Клетка нитчатых грибов с дефицитом протеаз и способы ее применения

Клетка нитчатых грибов с дефицитом протеаз и способы ее применения

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к композициям и способам, пригодным для продуцирования гетерологичных белков в клетках нитчатых грибов.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Посттрансляционная модификация эукариотических белков, в частности, терапевтических белков, таких как иммуноглобулины, часто является необходимой для надлежащего сворачивания и функционирования белка. Поскольку стандартные прокариотические экспрессирующие системы лишены надлежащего аппарата, необходимого для таких модификаций, для получения этих терапевтических белков необходимо использовать альтернативные экспрессирующие системы. Даже когда эукариотические белки не имеют посттрансляционных модификаций, прокариотические экспрессирующие системы часто лишены необходимых белков-шаперонов, требуемых для надлежащего сворачивания. Дрожжи и грибы являются привлекательными возможностями для экспрессии белков, поскольку они могут без труда расти в большом масштабе в простых средах, что обеспечивает низкую стоимость продуцирования, и дрожжи и грибы имеют посттрансляционный аппарат и шапероны, которые выполняют сходные функции с теми, что и в клетках млекопитающих. Более того, доступны инструменты для манипуляции относительно простым генетическим набором клеток дрожжей и грибов, а также более сложных эукариотических клеток, таких как клетки млекопитающих или клетки насекомых (De Pourcq et al., Appl Microbiol Biotechnol, 87(5): 1617-31). Несмотря на эти преимущества, многие терапевтические белки все еще продуцируют в клетках млекопитающих, которые продуцируют терапевтические белки с посттрансляционными модификациями, наиболее сходными с нативными белками человека, в то время как посттрансляционные модификации, в природе осуществляемые дрожжами и грибами, часто отличаются от посттрансляционных модификаций, встречающихся в клетках млекопитающих.

Для решения этой проблемы разрабатывают новые штаммы дрожжей и грибов, которые осуществляют посттрансляционные модификации, которые в наибольшей степени сходны с посттрансляционными модификациями, встречающимися в нативных белках человека. Таким образом, возобновился интерес к использованию клеток дрожжей и грибов для экспрессии более сложных белков. Однако, поскольку промышленность была сфокусирована на технологии культивирования клеток млекопитающих в течение длительного времени, экспрессирующие системы в клетках грибов, таких как Trichoderma, не являются также хорошо установившимися, как культура клеток млекопитающих, и, таким образом, имеют недостатки при экспрессии белков млекопитающих.

Таким образом, в данной области остается потребность в улучшенных клетках нитчатых грибов, таких как клетки грибов Trichoderma, которые могут стабильно продуцировать гетерологичные белки, такие как иммуноглобулины, предпочтительно на высоких уровнях экспрессии.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В настоящем описании описаны композиции, включающие клетки нитчатых грибов, такие как клетки грибов Trichoderma, имеющие сниженную или не поддающуюся обнаружению активность по меньшей мере трех протеаз, и имеющие рекомбинантный полинуклеотид, кодирующий гетерологичный полипептид, который продуцируется на увеличенных уровнях. Кроме того, в настоящем описании описаны способы улучшения стабильности гетерологичного полипептида и способы получения гетерологичных полипептидов, в которых протеазы не обладают сниженной активностью.

Таким образом, один аспект включает клетки нитчатых грибов, имеющие сниженную или не поддающуюся обнаружению активность по меньшей мере трех протеаз, где клетка дополнительно содержит рекомбинантный полинуклеотид, кодирующий гетерологичный полипептид, продуцируемый на уровне, который по меньшей мере в 2 раза превышает уровень продукции полипептида в соответствующей родительской клетке нитчатых грибов, в которой протеазы не обладают сниженной активностью. В определенных вариантах осуществления, когда клетка представляет собой клетку Aspergillus, общая активность протеаз снижена до 50% или менее относительно общей активности протеаз соответствующей родительской клетки Aspergillus, в которой протеаза не обладает сниженной активностью. В других вариантах осуществления общая активность протеаз клетки нитчатых грибов снижена до 49% или менее, 31% или менее, относительно общей активности протеаз соответствующей родительской клетки нитчатых грибов, в которой протеазы не обладают сниженной активностью.

В определенных вариантах осуществления уровень экспрессии по меньшей мере трех протеаз снижен или их экспрессия устранена. В определенных вариантах осуществления каждый из генов, кодирующих три протеазы, содержит мутацию, которая снижает или устраняет соответствующую активность протеазы. В определенных вариантах осуществления, которые могут быть комбинированы с предшествующими вариантами осуществления, три гена, кодирующих протеазы, представляют собой pep1, tsp1 и slp1. В других вариантах осуществления три гена, кодирующих протеазы, представляют собой gap1, slp1 и pep1.

