Объект кукурузы mon 87411

Объект кукурузы mon 87411

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

Данная заявка претендует на приоритет предварительной заявки Соединенных Штатов Америки № 61/644368, поданной 8 мая 2012 года, которая включена в настоящее изобретение путем ссылки во всей полноте.

ВКЛЮЧЕНИЕ ПЕРЕЧНЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

Перечень последовательностей, находящийся в файле под наименованием "MONS308WO_ST25.txt", созданном 6 мая 2013 года, размер которого составляет 230 килобайт (размер измерен согласно Microsoft Windows®), в настоящем изобретении представлен в электронном виде и включен в него путем ссылки.

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Изобретение относится к трансгенному объекту Zea mays MON 87411. Объект обладает двумя механизмами действия, представляющими собой устойчивость к поражению злаковыми корневыми червями и толерантность к гербициду глифосату. Настоящее изобретение также относится к растениям, частям растений, семенам растений, клеткам растений, сельскохозяйственным продуктам и способам, связанным с объектом MON 87411, и рассматривает получение нуклеотидных молекул, которые являются уникальными для упомянутого объекта и были созданы путем вставки трансгенной ДНК в геном растения Zea mays.

УРОВЕНЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Во многих регионах мира кукуруза (Zea mays) является важной культурой, которую подвергают биотехнологическим разработкам с целью получения зерна с желательными признаками. Экспрессия в растении трансгена устойчивости к насекомым или толерантности к гербицидам может придавать растению желательные признаки устойчивости к насекомым и/или толерантности к гербицидам, но на экспрессию таких трансгенов может влиять множество различных факторов, включающих в себя ориентацию и композицию кассет, запускающих экспрессию отдельных генов, переносимых в хромосому растения, и хромосомная локализация и геномный результат вставки трансгена. Например, отдельные объекты могут иметь варианты по уровню и характеру экспрессии трансгена, которые в других отношениях идентичны, за исключением сайта хромосомной вставки трансгена. Некоторые объекты также могут иметь нежелательные фенотипические или агрономические различия. Поэтому часто приходится получать и анализировать большое количество отдельных трансформационных объектов растений с целью выбора объекта, имеющего улучшенные свойства по отношению к желаемому признаку и оптимальные фенотипические и сельскохозяйственные характеристики, необходимые для пригодности объекта для коммерческих целей. Для такой селекции часто требуется всестороннее определение молекулярных характеристик, а также исследования многочисленных объектов в тепличных и полевых условиях на протяжении ряда лет, в нескольких местоположениях и при различных условиях, чтобы получить возможность собрать значительное количество агрономических, фенотипических и молекулярных данных. Полученные данные и наблюдения должны быть проанализированы коллективом ученых и агрономов с целью селекции подходящего в коммерческом отношении объекта. После селекции такой объект можно использовать для интрогрессии желаемого признака в другие генетические среды с помощью способов селекции растений, и, таким образом, получать ряд различных сортов растений, которые содержат желаемый признак и соответствующим образом адаптированы к конкретным местным условиям роста.

