Нейротоксины, проявляющие укороченную биологическую активность

Иллюстрации

Показать все

Изобретение относится к области биохимии. Описана группа изобретений, включающая полинуклеотид, кодирующий нейротоксический полипептид BoNT/E, вектор для экспрессии вышеуказанного полинуклеотида, клетку-хозяина для экспрессии полинуклеотида, нейротоксический полипептид BoNT/E, способ получения нейротоксического полипептида BoNT/E, способ получения лекарственного средства. В одном из вариантов нейротоксический полипептид BoNT/E демонстрирует уменьшенную продолжительность биологического эффекта у субъекта, указанный биологический эффект вызывает паралич мышц у субъекта. Изобретение расширяет арсенал средств для получения эффекта паралича мышц. 6 н. и 5 з. п. ф-лы, 8 ил., 2 табл., 10 пр.

Реферат

Настоящее изобретение относится к фармацевтической области. В частности, оно охватывает полинуклеотид, кодирующий нейротоксичный полипептид, обладающий укороченной продолжительностью биологического эффекта у субъекта, где указанный полипептид содержит по меньшей мере один мотив узнавания E3 лигазы в легкой цепи, где мотив узнавания E3 лигазы предпочтительно представляет собой связывающий мотив для E3 лигазы MDM2. Настоящее изобретение дополнительно относится к полипептиду, кодируемому полинуклеотидом в соответствии с настоящим изобретением, а также полипептиду, содержащему одну или несколько аминокислотных замен. Дополнительно включенными в объем настоящего изобретения являются векторы и клетки-хозяева, содержащие указанные полинуклеотиды, полипептиды, кодируемые таким образом, и антитела, специфически связывающиеся с полипептидом. Более того, настоящее изобретение относится к лекарственным средствам, содержащим указанные полинуклеотиды и полипептиды, а также конкретным терапевтическим применениям вышеуказанного. Более того, настоящее изобретение рассматривает способы получения полипептидов и лекарственных средств.

Clostridium botulinum и Clostridium tetani продуцируют сильнодействующие нейротоксины, т.е. ботулинические токсины (BoNTs) и токсин столбняка (TeNT), соответственно. Эти нейротоксины клостридий (CNTs) специфически связываются с нервными клетками и нарушают высвобождение нейромедиаторов. Каждый токсин синтезируются в виде неактивного в непроцессированного приблизительно в 150 кДа одноцепочечного белка. Посттрансляционный процессинг включает образование дисульфидных мостиков и ограниченный протеолиз (никование) посредством бактериальной протеазы(протеаз). Активный нейротоксин состоит из двух цепей, N-концевой легкой цепи приблизительно 50 кДа, и тяжелой цепи приблизительно 100 кДа, связанных дисульфидной связью. CNTs состоят из трех доменов, то есть, каталитической легкой цепи, тяжелой цепи, охватывающей область транслокации (N-концевая половина), и рецептор-связывающего домена (С-концевая половина), см. Krieglstein 1990, Eur J. Biochem. 188, 39; Krieglstein, 1991, Eur J. Biochem. 202, 41; Krieglstein 1994, J. Protein Chem. 13, 49. Ботулинические нейротоксины синтезируются в виде молекулярных комплексов, содержащих нейротоксический белок на 150 кДа и связанные с ними нетоксичные комплексообразующие белки. Комплекс имеет размеры, отличающиеся на основе штамма Clostridial и различных серотипов нейротоксина в диапазоне от 300 кДа до 900 кДа. Комплексообразующие белки в их комплексах стабилизируют нейротоксин и защищают его от деградации, см. Chen 1998, Infect. Immun. 66(6): 2420-2425.

Clostridium botulinum секретирует семь отличающихся по антигенам серотипов, обозначаемых от А до G ботулинического нейротоксина (BoNT). Все серотипы вместе с соответствующим столбнячным нейротоксином (TeNT), секретируемым Clostridium tetani, являются Z2+-эндопротеазами, которые блокируют синаптический экзоцитоз посредством расщепления SNARE-белков, см. Couesnon, 2006, Microbiology, 152, 759. BoNTs вызывают паралич периферических мышц, наблюдаемый при ботулизме, см. Fischer 2007, PNAS 104,10447.

Несмотря на токсические эффекты, ботулинические токсины были использованы в качестве терапевтических агентов для большого числа заболеваний или расстройств. Ботулинический токсин серотипа А одобрен для использования человеком в Соединенных Штатах в 1989 году для лечения косоглазия, блефароспазма и других расстройств. Он является коммерчески доступным в виде ботулинического нейротоксина А с комплексообразующими белками, например, под торговым названием BOTOX (Allergan Inc.) или под торговым названием DYSPORT (Ipsen Ltd.). Усовершенствованный препарат, свободный от комплекса, полипептид нейротоксина А доступен под торговой маркой XEOMIN (Merz Pharmaceuticals LLC). Действие ботулинического токсина является лишь временным, что является причиной, почему повторное введение ботулинического токсина может потребоваться для поддержания терапевтического эффекта.