В определенных вариантах осуществления клетки грибов имеют сниженную или не поддающуюся обнаружению активность четырех эндогенных протеаз; каждый из генов, кодирующих четыре протеазы, содержит мутацию, которая снижает или устраняет активность соответствующей протеазы. В определенных вариантах осуществления, которые могут быть комбинированы с предшествующими вариантами осуществления, четыре гена, кодирующих протеазы, представляют собой pep1, tsp1, slp1 и gap1.

В определенных вариантах осуществления, которые могут быть комбинированы с предшествующими вариантами осуществления, три или четыре гена, кодирующих протеазы, выбраны из pep1, pep2, pep3, pep4, pep5, pep8, pep11, pep12, tsp1, slp1, slp2, slp3, slp7, gap1 и gap2. В определенных вариантах осуществления, которые могут быть комбинированы с предшествующими вариантами осуществления, три или четыре гена, кодирующих протеазы, выбраны из pep1, pep3, pep4, tsp1, slp1, slp2, gap1 и gap2. В определенных вариантах осуществления три или четыре гена, кодирующих протеазы, выбраны из pep1, pep2, pep3, pep4, pep5, gap1, gap2, slp1, slp2 и tsp1.

В других вариантах осуществления клетки грибов имеют сниженную или не поддающуюся обнаружению активность пяти эндогенных протеаз; каждый из генов, кодирующих пять протеаз, содержат мутацию, которая снижает или устраняет активность соответствующей протеазы. В определенных вариантах осуществления, которые могут быть комбинированы с предшествующими вариантами осуществления, пять генов, кодирующих протеазы, представляют собой pep1, tsp1, slp1, gap1 и pep4. В других вариантах осуществления пять генов, кодирующих протеазы, представляют собой pep1, tsp1, slp1, gap1 и gap2.

В определенных вариантах осуществления клетки грибов имеют сниженную или не поддающуюся обнаружению активность шести эндогенных протеаз; каждый из генов, кодирующих шесть протеаз, содержит мутацию, которая снижает или устраняет активность соответствующей протеазы. В определенных вариантах осуществления клетка имеет шесть генов, кодирующих протеазы, каждый из которых содержит мутацию, которая снижает или устраняет активность соответствующей протеазы, и шесть генов, кодирующих протеазы, представляют собой pep1, tsp1, slp1, gap1, gap2 и pep4.

В определенных вариантах осуществления, которые могут быть комбинированы с предшествующими вариантами осуществления, клетки грибов имеют от трех до шести протеаз, имеющих сниженную или не поддающуюся обнаружению активность, где каждая из от трех до шести протеаз выбрана из pep1, pep2, pep3, pep4, pep5, tsp1, slp1, slp2, slp3, gap1 и gap2.

В определенных вариантах осуществления, которые могут быть комбинированы с предшествующими вариантами осуществления, клетка имеет семь генов, кодирующих протеазы, каждый из которых содержит мутацию, которая снижает или устраняет активность соответствующей протеазы, и семь генов, кодирующих протеазы, представляют собой pep1, tsp1, slp1, gap1, gap2, pep4 и pep3.

В определенных вариантах осуществления, которые могут быть комбинированы с предшествующими вариантами осуществления, клетка имеет восемь генов, кодирующих протеазы, каждый из которых содержит мутацию, которая снижает или устраняет активность соответствующей протеазы, и восемь генов, кодирующих протеазы, представляют собой pep1, tsp1, slp1, gap1, gap2, pep4, pep3 и pep5.

В определенных вариантах осуществления, которые могут быть комбинированы с предшествующими вариантами осуществления, клетка грибов имеет дополнительную протеазу, имеющую сниженную активность, ген, кодирующий дополнительную протеазу, содержит мутацию, которая снижает или устраняет активность соответствующей протеазы, и дополнительная протеаза выбрана из pep7, pep8, pep11, pep12, tpp1, gap2, slp3, slp5, slp6, slp7 и slp8.

В определенных вариантах осуществления, которые могут быть комбинированы с предшествующими вариантами осуществления, гетерологичный полипептид представляет собой полипептид млекопитающих. В определенных вариантах осуществления полипептид млекопитающих является гликозилированным.

В определенных вариантах осуществления полипептид млекопитающих выбран из иммуноглобулина, антитела и его антигенсвязывающих фрагментов, фактора роста, интерферона, цитокина и интерлейкина. В определенных вариантах осуществления полипептид млекопитающих представляет собой иммуноглобулин или антитело. В определенных вариантах осуществления полипептид млекопитающих выбран из инсулиноподобного фактора роста 1 (IGF1), гормона роста человека (hGH) и интерферона-альфа 2b (IFNα2b).

