Способы идентификации антител с пониженной иммуногенностью

Способы идентификации антител с пониженной иммуногенностью

Иллюстрации

Показать все

Реферат

1. ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

В данной заявке согласно § 119(e) 35 U.S.С. (Свод федеральных законов США) испрашивается приоритет для предварительной заявки с серийным №61/703170, поданной 19 сентября 2012 г., содержание которой включено сюда посредством ссылки во всей ее полноте.

2. ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

Настоящая заявка содержит перечень последовательностей, который был подан в формате ASCII посредством EFS-Web и является тем самым включенным посредством ссылки во всей его полноте. Указанная копия ASCII, созданная 17 сентября 2013 г., названа 381493-721WO(118133)_SL.txt и имеет размер 6980 байт.

3. ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

В-клеточные эпитопы представляют собой сайты молекул, которые распознаются антителами иммунной системы. Идентификация В-клеточных эпитопов в терапевтических белках может быть полезной при конструировании вариантов, которые не индуцируют иммунный ответ при введении пациентам.

В-клеточные эпитопы можно идентифицировать путем индивидуального мутирования аминокислот белка, типично на аланин (аланиновое сканирование), и определения влияния каждой мутации на связывание антителом (Onda et al., 2011, Proc. Natl. Acad. Sci. 108(14): 5742-7). Нарушение связывания белок-антитело после мутагенеза указывает на то, что мутировавший остаток является частью В-клеточного эпитопа, распознаваемого антителом. Обнаружили, что даже одна мутация в В-клеточном эпитопе может устранять связывание с группой антител, направленных на данный белок, и что иммуногенность белка может быть снижена введением мутаций в В-клеточный эпитоп (Nagata, Pastan, 2009, Advanced Drug Delivery Reviews 61: 977-985). Однако данный подход также является времязатратным и трудоемким. Кроме того, аланиновое сканирование не обязательно идентифицирует мутации, которые обеспечили бы наибольшее уменьшение иммуногенности.

Таким образом, существует потребность в простом, нетрудоемком, и, тем не менее, всестороннем способе, который обеспечивает идентификацию и устранение В-клеточных эпитопов.

4. КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В настоящем описании предложена система, которая обеспечивает выяснение иммуногенного вклада любой и каждой аминокислоты в пределах интересующей области в исходном антителе. В данном описании предложено то, что аминокислотный остаток в любом, некотором или во всех положениях исходного антитела может быть мутирован до некоторой или всех других 19 аминокислот, и может быть оценен эффект данной мутации на иммуногенность антитела. Также может быть оценен эффект мутаций на уровень экспрессии и/или связывание антитела с молекулой-мишенью, обеспечивая идентификацию вариантов антитела, в которых иммуногенные области устраняются или уменьшаются, сохраняющих, тем не менее, полезные свойства (например, подходящие уровни экспрессии, связывание с молекулой-мишенью). Соответственно, согласно настоящему описанию предложены способы уменьшения иммуногенности антитела. Данные способы основаны на скрининге и на идентификации вариантов антитела с пониженным связыванием с антиидиотипическими антителами. Уменьшение связывания с антиидиотипическими антителами коррелирует с пониженной иммуногенностью in vivo (см., например, Nagata, Pastan, 2009, Advanced Drug Delivery Reviews 61: 977-985).

Способы по данному изобретению обычно включают стадии (а) приведения в контакт библиотеки клеток-хозяев с антиидиотипическим антителом, которое специфично связывается с исходным антителом, причем исходное антитело представляет собой моноклональное антитело, которое связывается с молекулой-мишенью, библиотека клеток-хозяев содержит клетки-хозяева млекопитающих, каждая из которых экспрессирует на поверхности клетки вариант антитела, отличающийся от исходного антитела одной точечной мутацией аминокислоты; (б) осуществления идентификации популяции клеток в указанной библиотеке клеток-хозяев, которые экспрессируют варианты антитела, демонстрирующие пониженное связывание с антиидиотипическим антителом относительно исходного антитела; и (в) осуществления идентификации варианта антитела, которым обогащена данная популяция, идентифицируя посредством этого вариант исходного антитела с пониженной иммуногенностью. В некоторых аспектах данные способы влекут за собой подвергание библиотеки клеток-хозяев проточной цитометрии и сортировке популяции из библиотеки клеток-хозяев с использованием, например, сортировки клеток, активированной флуоресценцией (FACS).

В некоторых аспектах данные способы дополнительно включают стадию определения того, связывается ли вариант антитела, имеющий пониженную иммуногенность, с молекулой-мишенью на уровне, который по существу является равным или лучшим, чем для исходного антитела, и/или экспрессируется ли он на уровне, который по существу является равным или лучшим, чем уровень экспрессии исходного антитела. В конкретных воплощениях связывание и экспрессию определяют посредством проточной цитометрии, сортировки с использованием магнитных шариков, BIAcore, FACS, ELISA (твердофазный иммуноферментный анализ), AlphaLisa или KinExA (кинетический эксклюзионный анализ), и определяют до, одновременно с или после идентификации вариантов антитела, имеющих пониженную иммуногенность.

