Опосредованное нуклеазой нацеливание с большими нацеливающими векторами

Опосредованное нуклеазой нацеливание с большими нацеливающими векторами

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Перекрестная ссылка на родственные заявки

Настоящая заявка испрашивает приоритет по предварительной заявке US 61/638,267, поданной 25 апреля 2012, которая включена в данное описание посредством ссылки во всей своей полноте.

Область техники, к которой относится изобретение

Нуклеазы и конструкции ДНК, включая нацеливающие векторы (например, большие нацеливающие векторы (large targeting vectors, "LTVEC"), предназначенные для достижения гомологичной рекомбинации в целевом геномном локусе. Композиции и способы осуществления целевой генетической модификации путем гомологичной рекомбинации, которой способствуют одно- или двухцепочечные разрывы в целевом геномном локусе или около него. Композиции и способы для улучшения эффективности гомологичной рекомбинации между LTVEC и целевым геномным локусом в прокариотических или эукариотических клетках, использующие сконструированные нуклеазы.

Уровень техники

Гомологичная рекомбинация с использованием нацеливающих векторов, которые специально разработаны для того, чтобы добавить, удалить или заменить определенную нуклеотидную последовательность в геномном локусе, представляет собой популярный подход к достижению желаемой геномной модификации у животных, не являющихся человеком. Нуклеаза, которая специально разработана для введения одно- или двухцепочечного разрыва в целевом геномном локусе или около него, может использоваться вместе с нацеливающим вектором для того, чтобы повысить эффективность гомологичной рекомбинации в целевом геномном локусе.

Хотя область техники модификации генома посредством гомологичной рекомбинации значительно продвинулась за последние два десятилетия, во многих случаях все еще остаются трудности, связанные с достижением приемлемой частоты попадания в цель при использовании очень больших нацеливающих векторов, LTVEC, например, когда большой участок генома грызуна заменен большим фрагментом человеческого генома, или трудности, связанные с нацеливанием на определенные типы клеток, например, фибробласты или другие соматические клетки. Данная область техники нуждается в дальнейших и более совершенных способах модификации больших геномных локусов в эукариотическом геноме с использованием LTVEC.

Сущность изобретения

Настоящее изобретение относится к композициям и способам модификации геномного локуса, представляющего интерес, с использованием большого нацеливающего вектора (LTVEC) в сочетании с нуклеазным агентом, которые позволяют эффективно проводить удаление, добавление (например, инсерцию), и/или замену большой нуклеотидной последовательности в геномном локусе, представляющем интерес.

Настоящее изобретение относится к композициям и способам модификации целевого геномного локуса млекопитающего в прокариотической клетке с использованием LTVEC и нуклеазного агента посредством бактериальной гомологичной рекомбинации (bacterial homologous recombination, BHR), где рекомбинации BHR способствует одно- или двухцепочечное расщепление в целевом геномном локусе или около него, созданное нуклеазным агентом. Настоящее изобретение относится к прокариотическим клеткам, содержащим LTVEC и нуклеазный агент, который при экспрессии способен к введению одно-ил и двухцепочечного расщепления в целевом сайте или около него. Настоящее изобретение относится к композициям и способам замены большого геномного локуса животного, не являющегося человеком, экзогенной нуклеотидной последовательностью, например, гомологичными или ортологичными геномными нуклеотидными последовательностями человека, в рекомбинантной прокариотической клетке, используя различные LTVEC и нуклеазы, как описано здесь.

Настоящее изобретение относится к композициям и способам модификации геномного локуса, представляющего интерес, с использованием LTVEC и нуклеазного агента в различных плюрипотентных клетках млекопитающих. Настоящее изобретение относится к композициям и способам замены большого геномного локуса из животного, не являющегося человеком, экзогенной нуклеотидной последовательностью, например, гомологичными или ортологичными геномными нуклеотидными последовательностями человека, в плюрипотентной клетке животного, не являющегося человеком, используя различные LTVEC и нуклеазы, как описано здесь.

Настоящее изобретение относится к плюрипотентным клеткам из животного, не являющегося человеком, содержащим различные LTVEC и нуклеазные агенты, описанные здесь.

Настоящее изобретение относится к композициям и способам получения генетически модифицированного животного, не являющегося человеком, содержащим одну или более целевых генетических модификаций, как описано здесь.

Один из объектов настоящего изобретения относится к прокариотической клетке, содержащей большой нацеливающий вектор (LTVEC), содержащий гомологичные плечи, направленные на целевой локус, и нуклеотидную последовательность, кодирующую нуклеазный агент, который осуществляет одно- или двухцепочечный разрыв в целевом геномном локусе или около него.