Нейротоксины Clostridial ослабляют силу произвольно сокращающихся мышц и являются эффективными средствами для лечения косоглазия, фокусной дистонии, в том числе цервикальной дистонии, и доброкачественного эссенциального блефароспазма. Они, как было показано в дальнейшем, облегчают гемифациальный спазм и фокусную спастичность и, более того, являются эффективными в широком диапазоне других показаний, таких как желудочно-кишечные расстройства, гипергидроз, и коррекции косметических морщин, см. Jost 2007, Drugs 67, 669.

Однако ослабление силы и сокращения мышц также желательно для медицинских состояний или заболеваний: таких как заживление ран, иммобилизация для костей и лечения разрывов сухожилия, послеоперационной иммобилизации, в частности, в связи с удалением геммороя, внедрение дентальных имплантатов, или замены тазобедренного сустава (эндопротезирование), артропластика коленного сустава, офтальмологическая хирургия, угревая сыпь, синдром раздраженной толстой кишки, вагинизм, боли в пояснице или доброкачественная гиперплазия предстательной железы. Нейротоксины обычно демонстрируют свой биологический эффект в течение периода времени большего, чем действительно необходим для эффективного лечения указанных заболеваний или состояний. Длительный паралич мышц, однако, является вредным или по меньшей мере менее предпочтительным в терапии указанных медицинских состояний или заболеваний. Нейротоксины, демонстрирующие свой биологический эффект только на протяжении желаемого периода времени, однако пока не являются доступными.

Соответственно, технической задачей, лежащей в основе настоящего изобретения, можно рассматривать как обеспечение средств и способов для удовлетворения указанных выше потребностей. Техническая задача решается с помощью вариантов выполнения, приведенных в формуле изобретения и ниже в настоящем описании.

Настоящее изобретение, соответственно, относится к полинуклеотиду, кодирующему нейротоксический полипептид, обладающему уменьшенной продолжительностью биологического эффекта у субъекта, в котором указанный полипептид содержит по меньшей мере один мотив узнавания E3 лигазы в легкой цепи, в котором указанный мотив узнавания E3 лигазы предпочтительно является мотивом связывания для E3 лигазы MDM2. Уменьшенная продолжительность биологической активности модифицированных полипептидов проиллюстрирована для BoNT/E-MDM2. Кроме того, указанный нейротоксический полипептид был дополнительно оптимизировать посредством сайт-направленного мутагенеза конкретных аминокислотных остатков в легкой цепи. С этой целью были идентифицированы посредством трехмерного структурного анализа экспонированные аминокислотные остатки в легкой цепи нейротоксина, находящиеся в пространственной близости к введенному мотиву узнавания E3 лигазы MDM2. Впоследствии идентифицированные аминокислотные остатки в легкой цепи нейротоксина были заменены остатками лизина. Этот оптимизационный подход привел к еще более быстрой деградации мутантных полипептидов BoNT/E-MDM2, по сравнению с немутированным полипептидом BoNT/E-MDM2, как это продемонстрировало в следующих примерах.

Соответственно, такие модифицированные или мутантные нейротоксические полипептиды в соответствии с настоящим изобретением особенно полезны для терапии заболеваний, которые требуют короткой или уменьшенной продолжительностью биологического действия нейротоксина.

Термин "полинуклеотид", используемый в настоящем изобретении, относится к молекулам, одно- или двухцепочечных ДНК, а также к молекулам РНК. Охватываемые указанным термином являются геномная ДНК, кДНК, гяРНК, мРНК, а также все встречающиеся в природе или искусственно модифицированные производные таких молекулярных видов. Полинуклеотид может быть в некотором варианте выполнения настоящего изобретения линейной или кольцевой молекулой. Более того, в дополнение к последовательностям нуклеиновой кислоты, кодирующей вышеуказанные нейротоксические полипептиды, полинуклеотид настоящего изобретения может содержать дополнительные последовательности, необходимые для правильных транскрипции и/или трансляции: такие как 5' или 3'UTR последовательности. Полинуклеотид в соответствии с настоящим изобретением кодирует модифицированный нейротоксический полипептид, получаемый из одного из антигенно различных серотипов ботулинического нейротоксина, т.е. ΒοΝТ/А, BoNT/B, BoNT/C1, BoNT/D, BoNT/E, BoNT/F, BoNT/G или столбнячного нейротоксина (TeNT).