Описанные здесь способы применяли к антителу против TNF-α (фактор некроза опухолей-альфа) D2E7 (также известному как адалимумаб). Идентифицировали варианты D2E7 с пониженным связыванием с одним, двумя или тремя разными антиидиотипическими антителами. Согласно настоящему изобретению предложены антитела против TNF-α с последовательностями CDR (определяющая комплементарность область), родственными последовательностям D2E7, но которые имеют по меньшей мере одну замену, которая уменьшает связывание с анти-Id (антиидиотипическими) антителами. Такие варианты иногда здесь называются вариантами с «пониженной иммуногенностью».

Антитела против TNF-α по данному изобретению содержат шесть CDR, имеющих аминокислотные последовательности, соответствующие SEQ ID NO: 5 (CDR-H1), SEQ ID NO: 6 (CDR-H2), SEQ ID NO: 7 (CDR-H3), SEQ ID NO: 8 (CDR-L1), SEQ ID NO: 9 (CDR-L2) и SEQ ID NO: 10 (CDR-L3), и имеют по меньшей мере одну замену, выбранную из G5F в CDR-L1, G5I в CDR-L1, G5V в CDR-L1, G5W в CDR-L1, G5Y в CDR-L1, R7I в CDR-L1, R7T в CDR-L1, R7V в CDR-L1,

N8A в CDR-L1, N8D в CDR-L1, N8E в CDR-L1, N8G в CDR-L1, N8L в CDR-L1, N8M в CDR-L1, N8Q в CDR-L1, N8R в CDR-L1, N8T в CDR-L1, A1I в CDR-L2, А1Т в CDR-L2, A1V в CDR-L2, T4D в CDR-L2, R2G в CDR-L3, N4F в CDR-L3, N4M в CDR-L3, N4W в CDR-L3, N4Y в CDR-L3, R5L в CDR-L3, R5N в CDR-L3, R5W в CDR-L3, R5Y в CDR-L3, T9Y в CDR-L3, D1S в CDR-H1, Y2A в CDR-H1, Y2C в CDR-H1, Y2K в CDR-H1, Y2M в CDR-H1, Y2R в CDR-H1, Y2S в CDR-H1, Y2V в CDR-H1, Н5С в CDR-H1, H5D в CDR-H1, Н5Е в CDR-H1, H5S в CDR-H1, Н5Т в CDR-H1, Т3А в CDR-H2, T3G в CDR-H2, T3N в CDR-H2, W4A в CDR-H2, W4F в CDR-H2, W4H в CDR-H2, W4L в CDR-H2, W4M в CDR-H2, W4V в CDR-H2, N5G в CDR-H2, S6D в CDR-H2, S6L в CDR-H2, I9K в CDR-H2, D10L в CDR-H2, Y11A в CDR-H2, Y11C в CDR-H2, Y11E в CDR-H2, Y11F в CDR-H2, Y11G в CDR-H2, Y11H в CDR-H2, Y11I в CDR-H2, Y11K в CDR-H2, Y11L в CDR-H2, Y11M в CDR-Н2, Y11N в CDR-H2, Y11Q в CDR-H2, Y11R в CDR-H2, Y11S в CDR-H2, Y11V в CDR-H2, Y11W в CDR-H2, A12Y в CDR-H2, D13N в CDR-H2, V15D в CDR-H2, V15L в CDR-H2, V15M в CDR-H2, V15Q в CDR-H2, V15T в CDR-H2, E16F в CDR-Н2, Е16Н в CDR-H2, Е16K в CDR-H2, E16R в CDR-H2, Е16Т в CDR-H2, E16W в CDR-H2, G17A в CDR-H2, G17C в CDR-H2, G17E в CDR-H2, G17H в CDR-H2, G17I в CDR-H2, G17K в CDR-H2, G17L в CDR-H2, G17M в CDR-H2, G17N в CDR-Н2, G17P в CDR-H2, G17Q в CDR-H2, G17R в CDR-H2, G17S в CDR-H2, G17T в CDR-H2, G17Y в CDR-H2, V1G в CDR-H3, V1R в CDR-H3, V1W в CDR-H3, L4T в CDR-H3, L4V в CDR-H3, T6V в CDR-H3, S9K в CDR-H3, S9W в CDR-H3, S9Y в CDR-H3 и D11V в CDR-H3. Шесть данных CDR могут в совокупности иметь вплоть до 8, вплоть до 7, вплоть до 6, вплоть до 5 или вплоть до 4 аминокислотных замен по сравнению с последовательностями CDR адалимумаба. В некоторых аспектах каждая CDR может иметь вплоть до 4, вплоть до 3 или вплоть до 2 замен по сравнению с CDR адалимумаба. В конкретных воплощениях антитела против TNF-α по данному изобретению имеют одну или более чем одну комбинацию аминокислотных замен, при которой замена(ы) в тяжелой цепи, при ее (их) наличии, содержит(ат) по меньшей мере одну из (а) Y2K в CDR-H1; (б) Y2M в CDR-H1; (в) Y2K в CDR-H1 и T6V в CDR-H3; (г) Y2K в CDR-H1, V1G в CDR-H3 и T6V в CDR-H3; (д) V1W в CDR-H3; и (е) V1G в CDR-H3 и T6V в CDR-H3, и при которой замена(ы) в легкой цепи, при ее (их) наличии, содержит(ат) по меньшей мере одну из (а) G5S в CDR-L1 и A11S в CDR-L1; (б) R7I в CDR-L1; (в) G5S в CDR-L1, R7T в CDR-L1 и A11S в CDR-L1; и (г) G5S в CDR-L1, R7I в CDR-L1 и A11S в CDR-L1. В конкретных воплощениях антитела по данному изобретению содержат комбинацию аминокислотных замен, выбранных из замен, представленных на ФИГ. 22.