В определенных вариантах осуществления, которые могут быть комбинированы с предшествующими вариантами осуществления, гетерологичный полипептид представляет собой полипептид не млекопитающих. В определенных вариантах осуществления полипептид не млекопитающих представляет собой аминопептидазу, амилазу, карбогидразу, карбоксипептидазу, каталазу, целлюлазу, хитиназу, кутиназу, дезоксирибонуклеазу, эстеразу, альфа-галактозидазу, бета-галактозидазу, глюкоамилазу, альфа-глюкозидазу, бета-глюкозидазу, инвертазу, лакказу, липазу, мутаназу, оксидазу, пектинолитический фермент, пероксидазу, фосфолипазу, фитазу, полифенолоксидазу, протеолитический фермент, рибонуклеазу, трансглутаминазу или ксиланазу.

В определенных вариантах осуществления, которые могут быть комбинированы с предшествующими вариантами осуществления, клетка грибов дополнительно обладает сниженной или не поддающейся обнаружению активностью ALG3, фермента маннозилтрансферазы. В определенных вариантах осуществления ген, кодирующий ALG3, содержит мутацию, которая снижает или устраняет соответствующую активность. В определенных вариантах осуществления, которые могут быть комбинированы с предшествующими вариантами осуществления, клетка грибов дополнительно содержит полинуклеотид, кодирующий α-1,2-маннозидазу.

В определенных вариантах осуществления, которые могут быть комбинированы с предшествующими вариантами осуществления, клетка грибов имеет мутацию, которая снижает экспрессию протеазы, для которой желательно наличие сниженной активности. В определенных вариантах осуществления, которые могут быть комбинированы с предшествующими вариантами осуществления, мутация представляет собой делецию в гене, кодирующем протеазу. В определенных вариантах осуществления, которые могут быть комбинированы с предшествующими вариантами осуществления, мутация представляет собой делецию части гена, кодирующего каталитический домен протеазы. В определенных вариантах осуществления, которые могут быть комбинированы с предшествующими вариантами осуществления, клетка грибов имеет точковую мутацию в части гена, кодирующей каталитический домен протеазы.

В других вариантах осуществления снижение или устранение протеазной активности одной или нескольких протеаз происходит благодаря конструкциям РНК-i, специфичным к i) одной протеазе или ii) двум или более протеазам, выбранным из группы, состоящей из протезы pep-типа, трипсин-подобной сериновой протеазы, протеазы gap-типа, седолизиновой протеазы и протеазы slp-типа. В определенных вариантах осуществления конструкции РНК-i являются специфичными к slp2, slp3, slp5 и/или slp6.

В определенных вариантах осуществления, которые могут быть комбинированы с предшествующими вариантами осуществления, клетка грибов дополнительно содержит каталитический домен N-ацетилглюкозаминилтрансферазы I и каталитический домен N-ацетилглюкозаминилтрансферазы II. В определенных вариантах осуществления каталитический домен N-ацетилглюкозаминилтрансферазы I и каталитический домен N-ацетилглюкозаминилтрансферазы II кодируются полинуклеотидом. В определенных вариантах осуществления каталитический домен N-ацетилглюкозаминилтрансферазы I кодируется первым полинуклеотидом, и каталитический домен N-ацетилглюкозаминилтрансферазы II кодируется вторым полинуклеотидом. В определенных вариантах осуществления, которые могут быть комбинированы с предшествующими вариантами осуществления, клетка грибов дополнительно содержит полинуклеотид, кодирующий маннозидазу II и/или галактозилтрансферазу. В определенных вариантах осуществления клетка грибов содержит ферменты, выбранные из группы, состоящей из α-1,2-маннозидазы, N-ацетилглюкозаминилтрансферазы I, N-ацетилглюкозаминилтрансферазы II, маннозидазы II и/или галактозилтрансферазы, причем указанные ферменты дополнительно содержат нацеливающий пептид, например, гетерологичный нацеливающий пептид для надлежащей локализации соответствующего фермента. В определенных вариантах осуществления нацеливающий пептид выбран из SEQ ID NO: 589-594.

В определенных вариантах осуществления, которые могут быть комбинированы с предшествующими вариантами осуществления, клетка грибов представляет собой клетку грибов Trichoderma, клетку грибов Myceliophthora, клетку грибов Aspergillus, клетку грибов Neurospora, клетку грибов Fusarium или Penicillium, или клетку грибов Chrysosporium. В определенных вариантах осуществления, которые могут быть комбинированы с предшествующими вариантами осуществления, клетка грибов представляет собой Trichoderma reesei.

В определенных вариантах осуществления, которые могут быть комбинированы с предшествующими вариантами осуществления, клетка грибов является диким типом по протеазе pep4.