В одном варианте выполнения настоящего изобретения указанный полинуклеотид включает (перед модификацией в соответствии с настоящим изобретением, т.е. модификацией легкой цепи по меньшей мере одного мотива узнавания E3 лигазы) последовательность нуклеиновой кислоты, как показано в SEQ ID NO: 1 (BoNT/A), SEQ ID NO: 3 (BoNT/B), SEQ ID NO: 5 (BoNT/C1), SEQ ID NO: 7 (BoNT/D), SEQ ID NO: 9 или 81 (BoNT/E), SEQ ID NO: 11 (BoNT/F), SEQ ID NO: 13 (BoNT/G) или SEQ ID NO: 15 (TeNT). Более того, охватывается, в некотором варианте выполнения настоящего изобретения, полинуклеотид, содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую аминокислотную последовательность (перед модификацией в соответствии с настоящим изобретением, т.е. модификации легкой цепи посредством по меньшей мере одного мотива узнавания E3 лигазы), как показано в любом из SEQ ID NO: 2 (BoNT/A), SEQ ID NO: 4 (BoNT/B), SEQ ID NO: 6 (BoNT/C1), SEQ ID NO: 8 (BoNT/D), SEQ ID NO: 10 или 82 (BoNT/E), SEQ ID NO: 12 (BoNT/F), SEQ ID NO: 14 (BoNT/G) или SEQ ID NO: 16 (TeNT). В другом варианте выполнения настоящего изобретения указанный полинуклеотид является вариантом указанного выше полинуклеотида, содержащего одну или более нуклеотидных замен, делеций и/или вставок, которые в еще одном варианте выполнения настоящего изобретения могут приводить к закодированной аминокислоте, имеющей одну или более аминокислотных замен, делеций и/или вставок. Более того, вариантный полинуклеотид в соответствии с настоящим изобретением должен в другом варианте выполнения настоящего изобретения содержать вариант последовательности нуклеиновой кислоты, имеющей по меньшей мере 40%, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% идентичность или 100% идентичность последовательности нуклеиновой кислоты, как показано в любой из SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 81, 11, 13 или 15, или вариант последовательности нуклеиновой кислоты, которая кодирует аминокислотную последовательность, которая имеет по меньшей мере 40%, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% идентичности или 100% идентичности с аминокислотной последовательностью, как показано в любой из SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 82, 12, 14, 16. В некотором варианте выполнения настоящего изобретения каждый из вышеупомянутых вариантов полинуклеотидов кодируют вариантный полипептид, сохраняющий одно или нескольких биологических свойств, и в другом варианте выполнения настоящего изобретения все биологические свойства соответствующего нейротоксического полипептида, то есть BoNT/A, BoNT/B, BoNT/C1, BoNT/D, ΒοΝT/Ε, BoNT/F, BoNT/G или столбнячного нейротоксина (TeNT). Специалистам в данной области техники будет понятно, что полная биологическая активность сохраняется только после активации протеолитической активности, хотя вполне возможно, что непроцессированный предшественник может проявлять некоторые биологические функции или быть частично активным. Термин "биологические свойства", используемый в настоящем изобретении, относится к: (а) связыванию рецептора, (b) интернализации, (с) транслокации через мембрану эндосом в цитозоль, и/или (d) эндопротеолитическому расщеплению белков, участвующих в слияния мембран синаптической везикулы. В дополнительном варианте выполнения настоящего изобретения вариантные полинуклеотиды могут кодировать вариантные полипептиды, имеющие улучшенные или измененные биологические свойства, например, они могут содержать сайты расщепления, которые улучшены для ферментного узнавания или могут быть улучшены для связывания с рецептором или другие вышеуказанные свойства. В еще одном дополнительном варианте выполнения настоящего изобретения вариантные полинуклеотиды должны кодировать слитые нейротоксические полипептиды, содержащие часть по меньшей мере двух нейротоксических полипептидов различных серотипов, например, слитый нейротоксин, содержащий тяжелую цепь BoNT/A и легкую цепь BoNT/E или связывающий домен BoNT/E и транслокационный домен и легкую цепь BoNT/A.

Термин "идентичный", используемый в настоящем изобретении, относится к идентичности последовательностей, характеризующихся посредством определения числа одинаковых аминокислот в двух последовательностей нуклеиновых кислот или аминокислотных последовательностей, в которых последовательности, выровнены таким образом, что получается самая высокая степень совпадений. Она может быть рассчитана, при использовании опубликованных методик или способов, кодифицированных в компьютерных программах, таких как, например, BLASTP, BLASTN или FASTA (Altschul, 1990, J. Mol Biol 215, 403). Значения процентной идентичности в одном аспекте рассчитывается по введенной аминокислотной последовательности. Серия программ на основе различных алгоритмов является доступной специалисту в данной области техники для сравнения различных последовательностей. В этом контексте алгоритмы Needleman и Wunsch или Smith и Waterman дают особенно надежные результаты. Для выполнения выравнивания последовательностей могут быть использованы программа PileUp (Higgins 1989, CABIOS 5, 151) или программы Gap и BestFit (Needleman 1970, J. Mol. Biol. 48; 443; Smith 1981, Adv. Appl. Math. 2, 482), которые являются частью пакета программного обеспечения GCG (Genetics Computer Group 1991, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA 53711). Значения идентичности последовательностей, представленные выше в процентах (%), должны быть определены в другом аспекте настоящего изобретения, с помощью программы GAP во всей области последовательности со следующими настройками: Gap Weight: 50, Length Weight: 3, Average Match: 10.000 and Average Mismatch: 0.000, которые, если не указано иное, всегда должны использоваться в качестве стандартных настроек для выравнивания последовательностей.