Антитела против TNF-α по данному изобретению предпочтительно имеют ослабленное связывание с одним, двумя, тремя, четырьмя, пятью или всеми шестью антиидиотипическими антителами против адалимумаба 5А1, 10F8, 7А11, 1Н11, 6А11 и 10В7.

Настоящее изобретение дополнительно относится к нуклеиновокислотным молекулам, кодирующим антитела против TNF-α по данному изобретению, и к содержащим их клеткам-хозяевам.

Настоящее изобретение дополнительно относится к фармацевтическим композициям, содержащим антитела против TNF-α по данному изобретению, и к способам лечения пациента-человека, страдающего от иммунного расстройства, путем введения данных антител против TNF-α или содержащих их фармацевтических композиций. В определенных аспектах иммунным расстройством, которое лечат, является ревматоидный артрит (RA) (включая RA от умеренного до тяжелого у взрослых), ювенильный идиопатический артрит (ЛА) (включая ЛА от умеренного до тяжелого полиартикулярного у пациентов в возрасте 4 года и старше), псориатический артрит (PsA) (включая PsA у взрослых), анкилозирующий спондилит (AS) (включая AS у взрослых), болезнь Крона (CD) (включая CD от умеренной до тяжелой у взрослых), хронический бляшечный псориаз (Ps) (включая хронический бляшечный псориаз от умеренного до тяжелого у взрослых) или аксиальный спондилоартрит (axSpA) (включая тяжелый axSpA у взрослых пациентов, которые не имеют рентгенологического доказательства структурного повреждения).

5. КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

ФИГ. 1А - 1В: на ФИГ. 1А представлены транслируемые аминокислотные последовательности фрагментов вариабельной области тяжелой цепи (V_H) и вариабельной области легкой цепи (V_L) синтетического D2E7 (адалимумаб, HUMIRA). На ФИГ. 1Б представлены аминокислотные последовательности CDR фрагментов V_H и V_L D2E7. На ФИГ. 1В представлены нуклеотидные последовательности фрагментов V_H D2E7 и V_L D2E7 (SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 3 соответственно).

На ФИГ. 2: представлен список полезных мутаций в V_L D2E7, которые будут приводить к нейтральному связыванию с TNF-α и ослабленному связыванию с анти-Id 5А1 (а), 10F8 (б) или 7А11 (в). Положения аминокислот приведены в контексте как индивидуальных CDR, так и нумерации по Kabat. На ФИГ. 2 раскрыты SEQ ID NO: 8-10, соответственно, в порядке появления.

ФИГ. 3А - 3Б: на ФИГ. 3А представлен список полезных мутаций в CDR-H1 и CDR-H2 V_H D2E7, которые будут приводить к нейтральному связыванию с TNF-α и ослабленному связыванию с анти-Id 1Н11 (г), 6А11 (д) или 10В7 (е). На ФИГ. 3Б представлен список полезных мутаций в CDR-H3 V_H D2E7, которые будут приводить к нейтральному связыванию с TNF-α и ослабленному связыванию с анти-Id 1Н11 (г), 6А11 (д) или 10В7 (е). Положения аминокислот приведены в контексте как индивидуальных CDR, так и нумерации по Kabat. На ФИГ. 3А раскрыты SEQ ID NO: 5-6 соответственно в порядке появления. На ФИГ. 3Б раскрыта SEQ ID NO: 7.

На ФИГ. 4 представлена структура D2E7 в векторах pYA206 и pCW600.

На ФИГ. 5 представлен график титрования человеческого TNF-α на Fab D2E7 дикого типа (WT), экспрессируемом на поверхности клетки.

На ФИГ. 6 представлен график титрования связывания антиидиотипических антител (анти-Id) с Fab D2E7 дикого типа (WT), экспрессируемым на поверхности клетки.

ФИГ. 7А - 7Б: на ФИГ. 7А представлены профили сортировки FACS для D2E7 дикого типа, окрашенного TNF-α. На ФИГ. 7Б представлены профили сортировки FACS для библиотеки точечных мутаций V_H, окрашенных TNF-α.

На ФИГ. 8А - 8Б представлены профили сортировки FACS для D2E7 дикого типа и библиотеки точечных мутаций V_H, окрашенных 1Н11.

На ФИГ. 9 представлены отношения обогащения молчащих мутаций кодонов D2E7 по положению. Положения аминокислот приведены в контексте индивидуальных CDR.