Другой аспект включает способы повышения стабильности гетерологичного полипептида посредством: a) предоставления клетки нитчатых грибов согласно любому из предшествующих вариантов осуществления; и b) культивирования клетки так, чтобы экспрессировался гетерологичный полипептид, где гетерологичный полипептид обладает повышенной стабильностью по сравнению с гетерологичным полипептидом, полученным в соответствующей родительской клетке нитчатых грибов, в которой протеазы не обладают сниженной активностью, например, поскольку не содержат мутаций генов, кодирующих протеазы. Другой аспект включает способы получения гетерологичного полипептида посредством: a) предоставления клетки нитчатых грибов согласно любому из предшествующих вариантов осуществления; b) культивирования клетки-хозяина так, чтобы экспрессировался гетерологичный полипептид; и c) очистки гетерологичного полипептида. В определенных вариантах осуществления, которые могут быть комбинированы с предшествующими вариантами осуществления, клетка нитчатых грибов дополнительно содержит белок-носитель. В определенных вариантах осуществления белок-носитель представляет собой CBH1. В определенных вариантах осуществления, которые могут быть комбинированы с предшествующими вариантами осуществления, культивирование проводят в среде, содержащей ингибитор протеаз. В определенных вариантах осуществления культивирование проводят в среде, имеющей один или два ингибитора протеаз, выбранных из SBT1 и химостатина. В определенных вариантах осуществления гетерологичный полипептид, полученный родуцируемый в соответствии со способом, представляет собой гликозилированный полипептид млекопитающих, и по меньшей мере 10%, по меньшей мере 20%, по меньшей мере 30%, по меньшей мере 40%, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90% или 100% (моль.%) от всех N-гликанов полипептида состоит из Man₃GlcNAc₂ N-гликана. В других вариантах осуществления гетерологичный полипептид, полученный в соответствии со способом, представляет собой гликозилированный полипептид млекопитающих, и по меньшей мере 10%, по меньшей мере 20%, по меньшей мере 30%, по меньшей мере 40%, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90% или 100% (моль.%) от всех N-гликанов полипептида состоит из комплексного N-гликана. В определенных вариантах осуществления гетерологичный полипептид, полученный в соответствии со способом, представляет собой гликозилированный полипептид млекопитающих, и по меньшей мере 10%, по меньшей мере 20%, по меньшей мере 30%, по меньшей мере 40%, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90% или 100% (моль.%) от всех N-гликанов полипептида состоит из гибридного N- гликана. В определенных вариантах осуществления гетерологичный полипептид, полученный в соответствии со способом, представляет собой гликозилированный полипептид млекопитающих, и по меньшей мере 10%, по меньшей мере 20%, по меньшей мере 30%, по меньшей мере 40%, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90% или 100% (моль.%) от всех N-гликанов полипептида состоит из N-гликана G1 или G2. Другой аспект включает гетерологичные полипептиды, получаемые способами, как описано выше.

Другой аспект включает клетки грибов Trichoderma, имеющие сниженную или не поддающуюся обнаружению активность по меньшей мере трех протеаз, выбранных из pep1, pep2, pep3, pep4, pep5, tsp1, slp1, slp2, gap1 и gap2, где клетка дополнительно содержит рекомбинантный полинуклеотид, кодирующий полипептид млекопитающих, продуцируемый на уровне, который по меньшей мере в 2 раза превышает уровень продукции полипептида в соответствующей родительской клетке грибов Trichoderma.