Выражения «активность», «функция», «биологическая активность», «биологическая функция» или «биологический эффект» нейротоксина, как используемые в настоящем изобретении, обозначает количество клеточного экзоцитоза, ингибируемого из клетки в единицу времени, такие как экзоцитоз нейромедиатора, например ацетилхолина, из клетки-мишени, такой как нейрон. В частности, это относится к биологической активности зрелого двухцепочечного нейротоксического полипептида, демонстрирующего a) связывание с рецептором, b) интернализацию, с) транслокацию через эндосомную мембрану в цитозоль, и/или d) эндопротеолитическое расщепление белков, участвующих в слияние синаптических везикул. Выражение "продолжительность биологического действия (нейротоксина) в субъекте", используемый в настоящем изобретении, означает период времени биологической активности нейротоксина у субъекта, к которому нейротоксин был применен. Исследования in vivo для анализа на биологическую активность включают определение ЛД50 для мыши и ex vivo исследование на мышиной гемидиафрагме, описанное Pearce et al. (Pearce 1994, Toxicol. Appl. Pharmacol. 128: 69-77) и Dressier et al. (Dressier 2005, Mov. Disord. 20:1617-1619, Keller 2006, Neuroscience 139: 629-637). Биологическая активность также может быть оценена с помощью анализа на основе клеток, как описано, например, Whitemarsh et al. (Whitemarsh et al. 2012, Toxicol. Sci. 126: 426-435).

Биологическая активность обычно выражается в мышиных единицах (MU). Как используется в настоящем изобретении, 1 MU соответствует такому количеству нейротоксического компонента, который убивает 50% определенной популяции мышей после внутрибрюшинной инъекции, т.е. внутрибрюшинное LD50 для мыши. Термин "субъект", как используется в настоящем изобретении, означает млекопитающее, предпочтительно человек.

Более того, слитые полипептиды, дополнительно содержащие обнаруживаемые маркерные пептиды или метки, охватываются в других вариантах нейротоксического полипептида в соответствии с настоящим изобретением, обладающего сокращенной продолжительностью биологического эффекта у субъекта, вследствие по меньшей мере одного мотива узнавания E3 лигазы в легкой цепи. В одном варианте выполнения настоящего изобретения пригодными метками, которые также позволяют более эффективную очистку меченного полипептида, являются, например, FLAG метки, Myc метки, His-метки, HA-метки и GST-метки. Обнаруживаемые маркерные пептиды, в некотором варианте выполнения настоящего изобретения, включают флуоресцентные белки: например, GFP, BFP, YFP и тому подобное. Указанный слитый полипептид может содержать дополнительные домены полипептида в некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения. Например, нейротоксический полипептид в соответствии с настоящим изобретением может содержать пептидный домен, который опосредует проникновение, чтобы получить доступ к месту действия легкой цепи нейротоксина, т.е. в цитоплазму нейрональной клетки-мишени. С этой целью, например, полиаргининовый пептид может быть использован для слияния с нейротоксическим полипептидом в соответствии с настоящим изобретением, который хорошо известен в данной области техники.

