Метод детекции рака

Метод детекции рака

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к способу детекции рака с использованием CAPRIN-1 в качестве опухолевого маркера. Предшествующий уровень техники

Рак занимает лидирующее место по причине смертности. В настоящее время, основным способом лечения этого заболевания является хирургическая операция в комбинации с лучевой терапией и/или химиотерапией. Благодаря успехам, уже достигнутым в области медицины, рак, в зависимости от его типа, может быть надежно излечим, если он был обнаружен на ранней стадии. Поэтому необходимо разработать способ детекции рака, который не причиняет ни физического, ни материального ущерба больному, страдающему раком, и который мог бы быть осуществлен с помощью рутинных тестов.

В последнее время, широкое распространение получили методы анализа опухолевых продуктов, таких как опухолевые маркеры. Термин «опухолевые продукты» означает, например, опухолеассоциированные антигены, ферменты, специфические белки, метаболиты, онкогены, онкогенные продукты и гены-супрессоры опухоли. В качестве опухолевых маркеров, которые могут быть использованы для диагностики некоторых видов рака, являются канцероэмриональный антиген СЕА, гликопротеин СА19-9, антиген PSA, специфичный для предстательной железы, кальцитонин (пептидный гормон, продуцируемый в щитовидной железе) и т.п. Однако, для многих видов рака, опухолевые маркеры, которые могли бы быть использованы для диагностики рака, еще не обнаружены. Кроме того, подавляющее большинство уже известных опухолевых маркеров присутствуют в физиологических жидкостях лишь в очень небольших количествах (порядка пг/мл), а поэтому, для детектирования этих маркеров требуются высокочувствительные аналитические методы или какие-либо специальные методы. В таких случаях, разработка новых методов диагностики рака, позволяющих проводить в высокой степени чувствительные и простые тесты на рак различных типов откроет новую эру в детекции рака различных типов.

С другой стороны, несмотря на последние достижения в разработке новых хирургических технологий или новых противораковых средств, существующие способы лечения рака пока не дают удовлетворительных положительных результатов. Это обусловлено тем, что для многих видов рака не существует эффективных методов диагностики рака за исключением некоторых видов рака. По этой причине, эти раковые заболевания невозможно детектировать на ранней стадии.

Последние достижения в области молекулярной биологии или иммунологии рака, позволили идентифицировать антитела, специфически реагирующие с раковыми антигенами, и разработать молекулярные лекарственные средства для нацеливания на раковые антигены, ассоциированные со злокачественной трансформацией или прогрессированием рака и т.п., что дало возможность улучшить прогноз конкретного рака после терапии, нацеленной на раковые антигены.

В частности, было разработано множество терапевтических антител для лечения рака, нацеленных на антигенные белки, присутствующие на раковых клетках, и такие антитела могут быть использованы для лечения рака. Эти терапевтические антитела представляют особый интерес для специалистов, поскольку они являются достаточно эффективными при их использовании в качестве терапевтических средств для лечения рака. Однако, подавляющее большинство антигенных белков, на которые нацелены эти лекарственные средства, также экспрессируются и в нормальных клетках. В результате введения антител, раковые клетки, а также нормальные клетки, экспрессирующие эти антигены, разрушаются, что приводит к нежелательным побочным эффектам. Кроме того, эффективность лечения рака у различных пациентов в значительной степени варьируется, что обусловлено рядом особенностей, характерных для каждого конкретного пациента, страдающего раком. Так, например, эффективность хирургической операции,

химиотерапии или лучевой терапии широко варьируется с точки зрения исхода лечения и прогноза ракового заболевания в зависимости от стадии его развития. Известно, что различные индивидуумы имеют разную чувствительность к одному и тому же противораковому лекарственному средству. Это означает, что определенное лекарственное средство является эффективным для одних пациентов и неэффективным для других пациентов, что обусловлено особенностями конкретного индивидуума.