В определенных вариантах осуществления уровень экспрессии по меньшей мере трех протеаз снижен или их экспрессия устранена в клетке грибов Trichoderma. В определенных вариантах осуществления каждый из генов, кодирующих по меньшей мере три протеазы, содержит мутацию, которая снижает или устраняет активность соответствующей протеазы в клетке грибов Trichoderma. В определенных вариантах осуществления клетка грибов Trichoderma включает три гена, кодирующих протеазы, с мутацией, которая снижает или устраняет протеазную активность, которые выбраны из gap1, slp1 и pep1. В определенных вариантах осуществления, которые могут быть комбинированы с предшествующими вариантами осуществления, полипептид млекопитающих в клетке грибов Trichoderma представляет собой антитело или его антигенсвязывающие фрагменты, или иммуноглобулин, и по меньшей мере три протеазы выбраны из pep1, pep3, pep4, tsp1, slp1, slp2, gap1 и gap2. В определенных вариантах осуществления клетка грибов Trichoderma содержит четыре гена, кодирующих протеазы, каждый из которых содержит мутацию, которая снижает или устраняет активность соответствующей протеазы, и четыре гена, кодирующих протеазы с такой мутацией, представляют собой pep1, tsp1, slp1 и gap1. В определенных вариантах осуществления клетка грибов Trichoderma имеет пять генов, кодирующих протеазы, каждый из которых содержит мутацию, которая снижает или устраняет активность соответствующей протеазы, и пять генов, кодирующих протеазы с такой мутацией, представляют собой pep1, tsp1, slp1, gap1 и pep4. В определенных вариантах осуществления, которые могут быть комбинированы с предшествующими вариантами осуществления, полипептид млекопитающих в клетке грибов Trichoderma представляет собой фактор роста, интерферон, цитокин или интерлейкин, и три протеазы со сниженной активностью выбраны из pep1, pep2, pep3, pep4, pep5, pep8, pep11, pep12, gap1, gap2, slp1, slp2, slp7 и tsp1. В определенных вариантах осуществления клетка грибов Trichoderma имеет пять генов, кодирующих протеазы, каждый из которых содержит мутацию, которая снижает или устраняет активность соответствующей протеазы, и пять генов, кодирующих протеазы с такой мутацией, представляют собой pep1, tsp1, slp1, gap1 и gap2. В определенных вариантах осуществления клетка грибов Trichoderma имеет шесть генов, кодирующих протеазы, каждый из которых содержит мутацию, которая снижает или устраняет активность соответствующей протеазы, и шесть генов, кодирующих протеазы с такой мутацией, представляют собой pep1, tsp1, slp1, gap1, gap2 и pep4. В определенных вариантах осуществления, которые могут быть комбинированы с предшествующими вариантами осуществления, клетка грибов Trichoderma имеет семь генов, кодирующих протеазы, каждый из которых содержит мутацию, которая снижает или устраняет активность соответствующей протеазы, и семь генов, кодирующих протеазы, представляют собой pep1, tsp1, slp1, gap1, gap2, pep4 и pep3. В определенных вариантах осуществления, которые могут быть комбинированы с предшествующими вариантами осуществления, клетка грибов Trichoderma имеет восемь генов, кодирующих протеазы, каждый из которых содержит мутацию, которая снижает активность соответствующей протеазы, и восемь генов, кодирующих протеазы с такой мутацией, представляют собой pep1, tsp1, slp1, gap1, gap2, pep4, pep3 и pep5.

В определенных вариантах осуществления, которые могут быть комбинированы с предшествующими вариантами осуществления, клетка грибов Trichoderma дополнительно обладает сниженной или не поддающейся обнаружению активностью одной или нескольких дополнительных протеаз. В определенных вариантах осуществления уровень экспрессии одной или нескольких дополнительных протеаз в клетке грибов Trichoderma снижен или их экспрессия устранена. В определенных вариантах осуществления каждый из генов, кодирующих одну или несколько дополнительных протеаз в клетке грибов Trichoderma, имеет мутацию, которая снижает или устраняет активность соответствующей протеазы. В определенных вариантах осуществления, которые могут быть комбинированы с предшествующими вариантами осуществления, один или несколько дополнительных генов, кодирующих протеазы, выбраны из pep7, pep8, pep11, pep12, tpp1, gap2, slp3, slp5, slp6, slp7 и slp8.

В определенных вариантах осуществления, которые могут быть комбинированы с предшествующими вариантами осуществления, клетка грибов Trichoderma дополнительно обладает сниженной или не поддающейся обнаружению активностью ALG3. В определенных вариантах осуществления ген, кодирующий ALG3 в клетке грибов Trichoderma, содержит мутацию, которая снижает или устраняет соответствующую активность. В определенных вариантах осуществления, которые могут быть комбинированы с предшествующими вариантами осуществления, клетка грибов Trichoderma дополнительно содержит полинуклеотид, кодирующий α-1,2-маннозидазу. В определенных вариантах осуществления, которые могут быть комбинированы с предшествующими вариантами осуществления, мутация снижает или устраняет экспрессию гена в клетке грибов Trichoderma. В определенных вариантах осуществления, которые могут быть комбинированы с предшествующими вариантами осуществления, мутация представляет собой делецию гена в клетке грибов Trichoderma. В определенных вариантах осуществления, которые могут быть комбинированы с предшествующими вариантами осуществления, мутация представляет собой делецию части гена, кодирующей каталитический домен протеазы в клетке грибов Trichoderma. В определенных вариантах осуществления, которые могут быть комбинированы с предшествующими вариантами осуществления, мутация представляет собой точковую мутацию в части гена, кодирующей каталитический домен протеазы в клетке грибов Trichoderma. В определенных вариантах осуществления, которые могут быть комбинированы с предшествующими вариантами осуществления, клетка грибов Trichoderma дополнительно содержит каталитический домен N-ацетилглюкозаминилтрансферазы I и каталитический домен N-ацетилглюкозаминилтрансферазы II. В определенных вариантах осуществления каталитический домен N-ацетилглюкозаминилтрансферазы I и каталитический домен N-ацетилглюкозаминилтрансферазы II кодируются полинуклеотидом клетки грибов Trichoderma. В определенных вариантах осуществления каталитический домен N-ацетилглюкозаминилтрансферазы I кодируется первым полинуклеотидом и каталитический домен N-ацетилглюкозаминилтрансфераза II кодируется вторым полинуклеотидом клетки грибов Trichoderma. В определенных вариантах осуществления, которые могут быть комбинированы с предшествующими вариантами осуществления, клетка грибов Trichoderma дополнительно содержит полинуклеотид, кодирующий маннозидазу II. В определенных вариантах осуществления каждая из протеаз обладает по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% идентичностью последовательности с аминокислотной последовательностью, выбранной из SEQ ID NO: 1, 17, 37, 58, 66, 82, 98, 118, 129, 166 и 182. В определенных вариантах осуществления общая протеазная активность в клетке грибов Trichoderma снижена до 49% или менее, 31% или менее от общей протеазной активности соответствующей родительской клетки Trichoderma, в которой протеазы не обладают сниженной активностью. В определенных вариантах осуществления, которые могут быть комбинированы с предшествующими вариантами осуществления, клетка дополнительно содержит рекомбинантный полинуклеотид, кодирующий полипептид млекопитающих, продуцируемый на уровне, который по меньшей мере в 2 раза превышает уровень продукции полипептида в соответствующей родительской клетке грибов Trichoderma. В определенных вариантах осуществления, которые могут быть комбинированы с предшествующими вариантами осуществления, полипептид млекопитающих продуцируется в полноразмерной версии на уровне, который превышает уровень продукции полипептида полноразмерной версии в соответствующей родительской клетке грибов Trichoderma.