Нейротоксический полипептид (кодируемый полинуклеотидом) в соответствии с настоящим изобретением дополнительно содержит по меньшей мере один мотив узнавания E3 лигазы в своей легкой цепи. Как изложено в другом месте более подробно и как продемонстрировало в следующих примерах, на продолжительность биологического действия нейротоксина у субъекта можно влиять, т.е. изменять, посредством введения по меньшей мере одного мотива узнавания E3 лигазы в легкой цепи или добавлением по меньшей мере одного мотива узнавания E3 лигазы в N- или С-конец легкой цепи. Таким образом, в одном варианте выполнения настоящего изобретения нейротоксический полипептид в соответствии с настоящим изобретением содержит по меньшей мере один внутренне или терминально введенный мотив узнавания E3 лигазы в легкой цепи. Такая модификация приводит к уменьшению продолжительности биологического действия нейротоксина в соответствии с настоящим изобретением у субъекта, по сравнению с нейротоксином, не содержащим мотив узнавания E3 лигазы. В другом варианте настоящего изобретения указанную легкую цепь нейротоксического полипептида, кодируемого полинуклеотидом в соответствии с настоящим изобретением, получают путем модификации из легкой цепи, которая кодируется полинуклеотидом, содержащим любую из вышеупомянутых специфических последовательностей нуклеиновых кислот или их вариантов, описанных выше. Как описано выше и хорошо известно в данной области техники, легкие цепи нейротоксических полипептидов генерируются посредством протеолитического расщепления полипептида-предшественника. Легкая цепь представляет собой N-концевую часть полипептида-предшественника, которая получается в результате указанного протеолитического расщепления. Аминокислотные последовательности легких цепей нейротоксических полипептидов, упомянутых выше, могут быть выведены в одном варианте выполнения настоящего изобретения из сайтов расщепления нейротоксинов дикого типа, указанных в таблице 1. В рекомбинантных нейротоксинах сайты расщепления (например, сайт расщепления тромбином или сайт расщепления энтерокиназой) вводятся в последовательность между двумя цистеинами, образующими дисульфидный мостик между тяжелой и легкой цепями, предпочтительно в линкер, как определено в настоящем описании в других местах.

Термин «мотив узнавания E3 лигазы», как используется в настоящем изобретении, относится к: (а) модификации(ям) легкой цепи нейротоксического полипептида в соответствии с настоящим изобретением, которые приводят к ускоренной деградации нейротоксического полипептида посредством эндогенных путей деградации, присутствующих в субъекте, к которому нейротоксин был применен. Мотив узнавания E3 лигазы представляет собой структурный мотив, который позволяет узнавание мотива и связывание с мотивом E3 лигазы. Дополнительные сигналы пептидной деградации, опосредующие клеточную деградации белков известны в данной области техники, и включают в себя, например, PEST мотивы, WW мотивы или WD40 мотивы. Путь деградации может быть протеасомным путем деградации или лизосомальным путем деградации. В другом варианте выполнения настоящего изобретения один из путей деградации может просто привести к частичной деградации нейротоксического полипептида в соответствии с настоящим изобретением, например, посредством одной или нескольких стадий протеолитического расщепления. Указанный мотив узнавания E3 лигазы может быть введен в легкую цепь, т.е. располагаться (внутренне) внутри легкой цепи или присоединяться к ней либо на N-, либо на С-конце. В последнем случае нейротоксический полипептид в соответствии с настоящим изобретением может, например, нести мотив узнавания E3 лигазы, который располагается между легкой цепи нейротоксина и тяжелой цепи нейротоксина. Например, такая конструкция может в одном варианте выполнения настоящего изобретения иметь расположение, от N-конца к С-концу: легкая цепь нейротоксина - мотив узнавания E3 лигазы - тяжелая цепь нейротоксина. Альтернативно, доменное расположение может быть, от N- к С-концу: тяжелая цепь нейротоксина - мотив узнавания E3 лигазы - легкая цепь нейротоксина. В дополнительном варианте выполнения настоящего изобретения дополнительный линкер, такой как, например, полиглициновый линкер, может быть использован для соединения легкой и тяжелой цепей нейротоксина. Такая конструкция может быть организована от N- к С-концу: легкая цепь нейротоксина - мотив узнавания E3 лигазы - линкер - тяжелая цепь нейротоксина. Кроме того, доменное расположение может быть от N- к С-концу: тяжелая цепь нейротоксина - линкер - мотив узнавания E3 лигазы - легкая цепь нейротоксина. Линкер предпочтительно содержит сайт расщепления протеазой, например, сайт расщепления энтерокиназой или сайт расщепления тромбином. Положение мотива узнавания E3 лигазы предпочтительно - С-конец первого цистеина легкой цепи, образующего дисульфидный мостик, и N-конец сайта расщепления протеазой; см. Фиг. 1. После расщепления посредством соответствующей протеазы, легкая цепь нейротоксина (содержащая мотив узнавания E3 лигазы) высвобождается из вышеуказанной конструкции. В других вариантах выполнения настоящего изобретения нейротоксический полипептид в соответствии с настоящим изобретением содержит не только один мотив узнавания E3 лигазы в или присоединенным к природной рекомбинантной легкой цепи, а два, три, четыре или даже больше мотивов узнавания E3 лигазы. Термин "модифицированный" нейротоксический полипептид, обладающий пониженной продолжительность биологического эффекта у субъекта, как используется в настоящем изобретении, означает, что нейротоксический полипептид в соответствии с настоящим изобретением содержит по меньшей мере один мотив узнавания E3 лигазы в или присоединенным к природной рекомбинантной легкой цепи, предпочтительно в комбинации с одной или более мутаций в легкой цепи нейротоксина. Еще более предпочтительно указанная мутация в легкой цепи нейротоксина является аминокислотной заменой, как определено в настоящем изобретении в других местах.