На ФИГ. 10 представлена карта планшета с подбиблиотеками D2E7. Положения аминокислот приведены в контексте как индивидуальных CDR, так и нумерации по Kabat. На ФИГ. 10 раскрыты SEQ ID NO: 8-10 и 5-7 сверху вниз, слева направо, соответственно, в порядке появления.

На ФИГ. 11 представлены профили FACS подбиблиотек мутантных D2E7 и контролей дикого типа.

На ФИГ. 12 представлены профили FACS подбиблиотек мутантных D2E7 и контролей дикого типа.

На ФИГ. 13А - 13Г представлена модель заполнения пространства вариабельной области тяжелой цепи D2E7. На панелях А, Б и В серым показаны CDR1, 2 и 3 легкой цепи соответственно. На панели Г серым показан эпитоп анти-Id 1Н11. В последовательности V_H (SEQ ID NO: 2), описанной ниже, CDR показаны подчеркнутыми, а положения, которые являются важными для связывания с анти-Id 1Н11, - жирным дважды подчеркнутым текстом. Каждая из трех CDR дает один или более чем один аминокислотный остаток в эпитоп.

На ФИГ. 14А - 14Г представлена модель заполнения пространства вариабельной области легкой цепи D2E7. На панелях А, Б и В серым показаны CDR1, 2 и 3 легкой цепи соответственно. На панели Г серым показан эпитоп анти-Id 5А1 и 10F8. В последовательности V_L (SEQ ID NO: 4), описанной ниже, CDR показаны подчеркнутыми, а положения, которые являются важными для связывания с анти-Id 5А1 и 10F8, - жирным дважды подчеркнутым текстом. Каждая из трех CDR дает один или более чем один аминокислотный остаток в эпитоп.

На ФИГ. 15 представлен одноточечный анализ FACS мутантов CDR1-2 V_H D2E7.

На ФИГ. 16 представлен репрезентативный позиционный анализ D2E7.

На ФИГ. 17 представлены средние отношения обогащения 1Н11 по положению.

На ФИГ. 18 представлены средние отношения обогащения 5А1 по положению.

На ФИГ. 19 представлены средние отношения обогащения 10F8 по положению.

На ФИГ. 20А - 20Б показано влияние мутаций антитела против TNF-α на связывание антител против адалимумаба в образцах сыворотки от четырех оплачиваемых доноров. Положения аминокислот приведены согласно нумерации по Kabat. VL-SS относится к VL, имеющей замены G28S и A34S в CDR-L1 (нумерация по Kabat), соответствуя комбинации G5S плюс A11S в CDR-L1.

На ФИГ. 21А - 21Б показаны варианты антител против TNF-α с наибольшим снижением связывания с антителами против адалимумаба. VL-SS относится к VL, имеющей замены G28S и A34S в CDR-L1 (нумерация по Kabat), соответствуя комбинации G5S плюс A11S в CDR-L1.

На ФИГ. 22 показаны данные по связыванию для вариантов с множественными заменами аминокислот.VL-SS относится к VL, имеющей замены G28S и A34S в CDR-L1 (нумерация по Kabat), соответствуя комбинации G5S плюс A11S в CDR-L1.

6. ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

6.1. Способы идентификации антител с пониженной иммуногенностью

Согласно настоящему изобретению дополнительно предложена система, которая обеспечивает выяснение иммуногенного вклада любой и каждой аминокислоты в интересующей области в пределах интересующего антитела (исходного антитела). Данные способы включают подвергание исходного антитела всеохватывающему мутагенезу в одной или более чем одной области (например, в одной или более чем одной CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3, CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, FR-L1, FR-L2, FR-L3, FR-H1, FR-H2, FR-H3 и FR-H4) и оценку влияния мутаций на связывание с антиидиотипическим антителом («анти-Id»). Описанные здесь способы приводили к идентификации описанных выше вариантов антител против TNF-α с пониженной иммуногенностью.

Конструирование и построение библиотеки: конструируется библиотека антител, которая содержит каждую возможную замену одной аминокислоты в каждом возможном положении в желаемой области или домене исходного антитела, для идентификации эффекта (хорошего, плохого или нейтрального) мутации на связывание с анти-Id антителом. Затем строят библиотеку вариантов антитела, например с использованием «рандомизированных кодонов NNK» с получением вариантов с заменой одной аминокислоты, где «N» относится к любому основанию (например, А, С, G или Т) и «K» относится либо к G, либо к Т. При схеме рандомизации NNK могут кодироваться 32 разных кодона, покрывающих все 20 встречающихся в природе аминокислот. Аминокислотные остатки в каждом положении антитела можно мутировать до любой из 19 аминокислот, которые отличаются от аминокислоты дикого типа в том же самом положении, что приводит к точечной мутации одной аминокислоты в данном антителе. Конечным результатом является библиотека вариантов антитела, охватывающая группы из множества антител, имеющих один остаток, который отличается от члена к члену данной библиотеки. Общее множество составляющих библиотеки может насчитывать примерно 50-10000 членов (например, 50, 100, 500, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000, 5500, 6000, 6500, 7000, 7500, 8000, 8500, 9000, 9500 или 10000 членов), примерно 1000-5000 членов или примерно 1000 членов, на основании числа аминокислот, намеченных для мутации. Независимо от размера и сложности библиотеки, описанные здесь способы обеспечивают одновременный скрининг и одновременное секвенирование всех членов библиотеки.