Таким образом, возможность введения некоторых терапевтических лекарственных средств пациентам, страдающим раком, определяют путем предварительного измерения экспрессии генов или белков, ассоциированных с развитием заболевания у пациентов, и последующего проведения анализа на эффективность конкретного лекарственного средства у пациента, у которого экспрессируются данный ген или белок. В частности, присутствие ракового антигена в образце, например, в сыворотке или ткани, взятых у пациента, страдающего раком, определяют в соответствии со стандартной клинической практикой с применением метода анализа на ген или белок, ассоциированный с конкретным видом рака. Затем определяют эффективность введения терапевтического лекарственного средства, специфичного к раковому антигену. Так, например, раковые ткани, взятые из толстой кишки пациента, страдающего раком, анализируют методом иммуногистохимического окрашивания с использованием EGFR (рецептора эпидермального фактора роста), называемого «EGFRpharm (DAKO)», в целях предсказания эффективности лекарственного средства Erbitux^® (цетуксимаба) для лечения рака толстой кишки. Затем определяют эффективность введения Erbitux. Или, например, раковые ткани, взятые у пациентки с раком молочной железы, анализируют методом иммуногистохимического окрашивания с использованием Her2 «HercepTest» в целях предсказания эффективности лекарственного средства Herceptin® (трастузумаба) для лечения рака молочной железы. После этого определяют эффективность введения герцептина (Herceptin).

В некоторых случаях, животные-компаньоны, которые считаются своими хозяевами членами семьи, часто ведут такой же образ жизни, как и их хозяева. По этой причине, по раковым заболеваниям животных-компаньонов можно с уверенностью предсказать, что их хозяева имеют высокий риск развития рака в будущем.

Известно, что возраст собак, которые являются типичными животными-компаньонами, в 7 раз короче человеческого возраста. Сообщалось, что в настоящее время в Японии, число собак составляет приблизительно 6,7 миллиона, а в США - приблизительно 17,64 миллиона. Обычно, собакам вводят вакцины против бешенства, а также комбинированные вакцины, такие как пятивалентные, семивалентные или восьмивалентные вакцины, которые способствуют снижению смертности от высоколетальных инфекций, включая собачью парвовирусную инфекцию; инфекцию, вызывающую чуму собак; вирусную инфекцию, вызывающую собачий парагрипп (собачий кашель); инфекцию, вызываемую собачьим аденовирусом типа 2 (собачий кашель); собачий инфекционный гепатит; собачью коронавирусную инфекцию и лептоспироз. Поэтому, в среднем, продолжительность жизни собак, которые являются домашними питомцами, значительно выше, и по оценкам специалистов, собаки-компаньоны, достигшие возраста 7 лет или выше, составляют 35,5% от общего числа собак. У собак, как и у людей, смертность от рака, гипертензии и сердечно-сосудистых заболеваний постоянно возрастает. В настоящее время, в США ежегодно регистрируется гибель приблизительно 4 миллиона собак от рака. Существует мнение, что в Японии 1,6 миллиона собак, возможно, страдают некоторыми видами опухолей. Однако, своевременное обследование домашних животных, в отличие от людей, проводится не очень часто. По этой причине, такое заболевание обнаруживается слишком поздно. В большинстве случаев, хозяева домашних питомцев обнаруживают у них симптомы только тогда, когда как опухоль достигает крупных размеров, и лишь после этого приводят животное в ветеринарную клинику. Если такая крупная опухоль является злокачественной, то для лечения этой опухоли уже слишком поздно проводить хирургическое лечение (например, хирургическую операцию) или консервативное лечение с использованием противораковых средств или т.п. Опухоли, которые были подтверждены ветеринаром как злокачественные, обычно подвергают лечению противораковыми средствами без хирургической операции. Даже в случае проведения хирургической операции необходимо обезопасить иссеченные края или принять срочные меры во время проведения хирургической операции, такие как меры по предотвращению гематогенного или клеточного метастазирования во время операции. При этом, желательно, чтобы лечение противораковыми средствами было проведено сразу после хирургической операции, после чего, через короткие интервалы времени необходимо также проводить наблюдение за животным. Таким образом, медикаментозное лечение с использованием терапевтических лекарственных средств является жизненно необходимым для лечения животных-компаньонов, страдающих раком. Если будет разработан способ детекции, осуществляемый посредством анализа на гены или белки, ассоциированные с некоторыми видами рака, то это позволит проводить более эффективное лечение, чем лечение уже известными способами, и такой способ лечения животных будет предпочтительным как для хозяев животных, так и для ветеринаров.