В одном варианте осуществления прокариотическая клетка способна экспрессировать рекомбиназу, которая опосредует бактериальную гомологичную рекомбинацию (BHR). В одном варианте осуществления прокариотическая клетка представляет собой способный к рекомбинации (компетентный) штамм E.coli.

В одном из вариантов осуществления длина LTVEC составляет от около 50 т.н. до около 300 т.н. В одном из вариантов осуществления длина LTVEC составляет от около 50 т.н. до около 75 т.н. В одном из вариантов осуществления длина LTVEC составляет от около 75 т.н. до около 100 т.н. В одном из вариантов осуществления длина LTVEC составляет от около 100 т.н. до 125 т.н. В одном из вариантов осуществления длина LTVEC составляет от около 125 т.н. до около 150 т.н. В одном из вариантов осуществления длина LTVEC составляет от около 150 т.н. до около 175 т.н. В одном из вариантов осуществления длина LTVEC составляет от около 175 т.н. до около 200 т.н. В одном из вариантов осуществления длина LTVEC составляет от около 200 т.н. до около 225 т.н. В одном из вариантов осуществления длина LTVEC составляет от около 225 т.н. до около 250 т.н. В одном из вариантов осуществления длина LTVEC составляет от около 250 т.н. до около 275 т.н. В одном из вариантов осуществления длина LTVEC составляет от около 27 5Кб до около 300 т.н.

В одном из вариантов осуществления гомологичные плечи нацеливающего вектора происходят из ВАС-библиотеки, космидной библиотеки или библиотеки фага Р1. В одном из вариантов осуществления гомологичные плечи происходят из геномного локуса животного, не являющегося человеком, который не может служить целью при использовании стандартного способа. В одном из вариантов осуществления гомологичные плечи получены из синтетической ДНК.

В одном из вариантов осуществления общая суммарная длина вышележащего гомологичного плеча и нижележащего гомологичного плеча составляет по меньшей мере 10 т.н. В одном из вариантов осуществления длина вышележащего гомологичного плеча составляет от около 5 т.н. до около 100 т.н. В одном из вариантов осуществления длина нижележащего гомологичного плеча составляет от около 5 т.н. до около 100 т.н. В одном из вариантов осуществления длина вышележащего и нижележащего гомологичных плеч составляет от около 5 т.н. до около 10 т.н. В одном из вариантов осуществления длина вышележащего и нижележащего гомологичных плеч составляет от около 10 т.н. до около 20 т.н. В одном из вариантов осуществления длина вышележащего и нижележащего гомологичного плеча составляет от около 20 т.н. до около 30 т.н. В одном из вариантов осуществления длина вышележащего и нижележащего гомологичных плеч составляет от около 30 т.н. до около 40 т.н. В одном из вариантов осуществления длина вышележащего и нижележащего гомологичных плеч составляет от около 40 т.н. до около 50 т.н. В одном из вариантов осуществления длина вышележащего и нижележащего гомологичных плеч составляет от около 50 т.н. до около 60 т.н. В одном из вариантов осуществления длина вышележащего и нижележащего гомологичных плеч составляет от около 60 т.н. до около 70 т.н. В одном из вариантов осуществления длина вышележащего и нижележащего гомологичных плеч составляет от около 70 т.н. до около 80 т.н. В одном из вариантов осуществления длина вышележащего и нижележащего гомологичных плеч составляет от около 80 т.н. до около 90 т.н. В одном из вариантов осуществления длина вышележащего и нижележащего гомологичных плеч составляет от около 90 т.н. до около 100 т.н. В одном из вариантов осуществления длина вышележащего и нижележащего гомологичных плеч составляет от около 100 т.н. до около 110 т.н. В одном из вариантов осуществления длина вышележащего и нижележащего гомологичных плеч составляет от около 110 т.н. до около 120 т.н. В одном из вариантов осуществления длина вышележащего и нижележащего гомологичных плеч составляет от около 120 т.н. до около 130 т.н. В одном из вариантов осуществления длина вышележащего и нижележащего гомологичных плеч составляет от около 130 т.н. до около 140 т.н. В одном из вариантов осуществления длина вышележащего и нижележащего гомологичных плеч составляет от около 140 т.н. до около 150 т.н. В одном из вариантов осуществления длина вышележащего и нижележащего гомологичных плеч составляет от около 150 т.н. до около 160 т.н. В одном из вариантов осуществления длина вышележащего и нижележащего гомологичных плеч составляет от около 160 т.н. до около 170 т.н. В одном из вариантов осуществления длина вышележащего и нижележащего гомологичных плеч составляет от около 170 т.н. до около 180 т.н. В одном из вариантов осуществления длина вышележащего и нижележащего гомологичных плеч составляет от около 180 т.н. до около 190 т.н. В одном из вариантов осуществления длина вышележащего и нижележащего гомологичных плеч составляет от около 190 т.н. до около 200 т.н.

