Прогнозирование преждевременных родов путем определения каталазной активности в плазме периферической крови

Прогнозирование преждевременных родов путем определения каталазной активности в плазме периферической крови

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Изобретение относится к акушерству и предназначено для прогнозирования преждевременных родов путем определения в периферической крови беременных уровня активности каталазы модифицированным методом Рота и Дженсена, основанным на проведении полярографического теста в ячейке закрытого типа с электродом Кларка

После определения скорости разложения перекиси в ячейке закрытого типа с электродом Кларка, полученную величину ферментативной активности каталазы используют для расчета вероятности преждевременных родов, что позволяет своевременно начать комплекс лечебных мероприятий и снизить частоту акушерских и перинатальных осложнений. На сегодняшний день доказано, что в случае пролонгирования беременности на срок, равный или более 48 ч, возможно проведение полного курса профилактики РДС плода, а также токолитической терапии, улучшающих перинатальные исходы более чем на 5% [1, 2].

Предложен экспресс-метод прогнозирования преждевременных родов с 22 недель беременности путем определения уровня активности каталазы в периферической крови беременной.

В частности, предложен способ прогнозирования преждевременных родов путем определения уровня активности каталазы в периферической крови у беременных женщин с угрожающими преждевременными родами. У данных пациенток достоверно выше уровень активности каталазы (р<0.05). Определено пороговое значение ферментативной активности каталазы, позволяющие с высокой вероятностью прогнозировать преждевременные роды у данной группы беременных

Для определения активности каталазы в периферической крови беременных женщин используются модифицированный метод Рота и Дженсена, основанный на проведении полярографического теста в ячейке закрытого типа с электродом Кларка.

Использованный метод определения ферментативной активности каталазы основан на прямом измерении в ячейке полярографа содержания молекулярного кислорода - продукта реакции разложения перекиси водорода каталазой. В связи с применением метода прямого измерения содержания кислорода отсутствует необходимость использования реактантов, красителей и др. промежуточных соединений, содержание которых обычно измеряется методами непрямого определения в системе специфических реакций и нуждается в построении калибровочной кривой. Отсутствие необходимости использования дополнительных реактантов при прямом определении максимальной скорости реакции, катализируемой каталазой (Vmax), существенно упрощает исследование, минимизирует время определения и стоимости анализа. Расчет вероятности развития преждевременных родов проводится с помощью подстановки значений в уравнение логистической регрессии. Моделирование при помощи логистической регрессии в достаточной мере устойчиво к отклонениям в распределении предиктора, позволяет получать легко интерпретируемые результаты в явном виде значения вероятности отнесения к тому или иному классу. Совокупность этих факторов послужила причиной использования именно этой модели.

На основании экспериментальных данных при сравнении женщин контрольной группы, родоразрешенных своевременно и наблюдаемой, с преждевременными родами была проведена подгонка параметров модели по методу наименьших квадратов и оценка эффективности предсказаний, полученных при использовании разработанной модели.

Уровень техники

В патогенезе осложнений беременности и раннего неонатального периода значимая роль отводится воспалительной реакции, приводящей к хроническому оксидативному стрессу на фоне дисбаланса нормальной продукции активных форм кислорода (АФК) и активности антиоксидантной защитной системы [1]. Известно, что преждевременные роды часто сопровождаются манифестацией симптомов, типичных для хронического оксидативного стресса, - накоплением продуктов перекисного окисления липидов, аддуктов ковалентной модификации белков, падением эффективности энергопреобразующих мембран митохондрий и ростом числа повреждений ядерной и митохондриальной ДНК [2]. Роль триггера ПР обычно выполняет инфекционная активность различного типа, при которой наблюдается нарушение механизмов активации фагоцитов и, как следствие, повышенный воспалительный ответ [4]. Критичным фактором является продолжительность и/или острота инфекции на фоне транзитного снижения активности антиоксидантных систем, приводящего к накоплению продуктов перекисного окисления липидов [3]. При достижении порогового значения содержания таких продуктов становится возможной протекание химических реакций, приводящих к модификации структуры белков, например, посредством образования внутримолекулярных ковалентных сшивок при участии альдегидной группы МДА, свободной аминогруппы лизина и других активных групп [4]. При этом если такая модификация затрагивает регуляторные белки, может быть инициирована последовательность событий, приводящих к формированию петли положительной обратной связи, негативной регуляции экспрессии элементов системы антиоксидантной защиты, а также к существенному снижению ее активности и емкости [5]. Наконец, долговременное воздействие АФК на клетки и ткани организма при дисбалансе защитных систем приводит к нарушению тканевого гомеостаза, дисфункции тканей и органов, системным нарушениям на уровне целого организма, а в некоторых случаях к полиорганной недостаточности [6].