Цитоплазматический белок 1 (CAPRIN-1), ассоциированный с пролиферацией клеток, представляет собой внутриклеточный белок, который, как известно, экспрессируется после активации или деления нормальных покоящихся клеток, и в условиях стресса образует цитоплазматические гранулы с внутриклеточными РНК, участвующими в регуляции транспорта и трансляции мРНК. Кроме того, было обнаружено, что CAPRIN-1 экспрессируется на высоком уровне на мембранной поверхности раковых клеток молочной железы, а антитела против CAPRIN-1 обладают сильным противоопухолевым действием на раковые клетки молочной железы (патентный документ 1). В другом документе сообщается, что экспрессия CAPRIN-1 в образце, взятом у пациента, может быть измерена с использованием антитела, связывающегося с белком CAPRIN-1, экспрессируемым на клеточной поверхности, что, тем самым, позволяет детектировать рак и определить степень его злокачественности (патентный документ 2). В частности, имеется сообщение о том, что плазматический мембранный белок CAPRIN-1 может служить в качестве мишени для лечения рака или т.п. Как упоминалось выше, из-за индивидуальных различий пациентов, страдающих раком, необходимо определить наличие CAPRIN-1 в образце, взятом у пациента, страдающего раком, для оценки эффективности введения терапевтического лекарственного средства, нацеленного на CAPRIN-1, например, антитела. Тем не менее, пока еще не существует каких-либо данных о способе детектирования CAPRIN-1, позволяющих разработать такое специфическое терапевтическое лекарственное средство, а также не существует каких-либо реагентов для детекции рака в образце, взятом у пациента, страдающего раком.

Список цитируемой литературы

Патентные документы:

Патентный документ 1: WO 2010/016526.

Патентный документ 2: WO 2010/016527.

Описание сущности изобретения

Техническая проблема

Целью настоящего изобретения является разработка способа обнаружения рака, который может быть применен для диагностики рака. Другой целью настоящего изобретения является разработка способа обнаружения рака, который включает определение присутствия и количества CAPRIN-1 в образце, взятом у пациента, страдающего раком, для определения эффективности введения пациенту, страдающему раком, лекарственного средства, нацеленного на CAPRIN-1, а также разработка лекарственного средства и набора для диагностики рака.

Способы решения данной проблемы

В результате проведения тщательных исследований, авторами настоящего изобретения были получены кДНК, кодирующие белки, связывающиеся с антителами, присутствующими в сыворотке, взятой из организма с раковой опухолью, методом SEREX с использованием библиотеки кДНК, выделенных из яичек собак, и в сыворотке собак с раковой опухолью, и на основе этих кДНК были также получены собачьи белки CAPRIN-1, имеющие аминокислотные последовательности, представленные в SEQ ID NO: 6, 8, 10, 12 и 14. На основе человеческих генов, гомологичных полученным генам, авторами настоящего изобретения были также продуцированы человеческие белки CAPRIN-1, имеющие аминокислотные последовательности, представленные в SEQ ID NO: 2 и 4. Затем, авторами настоящего изобретения было обнаружено, что гены, кодирующие эти белки, специфически экспрессируются в яичках собаки и человека, соответственно, и в злокачественных раковых клетках (см. описанный ниже пример 1), и что моноклональные антитела, продуцированные с использованием рекомбинантных полипептидов в качестве антигенов, содержащих аминокислотные последовательности этих белков, могут связываться с CAPRIN-1 в различных раковых тканях и разрушать раковые клетки, имеющие на своей поверхности CAPRIN-1. В результате этого, авторами настоящего изобретения было обнаружено, что CAPRIN-1 может быть использован в качестве мишени для лечения рака. Авторами настоящего изобретения было также обнаружено, что CAPRIN-1 может быть специфически детектирован в образцах, взятых у пациента, страдающего раком, с использованием вышеупомянутых моноклональных антител. Более конкретно, настоящее изобретение относится к способу детекции рака, где указанный способ включает измерение уровня экспрессии CAPRIN-1 с использованием предварительно определенного анти-CAPRIN-1 антитела, которое вводят в образец, выделенный из организма. Кроме того, авторами настоящего изобретения был разработан способ детектирования CAPRIN-1 в образце, взятом у пациента, страдающего раком, и измерения уровня экспрессии этого белка с помощью иммунологического анализа, проводимого с использованием любого из вышеупомянутых моноклональных антител, например, с помощью ELISA-анализа сыворотки, взятой у пациента, страдающего раком, с использованием предварительно определенного моноклонального анти-CAPRIN-1 антитела или с применением метода иммуногистохимического окрашивания раковых тканей. В результате анализа образца раковой опухоли указанным способом, авторами настоящего изобретения было также обнаружено, что применение лекарственного средства, нацеленного на CAPRIN-1, может оказаться эффективным, если у данного пациента наблюдается высокий уровень экспрессии CAPRIN-1. Исходя из этих результатов было осуществлено настоящее изобретение.