Для создания трансгенного растения, содержащего один объект трансформации, часть конструкции рекомбинантной ДНК переносят в геном клетки кукурузы, и затем выращивают эту клетку кукурузы до растения. Клетку кукурузы, в которую изначально переносится объект, подвергают регенерации для получения поколения R₀. Растения R₀ и потомство растений от растения R₀ можно тестировать в отношении любого желаемого признака (признаков), но на эффективность объекта могут влиять факторы цис- и/или транс-ориентации, относящиеся к сайту интеграции в случае трансформации. На фенотип, придаваемый объектом, также может влиять размер и дизайн ДНК-конструкции, которые можно варьировать путем комбинации генетических элементов в экспрессионной кассете, количества трансгенов, количества кассет экспрессии и конфигурации таких элементов и таких кассет. Идентификация объекта с желаемыми признаками может дополнительно осложняться такими факторами, как параметры трансгенной экспрессии в ходе развития растения, в зависимости от времени суток, продолжительности или местоположения; или внешними факторами, такими как условия окружающей среды для роста растений, обеспеченность водой, наличие азота, тепла или стресса. Таким образом, невозможно легко прогнозировать получение объекта, придающего желаемый набор фенотипических признаков.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Авторы изобретения идентифицировали трансгенный объект кукурузы MON 87411, проявляющий превосходные свойства и продуктивность, по сравнению с имеющимися в настоящее время трансгенными растениями кукурузы и с созданными параллельно новыми объектами. Объект кукурузы MON 87411 содержит три связанных кассеты экспрессии, которые в совокупности придают признаки устойчивости к злаковым корневым червям и толерантность к гербициду глифосату в клетках кукурузы, тканях кукурузы, семенах кукурузы и растениях кукурузы, содержащих трансгенный объект MON 87411. Объект кукурузы MON 87411 обладает двумя механизмами действия против видов вредителей кукурузы - злаковых корневых червей (включающих в себя виды Diabrotica, в частности, вредителей, представляющих собой Diabrotica virgifera virgifera (блошка длинноусая западная, WCR), Diabrotica barbery (блошка длинноусая северная, NCR), Diabrotica virgifera zeae (блошка длинноусая мексиканская, MCR), Diabrotica balteata (блошка длинноусая бразильская (BZR) или комплекс блошек длинноусых бразильских (BCR), состоящий из Diabrotica viridula и Diabrotica speciosa) и Diabrotica undecimpunctata howardii (блошка длинноусая южная, SCR)). Двойной механизм действия обеспечивает избыточность и значительно снижает вероятность развития резистентности к признакам борьбы с вредителями.

Объект MON 87411 характеризуется специфичными уникальными сегментами ДНК, которые являются полезными для обнаружения присутствия объекта в образце. Считается, что образец относится или к композиции, которая по существу не содержит ДНК кукурузы, или к композиции, которая содержит ДНК кукурузы. В любом случае, образец представляет собой биологический образец, то есть этот образец содержит биологические материалы, включающие в себя без ограничения ДНК, полученную или происходящую, прямым или опосредованным способом, из генома объекта кукурузы MON 87411. "Прямой способ" относится к тому, что специалист в данной области может получать ДНК непосредственно из генома кукурузы путем разрушения клеток кукурузы (или путем получения образцов кукурузы, которые содержат разрушенные клетки кукурузы) и проводить детекцию геномной ДНК. "Опосредованный способ" относится к тому, что специалист в данной области может получать в конкретном образце целевую ДНК или специфичную референс-ДНК, то есть новый и уникальный сочленяющий сегмент, предназначенный, согласно изобретению, для диагностики наличия объекта MON 87411, способами, отличными от прямого способа, путем разрушения клеток кукурузы или получения образца кукурузы, содержащего разрушенные клетки кукурузы. Такие опосредованные способы включают в себя без ограничения амплификацию сегмента ДНК, содержащего последовательность ДНК-мишени для конкретного зонда, предназначенного для специфичного связывания с последовательностью-мишенью, или амплификацию сегмента ДНК, который можно измерить и описать его характеристики, т.е. измерить путем отделения от других сегментов ДНК с помощью какой-либо эффективной матрицы, например, агарозного или акриламидного геля или подобной матрицы, или описать его характеристики путем анализа прямого секвенирования ампликона или клонирования ампликона в вектор и прямого секвенирования вставленного ампликона, расположенного в пределах такого вектора. Альтернативно, можно клонировать различными способами сегмент ДНК, соответствующий положению внутри хромосомы кукурузы, в который была встроена трансгенная ДНК в хромосому кукурузы и который можно использовать для определения объекта MON 87411, а также идентифицировать и описывать его присутствие в конкретном образце или в конкретном геноме кукурузы. Такие сегменты ДНК называют сочленяющими сегментами или последовательностями, и они могут иметь любую длину вставленной ДНК и примыкающей (фланкирующей) хромосомной ДНК кукурузы при условии, что точка сочленения между вставленной ДНК и геномом кукурузы входит в этот сегмент. Примерами таких сегментов являются SEQ ID NO: 12 и SEQ ID NO: 21 и их обратно комплементарные последовательности.