Поскольку в основе молекулярного механизма окислительных повреждений лежит снижение активности антиоксидантных ферментов, нарушение структурно-функционального состояния клеточных мембран при патологии беременности, вероятно, опосредовано окислительной деструкцией как белков, так и липидов эндотелия сосудов, приводящей к активации клеток иммунной системы матери [7]. При этом на начальной стадии патологического состояния происходит накопление в периферической крови матери продуктов распада клеток и внутриклеточных органелл синцитиотрофобласта, в том числе в результате развития инфекции и/или асептического воспаления [8].

Известен способ диагностики преждевременных родов по ряду биохимических маркеров. Данные вещества участвуют как в физиологических, так и патологических процессах во время беременности и родов.

Известен способ диагностики угрозы прерывания беременности в ранние сроки путем определения в периферической крови концентрации фактора угнетающего миграцию лейкоцитов до и после однократной иммунизации донорскими лейкоцитами (патент РФ №2014598, 1994). Данный способ является технологически сложным в исполнении, а также неизвестна его эффективность для прогнозирования прерывания беременности во II и III триметрах беременности.

Известен способ прогнозирования угрозы прерывания беременности по определению концентрации эстриола, плацентарного лактогена и интерлейкина-6 в сыворотке крови (патент РФ №2285926, 2006).

Известен способ прогнозирования невынашивания беременности путем определения содержания периферических Т-лимфоцитов до и после инкубации с АМГФ (патент РФ №20077727, 1997).

Известен способ прогнозирования преждевременных родов инфекционного генеза путем определения экспрессии гена Toll-подобного рецептора-2 (TLR-2) в слизистой цервикального канала (патент РФ №2334233, 2008), однако данный способ не имеет точных пороговых значений. Кроме того, имеется большой разброс абсолютных значений показателей экспрессии TLR-2. Чувствительность метода составляет 70%.

Известен способ определения концентрации плодового фибронектина в цервико-вагинальном секрете и при значении выше 50 нг/мл, уровень интерлейкина-6 в амниотической жидкости ≥20 нг/мл и интерлейкина -8≥450 пг/мл, данные показатели являются диагностически значимыми [12]. Н. Leitich et al. [13] провел мета-анализ 40 исследований, посвященных фибронектину как предиктору ПР. По данным этих исследований повышение уровня фибронектина в цервикальной слизи было ассоциировано с риском развития ПР, причем наибольшая чувствительность теста проявлялась в отношении развития ПР в ближайшие 7-14 дней (около 71%), а в отношении ПР в ближайшие 21 день оказалась несколько ниже (59%). Также в качестве критерия оценки теста была рассмотрена его способность оценить вероятность ПР ранее 34 и ранее 37 недель, при этом его чувствительность оказалась еще ниже - 53% и 52% соответственно [13, 14]. Таким образом данный метод прогнозирования ПР не может быть использован у пациенток с начальными признаками угрозы прерывания беременности, в связи с его низкой чувствительностью. Это существенно снижает возможность своевременного начала терапии, направленной на пролонгирование беременности.

Способ прогнозирования невынашиваня беременности при урогенитальной инфекции путем определения в биологической жидкости уровня ИЛ-12. В цервикальном канале определяют ИЛ-12 и при его значениях 102,0 пг/мл и выше прогнозируют высокий риск невынашивания беременности в I и II триместрах (патент РФ №234424, 2008).