Настоящее изобретение относится к способу детектирования рака, который осуществляют в образце, взятом из организма, где указанный способ включает детектирование CAPRIN-1 в образце и измерение количества этого CAPRIN-1. Настоящее изобретение также относится к способу диагностики, где указанный способ включает измерение уровня экспрессии CAPRIN-1 в ткани до введения лекарственного средства, нацеленного на CAPRIN-1, пациенту, для предсказания эффективности такого введения и возможности применения терапевтического лекарственного средства против CAPRIN-1 (например, для того, чтобы определить, можно ли пациенту, страдающему раком, вводить лекарственное средство, нацеленное на CAPRIN-1, например, антитело). Настоящее изобретение также относится к лекарственному средству или к набору для диагностики рака, которые содержат антитело, способные вступать в реакцию с антигеном CAPRIN-1, или его антигенсвязывающий фрагмент.

В частности, настоящее изобретение включает следующие аспекты.

(1) Способ детектирования рака, включающий измерение уровня экспрессии CAPRIN-1 в биологическом образце посредством реакции «антиген-антитело» с использованием антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, обладающего иммунологической реактивностью с полипептидом, имеющим аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 66.

(2) Способ детектирования рака по п. (1), где измеряемый CAPRIN-1 представляет собой (а) полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в любой последовательности SEQ ID NO: с четными номерами от SEQ ID NO: 2 до 30 в списке последовательностей; или (b) полипептид, имеющий последовательность, которая на 85% или более идентична последовательности полипептида, содержащего аминокислотную последовательность, представленную в любой последовательности SEQ ID NO: с четными номерами от SEQ ID NO: 2 до 30 в списке последовательностей.

(3) Способ детектирования рака по п. (1) или (2), где указанный биологический образец представляет собой образец, взятый у человека, собак или кошек.

(4) Способ детектирования рака по любому из пп. (1)-(3), где указанный биологический образец представляет собой образец, взятый у собаки, и где измеряемый CAPRIN-1 имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 6, 8, 10, 12 или 14.

(5) Способ детектирования рака по любому из пп. (1)-(3), где указанный биологический образец представляет собой образец, взятый у человека, и где измеряемый CAPRIN-1 имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2 или 4.

(6) Способ детектирования рака по любому из пп. (1)-(5), где уровень экспрессии измеряемого CAPRIN-1, превышающий уровень экспрессии CAPRIN-1 у здорового индивидуума, указывает на наличие раковой опухоли, являющейся мишенью для антитела, используемого в качестве терапевтического лекарственного средства для лечения рака.

(7) Способ детектирования рака по любому из пп. (1)-(6), где измерение уровня экспрессии CAPRIN-1 осуществляют методом иммунологического анализа.

(8) Способ детектирования рака по п. (7), где метод иммунологического анализа представляет собой ELISA и/или метод иммуногистохимического окрашивания.

(9) Способ детектирования рака по любому из пп. (1)-(8), где указанный образец представляет собой физиологическую жидкость, ткань или клетку.

(10) Способ детектирования рака по любому из пп. (1)-(9), где указанный рак представляет собой по меньшей мере одно раковое заболевание, выбранное из группы, состоящей из рака молочной железы, опухоли головного мозга, рака пищевода, рака желудка, рака легкого, рака печени, рака почки, рака щитовидной железы, рака селезенки, рака поджелудочной железы, рака толстой кишки, рака кожи, рака яичника, рака матки, рака предстательной железы, рака мочевого пузыря, рака яичка, остеосаркомы и фибросаркомы.

(11) Способ детектирования рака по любому из пп. (1)-(10), где указанное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент представляет собой моноклональное антитело, имеющее вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 70, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 71, или антигенсвязывающий фрагмент этого антитела.