В качестве неограничивающего примера для идентификации конкретных вариантов антитела с пониженной иммуногенностью по сравнению с исходным антителом аминокислотные остатки в определяющих комплементарность областях (CDR) являются потенциальными мишенями для мутации. Устранение или уменьшение В-клеточного эпитопа может давать антитело с пониженной иммуногенностью. Типично для мутации можно рассматривать и идентифицировать примерно от 50 до 60 положений аминокислот CDR. Можно конструировать и строить набор синтетических фрагментов ДНК, которые кодируют родительские V_H или V_L дикого типа и все возможные варианты антитела с заменой одной аминокислоты. Для получения вариантов антитела с заменой одной аминокислоты можно использовать описанные выше рандомизированные кодоны NNK. Таким образом, аминокислотные остатки в каждом положении в пределах CDR можно мутировать, что приводит к одноаминокислотным точечным мутациям вдоль выбранной области CDR. Конечным результатом являются библиотеки вариантов антитела, которые представляют собой группы из множества антител, имеющих один остаток, который отличается от члена к члену в данной библиотеке. В этом примере библиотека имеет приблизительно 1000-1300 членов, где в каждом из 50-60 или 65 положений аминокислот CDR в выбранной области производится замена на одну из 19 встречающихся в природе аминокислот всего для 20 разных аминокислот в любом данном положении (т.е. 50×20=1000; 60×20=1200 или 65×20=1300).

Экспрессия вариантов антитела: после построения библиотеки второй стадией является экспрессия библиотеки вариантов антитела для сортировки посредством дисплея на поверхности клетки. Библиотеку вариантов можно экспрессировать с использованием способов на основе дисплея, таких как, например, фаговый дисплей, дрожжевой дисплей, бактериальный дисплей и рибосомальный дисплей, и она предпочтительно экспрессируется в клетках млекопитающих для обеспечения правильного сворачивания и посттрансляционной модификации экспрессируемых вариантов.

Для экспрессии у млекопитающих трансмембранные домены, используемые для связывания и дисплея тетрамерных молекул иммуноглобулинов на поверхности клетки, могут представлять собой любой трансмембранный домен, способный к удалению посредством ферментативного, химического или фотолитического расщепления. В некоторых воплощениях трансмембранный домен фланкирован сайтами расщепления, которые распознаются и расщепляются расщепляющим ферментом. Например, расщепляющий фермент может представлять собой липазу, эстеразу, фосфатазу, гликозидазу или карбоксипептидазу. В некоторых воплощениях трансмембранный домен содержит олигонуклеотид или олигонуклеотидный аналог, имеющий последовательность, которая распознается и расщепляется нуклеазой, такой как рибонуклеаза (РНКаза) или дезоксирибонуклеаза (ДНКаза). В некоторых воплощениях трансмембранный домен содержит пептид или пептидный аналог, который распознается и расщепляется протеазой.

В некоторых воплощениях для получения иммуноглобулинов с трансмембранным доменом или без него можно использовать сплайсинг мРНК (матричная РНК) (см., например, патент США №7947495, включенный сюда посредством ссылки во всей его полноте).

В других воплощениях трансмембранный домен фланкирован рекомбиназными сайтами распознавания, которые распознаются рекомбиназой. Примеры рекомбиназных сайтов распознавания включают сайты lox, сайты att, сайты dif и сайты frt, но не ограничиваются ими. Относительно обзоров рекомбиназ, см., например, Sauer, 1994, Curr. Opin. Biotech. 5: 521-527; Landy, 1993, Curr. Opin. Biotech. 3: 699-707; Sadowski, 1993, FASEB 7: 760-767 и публикацию патента США №20040115814.

Трансмембранные домены для применения в описанных здесь композициях и способах могут происходить из мембранных белков типа I, типа II и типа III (см., например, Chesnut et al., 1996, J. Imm. Methods, 193: 17-27; Wahlberg et al., 1997, J. Cell Biol., 137: 555-562; Liao, 2001, Biotech, and Bioeng., 73: 313-323 и патенты США №5264357 и 6686168). Описанные здесь трансмембранные домены можно использовать для получения слитых белков иммуноглобулин-трансмембранный домен, содержащих полноразмерные антитела (например, IgG) или их фрагменты, которые связаны с и подвергаются дисплею на поверхности клеток, экспрессирующих слитые белки.