Другой аспект включает способы повышения стабильности гетерологичного полипептида посредством: a) предоставления клетки грибов Trichoderma согласно любому из предшествующих вариантов осуществления; и b) культивирования клетки так, чтобы экспрессировался гетерологичный полипептид, где гетерологичный полипептид обладает повышенной стабильностью по сравнению с клеткой-хозяином, не содержащей мутации генов, кодирующих протеазы. Другой аспект включает способы получения гетерологичного полипептида путем: a) предоставления клетки грибов Trichoderma согласно любому из предшествующих вариантов осуществления; b) культивирования клетки-хозяина так, чтобы экспрессировался гетерологичный полипептид; и c) очистки гетерологичного полипептида. В определенных вариантах осуществления, которые могут быть комбинированы с предшествующими вариантами осуществления, клетка нитчатых грибов дополнительно содержит белок-носитель. В определенных вариантах осуществления белок-носитель представляет собой CBH1.

ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

На фиг.1 представлен гель PAGE, на котором показаны фракции, элюированные при очистке на аффинной колонке аспарагиновых протеаз.

На фиг.2 представлен гель PAGE, на которым показаны результаты инкубации IgG с аспарагиновыми протеазами.

На фиг.3 представлен анализ с использованием саузерн-блоттинга, демонстрирующий получение штаммов с делецией одной протеазы M181 и M195. На фиг.3A представлен ожидаемый сигнал pep1 ORF: >8 т.п.н. из родительского M127, у трансформантов сигнал отсутствует. На фиг.3B представлен ожидаемый сигнал 5'-фланкирующей области pep1: >8 т.п.н. из родительского M127, 4 т.п.н. из трансформантов. На фиг.3C представлен ожидаемый сигнал 3'-фланкирующей области pep1: >8 т.п.н. из родительского M127, 4,2 т.п.н. из трансформантов.

На фиг.4 представлен анализ с использованием саузерн-блоттинга, демонстрирующий получение антитела ритуксимаба в штамме с делецией pep1 M182. На фиг.4A представлен ожидаемый сигнал ORF pep1: >8 т.п.н. из родительского M169, у трансформантов сигнал отсутствует. На фиг.4B представлен ожидаемый сигнал bar: 1,0+1,7 т.п.н. из трансформантов, 3,1 т.п.н. из pTTv41, у M169 сигнал отсутствует. На фиг.4C представлен ожидаемый сигнал bar: 1,8+2,8 т.п.н. из трансформантов, 3,1 т.п.н. из pTTv41, у M169 сигнал отсутствует.

На фиг.5 представлен белковый гель, на котором показаны пиковые фракции при очистке аспарагиновых протеаз из штамма, содержащего pep1, и штамма Δpep1.

На фиг.6A-B представлен иммуноблот, иллюстрирующий, что делеция протеазы pep2 из продуцирующего ритуксимаб штамма М169 увеличивала продукцию (A) легкой и (B) тяжелой цепи в трансформанте 206A (штамм M455). Полосы, соответствующие фрагменту легкой цепи на уровне 18 кДа и фрагменту тяжелой цепи на уровне 38 кДа, были более интенсивными у штамма M455 по сравнению с родительским штаммом M169.