В одном из вариантов осуществления LTVEC содержит кассету селекции. В одном варианте кассета селекции содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую селективный маркер, где нуклеотидная последовательность функционально связана с промотором. В одном варианте осуществления промотор активен в прокариотической клетке. В одном варианте осуществления промотор активен как в прокариотической, так и в эукариотической клетках. В одном из вариантов осуществления селективный маркер выбирают из неомицинфосфотрансферазы (neo^r), гигромицин-В-фосфотрансферазы (hyg^r), пуромицин-N-ацетилтрансферазы (puro^r), бластицидин-S-деаминазы (bsr^r), ксантин/гуанинфосфорибозилтрансферазы (bsr^r) и тимидинкиназы простого вируса герпеса (HSV-k) и их комбинации.

В одном из вариантов осуществления LTVEC содержит нуклеотидную вставку с длиной в диапазоне от около 5 т.н. до около 200 т.н. В одном из вариантов осуществления длина нуклеотидной вставки составляет от около 5 т.н. до около 10 т.н. В одном из вариантов осуществления длина нуклеотидной вставки составляет от около 10 т.н. до 20 т.н. В одном из вариантов осуществления длина нуклеотидной вставки составляет от около 20 т.н. до 30 т.н. В одном из вариантов осуществления длина нуклеотидной вставки составляет от около 30 т.н. до 40 т.н. В одном из вариантов осуществления длина нуклеотидной вставки составляет от около 40 т.н. до около 50 т.н. В одном из вариантов осуществления длина нуклеотидной вставки составляет от около 60 т.н. до 70 т.н. В одном из вариантов осуществления длина нуклеотидной вставки составляет от около 80 т.н. до около 90 т.н. В одном из вариантов осуществления длина нуклеотидной вставки составляет от около 90 т.н. до около 100 т.н. В одном из вариантов осуществления длина нуклеотидной вставки составляет от около 100 т.н. до около 110 т.н. В одном из вариантов осуществления длина нуклеотидной вставки составляет от около 120 т.н. до около 130 т.н. В одном из вариантов осуществления длина нуклеотидной вставки составляет от около 130 т.н. до около 140 т.н. В одном из вариантов осуществления длина нуклеотидной вставки составляет от около 140 т.н. до около 150 т.н. В одном из вариантов осуществления длина нуклеотидной вставки составляет от около 150 т.н. до около 160 т.н. В одном из вариантов осуществления длина нуклеотидной вставки составляет от около 160 т.н. до около 170 т.н. В одном из вариантов осуществления длина нуклеотидной вставки составляет от около 170 т.н. до около 180 т.н. В одном из вариантов осуществления длина нуклеотидной вставки составляет от около 180 т.н. до 190 т.н. В одном из вариантов осуществления длина нуклеотидной вставки составляет от около 190 т.н. до около 200 т.н.

В одном из вариантов осуществления LTVEC содержит нуклеотидную вставку, содержащую нуклеиновую кислоту, фланкированную целевыми последовательностями для сайт-специфической рекомбинации. В одном из вариантов осуществления нуклеиновая кислота содержит геномную нуклеиновую кислоту. В одном из вариантов осуществления геномная нуклеиновая кислота происходит от мыши, человека или их комбинации. В одном из вариантов осуществления целевые последовательности для сайт-специфической рекомбинации выбраны из группы, состоящей из lοxΡ, lοx511, lοx2272, lοx66, lox71, loxM2, lox5171, FRT, FRT11, FRT71, attp, att, FRT, rox и их комбинации.

В одном из вариантов осуществления LTVEC содержит нуклеотидную вставку, содержащую условный (conditional) аллель. В одном из вариантов осуществления условный аллель представляет собой многофункциональный аллель, как описано в US 2011/0104799, который включен посредством ссылки в полном объеме. В одном из вариантов осуществления условный аллель содержит: (а) действующую последовательность (actuating sequence) в смысловой ориентации относительно направления транскрипции целевого гена и кассету для селекции на устойчивость против лекарственного средства (drug selection cassette (DSC)) в смысловой или антисмысловой ориентации; (b) представляющую интерес нуклеотидную последовательность (nucleotide sequence of interest (NSI)) в антисмысловой ориентации и модуль COIN (conditional by inversion module), который использует экзон-расщепляющий интрон (exon-splitting intron), и обратимый, подобный генной ловушке (invertible genetrap-like) модуль; смотри, например, US 2011/0104799, который включен посредством ссылки в полном объеме); и (с) способные к рекомбинации блоки, которые рекомбинируют при воздействии первой рекомбиназы с образованием условного аллеля, в котором (i) отсутствует действующая последовательность и DSC, и (ii) содержится NSI в смысловой ориентации и COIN в антисмысловой ориентации.