(12) Лекарственное средство или набор для диагностики рака, содержащие антитело, обладающее иммунологической реактивностью с полипептидом, имеющим аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 66, или антигенсвязывающий фрагмент этого антитела.

(13) Лекарственное средство или набор для диагностики рака по п. (12), где указанное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент представляет собой моноклональное антитело, имеющее вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 70, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 71, или антигенсвязывающий фрагмент этого антитела.

(14) Способ отбора терапевтического лекарственного средства, специфичного для индивидуума, для лечения рака, где указанный способ включает измерение уровня экспрессии CAPRIN-1 в биологическом образце с использованием антитела, обладающего иммунологической реактивностью с полипептидом, имеющим аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 66, или антигенсвязывающего фрагмента этого антитела, и если уровень экспрессии статистически значимо превышает уровень экспрессии у здорового индивидуума, отбор лекарственного средства, нацеленного на CAPRIN-1, как терапевтического лекарственного средства для лечения рака, подходящего для его введения индивидууму, у которого был взят биологический образец.

(15) Способ отбора терапевтического лекарственного средства, специфичного для индивидуума, для лечения рака по п. (14), где указанное лекарственное средство, нацеленное на CAPRIN-1, представляет собой антитело, обладающие иммунологической реактивностью с CAPRIN-1, или его антигенсвязывающий фрагмент.

В настоящей заявке испрашивается приоритет заявки на патент Японии No. 2012-160763, которая во всей своей полноте вводится в настоящее описание посредством ссылки.

Преимущественные эффекты настоящего изобретения

Настоящее изобретение относится к новому способу детектирования рака, включающему измерение уровня экспрессии CAPRIN-1 в образце, взятом у пациента, страдающего раком. Как конкретно описано ниже в примерах, антитела, полученные с использованием рекомбинантных полипептидов в качестве антигенов, продуцированных на основе аминокислотной последовательности CAPRIN-1 (также называемого белком каприном-1 или CAPRIN-1), специфически реагируют с CAPRIN-1 в физиологических жидкостях (например, в сыворотке) или в тканях пациентов, страдающих раком. Кроме того, как описано ниже в примерах, сам белок CAPRIN-1 специфически экспрессируется на высоком уровне в различных раковых тканях. Поэтому, для детекции рака может быть определено присутствие и количество CAPRIN-1 в образце, взятом у пациента с раком. Кроме того, присутствие или отсутствие чувствительности к лекарственному средству, нацеленному на CAPRIN-1, такому как терапевтическое лекарственное средство, нацеленное на CAPRIN-1, например, антитело, может быть предварительно определено для выбора пациента, который будет восприимчив к такому лекарственному средству. В частности, экспрессия и количество CAPRIN-1 могут быть предварительно определены путем введения лекарственного средства согласно изобретению пациенту, страдающему раком, для проведения более эффективного лечения с использованием антитела против CAPRIN-1.

Краткое описание графического материала

[Фигура 1] На фигуре 1 представлена диаграмма, на которой проиллюстрированы паттерны экспрессии CAPRIN-1-кодирующего гена в нормальных тканях и в опухолевых клеточных линиях. На панели для сравнения 1 представлены паттерны экспрессии гена, кодирующего белок CAPRIN-1. На панели для сравнения 2 представлены паттерны экспрессии гена GAPDH. На самой верхней панели представлены результаты, полученные для нормальных тканей собаки. На левой средней панели представлены результаты, полученные для тканей рака молочной железы собак. На правой средней панели представлены результаты, полученные для клеточных линий рака молочной железы человека. На самой нижней панели представлены результаты, полученные для различных клеточных линий рака человека.

Описание вариантов осуществления изобретения

Способ детектирования рака согласно изобретению включает измерение количества (уровня экспрессии) CAPRIN-1 (белка CAPRIN-1) в образце, взятом из организма (биологическом образце). Измерение уровня экспрессии CAPRIN-1 в образце, взятом у пациента, страдающего раком, может быть осуществлено, например, методом иммунологического анализа, который включает детектирование CAPRIN-1 с использованием антитела против CAPRIN-1 (анти-CAPRIN-1 антитела). Различные методы иммунологического анализа, применяемые для измерения уровня экспрессии CAPRIN-1, хорошо известны специалистам. Примерами таких методов являются иммуногистохимический анализ, вестерн-блот-анализ, иммунопреципитация, анализ на молекулярное связывание, ELISA и биохимический анализ на ферментативную активность. В результате измерения уровня экспрессии CAPRIN-1, проводимого таким аналитическим методом, можно также, например, определить присутствие CAPRIN-1 в образце; отношение клеток, экспрессирующих CAPRIN-1; распределение сайтов экспрессии в тканях и интенсивность экспрессии в этих сайтах. В этом контексте, используемый здесь термин «уровень экспрессии» включает уровень внутриклеточной аккумуляции и избыточный уровень белка.