На фиг.7 графически изображена протеазная активность супернатанта из продуцирующего ритуксимаб штамма M169 и трансформантов с делецией протеаз pep2 98A, 116A, 198A, 201A и 206A (M455). Трансформанты 116A, 198A и 206A демонстрируют сниженную протеазную активность в отношении казеина по сравнению с их родительским штаммом М169.

На фиг.8 представлен иммуноблот, демонстрирующий эффекты протеазной активности PEP3 и PEP7 на тяжелую цепь MAB01 и нативный IGF-1. На фиг.8A представлены эффекты протеазной активности на MAB01 при pH 5,5. На фиг.8B представлены эффекты протеазной активности на MAB01 при pH 4,5. На фиг.8C представлены эффекты протеазной активности на нативный IGF-1 при pH 4,5.

На фиг.9 представлен гель PAGE, демонстрирующий протеазу, содержащую фракции, очищенные на аффинной колонке с пептидом SIP.

На фиг.10 представлен иммуноблот, демонстрирующий активность протеазы SIP в отношении тяжелой цепи MAB01.

На фиг.11 графически изображена протеазная активность в отношении казеина с ингибиторами и без них.

На фиг.12 представлен иммуноблот, демонстрирующий уровни продукции тяжелой и легкой цепей MAB01 после удаления каждой из протеаз slp1, slp2, slp3 и gap1. На фиг.12A представлена продукция тяжелой цепи MAB01. На фиг.12B представлена продукция легкой цепи MAB01.

На фиг.13 графически представлена кратность увеличения продукции тяжелой и легкой цепей MAB01 после делеции каждой из протеаз slp1, slp2, slp3 и gap1. Каждый столбик соответствует среднему значению для нескольких клонов, представленных на фиг.12.

На фиг.14 представлен иммуноблот, демонстрирующий уровни продукции MAB01 из штамма M244 с делецией gap2. На фиг.14A представлена продукция тяжелой цепи MAB01 (HC). На фиг.14B представлена продукция легкой цепи MAB01 (LC).

На фиг.15 представлен иммуноблот, демонстрирующий уровни антитела MAB01 после инкубации с супернатантом Pichia, содержащим протеазу GAP2.

На фиг.16 представлен иммуноблот, демонстрирующий уровень деградации IgG1 человека протеазой.

На фиг.17 представлены результаты зимографии антитела MAB02 после аффинной очистки с помощью колонки с аминобензамидином (очищенные фракции) и в образцах супернатантов (супернатант).

На фиг.18 представлено получение штамма M219 с делецией двух протеаз Δpep1Δtsp1. На фиг.18A представлен ожидаемый сигнал ORF tsp1: 6,4 т.п.н. из родительского M196. На фиг.18B представлен ожидаемый сигнал 5'-фланкирующей области tsp1: 3,9 т.п.н. из трансформантов, >8 т.п.н. из M196, 3,9 т.п.н. из pTTv72. На фиг.18C представлен ожидаемый сигнал 3'-фланкирующей области tsp1: 2,8 т.п.н. из трансформантов, >8 т.п.н. из M196, 3,9 т.п.н. из pTTv72.

На фиг.19 представлен анализ с использованием саузерн-блоттинга, демонстрирующий получение штамма М194 с двойной делецией Δpep1Δtsp2. На фиг.19A представлен ожидаемый сигнал ORF tsp1: т.п.н. из родительского M181. На фиг.19B представлен ожидаемый сигнал bar: 1,4+2,5 т.п.н. из трансформантов, 2,9 т.п.н. pTTv42, у М181 сигнал отсутствует. На фиг.19C представлен ожидаемый сигнал bar: 1,9+3,2 т.п.н. из трансформантов, 2,9 т.п.н. из pTTv42, у М181 сигнал отсутствует.

На фиг.20 графически представлены нормализованные данные о протеазной активности из культуральных супернатантов каждого из супернатантов с делецией протеазы и родительского штамма M124. Протеазную активность измеряли при pH 5,5 в первых 5 штаммах и при pH 4,5 в последних трех штаммах с делецией. Протеазная активность представлена в отношении зеленого флуоресцентного казеина. Штамм с делецией шести протеаз имеет только 6% от протеазной активности родительского штамма дикого типа, и протеазная активность штамма с делецией 7 протеаз была приблизительно на 40% меньшей, чем активность штамма с делецией 6 протеаз.

На фиг.21A представлены результаты зимографии MAB02 с очищенными с помощью аминобензамидина фракциями из супернатантов ферментации. На фиг.21B представлен гель SDS PAGE (7%) с очищенными с помощью аминобензамидина фракциями из супернатантов ферментации.