Трансмембранные домены, которые являются особенно полезными в описанных здесь композициях и способах, включают трансмембранный домен рецептора фактора роста тромбоцитов (PDGF-R) (см., например, Chesnut et al., 1996, J. Imm. Methods, 193: 17-27), трансмембранный домен B7-1 (см., например, Chou et al., 1999, Biotech. & Bioeng., 65(2): 160-169) и трансмембранный домен рецептора асиалогликопротеина (ASGPR) (см., например, Liao, 2001, Biotech. & Bioeng., 73: 313-323). В некоторых воплощениях термин «домен, связывающий с поверхностью клетки» относится к сигнальной последовательности GPI, которая направляет заякоривание иммуноглобулина на поверхности клетки посредством гликозилфосфатидилинозитольного (GPI) линкера (см., например, Medof et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84: 2007-2011 и патенты США №5109133 и 5264357). В определенных случаях сигнальная последовательность GPI происходит из человеческого фактора ускорения распада (DAF). В других воплощениях якорь в виде трансмембранного домена поверхности клетки происходит из иммуноглобулинового белка.

Дисплейные векторы млекопитающих можно использовать для дисплея интактных антител, хотя дисплею также можно подвергать и фрагменты антитела, такие как, например, Fc, Fab', F(ab)'₂ и одноцепочечный Fv. Как тяжелая, так и легкая цепи могут кодироваться в виде одного транскрипта посредством применения элемента участка внутренней посадки рибосомы (IRES), который соединяет полинуклеотидную последовательность, кодирующую вариабельные и константные области легких цепей с полинуклеотидом, кодирующим вариабельные и константные области тяжелых цепей.

В одном воплощении дисплейные векторы млекопитающих содержат удаляемый GPI якорь, слитый с С-концом константной области тяжелой цепи, для облегчения выделения антител с желаемыми характеристиками связывания и биологическими активностями. GPI якорь, при его наличии, обеспечивает дисплей молекул иммуноглобулинов на поверхности клетки-хозяина млекопитающего. Удаление GPI якоря посредством расщепления подходящими эндонуклеазами рестрикции обеспечивает превращение мембраносвязанных молекул иммуноглобулинов в растворимые.

Примеры подходящих клеток-хозяев млекопитающих включают клетки HeLa (клетки HeLa S3, АТСС CCL2.2), клетки Jurkat, клетки Raji, клетки Daudi, клетки эмбриональной почки человека (293-HEK; АТСС 293с18, АТСС CRL 1573), клетки почки африканской зеленой мартышки (CV-1; Vero; АТСС CRL 1587), клетки почки обезьяны, трансформированные SV40 (COS-1; АТСС CRL 1650), клетки почки собаки (MDCK; АТСС CCL 34), клетки почки детеныша хомяка (BHK-21, BHK-570; АТСС CRL 8544, АТСС CRL 10314), клетки яичника китайского хомяка (СНО-K1; АТСС CCL61; СНО DG44 (Chasin et al., 1986, Som Cell Molec Genet, 12, 555)) и другие линии клеток грызунов, такие как NSO, SP2/O, GH1 (АТСС CCL82), H-4-II-E (АТСС CRL 1548) и NIH-3T3 (АТСС CRL 1658).

В одном воплощении можно использовать способы и векторы, описанные в патенте США №7947495, включенном сюда посредством ссылки во всей его полноте. Система дисплея на поверхности клетки млекопитающего включает самореплицирующиеся векторы и клетки млекопитающих. Самореплицирующиеся векторы млекопитающих типично содержат: (1) самореплицирующуюся точку начала репликации; (2) по меньшей мере один эукариотический промотор; (3) фиксированный или удаляемый трансмембранный домен; (4) константную область легкой цепи; (5) константную область тяжелой цепи; (6) сайты рестрикции для вставки вариабельных областей легкой и тяжелой цепи; (7) участок внутренней посадки рибосомы (IRES) и (8) по меньшей мере один селектируемый маркер. Кроме того, векторы могут содержать прокариотическую точку начала репликации, терминатор транскрипции, сигнал полиаденилирования и/или лидерные последовательности, а также другие последовательности, необходимые для экспрессии в эукариотических клетках-хозяевах. После трансформации клетки-хозяева инкубируют при условиях, которые обеспечивают экспрессию антител. Образующиеся плазмиды можно легко выделять из клеток, как описано (см., например, Hirt, 1967, J. Mol. Biol., 26, 365-369).

Помимо приведенных выше методик для дисплея на поверхности клетки библиотек вариантов антитела можно использовать дрожжевую библиотеку поверхностного дисплея. Методика дрожжевого поверхностного дисплея (обзор дан в Boder, Wittrup, 2000, Methods in Enzymology 328: 430-444, которая включена сюда посредством ссылки во всей ее полноте) обеспечивает экспрессию библиотек антител на дрожжевой клеточной стенке в форме, доступной для взаимодействия с меченой молекулой для анализа в способах сортировки клеток. В одном воплощении варианты экспрессируются в виде слитых белков со всем или с частью дрожжевого белка AGA2, который подвергается дисплею на поверхности дрожжевой клеточной стенки, для сортировки согласно описанным ниже способам. См., например, Boder et al., 1997, Nat. Biotechnol. 15: 553-557 и Feldhaus et al., 2003, Nat. Biotechnol. 21: 163-170.