Конкретные последовательности, идентифицированные в изобретении, могут однозначно присутствовать в объекте MON 87411, или в содержащей этот объект конструкции, и определение этих последовательностей, как с помощью прямого анализа последовательностей, путем обнаружения зондов, связанных с этими последовательностями, так и путем установления размера и, возможно, композиции конкретных ампликонов, описанных в изобретении, если они присутствуют в конкретной зародышевой плазме кукурузы или в геноме и/или присутствуют в конкретном биологическом образце, содержащем ДНК кукурузы, является диагностическим на наличие в таком образце объекта MON 87411 или содержащей этот объект конструкции. Известно, что фланкирующие геномные сегменты (то есть геномные сегменты последовательности ДНК кукурузы, смежные по отношению к вставленной трансгенной ДНК) подвергаются небольшой изменчивости, и таким образом, существует ограничение идентичности по меньшей мере 99% или больше, в отношении таких аномалий или полиморфизмов от одного генома кукурузы до другого генома кукурузы. В объем настоящего изобретения входят нуклеотидные сегменты, которые являются полностью комплементарными по всей их длине, при сравнении с конкретными диагностическими последовательностями, упомянутыми в настоящем изобретении.

Положение нуклеотидных сегментов по настоящему изобретению по отношению друг к другу и в геноме кукурузы представлены на Фиг. 3, и нуклеотидная последовательность каждого из них показана в SEQ ID NO: 1. Нуклеотидные сегменты, которые характеризуют объект MON 87411 и которые являются диагностическими на присутствие в образце объекта MON 87411 или содержащей этот объект конструкции, включают в себя SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51 или SEQ ID NO: 52. Если упомянутый образец содержит ткани кукурузы и, следовательно, ДНК кукурузы, то наличие одной или двух, или нескольких из этих нуклеотидных последовательностей в образце является диагностическим на присутствие объекта MON 87411 или конструкции, содержащей этот объект.

Использование понятия "происходящий от" предполагает, что конкретная молекула ДНК находится в геноме растения кукурузы или может быть обнаружена в ДНК растения кукурузы. "Возможный для обнаружения" относится к возможности амплификации конкретного сегмента ДНК, и к определению или выяснению характеристик его размера и последовательности путем анализа последовательности ДНК, и может также относиться к способности зонда к специфичному связыванию с конкретным сегментом ДНК, то есть, с целевым сегментом ДНК, и к последующей способности обнаруживать связывание зонда с этой мишенью. Конкретный сегмент ДНК или целевой сегмент ДНК по настоящему изобретению присутствует в кукурузе, которая содержит вставку - объект MON 87411.

В отношении кукурузы предполагается, что клетки кукурузы, семена кукурузы, части растений кукурузы и растения кукурузы входят в объем настоящего изобретения при условии, что каждый их вариант осуществления содержит определяемое количество ДНК, соответствующее какому-либо из одного, двух или нескольких сегментов, которые описаны в настоящем изобретении как диагностические на присутствие ДНК объекта кукурузы MON 87411. Части растений кукурузы включают в себя клетки, пыльцу, семязачаток, цветки и части цветков, такие как початки, нити и кисти, ткань корня, ткань стебля и ткань листа. В объем настоящего изобретения входят товарные продукты, сделанные из кукурузы, которая имеет поддающееся обнаружению количество сегментов ДНК, описанных в изобретении в качестве диагностических на присутствие объекта MON 87411. Такие товарные продукты могут включать в себя цельные или обработанные семена кукурузы, корма для животных, содержащее зерно кукурузы или побочные кукурузные продукты, кукурузное масло, размолотую кукурузу, кукурузную муку, кукурузный крахмал, кукурузные хлопья, кукурузные отруби, кукурузную биомассу и солому, и топливные продукты и вторичные топливные продукты, сделанные из кукурузного зерна или растений и частей растений кукурузы.