Недостатком данных способов является их трудоемкость в исполнении.

Известен способ прогнозирования невынашивания беременности путем определения в плазме крови содержания фибрин-мономерных комплексов. По их величине прогнозируют прерывание беременности в I, II, III триместрах (патент РФ №2123698, 1998). Известен способ прогнозирования невынашивания беременности путем определения в сыворотке крови прогестерона, хорионического гонадотропина и уровня альфа-2-микроглобулиина в сыворотке крови (патент РФ №2004135161, 2006). Известен способ прогнозирования исхода беременности, осуществляемый путем исследования в периферической крови относительное содержание СД16+и СД3+ клеток и при соотношении ≥0,11 прогнозируют наступление преждевременных родов и угрозу преждевременных родов (патент РФ №2132069, 1999).

Недостатками данных способов является их низкая специфичность и необходимость использования дорогостоящих реактантов и колорантов, а также коммерческих наборов, что удлиняет время исследования и ставит результат в зависимость от качества реагентов, определяемого соблюдением ТУ по условиям и срокам хранения как клинической лабораторией, так и поставщиком.

Аналогом к заявленному способу является:

Способ прогнозирования преждевременных родов путем исследования определения относительного содержания CD 25+ и IL-2+ лимфоцитам в периферической и венозной крови (патент РФ №2344424, 2009). Технический результат в данном способе достигается за счет определения относительного содержания CD25+к ИЛ-2+ при значении соотношения равным или более 1,0 прогнозируют угрожающие преждевременные роды (патент РФ №2344424, 2009). Способ осуществляется следующим образом: к 3 мл гепаринизировнной крови из кубитальной вены добавляют 3 мл «Среды 199» и выделяют обогащенную популяцию мононуклеарных клеток стандартным методом скоростного центрифугирования. Скорость центрифугирования -1500 оборотов/мин в течение 40 мин. Суспензию мононуклеарных клеток дважды отмывают физраствором, доводят до концентрации клеток до 1×10⁶ кл/мл. В одной пробирке полученной суспензии добавляют 20 мкл моноклональных антител анти-CD25, конъюгированных с флюоресцеин изотиоцианатом. Клетки инкубируют в течение 30 мин при комнатной температуре, отмывают и фиксируют в 0,5 мл фиксирующего раствора CellFix^tm. Параллельно во второй пробирке проводят процедуру внутриклеточного окрашивания с моноклональными антителами к IL-2. К 0,05 мл клеточной суспензии добавляют 100 мкл фиксирующего буфера из набора «FIX$PERM cell permeabilization kit» для пермеабилизации клеточной мембраны. К 0,05 мл клеточной суспензии добавляют 100 мкл фиксирующего буфера из набора набора «FIX$PERM cell permeabilization kit» и инкубируют в течение 15 мин при комнатной температуре в темноте. Дале клетки отмывают от фиксирующего буфера и добавляют 100 мкл пермеабилизирующего буфера В и 1 мкл моноклональных антител к IL-2, меченных фикоэритрином, для внутриклеточного окрашивания. Инкубируют в течении 15 мин при комнатной температуре в темноте, отмывают и фиксируют в 0,5 мл фиксирующего раствора CellFix^tm. Затем определяют относительное количество CD25+ к IL2+ лимфоцитов в лимфоцитарном гейте на проточном цитрометре и вычисляют индекс соотношения CD25+ к IL2+. содержания CD25+ к IL2+. При его значении соотношения равным или более 1,0 прогнозируют угрожающие преждевременные роды.

Из вышеизложенного очевидно, что на сегодняшний день основными недостатками прогнозирования исхода беременности являются неспецифичность и трудоемкость методов, необходимость использования дорогостоящего оборудования и высококвалифицированного персонала, в то время как предложенный метод прост в использовании, не требует закупки дополнительных реактивов, обладает высокой специфичностью и достоверностью результатов, получаемых за короткий промежуток времени (менее часа).