Также можно использовать фаговый дисплей вариантов антитела. Цепи антитела могут экспрессироваться в виде слитых белков с белком оболочки фага из наружной поверхности фага. Затем пакеты дисплея можно подвергать скринингу на предмет дисплея антител, связывающихся с мишенью. В одном воплощении варианты антитела подвергаются дисплею одновалентным образом из частиц нитчатого фага в виде слияний с продуктом гена III М13, упакованных в каждую частицу и экспрессируемых на внешней стороне фага. Способы фагового дисплея антител известны специалистам в данной области и описаны, например, в Hoogenboom, "Overview of Antibody Phage-Display Technology and Its Applications," из Methods in Molecular Biology: Antibody Phage Display: Methods and Protocols (2002) 178: 1-37 (O'Brien, Aitken, eds., Human Press, Totowa, N.J.).

В другом воплощении для экспрессии вариантов антитела используют методику рибосомального дисплея (см. Hanes et al., 2000, Meth. Enzymol. 328: 403-430; Pluckthun et al., 2000, Adv. Prot. Chem. 55: 367-403; Lipovsek, Pluckthun, 2004, J. Immunological Methods 290: 51-67). Технология рибосомального дисплея включает трансляцию in vitro и ковалентную или нековалентную связь между генотипом, таким как РНК, и кодируемым фенотипом, таким как вариант антитела, для отбора антител-вариантов, которые имеют ослабленное связывание с анти-Id антителами. Библиотеку получают путем осуществления синтеза пула ДНК различных последовательностей, которые затем транскрибируют с получением пула мРНК. Для получения подвергающихся дисплею кодируемых полипептидов или белков используют трансляцию in vitro и отбирают желаемые взаимодействия связывания с использованием иммобилизованного партнера связывания. Для получения кДНК (комплементарная ДНК), которые затем могут амплифицироваться, можно использовать мРНК, кодирующие связывающие молекулы, и процесс можно повторять для обогащения популяции генами, кодирующими антитела-варианты с желаемыми характеристиками. Отобранные белки можно идентифицировать путем клонирования индивидуальных кодирующих последовательностей и секвенирования ДНК.

Для экспрессии антител-вариантов также можно использовать систему бактериального дисплея. См., например, Skerra et al., 1988, Science 240: 1038-1041; Better et al., 1988, Science 240: 1041-1043; Harvey et al., 2004, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 101 (25): 9193-9198 и Mazor et al., 2007, Nat. Biotechnol. 25(5): 563-565.

Сортировка библиотеки: клетки-хозяева, осуществляющие дисплей экспрессируемых вариантов антитела, можно сортировать с использованием анализов обогащения на основе аффинности. Антитела-варианты можно сортировать на основе их (1) потери связывания с анти-Id, (2) возможно, сохранения связывания с антигеном-мишенью и (3) возможно, уровней экспрессии. Анти-Id представляют собой антитела, направленные против вариабельных областей других антител. По этой причине антигенсвязывающий сайт анти-Id может быть аналогичным молекуле-мишени, связываемой антителом, распознаваемым анти-Id. Способы получения анти-Id известны в данной области и обычно включают использование интересующего антитела (например, исходного антитела) в качестве иммуногена для получения антител традиционными способами, такими как способы, описанные ниже для исходного антитела. Анти-Id антитела могут быть моноклональными антителами или человеческого, или животного происхождения.

Примеры подходящих анализов для применения в сортировке вариантов антитела, включают сортировку клеток, активированную флуоресценцией (FACS), сортировку с использованием магнитных шариков, технологию скрининга антител CellSpot™ от Trellis Bioscience, Inc. (Южный Сан-Франциско, СА) и/или использование системы скрининга клонов клеток млекопитающих ClonePix FL от Genetix Ltd. (Hampshire, Великобритания), но не ограничиваются ими.

Для сортировки FACS клетки инкубируют с флуоресцентно меченным антителом (например, анти-Id или антителом, которое выявляет общий эпитоп в немутагенизированных частях вариантов) или антигеном-мишенью в концентрации, близкой к константе диссоциации (K_D) в отношении аффинности исходного антитела, для максимального различения между исходным антителом и вариантами с аналогичными аффинностями. Окрашенные клетки сортируют на одну или более чем одну подпопуляцию таким образом, чтобы частоты вариантов с интересующим свойством либо возрастали, либо снижались в релевантной подпопуляции.

Сортировку на предмет связывания с анти-Id можно осуществлять с использованием любого из вышеописанных способов. В общем, клетки, экспрессирующие варианты антитела, инкубируют с анти-Id и сортируют по количеству связавшегося анти-Id. От клеток, экспрессирующих исходное антитело, можно получать значение исходного связывания, и можно идентифицировать клетки, которые демонстрируют пониженное связывание с анти-Id, путем сортировки клеток на подпопуляции, имеющие количество связавшегося анти-Id выше или ниже исходного значения.