Обычно ДНК из объекта кукурузы MON 87411 присутствует в каждой клетке и в каждой хромосоме растения кукурузы, семян кукурузы и тканей кукурузы, содержащих упомянутый объект. Геном кукурузы передается потомству согласно менделевским принципам, поэтому, если растения кукурузы были гомозиготными, в потомстве каждое растение и клетка кукурузы будет содержать этот объект ДНК в каждой из родительских хромосом, полученных в наследство от родителя (родителей). При этом, если геном кукурузы, содержащей ДНК объекта MON 87411, принадлежит гетерозиготным или гибридным родителям, то только пятьдесят процентов пыльцы и пятьдесят процентов яйцеклеток, участвующих в спаривании от гибридных родителей, будут нести ДНК объекта кукурузы MON 87411, в результате чего будет получена смешанная популяция потомства, несущего ДНК объекта MON 87411, и процент этого потомства, возникающего в результате таких скрещиваний с гибридами, может варьироваться от пятидесяти до семидесяти пяти процентов, несущих ДНК объекта MON 87411, которая было передана такому потомству.

Молекулы ДНК согласно настоящему изобретению могут быть уникальными для вставленной ДНК в объекте кукурузы MON 87411 или для двух сочленений между трансгенной вставкой ДНК и геномной ДНК кукурузы, которая примыкает к какому-либо из концов вставленной ДНК. Если такие молекулы присутствуют в конкретном образце, который анализируют с помощью описанных в изобретении способов с использованием зондов, праймеров, и в некоторых случаях, с помощью анализа последовательности ДНК, то они могут быть диагностическими на присутствие в этом образце некоторого количества объекта кукурузы MON 87411. Такие молекулы ДНК, уникальные для ДНК объекта кукурузы MON 87411, могут быть идентифицированы и охарактеризованы несколькими способами, в том числе с использованием молекул нуклеиновых кислот, сконструированных для специфичного связывания с молекулами уникальных ДНК с последующим обнаружением связывания таких зондов с уникальной ДНК, и с помощью способов термической амплификации, в которых используют по меньшей мере две разных молекулы ДНК, действующих в качестве зондов, при этом последовательность таких молекул может быть несколько меньше, чем описанные выше зонды. Специалисту в данной области техники будет очевидно, что контактирование специфичной целевой ДНК с зондом или праймером при подходящих условиях гибридизации приведет к связыванию этого зонда или праймера с целевым сегментом ДНК.

Молекулы ДНК по настоящему изобретению, которые представляют собой целевые сегменты ДНК, способны к амплификации и, если они определены в качестве одного или нескольких ампликонов представленной длины, полученных путем амплификации конкретного образца, эти молекулы могут быть диагностическими на присутствие в таком образце объекта MON 87411 или содержащей его конструкции. Такие молекулы ДНК или полинуклеотидные сегменты имеют нуклеотидные последовательности, указанные в каждой из последовательностей SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51 и SEQ ID NO: 52, и дополнительно описаны в данном разделе и в примерах ниже. Праймерные молекулы и/или зонды могут быть представлены в виде комплекта вместе с необходимыми реагентами, включающими в себя контрольные реагенты, и упакованы вместе с инструкцией по применению.

Молекулы рекомбинантных ДНК по настоящему изобретению считаются входящими в объем настоящего изобретения, если они находятся в микроорганизме или получены из микроорганизма. Микроорганизм должен включать в себя любую микроскопическую клетку, прокариотическую или эукариотическую, или клетку другого типа, которая содержит ДНК в геноме, или хромосоме или в экстра-хромосомной структуре ДНК, чаще называемой плазмидой или вектором. Микроскопические организмы включают в себя бактерии (прокариоты) и клетки, относящиеся к высшим формам жизни (эукариоты), размер которых ниже визуального уровня среднего человека, обычно меньше пятидесяти кубических микрон, и чаще меньше десяти кубических микрон. Бактерии являются распространенными микроскопическими микроорганизмами, которые, по всей вероятности, не могут содержать вектор или плазмиду, несущие один, или несколько, или все из новых сегментов ДНК по настоящему изобретению, в том числе каждую из соответствующих кассет экспрессии, присутствующих, как указано в SEQ ID NO: 1. Растительные клетки и, в частности, клетки растений кукурузы, входят в объем настоящего изобретения, если они содержат какой-либо из одного, двух или нескольких новых сегментов ДНК, или все из новых сегментов ДНК по настоящему изобретению.