Результаты измерения уровней экспрессии CAPRIN-1 в образце могут быть классифицированы по баллам, как описано в примерах. Чем выше балл, тем выше количество CAPRIN-1 в биологическом образце (например, в раковой ткани или в сыворотке пациента с раком), взятом у пациента, страдающего раком. В настоящем изобретении, термин «измерение» или «анализ» охватывает детектирование и методы качественной, количественной и полуколичественной оценки.

Аминокислотная последовательность, представленная в SEQ ID NO: 6, 8, 10, 12 или 14, представляет собой аминокислотную последовательность CAPRIN-1 собаки. CAPRIN-1 собаки, имеющий такую аминокислотную последовательность, был обнаружен методом SEREX с использованием библиотеки кДНК яичек собаки и сыворотки, взятой у собаки с раковой опухолью, и идентифицирован из библиотеки кДНК как полипептид, связывающийся со специфическим антителом, присутствующим в сыворотке собаки с раковой опухолью (см. пример 1). Сам белок CAPRIN-1, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6, 8, 10, 12 или 14, может быть также проанализирован как антиген в тканях собаки вышеупомянутым методом в целях выявления наличия или отсутствия чувствительности к лекарственному средству, нацеленному на CAPRIN-1 (см. Примеры).

В этом контексте, словосочетание «имеющий аминокислотную последовательность» означает, что аминокислотные остатки, в соответствии с имеющейся информацией о предварительно определенной аминокислотной последовательности, расположены в этой последовательности в определенном порядке. Так, например, словосочетание «полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2» означает полипептид длиной в 709 аминокислотных остатков, где аминокислотные остатки присоединены друг к другу в следующей аминокислотной последовательности: Met Pro Ser Ala … (и так далее) … Gln Gln Val Asn, как показано в SEQ ID NO: 2. Иногда, словосочетание «полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2» сокращенно обозначается «полипептид SEQ ID NO: 2». Это в равной степени касается и словосочетания «имеющий нуклеотидную последовательность». Слово «имеющий» в словосочетании «имеющий аминокислотную последовательность» и «имеющий нуклеотидную последовательность» может быть заменено словами «состоящий из».

Используемый здесь термин «полипептид» означает молекулу, которая образуется посредством пептидных связей из множества аминокислот и включает не только полипептидную молекулу, состоящую из большого числа аминокислот, но также и низкомолекулярное соединение, имеющее небольшое число аминокислот (олигопептид или пептид), и полноразмерный белок.

Полипептид согласно изобретению также включает полноразмерные белки CAPRIN-1, имеющие аминокислотные последовательности, представленные в SEQ ID NO: с четными номерами от SEQ ID NO: 2 до 30.

В способе согласно изобретению может быть также определен дополнительный другой CAPRIN-1 млекопитающих, отличающийся от собачьего CAPRIN-1, представленного в SEQ ID NO: 6, 8, 10, 12 или 14. В настоящем описании, такой CAPRIN-1 млекопитающих, но не собак, также называется «гомологом» собачьего CAPRIN-1. Термин «CAPRIN-1» охватывает CAPRIN-1, происходящий не только от собак, но также и от других млекопитающих. Примерами дополнительных белков CAPRIN-1 млекопитающих, которые могут быть определены в способе согласно изобретению, являются, но не ограничиваются ими, CAPRIN-1 человека и CAPRIN-1 кошки.

Как конкретно описано ниже в примерах, мРНК, кодирующая человеческий CAPRIN-1, также как и мРНК, кодирующая собачий CAPRIN-1 SEQ ID NO: 6, 8, 10, 12 или 14, экспрессируется на достаточно высоких уровнях в человеческих клетках яичек и в раковых клетках. Однако, антитело против человеческого CAPRIN-1 не детектируется в организме здорового человека. Антитело против кошачьего CAPRIN-1 не детектируется в организме здоровых кошек, а детектируется только у кошек с раковой опухолью. Таким образом, возможность введения лекарственного средства, нацеленного на CAPRIN-1, млекопитающему, не являющемуся собакой, может быть также определена путем измерения уровня экспрессии CAPRIN-1, происходящего от млекопитающего, не являющегося собакой.