Возможно, клетки, экспрессирующие варианты антитела, также сортируют на основании уровней экспрессии. Общее количество флуоресцентного антитела или антигена, связавшихся с клеткой, экспрессирующей вариант антитела, на протяжении, например, FACS, относят и к аффинности связывания, и к общему количеству антитела-варианта, подвергающегося дисплею. Количество антитела-варианта, подвергающегося дисплею, может варьировать от клона к клону. Таким образом, в некоторых случаях клетки, экспрессирующие интересующие антитела-варианты, например, полноразмерный IgG, связанный с поверхностью клетки через якорь в виде трансмембранного домена, можно сортировать, используя FACS с использованием флуоресцентно меченного антитела против данного иммуноглобулина (например, антитела против IgG) (помимо сортировки на предмет связывания с анти-Id). Разные антитела, используемые для выявления разных свойств, например анти-Id и антитело против IgG, используемое для выявления уровней экспрессии, типично метят флуорофорами, имеющими разные спектры возбуждения и/или испускания, обеспечивая посредством этого двухцветную систему выявления.

Клетки также можно сортировать на предмет связывания мишени. Типично будет желательным отбор варианта антитела, который сохраняет связывание с мишенью, например варианта с приблизительно равным или большим связыванием с молекулой-мишенью по сравнению с исходным антителом. Библиотеки, совместно окрашенные анти-Id и молекулой-мишенью, можно сортировать посредством FACS на две подпопуляции: первую популяцию с превышением определенного порога связывания мишени и вторую популяцию, дважды сортированную на предмет связывания с мишенью, а также на пониженное связывание с антиидиотипическим антителом. Разные молекулы, используемые для выявления разных свойств, например анти-Id и молекулу-мишень, типично метят флуорофорами, имеющими разные спектры возбуждения и/или испускания, предоставляя посредством этого двухцветную систему выявления.

В других воплощениях клетки можно сортировать на предмет связывания с анти-Id, уровней экспрессии и связывания мишени. В данных воплощениях можно использовать трехцветную систему выявления с использованием трех различимых меток.

При использовании двойного или тройного окрашивания для одновременной сортировки на предмет связывания с анти-Id и уровней экспрессии, и/или связывания с мишенью меченую мишень и меченые антитела типично метят флуорофорами, имеющими разные спектры возбуждения и/или испускания, предоставляя посредством этого двухцветную или трехцветную систему выявления. Сортировку на разные популяции также можно проводить серийно. Например, клетки, сортированные на подпопуляцию, имеющую пониженное связывание с анти-Id, можно сортировать на другие подпопуляции на основе связывания мишени и уровней экспрессии, причем сортировка на основе связывания мишени и уровней экспрессии происходит одновременно или последовательно. В других воплощениях варианты, идентифицированные во время сортировки на предмет связывания с антиидиотипическим антителом (и экспрессирующие их клетки-хозяева), характеризуют на предмет связывания мишени с использованием независимых способов подтверждения, описанных ниже.

Анализ сортированных популяций: после сортировки на подпопуляции частоту каждого варианта антитела в каждой подпопуляции можно определять посредством секвенирования плазмид, кодирующих варианты. Предпочтительным способом секвенирования ДНК по изобретению является «массовое параллельное секвенирование» или «массовое параллельное пиросеквенирование» (см., например, патенты США №6787308; 6833246; 6897023; 6956114; 7057026; 7115400, 7211390 и 7232656). Данный способ обеспечивает быстрое и недорогое секвенирование ДНК и ускоряет идентификацию конкретных вариантов антитела с желательной активностью или характеристиками.

После секвенирования можно осуществлять статистический анализ последовательностей для идентификации желаемых вариантов. Такой анализ может включать компьютерный анализ необработанных последовательностей ДНК. Необработанные последовательности ДНК могут быть переведены в последовательность белка, выровнены и сравнены с исходным антителом для идентификации мутаций. Частоту каждой аминокислоты, наблюдаемой в каждом положении, можно свести в таблицу для типа категории (например, пониженная иммуногенность и увеличение, уменьшение или нейтральная экспрессия или аффинность в отношении молекулы-мишени) и сравнить с исходным антителом. Вариантами с желательной активностью, такими как, например, варианты, у которых снижена иммуногенность, сохраняется экспрессия и/или сохраняется связывание с молекулой-мишенью, отобранная популяция будет обогащена, тогда как вариантами с нежелательными активностями отобранная популяция будет обеднена.

Для каждого варианта можно рассчитывать отношение обогащения (ER), которое дает меру степени обогащения или обеднения популяции вариантом по сравнению с другими вариантами и/или исходным антителом. В воплощениях, где клетки сортируют на основе (а) уровней экспрессии, превышающих определенный порог, и (б) низкого связывания с антиидиотипическим антителом («сортированная» популяция), число раз, которое обнаруживается мутация в данном положении, нормируют по числу раз, которое было секвенировано данное положение, и выражают в виде частоты на 1000 последовательностей. Затем частоту мутации в сортированной популяции делят на частоту в экспрессированной популяции с получением отношения обогащения (ER), которое показывает то, была ли сортированная популяция обогащена или обеднена мутацией по сравнению с экспрессированной популяцией, и в какой степени. Мутации, которыми обогащена сортированная популяция, будут иметь пониженное связывание с антиидиотипическим антителом, тогда как мутации, которыми сортированная популяция обеднена, будут иметь повышенное связывание с антиидиотипическим антителом. Аналогично отношения обогащения можн