Специалисту в данной области техники хорошо известны подходящие мотивы узнавания E3 лигазы и, как ввести или связать их с легкой цепью нейротоксического полипептида. Кроме того, специалист в данной области техники может генерировать полинуклеотиды, кодирующие такие нейротоксические полипептиды, по меньшей мере с одним мотивом узнавания E3 лигазы посредством применения рекомбинантных молекулярно-биологических методик или химических модификаций. Например, сайт-направленный мутагенез может быть использован для введения мотивов узнавания E3 лигазы, описываемых в настоящем изобретении. С другой стороны, последовательность нуклеиновой кислоты для полинуклеотида, содержащая кодирующие последовательности для нейротоксического полипептида и предполагаемого мотива узнавания E3 лигазы, могут быть разработаны и весь полинуклеотид может впоследствии быть химически синтезирован.

В одном варианте выполнения настоящего изобретения указанный мотив узнавания E3 лигазы является по меньшей мере внутренне или терминально введенным мотивом узнавания E3 лигазы и/или мотивом, связывающим Е3-лигазу. Предпочтительно, узнающий и связывающий мотивы для соответствующей E3 лигазы являются идентичными, то есть указанный мотив используется как для узнавания, так и для связывания E3 лигазы. В этом варианте выполнения настоящего изобретения мотив узнавания E3 лигазы нацеливает легкою цепь нейротоксического полипептида в соответствии с настоящим изобретением на клеточную деградацию через протеасомный путь убиквитин-опосредованной деградации. Деградация через убиквитин-протеасомный путь состоит из двух дискретных и последовательных стадий: (i) ковалентное присоединение множества молекул убиквитина к легкой цепи нейротоксического полипептида в соответствии с настоящим изобретением с формированием полиубиквитиновой цепи и (ii) деградация таким образом помеченной легкой цепи нейротоксического полипептида посредством пути 26S протеасомы. Как описано в этой области техники, убиквитин, высоко консервативный белок из 76 аминокислот, конъюгируется с белком-мишенью посредством трехстадийного механизма. Первоначально С-концевая карбоксильная группы убиквитина активируется посредством убиквитин-активирующего фермента (E1). Тиоэфир, образующийся при присоединении убиквитина к ферменту E1, затем переносится посредством реакции транс-ацилирования к убиквитин-конъюгирующему ферменту (Е2). В зависимости от вовлеченной E3 лигазы убиквитин затем либо непосредственно переносится к E3 лигазе (RING E3 лигазы), либо комплекс Е2-убиквитин связывается с E3 лигазой (RING E3 лигазы). Наконец, в обоих случаях E3 лигаза специфически связывается с субстратом и катализирует последнюю стадию в процессе конъюгации, которая является ковалентным присоединением убиквитина к субстрату, в настоящем случае, к легкой цепи нейротоксического полипептида в соответствии с настоящим изобретением (Marmor and Yarden 2004, Oncogene 23: 2057-2070). Последовательные конъюгации убиквитина с внутренними лизинами предварительно добавленных убиквитиновых молекул приводят к образованию полиубиквитиновых цепей. Полиубиквитинированный целевой белок затем узнается 26S протеасомой и элиминируется (Schrader 2009, Nat. Chem. Biol. 5: 815-22). Предпочтительно, мотив узнавания E3 лигазы, как определено в настоящем изобретении, опосредует необратимую деградацию. Такая необратимая деградация была описана, например, для пептидной деградации сигнального домена "ALAPYIP" (SEQ ID NO: 25). В конкретных вариантах выполнения настоящего изобретения мотив узнавания E3 лигазы и/или связывающий мотив представляет собой пептид или пептидомиметик, имеющий длину меньше чем 50 остатков аминокислот, длину меньше чем 40 остатков, длину меньше чем 30 остатков, длину меньше чем 20 остатков, или длину меньше чем 15 остатков. Конкретные примеры мотивов узнавания Е3-лигазы приведены в таблице 2 или мотивов узнавания Е3-лигазы, включающие аминокислотную ETFSDLWKLLPE (SEQ ID NO: 26), TSFAEYWNLLSP (SEQ ID NO: 27), LTFEHYWAQLTS (SEQ ID NO: 28), LTFEHWWAQLTS (SEQ ID NO: 29), LTFEHSWAQLTS (SEQ ID NO: 30), ETFEHNWAQLTS (SEQ ID NO: 31), LTFEHNWAQLTS (SEQ ID NO: 32), LTFEHWWASLTS (SEQ ID NO: 33), LTFEHWWSSLTS (SEQ ID NO: 34), LTFTHWWAQLTS (SEQ ID NO: 35), ETFEHWWAQLTS (SEQ ID NO: 36), LTFEHWWSQLTS (SEQ ID NO: 37), LTFEHWWAQLLS (SEQ ID NO: 38), ETFEHWWSQLLS (SEQ ID NO: 39), RFMDYWEGL (SEQ ID NO: 40), MPRFMDYWEGLN (SEQ ID NO: 41), SQETFSDLWKLLPEN (SEQ ID NO: 42) и/или LTFEHNWAQLEN (SEQ ID NO: 78).