В одном из вариантов осуществления LTVEC содержит нуклеотидную вставку, содержащую кассету селекции. В одном варианте осуществления кассета селекции содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую селективный маркер, причем нуклеотидная последовательность функционально связана с промотором. В одном варианте осуществления промотор активен в прокариотической клетке. В одном из вариантов осуществления нуклеиновая кислота является активной как в прокариотической, так и в эукариотической клетках. В одном варианте осуществления кассета селекции фланкирована целевыми последовательностями для сайт-специфической рекомбинации. В одном из вариантов осуществления селективный маркер выбирают из неомицинфосфотрансферазы (neo^r), гигромицин-В-фосфотрансферазы (hyg^r), пуромицин-N-ацетилтрансферазы (puro^r), бластицидин-S-деаминазы (bsr^r), ксантин/гуанинфосфорибозилтрансферазы (bsr^r) и тимидинкиназы простого вируса герпеса (HSV-k) и их комбинации.

В одном из вариантов осуществления LTVEC содержит нуклеотидную вставку, содержащую репортерный ген, функционально связанный с промотором, где репортерный ген кодирует репортерный белок, выбранный из группы, состоящей из LacZ, mPlum, mCherry, tdTomato, mStrawberry, J-Red, DsRed, mOrange, mKO, mCitrine, Venus, YPet, усиленного желтого флуоресцентного белка (EYFP), Emerald, усиленного зеленого флуоресцентного белка (EGFP), CyPet, голубого флуоресцентного белка (CFP), Cerulean, T-Sapphire, люциферазы, щелочной фосфатазы, а также их комбинации. В одном из вариантов осуществления репортерный ген экспрессируется под контролем индуцируемого промотора. В одном варианте осуществления репортерный ген экспрессируется под контролем эндогенного промотора. В одном варианте осуществления репортерный ген экспрессируется под контролем экзогенного промотора. В одном варианте осуществления репортерный ген экспрессируется в определенном типе клеток. В одном из вариантов осуществления репортерный ген экспрессируется в специфической ткани. В одном из вариантов осуществления репортерный ген экспрессируется на специфической стадии развития.

Один из объектов настоящего изобретения относится к эукариотической клетке, содержащей большой нацеливающий вектор, содержащий гомологичные плечи, направленные к целевому локусу в геноме эукариотической клетки, и нуклеотидную последовательность, кодирующую нуклеазный агент, который осуществляет одно- или двухцепочечный разрыв в целевом локусе или около него.

В одном из вариантов осуществления эукариотическая клетка представляет собой плюрипотентную клетку. В одном из вариантов осуществления плюрипотентная клетка представляет собой эмбриональную стволовую (embryonic stem (ES)) клетку. В одном из вариантов осуществления плюрипотентная клетка представляет собой ES-клетку не человека. В одном из вариантов осуществления плюрипотентная клетка представляет собой индуцированную плюрипотентную стволовую (induced pluripotent stem (iPS)) клетку. В одном из вариантов осуществления индуцированная плюрипотентная (iPS) клетка происходит от фибробласта. В одном из вариантов осуществления индуцированная плюрипотентная (iPS) клетка происходит от человеческого фибробласта. В одном из вариантов осуществления плюрипотентная клетка представляет собой гемопоэтическую стволовую клетку (hematopoietic stem cell (HSC)). В одном из вариантов осуществления плюрипотентная клетка представляет собой нейрональную стволовую клетку (neuronal stem cell (NSC)). В одном из вариантов осуществления плюрипотентная клетка представляет собой эпибластную стволовую клетку. В одном из вариантов осуществления плюрипотентная клетка представляет собой клетку-предшественника с ограниченными потенциями к развитию. В одном из вариантов осуществления плюрипотентная клетка представляет собой плюрипотентную клетку грызуна. В одном из вариантов осуществления плюрипотентная клетка грызуна представляет собой крысиную плюрипотентную клетку. В одном из вариантов осуществления крысиная плюрипотентная клетка представляет собой ES-клетку крысы. В одном из вариантов осуществления плюрипотентная клетка грызуна представляет собой мышиную плюрипотентную клетку. В одном из вариантов осуществления плюрипотентная клетка представляет собой мышиную эмбриональную стволовую (ES) клетку.