Зонды, используемые в настоящем изобретении, обычно представляют собой молекулы ДНК или полинуклеотидные сегменты достаточной длины для функционирования в жестких условиях гибридизации, согласно изобретению, чтобы связываться с конкретным целевым сегментом ДНК, то есть с уникальным сегментом ДНК, присутствующим в ДНК объекта MON 87741, и служить для диагностики присутствия ДНК объекта MON 87741 в образце. Такой зонд может быть предназначен для связывания только с единственным сочленением или с другой новой последовательностью, присутствующей только в ДНК объекта кукурузы MON 87411, или с двумя или несколькими такими единичными сочленяющими сегментами. Обнаружение в каком-либо объекте связывания такого зонда с молекулой ДНК в конкретном образце, предположительно содержащем ДНК кукурузы, является диагностическим на присутствие в этом образце объекта кукурузы MON 87411.

Праймеры обычно представлены в виде пар разных олигонуклеотидов или полинуклеотидных сегментов для использования в реакции термической амплификации, с помощью которой амплифицируется конкретный целевой сегмент ДНК. Каждый праймер в паре предназначен для связывания с довольно специфичным сегментом ДНК в пределах или вблизи к сегменту ДНК, представляющим интерес для амплификации. Праймеры связываются таким образом, что затем они действуют как локализованные области полимеризации последовательностей нуклеиновых кислот, в результате чего получают один или несколько ампликонов (амплифицированные целевые сегменты ДНК). В настоящем изобретении применение праймеров, сконструированных для связывания с уникальными сегментами ДНК объекта кукурузы MON 87411 в конкретном биологическом образце, и упомянутая амплификация конкретных ампликонов, несущих один или несколько сочленяющих сегментов, описанных в изобретении, и детекция и определение характеристик этих ампликонов после завершения или прекращения полимеразной реакции, является диагностическим признаком наличия объекта кукурузы MON 87411 в конкретном образце. Специалисту в данной области хорошо известен этот способ амплификации, и нет необходимости приводить ссылки о подробностях амплификации в настоящем изобретении.

Растения кукурузы, клетки растений кукурузы, ткани растений кукурузы и семена кукурузы являются нечувствительными к обработкам гербицидом глифосатом благодаря экспрессии CP4 EPSPS - фермента нечувствительности к глифосату из промотора Rcc3 риса в экспрессионной кассете на дистальном 3'-конце, как показано в SEQ ID NO: 1. Такие семена можно высевать в поле. Через несколько дней после прорастания и появления всходов можно применять эффективное для контроля сорняков количество гербицида глифосата, который уничтожит по существу все сорняки в поле, но позволит продолжить рост и развитие растений кукурузы, содержащих ДНК объекта кукурузы MON 87411. Растения также устойчивы к поражению злаковыми корневыми червями всех известных видов корневых червей Diabrotica, включающих в себя без ограничения Diabrotica virgifera virgifera (блошка длинноусая западная, WCR), Diabrotica barbery (блошка длинноусая северная, NCR), Diabrotica virgifera zeae (блошка длинноусая мексиканская, MCR), Diabrotica balteata (блошка длинноусая бразильская (BZR) или комплекс блошек длинноусых бразильских (BCR), состоящий из Diabrotica viridula и Diabrotica speciosa) и Diabrotica undecimpunctata howardii (блошка длинноусая южная, SCR). Устойчивость к видам Diabrotica возникает в связи с экспрессией двух разных сегментов ДНК, которые функционально и ковалентно связаны в пределах вставленной трансгенной ДНК: двухцепочечная РНК (дцРНК) транскрибируется из кассеты экспрессии на 5' проксимальном конце вставленной трансгенной ДНК, как показано в SEQ ID NO: 1 и проиллюстрировано в Фиг. 1 в позиции [G] в SEQ ID NO: 12, и нацеливает супрессию жизненно важного гена у злаковых корневых червей; и белок Cry3Bb, токсичный для жесткокрылых насекомых, экспрессируется из кассеты экспрессии (примерно в центре в SEQ ID NO: 1, как показано на Фиг. 1 в позиции [H] в SEQ ID NO: 14) по центру между кассетой, экспрессирующей дцРНК [G], и кассетой на дистальном 3'-конце вставленной трансгенной ДНК, показанной в SEQ ID NO: 1 (кассета экспрессии толерантности к глифосату, показанная в Фиг. 1, позиция [I] в SEQ ID NO: 16). дцРНК нацеливает супрессию ортологичного гена дрожжей под наименованием snf7, и экспрессируется из промотора CАMV e35S, а белок Cry3Bb экспрессируется из промотора PIIG Zea mays. Упомянутые дцРНК и белок Cry3Bb являются токсичными агентами для видов злаковых корневых червей.