Предпочтительно, чтобы мотив узнавания E3 лигазы опосредовал бы деградацию по меньшей мере 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 или 90%, более предпочтительно 100% легкой цепи нейротоксических полипептидов в соответствии с настоящим изобретением внутри клетки. Деградация может быть определена с помощью анализов, описанных в данной области техники, например, с помощью анализов in vitro, наподобие количественных анализов на клеточной основе или in vivo анализов: таких как, исследование на бегающих мышах, анализ отведения пальца (DAS), или анализ силы захвата крысы.

В другом варианте выполнения настоящего изобретения мотив узнавания E3 лигазы представляет собой связывающий мотив для E3 лигазы MDM2. Соответствующие последовательностей нуклеиновых кислот и аминокислотных последовательностей человека приведены в номерах доступа NM 002392 и NP 002383, соответственно. Предпочтительно, указанный связывающий мотив для E3 лигазы MDM2 содержит или состоит из аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из ETFSDLWKLLPE (SEQ ID NO: 26), TSFAEYWNLLSP (SEQ ID NO: 27), LTFEHYWAQLTS (SEQ ID NO: 28), LTFEHWWAQLTS (SEQ ID NO: 29), LTFEHSWAQLTS (SEQ ID NO: 30), ETFEHNWAQLTS (SEQ ID NO: 31), LTFEHNWAQLTS (SEQ ID NO: 32), LTFEHWWASLTS (SEQ ID NO: 33), LTFEHWWSSLTS (SEQ ID NO: 34), LTFTHWWAQLTS (SEQ ID NO: 35), ETFEHWWAQLTS (SEQ ID NO: 36), LTFEHWWSQLTS (SEQ ID NO: 37), LTFEHWWAQLLS (SEQ ID NO: 38), ETFEHWWSQLLS (SEQ ID NO: 39), RFMDYWEGL (SEQ ID NO: 40), MPRFMDYWEGLN (SEQ ID NO: 41), SQETFSDLWKLLPEN (SEQ ID NO: 42) и/или LTFEHNWAQLEN (SEQ ID NO: 78). Еще более предпочтительно, указанный связывающий мотив для E3 лигазы MDM2 содержит или состоит из аминокислотной последовательности LTFEFINWAQLTS (SEQ ID NO: 32) или LTFEHNWAQLEN (SEQ ID NO: 78). Также предпочтительно, чтобы длина связывающего мотива для E3 лигазы MDM2 составляла от 9 до 15 аминокислотных остатков, более предпочтительно она составляла 12 аминокислотных остатков в длину. Фиг. 1 иллюстрирует пример нейротоксического полипептида в соответствии с настоящим изобретением, содержащего связывающий мотив для E3 лигазы MDM2 (MDM2 мотив). Фиг. 2 показывает, что взаиморасположение связывающего мотива для E3 лигазы MDM2 между легкой цепью и тяжелой цепью нейротоксина, как показано на Фиг. 1, позволяет узнавание и связывание E3 лигазы MDM2 к таким образом модифицированной легкой цепи нейротоксина, что приводило к убиквитинированию остатков лизина, экспонированных на окружающей поверхности и ускоренной деградации легкой цепи убиквитинированного нейротоксина в соответствии с настоящим изобретением посредством клеточной протеасомной системы. В объем настоящей заявки включено, что последовательность указанных мотивов связывания для E3 лигазы MDM2 может быть дополнительно модифицирована, например, посредством одного или нескольких нуклеотидных замен, делеций и/или вставок, которые в еще одном варианте выполнения настоящего изобретения могут привести к закодированной аминокислотной последовательности, имеющей одну или более аминокислотных замен, делеций и/или вставок. Указанные модификации могут быть осуществлены для того чтобы изменить (например, улучшить) связывание E3 лигазы MDM2 с указанными связывающими мотивами, что привело бы к еще более усиленной деградации нейротоксического полипептида в соответствии с настоящим изобретением по пути убиквитин-опосредованной протеасомной деградации.

В дополнительном варианте выполнения настоящего изобретения указанный полинуклеотид в соответствии с настоящим изобретением содержит последовательность нуклеиновой кислоты, выбранную из группы, состоящей из:

a) последовательности нуклеиновой кислоты, имеющей нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 51 или 79;

b) последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 52 или 80; и

c) последовательности нуклеиновой кислоты, имеющей по меньшей мере 40%, предпочтительно по меньшей мере 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности с последовательностью нуклеиновой кислоты а) или b).

