человека, индуцируют