В одном из вариантов осуществления эукариотическая клетка представляет собой иммортализованную клетку мыши или крысы. В одном из вариантов осуществления эукариотическая клетка представляет собой иммортализованную человеческую клетку. В одном из вариантов осуществления эукариотическая клетка представляет собой фибробласт человека. В одном из вариантов осуществления эукариотическая клетка представляет собой раковую клетку. В одном из вариантов осуществления эукариотическая клетка представляет собой человеческую раковую клетку.

В одном из вариантов осуществления длина LTVEC составляет от около 50 т.н. до около 300 т.н. В одном из вариантов осуществления длина LTVEC составляет от около 50 т.н. до около 75 т.н. В одном из вариантов осуществления длина LTVEC составляет от около 75 т.н. до около 100 т.н. В одном из вариантов осуществления длина LTVEC составляет от около 100 т.н. до около 125 т.н. В одном из вариантов осуществления длина LTVEC составляет от около 125 т.н. до около 150 т.н. В одном из вариантов осуществления длина LTVEC составляет от около 150 т.н. до около 175 т.н. В одном из вариантов осуществления LTVEC в диапазоне от около 175 т.н. до около 200 т.н. В одном из вариантов осуществления длина LTVEC составляет от около 200 т.н. до около 225 т.н. В одном из вариантов осуществления LTVEC в диапазоне от около 225 т.н. до около 250 т.н. В одном из вариантов осуществления длина LTVEC составляет от около 250 т.н. до около 275 т.н. В одном из вариантов осуществления LTVEC в диапазоне от около 275 т.н. до около 300 т.н.

В одном из вариантов осуществления гомологичные плечи нацеливающего вектора происходят из ВАС-библиотеки, космидной библиотеки или библиотеки фага Р1. В одном из вариантов осуществления гомологичные плечи происходят из геномного локуса животного, не являющегося человеком, который не может служить целью при использовании стандартного способа. В одном из вариантов осуществления гомологичные плечи получены из синтетической ДНК.

В одном из вариантов осуществления общая суммарная длина вышележащего гомологичного плеча и нижележащего гомологичного плеча составляет по меньшей мере 10 т.н. В одном из вариантов осуществления длина вышележащего гомологичного плеча составляет от около 5 т.н. до около 100 т.н. В одном из вариантов осуществления длина нижележащего гомологичного плеча составляет от около 5 т.н. до около 100 т.н. В одном из вариантов осуществления длина вышележащего и нижележащего гомологичных плеч составляет от около 5 т.н. до около 10 т.н. В одном из вариантов осуществления длина вышележащего и нижележащего гомологичных плеч составляет от около 10 т.н. до около 20 т.н. В одном из вариантов осуществления длина вышележащего и нижележащего гомологичных плеч составляет от около 20 т.н. до около 30 т.н. В одном из вариантов осуществления длина вышележащего и нижележащего гомологичных плеч составляет от около 30 т.н. до около 40 т.н. В одном из вариантов осуществления длина вышележащего и нижележащего гомологичных плеч составляет от около 40 т.н. до около 50 т.н. В одном из вариантов осуществления длина вышележащего и нижележащего гомологичных плеч составляет от около 50 т.н. до около 60 т.н. В одном из вариантов осуществления длина вышележащего и нижележащего гомологичных плеч составляет от около 60 т.н. до около 70 т.н. В одном из вариантов осуществления длина вышележащего и нижележащего гомологичных плеч составляет от около 70 т.н. до около 80 т.н. В одном из вариантов осуществления длина вышележащего и нижележащего гомологичных плеч составляет от около 80 т.н. до около 90 т.н. В одном из вариантов осуществления длина вышележащего и нижележащего гомологичных плеч составляет от около 90 т.н. до около 100 т.н. В одном из вариантов осуществления длина вышележащего и нижележащего гомологичных плеч составляет от около 100 т.н. до около 110 т.н. В одном из вариантов осуществления длина вышележащего и нижележащего гомологичных плеч составляет от около 110 т.н. до около 120 т.н. В одном из вариантов осуществления длина вышележащего и нижележащего гомологичных плеч составляет от около 120 т.н. до около 130 т.н. В одном из вариантов осуществления длина вышележащего и нижележащего гомологичных плеч составляет от около 130 т.н. до около 140 т.н. В одном из вариантов осуществления длина вышележащего и нижележащего гомологичных плеч составляет от около 140 т.н. до около 150 т.н. В одном из вариантов осуществления длина вышележащего и нижележащего гомологичных плеч составляет от около 150 т.н. до около 160 т.н. В одном из вариантов осуществления длина вышележащего и нижележащего гомологичных плеч составляет от около 160 т.н. до около 170 т.н. В одном из вариантов осуществления длина вышележащего и нижележащего гомологичных плеч составляет от около 170 т.н. до около 180 т.н. В одном из вариантов осуществления длина вышележащего и нижележащего гомологичных плеч составляет от около 180 т.н. до около 190 т.н. В одном из вариантов осуществления длина вышележащего и нижележащего гомологичных плеч составляет от около 190 т.н. до около 200 т.н.