Нуклеотидная последовательность, кодирующая человеческий CAPRIN-1, и его аминокислотная последовательность представлены в SEQ ID NO: 1 или 3, и в SEQ ID NO: 2 или 4, соответственно, в списке последовательностей. Нуклеотидные последовательности человеческого CAPRIN-1 и собачьего CAPRIN-1 идентичны на 94%, а их аминокислотные последовательности идентичны на 98%. Поскольку аминокислотные последовательности CAPRIN-1 даже у собак и человека, которые имеют очень отдаленное родство, являются в высокой степени, то есть, на 98%, идентичными, то, вероятно, что многие нечеловеческие и несобачьи белки последовательности белка CAPRIN-1 имеют высокую степень идентичности (приблизительно на 85% или более) последовательностям человеческого или собачьего CAPRIN-1. Белками CAPRIN-1, уровень экспрессии которых измеряют в способе согласно изобретению, могут быть, но не ограничиваются им, белок, имеющий последовательность, которая, предпочтительно, на 85% или более, а более предпочтительно, на 95% или более идентична аминокислотной последовательности собачьего или человеческого CAPRIN-1, представленного в SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12 или 14.

Антигенная молекула, такая как белок, который имеет сложную структуру с высокой молекулярной массой, обычно содержит множество эпитопов, отличающихся друг от друга по своей структуре. Таким образом, антитела многих типов, которые, соответственно, распознают множество эпитопов и связываются с множеством эпитопов на такой антигенной молекуле, продуцируются in vivo. Другими словами, такими продуцируемыми in vivo антителами против антигенной молекулы (например, белка) являются поликлональные антитела, которые представляют собой смеси антител многих типов. Поликлональными антителами также являются антитела, которые, как было обнаружено авторами настоящего изобретения, присутствуют в сыворотке индивидуума, страдающего раком, и специфически связываются с рекомбинантным CAPRIN-1 посредством реакции «антиген-антитело». Термин «поликлональное антитело», используемый в настоящем изобретении, означает антитело, которое присутствует в сыворотке организма индивидуума, содержащего антигенную молекулу, и представляет собой антитело против антигенной молекулы, вырабатываемое данным организмом.

Конкретными примерами предпочтительных полипептидов, используемых в качестве антигена для получения антитела против CAPRIN-1, являются полипептиды, представленные в любой последовательности SEQ ID NO: с четными номерами от SEQ ID NO: 2 до 30, и их фрагменты. В частности, в способе согласно изобретению могут быть, предпочтительно, использованы антитела против CAPRIN-1, которые были получены с использованием, в качестве антигена, полипептида SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28 или 30, или его фрагмента, содержащего аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 66 и включающую предпочтительный эпитоп, и которые специфически связываются (то есть, обладают иммунологической реактивностью) с полипептидом, имеющим аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 66.

Полинуклеотидные последовательности, кодирующие полипептиды, состоящие из аминокислотных последовательностей, представленных в любой из последовательностей SEQ ID NO: с четными номерами от SEQ ID NO: 2 до 30 (то есть, SEQ ID NO: 2, 4, 6…28 и 30), представлены в любой последовательности SEQ ID NO: с нечетными номерами от SEQ ID NO: 1 до 2 9 (то есть, SEQ ID NO: 1, 3, 5…27 и 29), соответственно.

Специалистам хорошо известно, что даже белок, полученный из антигенного белка путем замены, делеции, добавления или инсерции небольшого числа аминокислотных остатков в аминокислотной последовательности данного белка, может, по существу, обладать такой же антигенностью, как и исходный белок. Таким образом, полипептид, имеющий последовательность, полученную из аминокислотной последовательности CAPRIN-1 путем замены, делеции, добавления и/или инсерции небольшого числа (предпочтительно, 1 или нескольких) аминокислотных остатков, может быть использован для продуцирования анти-CAPRIN-1 антитела также как и полипептиды, состоящие из аминокислотных последовательностей, представленных в любой последовательности SEQ ID NO: с четными номерами от SEQ ID NO: 2 до 30, при условии, что этот полипептид имеет последовательность, которая на 80% или более, на 85% или более, предпочтительно, на 90% или более, более предпочтительно, на 95% или более, а еще более предпочтительно, на 98% или более идентична исходной последовательности и специфически связывается с поликлональным антителом против CAPRIN-1 посредством реакции «антиген-антитело» (далее, для удобства, этот полипептид будет также называться «модифицированным полипептидом со специфической реактивностью»).