На фиг.22 представлены результаты зимографии MAB02 с подвергнутыми аффинной очистке с помощью SBTI фракциями, содержащими протеазы. Основная протеолитическая активность, где протеаза деградировала антитело MAB02, выглядит белой. В геле для зимографии разделяли концентрированную фракцию 3 (cf3) и неконцентрированные фракции 1-4 (f1-f4).

На фиг.23 представлен гель SDS PAGE, демонстрирующий подвергнутые аффинной очистке с помощью SBTI фракции, содержащие протеазы. На геле представлены концентрированные фракции cf3 и cf4.

На фиг.24 представлен иммуноблот, демонстрирующий уровень деградации тяжелой цепи ритуксимаба очищенными с помощью SBTI протеазами.

На фиг.25 представлен иммуноблот, демонстрирующий уровень деградации антитела при инкубации в течение ночи с содержащими субтилизин супернатантами Pichia. На фиг.25A представлена деградация протеазой тяжелой цепи ритуксимаба. На фиг.25B представлена деградация протеазой тяжелой цепи MAB01.

На фиг.26 представлен анализ с использованием саузерн-блоттинга, демонстрирующий получение штамма M277 с делецией трех протеаз. На фиг.26A представлен ожидаемый сигнал ORF slp1: 6,5 т.п.н. только из родительских штаммов (M219, M228). На фиг.26B представлен ожидаемый сигнал 5'-фланкирующей области slp1: 6,5 т.п.н. из родительских штаммов, 3,3 т.п.н. из трансформантов, 4,4 т.п.н. из контрольной плазмиды pTTv126. На фиг.26C представлен ожидаемый сигнал 3'-фланкирующей области slp1: 6,5 т.п.н. из родительских штаммов, 2,3 т.п.н. из трансформантов, 4,4 т.п.н. из контрольной плазмиды pTTv126.

На фиг.27 представлена зимография MAB02, демонстрирующая активность супернатантов штаммов с делецией протеаз. Белые области на окрашенном геле указывают на область активности протеазы.

На фиг.28 графически представлена общая протеазная активность культуральных супернатантов с делецией протеазы по сравнению с активностью М124 дикого типа.

На фиг.29 представлен анализ с использованием саузерн-блоттинга, демонстрирующий получение штамма M307 с делецией четырех протеаз. На фиг.29A представлен ожидаемый сигнал ORF gap1: 4 т.п.н. только из родительского штамма (M277 2A=M306). На фиг.29B представлен ожидаемый сигнал 5'-фланкирующей области gap1: 5,5 т.п.н. из родительского штамма, 3,4 т.п.н. из трансформантов, 4,1 т.п.н. из контрольной плазмиды pTTv117. На фиг.29C представлен ожидаемый сигнал 3'-фланкирующей области gap1: 5,5 т.п.н. из родительского штамма, 3,1 т.п.н. из трансформантов, 4,1 т.п.н. из контрольной плазмиды pTTv117.

На фиг.30 графически представлена общая протеазная активность в штаммах с тремя и четырьмя делециями по сравнению со штаммом М124 дикого типа.

На фиг.31 графически представлена протеазная активность с течением времени для штамма M304 с тремя делециями и штамма M371 с четырьмя делециями.

На фиг.32 представлен анализ с использованием саузерн-блоттинга, демонстрирующий получение штамма M369 с делецией пяти протеаз. На фиг.32A представлен ожидаемый сигнал ORF gap2: 4,9 т.п.н. из родительского штамма (M307). На фиг.32B представлен ожидаемый сигнал 5'-фланкирующей области gap2: 4,9 т.п.н. из родительского штамма, 2,3 т.п.н. из трансформанта, 2,3 т.п.н. из контрольной плазмиды pTTv145. На фиг.32C представлен ожидаемый сигнал 3'-фланкирующей области gap2: 4,9 т.п.н. из родительского штамма, 3,8 т.п.н. из трансформантов, 3,8 т.п.н. из контрольной плазмиды pTTv145. На фиг.32D представлен анализ с использованием саузерн-блоттинга, демонстрирующий получение pyr4- из штамма с делецией пяти протеаз M369, конечного штамма M381 (клон 14). Ожидаемый сигнал на 5'-фланкирующей области представляет собой: 1,5 т.п.н. из всех штаммов, 4,1 т.п.н. из контрольной плазмиды pTTv145. На фиг.32E представлен анализ с использованием саузерн-блоттинга, демонстрирующий получение pyr4- из штамма с делецией пяти протеаз M369 с получением штамма M381 (клон 14). Ожидаемый сигнал 3'-фланкирующей области представляет собой: 3,6 т.п.н. из M307, 2,7 т.п.н. из M369 + клоны с выпетливанием, 3,8 т.п.н. из контрольной плазмиды pTTv145.

На фиг.33 графически представлена протеазная активность супернатантов, по