В одном из вариантов осуществления LTVEC содержит кассету селекции. В одном варианте кассета селекции содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую селективный маркер, где нуклеотидная последовательность функционально связана с промотором. В одном варианте осуществления промотор активен в прокариотической клетке. В одном варианте осуществления промотор активен как в прокариотической, так и в эукариотической клетках. В одном из вариантов осуществления селективный маркер выбирают из неомицинфосфотрансферазы (neo^r), гигромицин-В-фосфотрансферазы (hyg^r), пуромицин-N-ацетилтрансферазы (puro^r), бластицидин-S-деаминазы (bsr^r), ксантин/гуанинфосфорибозилтрансферазы (bsr^r) и тимидинкиназы простого вируса герпеса (HSV-k) и их комбинации.

В одном из вариантов осуществления LTVEC содержит нуклеотидную вставку с длиной в диапазоне от около 5 т.н. до около 200 т.н. В одном из вариантов осуществления длина нуклеотидной вставки составляет от около 5 т.н. до около 10 т.н. В одном из вариантов осуществления длина нуклеотидной вставки составляет от около 10 т.н. до 20 т.н. В одном из вариантов осуществления длина нуклеотидной вставки составляет от около 20 т.н. до 30 т.н. В одном из вариантов осуществления длина нуклеотидной вставки составляет от около 30 т.н. до 40 т.н. В одном из вариантов осуществления длина нуклеотидной вставки составляет от около 40 т.н. до около 50 т.н. В одном из вариантов осуществления длина нуклеотидной вставки составляет от около 60 т.н. до 70 т.н. В одном из вариантов осуществления длина нуклеотидной вставки составляет от около 80 т.н. до около 90 т.н. В одном из вариантов осуществления длина нуклеотидной вставки составляет от около 90 т.н. до около 100 т.н. В одном из вариантов осуществления длина нуклеотидной вставки составляет от около 100 т.н. до около 110 т.н. В одном из вариантов осуществления длина нуклеотидной вставки составляет от около 120 т.н. до около 130 т.н. В одном из вариантов осуществления длина нуклеотидной вставки составляет от около 130 т.н. до около 140 т.н. В одном из вариантов осуществления длина нуклеотидной вставки составляет от около 140 т.н. до около 150 т.н. В одном из вариантов осуществления длина нуклеотидной вставки составляет от около 150 т.н. до около 160 т.н. В одном из вариантов осуществления длина нуклеотидной вставки составляет от около 160 т.н. до около 170 т.н. В одном из вариантов осуществления длина нуклеотидной вставки составляет от около 170 т.н. до около 180 т.н. В одном из вариантов осуществления длина нуклеотидной вставки составляет от около 180 т.н. до 190 т.н. В одном из вариантов осуществления длина нуклеотидной вставки составляет от около 190 т.н. до около 200 т.н.

В одном из вариантов осуществления LTVEC содержит нуклеотидную вставку, содержащую нуклеиновую кислоту, фланкированную целевыми последовательностями для сайт-специфической рекомбинации. В одном из вариантов осуществления нуклеиновая кислота содержит геномную нуклеиновую кислоту. В одном из вариантов осуществления геномная нуклеиновая кислота происходит от мыши, человека или их комбинации. В одном из вариантов осуществления целевые последовательности для сайт-специфической рекомбинации выбраны из группы, состоящей из lοxΡ, lοx511, lοx2272, lοx66, lοx71, lοxΜ2, lοx5171, FRT, FRT11, FRT71, attp, att, FRT, rox и их комбинации.