Описание метода

Измерение активности каталазы в плазме крови проводили полярографически с помощью электрода Кларка по модифицированому методу Рота и Дженсена на оксиграфе (Hansatech, UK)

Прямым методом измерения напряжения определяли количество кислорода, образующегося при распаде перекиси в ходе реакции:

2H₂O₂ = 2H₂O + O₂

Все измерения проводили в термостатируемых условиях при постоянной температуре 25°С. В ячейку оксиграфа вносили 2 мл фосфатно-солевого буфера (рН=7.4). В буфер добавляли 100 мкл 6% Н₂О₂. После того как скорость образования кислорода выходила на стационарный уровень, в ячейку добавляли 1 мкл плазмы крови и регистрировали приращение скорости выделения O₂ (нмоль/мл/мин). Активность каждого образца измерялась в трех повторностях. Исходя из полученных значений, рассчитывали среднее значение активности каталазы в плазме крови в «Единицах активности в 1 мл» (ЕД/мл), где одна единица активности соответствует количеству фермента, катализирующего превращение одного микромоля субстрата в минуту.

Величина ферментативной активности каталазы подставляется в уравнение, полученное после подгонки модели и используется для вычисления вероятности преждевременных родов у конкретной пациентки:

где р - вероятность развития преждевременных родов, Katalaz - уровень активности каталазы в ЕД/мл;

е - константа Эйлера ≈2.718281,

при вероятности, большей или равной 0.5643984, прогнозируются преждевременные роды в ближайшие 7 дней.

Примеры использования изобретения

Пример №1

Беременная Н., 33 лет (7017/17) поступила в стационар с диагнозом: «Беременность 30 недель. Головное предлежание. Угроза преждевременных родов».

Из анамнеза: Менструальная функция с 14 лет, регулярная через 26 дней, по 5 дней. При обследовании по экспресс-методу определения уровня активности каталазы, изменений не выявлено. Данная беременность 2-я, наступила самопроизвольно. В анамнезе 1 самопроизвольные роды в сроке 39 недель гестации. Беременность осложнилась ранним токсикозом легкой степени в I триместре, угрозой выкидыша в сроке 8-9 недель. II триместр - протекал без осложнений. В III триместре в связи угрозой преждевременных родов в 30 недель была госпитализирована, при поступлении взят биоматериал для оценки уровня активности каталазы в периферической крови

Получены следующие результаты:

р=0.23624431, прогнозируется возможность пролонгирования беременности.

Беременность удалось пролонгировать на 6 недель, что считается положительным результатом прогнозирования. Так как в случае пролонгирования беременности на срок, равный или более 48 ч, возможно проведение полного курса профилактики РДС плода, своевременно начать токолитическую терапию, что в свою очередь позволяет улучшить перинатальные исходы [1, 2].

Пример №2

Беременная К., 28 лет (6804/15) поступила в стационар с диагнозом: «Беременность 28 недель. Головное предлежание. Угрожающие преждевременные роды».

Из анамнеза: Менструальная функция с 14 лет, регулярная, через 30 дней, по 5 дней. Данная беременность 1-я, наступила самопроизвольно. Беременность осложнилась угрозой прерывания беременности, анемией. При поступлении осуществили взятие материала периферической крови на определение экспресс-методом активности каталазы, был определен уровень каталазы в периферической крови.

Получены следующие результаты:

р=0.99787535, прогнозируются преждевременные роды.

У данной пациентки на следующий день после госпитализации произошли преждевременные роды в сроке 28 недель мертвым недоношенным мальчиком массой 1130 г длиной 38 см.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Goldenberg R.L., Culhane J.F., Iams J.D., Romero R. Epidemiology and causes of preterm birth. Lancet. 2008; 5; 371 (9606): 75-84.