Как продемонстрировало в следующих примерах, нейротоксический полипептид (кодируемый полинуклеотидом) в соответствии с настоящим изобретением, содержащей по меньшей мере один мотив узнавания E3 лигазы в легкой цепи, демонстрирует уменьшенную продолжительность биологического эффекта у субъекта при введении по сравнения с немодифицированным нейротоксическим полипептидом (не содержащим один или более мотив(ов) узнавания E3 лигазы в легкой цепи). Уменьшенная продолжительность биологической активности таким образом модифицированного полипептида была примером для BoNT/E-MDM2. Уменьшенная продолжительность биологического эффекта нейротоксического полипептида в соответствии с настоящим изобретением является результатом более быстрой деградации нейротоксического полипептида (т.е. каталитической легкой цепи нейротоксина) с помощью протеасомной системы в нейроне субъекта.

Вышеупомянутый полипептид BoNT/E-MDM2 был дополнительно улучшен авторами настоящего изобретения посредством сайт-направленного мутагенеза экспонированных аминокислотных остатков в легкой цепи, которые находятся в пространственной близости к мотиву узнавания MDM2. "Экспонированные аминокислотные остатки" при использовании в настоящем изобретении означает, что аминокислотные остатки расположены на поверхности легкой цепи нейротоксина, например, в легкой цепи BoNT/E, а боковые цепи указанных аминокислотных остатков не вовлечены во внутримолекулярные взаимодействия. Указанные экспонированные аминокислотные остатки в пределах легкой цепи были сначала определены посредством трехмерного структурного анализа, а затем замещены остатками лизина. Эта процедура оптимизации привела в еще более ускоренной деградации мутантных полипептидов BoNT/E-MDM2 по сравнению с немутированными полипептидами BoNT/E-MDM2, содержащими мотив узнавания E3 лигазы. Неожиданно было обнаружено, что замены при Q53, N72, N378, N379, R394 и/или Т400 на лизин приводили к более быстрой деградации BoNT/E-MDM2 посредством протеасомой системы. Указанное положение аминокислотного остатка основано на нумерации в аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO. 52. В частности, мутанты BoNT/E-MDM2, в которых (i) Q53, N72, N378, N379, R394 и Т400 (SEQ ID NO. 57); (ii) Q53, N378 и N379 (SEQ ID NO. 58); (iii) N72, N378 и N379 (SEQ ID NO. 61); или (iv) N378, N379 и T400 (SEQ ID NO. 75) в легкой цепи были заменены остатками лизина, показали уменьшенный биологический эффект на культивируемые нейроны коры головного мозга. В противоположность этому, другие многочисленные мутации не показали какого-либо уменьшения продолжительности биологического эффекта, как продемонстрировано на Фиг. 3. Соответственно, в дополнительном варианте выполнения настоящего изобретения полипептиды в соответствии с настоящим изобретением содержат или состоят из аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из:

а) аминокислотной последовательности, как показано в SEQ ID NO: 57, 58, 61 или 75; и

b) аминокислотной последовательности, имеющей по меньшей мере 40%, предпочтительно 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности аминокислотной последовательности а).

Предпочтительно, чтобы аминокислотная последовательность b) несла бы тот же самый набор мутаций, как SEQ ID NO: 57 (Q53, N72, N378, N379, R394 и Т400), 58 (Q53, N378 и N379), 61 (N72, N378 и N379) или 75 (N378, N379 и Т400) в легкой цепи. В другом варианте выполнения настоящего изобретения настоящее изобретение относится к полинуклеотиду, кодирующему аминокислотные последовательности а) или b), приведенные выше.

В одном варианте выполнения настоящего изобретения биологический эффект нейротоксического полипептида в соответствии с настоящим изобретением, наблюдаемый в субъекте, вызывает паралич мышц, т.е. (обратимую) инактивацию способности мышц к сокращению. В дополнительном варианте выполнения настоящего изобретения уменьшение продолжительности биологического эффекта нейротоксического полипептида в соответствии с настоящим изобретением у человека сохраняется меньше 5, 4, 3, 2 недель или даже меньше, чем 1 неделя. В другом варианте выполнения настоящего изобретения эффекты могут быть исследованы in vivo посредством так называемого исследования на бегающих мышах (Keller 2006, Neuroscience 139: 629-637), анализ отведения пальца (Aoki 2001, Toxicon 12: 1815-20) или анализа силы сцепления крысы (Torii 2011, Toxicon 57 (1): 93-9). Биологические эффекты могут быть определены специалистом в данной области техники без дальнейших хлопот. Уменьшенная продолжительность биологического действия в некотором аспекте относится к статистически значимой уменьшенной продолжительности. Является ли уменьшенная продолжительность эффекта статистически значимой, может быть определено специалистами в этой области техники при исп