В одном из вариантов осуществления LTVEC содержит нуклеотидную вставку, содержащую условный аллель. В одном из вариантов осуществления условный аллель представляет собой многофункциональный аллель, как описано в US 2011/0104799, который включен посредством ссылки в полном объеме. В одном из вариантов осуществления условный аллель содержит: (а) действующую последовательность (actuating sequence) в смысловой ориентации относительно направления транскрипции целевого гена и кассету для селекции на устойчивость против лекарственного средства (drug selection cassette (DSC)) в смысловой или антисмысловой ориентации; (b) представляющую интерес нуклеотидную последовательность (nucleotide sequence of interest (NSI)) в антисмысловой ориентации и модуль COIN (conditional by inversion module), который использует экзон-расщепляющий интрон (exon-splitting intron), и обратимый, подобный генной ловушке (invertible genetrap-like) модуль; смотри, например, US 2011/0104799, который включен посредством ссылки в полном объеме); и (с) способные к рекомбинации блоки, которые рекомбинируют при воздействии первой рекомбиназы с образованием условного аллеля, в котором (i) отсутствует действующая последовательность и DSC, и (ii) содержится NSI в смысловой ориентации и COIN в антисмысловой ориентации.

В одном из вариантов осуществления LTVEC содержит нуклеотидную вставку, содержащую кассету селекции. В одном варианте осуществления кассета селекции содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую селективный маркер, где нуклеотидная последовательность функционально связана с промотором. В одном варианте осуществления промотор активен в прокариотической клетке. В одном из вариантов осуществления нуклеиновая кислота является активной как в прокариотической, так и в эукариотической клетках. В одном варианте осуществления кассета селекции фланкирована целевыми последовательностями для сайт-специфической рекомбинации. В одном из вариантов осуществления селективный маркер выбирают из неомицинфосфотрансферазы (neo^r), гигромицин-В-фосфотрансферазы (hyg^r), пуромицин-N-ацетилтрансферазы (puro^r), бластицидин-S-деаминазы (bsr^r), ксантин/гуанинфосфорибозилтрансферазы (bsr^r) и тимидинкиназы простого вируса герпеса (HSV-k) и их комбинации.

В одном из вариантов осуществления LTVEC содержит нуклеотидную вставку, содержащую репортерный ген, функционально связанный с промотором, где репортерный ген кодирует репортерный белок, выбранный из группы, состоящей из LacZ, mPlum, mCherry, tdTomato, mStrawberry, J-Red, DsRed, mOrange, mKO, mCitrine, Venus, YPet, усиленного желтого флуоресцентного белка (EYFP), Emerald, усиленного зеленого флуоресцентного белка (EGFP), CyPet, голубого флуоресцентного белка (CFP), Cerulean, T-Sapphire, люциферазы, щелочной фосфатазы, а также их комбинации. В одном из вариантов осуществления репортерный ген экспрессируется под контролем индуцируемого промотора. В одном варианте осуществления репортерный ген экспрессируется под контролем эндогенного промотора. В одном варианте осуществления репортерный ген экспрессируется под контролем экзогенного промотора. В одном варианте осуществления репортерный ген экспрессируется в определенном типе клеток. В одном из вариантов осуществления репортерный ген экспрессируется в специфической ткани. В одном из вариантов осуществления репортерный ген экспрессируется на специфической стадии развития.

Один из объектов настоящего изобретения относится к способу модификации целевого геномного локуса в клетке млекопитающего с помощью бактериальной гомологичной рекомбинации (BHR) в прокариотической клетке, содержащему:

(a) введение в прокариотическую клетку, включающую целевой геномный локус млекопитающего:

(i) нацеливающего вектора, содержащего нуклеотидную вставку, фланкированную первым вышележащим гомологичным плечом и первым нижележащим гомологичным плечом, и

(ii) нуклеазного агента, который осуществляет одно- или двухцепочечной разрыв в целевом геномном локусе или около него, и

(b) отбор целевой прокариотической клетки, содержащей нуклеотидную вставку,

где прокариотическая клетка способна экспрессировать рекомбиназу, которая опосредует BHR.

В одном из вариантов осуществления целевой геномный локус выбирают из локуса FcER1a, локуса TLR4, локуса PRLR, локуса Notch4, локуса Accn2, локуса Adamts5, локуса TRPA1, локуса FolH1, локуса LRP5 и локуса ERBB4.