2. Romero R., Miranda J., Chaemsaithong P., Chaiworapongsa Т., Kusanovic J.P., Dong Z., Ahmed A.I., Shaman M., Lannaman K., Yoon B.H., Hassan S.S., Kim C.J., Korzeniewski S.J., Yeo L., Kim Y.M. Sterile and microbial-associated intra-amniotic inflammation in preterm prelabor rupture of membranes. J Matern Fetal Neonatal Med. 2015; 28 (12): 1394-1409.

3. Romero R., Miranda J., Chaiworapongsa Т., Chaemsaithong P., Gotsch F., Dong Z., Ahmed A.I., Yoon B.H., Hassan S.S., Kim C.J., Korzeniewski S.J., Yeo L., Kim Y.M. Sterile intra-amniotic inflammation in asymptomatic patients with a sonographic short cervix: prevalence and clinical significance. J Matern Fetal Neonatal Med. 2014; 24: 1-17.

4. Левит Д.А., Лейдерман И.Н. Острое катаболическое состояние при синдроме системного воспалительного ответа различной этиологии. Попытка клинического анализа // Вестник интенсивной терапии 2006; 2: 9-14.

5. Singer М., Biomarkers in sepsis. Curr Opin Pulm Med. 2013, May; 19(3): 305-9.

6. Сухих Г.Т., Ванько Л.В. Иммунные факторы в этиологии и патогенезе осложнений беременности // Акушерство и гинекология. 2012: №1. - С. 128-136.

7. Иммунология. Практикум. Учебное пособие. Под ред. Л.В. Ковальчука, Г.А. Игнатьевой, Л.В. Ганковской. М.: ГЭОТАР-Медиа, 2012; 176 с. 1. Jiang G., Liu X., Wang М., Chen Н., Chen Z., Qiu Т. Oxymatrine ameliorates renal ischemia-repermsion injury from oxidative stress through Nrf2/HO-1 pathway. Acta Cir Bras. 2015; 30 (6): 422-429.

8. Ayaz A., Agarwal A., Sharma R., Arafa M., Elbardisi H., Cui Z. Impact of precise modulation of reactive oxygen species levels on spermatozoa proteins in infertile men. Clin Proteomics. 2015; 12 (1): 4.

9. Menon R Oxidative stress damage as a detrimental factor in preterm Birth pathology. Front Immunol. 2014 Nov 12; 5: 567.

10. Auten R.L., Davis J.M. Oxygen toxicity and reactive oxygen species: the devil is in the details. Pediatr Res. 2009; 66(2): 121-127.

11. Knuppel R.A, Hassan M.I., Mc Dermott J.J., Tucker M., Morrison J.C. Oxidative stress and antioxidants: preterm birtb and preterm infants. In: Morrison J., ed. Preterm Birth - Mother and Child. InTech 2012; 125-150.

12. Siddiqui I.A., Jaleel A., Tamimi W., Al Kadri H.M. Role of oxidative stress in the pathogenesis of preeclampsia. Am J Obstet Gynecol. 2010; 282(5): 469-74.

13. Ruder E.H., Hartman Т.J., Goldman M.B. Impact of oxidative stress on female fertility. Curr Opin Obstet Gynecol 2009; 21 (3): 219-222.

14. Mert I., Oruc A.S., Yuksel S., Cakar E.S., Buyukkagnici U., Karaer A., Danwan N. Role of oxidative stress in preeclampsia and intrauterine growth restriction. Obstet Gynecol Res. 2012. 38 (4): 658-664.

Способ прогнозирования преждевременных родов путем определения каталазной активности в плазме периферической крови, отличающийся тем, что у беременной женщины берут периферическую венозную кровь и определяют активность каталазы в периферической крови беременной; на основании полученных величин ферментативной активности каталазы эти данные используют в формуле для вычисления вероятности преждевременных родов у конкретной пациентки,

где р - вероятность развития преждевременных родов, Katalaz - уровень активности каталазы в ЕД/мл;

е - константа Эйлера ≈2.718281,

при вероятности, большей или равной 0.5643984, прогнозируются преждевременные роды в ближайшие 7 дней.