При этом предпочтительно, чтобы модифицированный полипептид со специфической реактивностью имел аминокислотную последовательность, полученную из аминокислотной последовательности CAPRIN-1 путем замены, делеции, добавления и/или инсерции 1 или нескольких аминокислотных остатков. Используемый здесь термин «несколько» означает целое число от 2 до 10, предпочтительно, целое число от 2 до 6, а более предпочтительно, целое число от 2 до 4. Термин «идентичность последовательностей», используемый здесь по отношению к аминокислотной последовательности, означает процентную величину, полученную путем деления числа соответствующих аминокислотных остатков на общее число аминокислотных остатков с наилучшим соответствием, выявленным путем выравнивания аминокислотных остатков двух сравниваемых аминокислотных последовательностей. Для выравнивания, если это необходимо, в одну или в обе эти сравниваемые последовательности могут быть внесены пробелы. Такое выравнивание последовательностей может быть осуществлено с использованием хорошо известной программы, например, BLAST, FASTA, of CLUSTAL W (Karlin and Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 87:2264-2268, 1993; и Altschul et al., Nucleic Acids Res., 25:3389-3402, 1997).

Двадцать аминокислот, составляющих природный белок, могут быть классифицированы по аналогичным свойствам на следующие группы: нейтральные аминокислоты, имеющие небольшую полярную боковую цепь (Gly, Ile, Val, Leu, Ala, Met и Pro); нейтральные аминокислоты, имеющие гидрофильную боковую цепь (Asn, Gln, Thr, Ser, Tyr и Cys); кислотные аминокислоты (Asp и Glu); основные аминокислоты (Arg, Lys и His) и ароматические аминокислоты (Phe, Tyr, Tpr и His). Известно, что замена аминокислоты каждой другой аминокислотой, входящей в одну и ту же группу, то есть, консервативная замена, в большинстве случаев, не влияет на свойства полипептида. Таким образом, в случае замены аминокислотных остатков CAPRIN-1, член каждой из этих групп может быть заменен другим членом той же самой группы так, чтобы сохранялась активность связывания этого белка с соответствующим антителом. Однако, в настоящем изобретении, модифицированная форма может иметь неконсервативную замену, при условии, что такая модифицированная форма будет обладать иммунитет-индуцирующей активностью, эквивалентной или, по существу, эквивалентной активности немодифицированной формы.

Полипептид, используемый в настоящем изобретении, может быть синтезирован методами химического синтеза, например, методами синтеза с использованием Fmoc (флуоренилметилоксикарбонила) и tBoc (трет-бутилоксикарбонила) (Seikagaku Jikken Koza (Biochemical Experimentation Course in English) 1, the Japanese Biochemical Society ed., Protein Chemistry IV, Chemical Modification and Peptide Synthesis, Tokyo Kagaku Dojin, Ltd. (Japan), 1981). Кроме того, этот полипептид может быть синтезирован рутинными методами на различных коммерчески доступных пептидных синтезаторах. Альтернативно, полипептид может быть легко получен методами генной инженерии, известными специалистам (Sambrook et al., Molecular Cloning, 2nd edition, Current Protocols in Molecular Biology (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology, 3rd Edition, A compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology (1995), John Wiley & Sons и т.п.). Так, например, РНК экстрагируют из ткани, экспрессирующей ген, кодирующий человеческий CAPRIN-1 SEQ ID NO: 2 или его гомолог. Из этой РНК получают кДНК гена с помощью ОТ-ПЦР. Полноразмерную кДНК или ее нужный неполный фрагмент вводят в экспрессионные векторы, которые затем переносят в клетки-хозяева с получением представляющего интерес полипептида. Нуклеотидные последовательности кДНК, кодирующие собачьи белки CAPRIN-1 SEQ ID NO: 6, 8, 10