В одном из вариантов осуществления целевой геномный локус присутствует в большом нацеливающем векторе (LTVEC), содержащем второе вышележащее гомологичное плечо и второе нижележащее гомологичное плечо. В одном из вариантов осуществления общая суммарная длина вышележащего гомологичного плеча и нижележащего гомологичного плеча составляет по меньшей мере 10 т.н. В одном из вариантов осуществления длина вышележащего гомологичного плеча составляет от около 5 т.н. до около 100 т.н. В одном из вариантов осуществления длина нижележащего гомологичного плеча составляет от около 5 т.н. до около 100 т.н. В одном из вариантов осуществления длина вышележащего и нижележащего гомологичных плеч составляет от около 5 т.н. до около 10 т.н. В одном из вариантов осуществления длина вышележащего и нижележащего гомологичных плеч составляет от около 10 т.н. до около 20 т.н. В одном из вариантов осуществления длина вышележащего и нижележащего гомологичных плеч составляет от около 20 т.н. до около 30 т.н. В одном из вариантов осуществления длина вышележащего и нижележащего гомологичных плеч составляет от около 30 т.н. до около 40 т.н. В одном из вариантов осуществления длина вышележащего и нижележащего гомологичных плеч составляет от около 40 т.н. до около 50 т.н. В одном из вариантов осуществления длина вышележащего и нижележащего гомологичных плеч составляет от около 50 т.н. до около 60 т.н. В одном из вариантов осуществления длина вышележащего и нижележащего гомологичных плеч составляет от около 60 т.н. до около 70 т.н. В одном из вариантов осуществления длина вышележащего и нижележащего гомологичных плеч составляет от около 70 т.н. до около 80 т.н. В одном из вариантов осуществления длина вышележащего и нижележащего гомологичных плеч составляет от около 80 т.н. до около 90 т.н. В одном из вариантов осуществления длина вышележащего и нижележащего гомологичных плеч составляет от около 90 т.н. до около 100 т.н. В одном из вариантов осуществления длина вышележащего и нижележащего гомологичных плеч составляет от около 100 т.н. до около 110 т.н. В одном из вариантов осуществления длина вышележащего и нижележащего гомологичных плеч составляет от около 110 т.н. до около 120 т.н. В одном из вариантов осуществления длина вышележащего и нижележащего гомологичных плеч составляет от около 120 т.н. до около 130 т.н. В одном из вариантов осуществления длина вышележащего и нижележащего гомологичных плеч составляет от около 130 т.н. до около 140 т.н. В одном из вариантов осуществления длина вышележащего и нижележащего гомологичных плеч составляет от около 140 т.н. до около 150 т.н. В одном из вариантов осуществления длина вышележащего и нижележащего гомологичных плеч составляет от около 150 т.н. до около 160 т.н. В одном из вариантов осуществления длина вышележащего и нижележащего гомологичных плеч составляет от около 160 т.н. до около 170 т.н. В одном из вариантов осуществления длина вышележащего и нижележащего гомологичных плеч составляет от около 170 т.н. до около 180 т.н. В одном из вариантов осуществления длина вышележащего и нижележащего гомологичных плеч составляет от около 180 т.н. до около 190 т.н. В одном из вариантов осуществления длина вышележащего и нижележащего гомологичных плеч составляет от около 190 т.н. до около 200 т.н.

В одном из вариантов осуществления млекопитающее представляет собой человека и нацеливание (таргетинг) производится ex vivo на человеческую клетку. В одном из вариантов осуществления млекопитающее представляет собой грызуна. В одном из вариантов осуществления грызуна выбирают из мыши, крысы и хомяка.

В одном из вариантов осуществления нуклеазный агент вводят совместно с нацеливающим вектором. В одном из вариантов осуществления нуклеазный агент вводят отдельно от нацеливающего вектора в течение определенного периода времени. В одном из вариантов осуществления нуклеазный агент вводят перед введением нацеливающего вектора. В одном из вариантов осуществления нуклеазный агент вводят после введения нацеливающего вектора.

В одном из вариантов осуществления комбинированное применение нацеливающего вектора с нуклеазным агентом приводит к повышенной эффективности нацеливания по сравнению с применением только нацеливающего вектора. В одном из вариантов осуществления, когда нацеливающий вектор применяют в сочетании с нуклеазным агентом, эффективность нацеливания нацеливающего вектора увеличивается по меньшей мере в два раза по сравнению с тем, когда нацеливающий вектор применяется отдельно. В одном из вариантов осуществления, когда нацеливающий вектор применяют в сочетании с нуклеазным агентом, эффективность нацеливания нацеливающего вектора увеличивается по меньшей мере в три раза по сравнению с тем, когда нацеливающий вектор применяется отдельно. В одном из вариантов осуществления, когда нацеливающий вектор применяют в сочетании с нуклеазным агентом, эффективность нацеливания нацеливающего вектора увеличивается по меньшей мере в четыре раза по сравнению с тем, когда нацеливающий вектор применяется отдельно.

В одном из вариантов осуществления прокариотическая клетка представляет собой компетентный (способный к рекомбинации) штамм E.coli. В одном из вариантов осуществления прокариотическая клетка содержит нуклеиновую кислоту, кото