Промоторы, запускающие экспрессию токсичных агентов дцРНК и Cry3Bb, расположены дивергентно, таким образом, что экспрессия каждого из промоторов соответствующего токсичного агента происходит далеко от точки, находящейся в центре между двумя промоторами, т.е. транскрипция каждой кассеты экспрессии протекает в противоположных направлениях, без конвергенции. Кассета экспрессии CP4 EPSPS толерантности к глифосату расположена ниже по ходу транскрипции, т.е. проксимальнее 3'-конца, как показано в SEQ ID NO: 1, и дистальнее 3'-конца по отношению к кассете, запускающей экспрессию белка Cry3Bb. Кассеты, запускающие экспрессию Cry3Bb и EPSPS, продуцируют соответствующие белки с помощью тандемной ориентации транскрипции, Cry3Bb расположен выше по ходу транскрипции от EPSPS, и транскрибируется в той же ориентации, но каждый из своих отдельных соответствующих промоторов. Оставляя интактными кассету экспрессии дцРНК и кассету устойчивости к глифосату, и помещая на дистальных концах ДНК сегмент, предназначенный для вставки в геном кукурузы, получали другие варианты конструкции, в которых ориентация кассеты Cry3Bb была инвертированной или обратной по отношению к конструкции, присутствующей в ДНК объекта MON 87411. В этих вариантах конструкций для запуска экспрессии Cry3Bb использовали промотор PIIG Zea mays или промотор Rcc3 риса.

Трансгенные объекты, содержащие только упомянутые варианты конструкций/ориентации кассеты экспрессии Cry3Bb, сравнивали с объектом MON 87411 и с доступными в настоящее время коммерческими объектами: MON863 (содержащим только кассету экспрессии Cry3Bb), MON88017 (содержащим кассету экспрессии Cry3Bb, которая функционально связана с кассетой экспрессии CP4 EPSPS) и DAS-59122-7 (содержащим три функционально связанные кассеты экспрессии, две из которых тандемно экспрессируют двойные компоненты токсина Bt Cry34 и Cry35 вместе с геном, придающим толерантность к глюфозинату). Результаты, показанные ниже в разделе примеров, свидетельствуют, что объект MON 87411 демонстрирует превосходные свойства в отношении направленной в корни экспрессии белка Cry3Bb, и множество трансгенных объектов, полученные с помощью конструкции, которую использовали для создания объектов MON 87411, чаще проявляли эффективный контроль злаковых корневых червей, чем других объекты, полученные с другими конструкциями.

В объем настоящего изобретения входят растения кукурузы по настоящему изобретению и их части, в том числе семена, и каждая из частей растения содержит ДНК, соответствующую объекту MON 87411. Такие растения устойчивы к поражению злаковыми корневыми червями и нечувствительны к применению гербицида глифосата. Эти растения включают в себя гибриды, содержащие только один аллель MON 87411, то есть геном, отличающийся гетерозиготностью в отношении локуса, соответствующего объекту MON 87411 ДНК. Такие гибриды получают путем селекции с желаемой зародышевой плазмой для гарантии гибридной силы и других желательных в сельскохозяйственном плане свойств кукурузы. Гибриды можно получать любым из множества способов, но в предпочтительном способе используют преимущества первого инбредного (гомозиготного) родителя, который несет специфичный аллель объекта MON 87411 в обеих хромосомах в локусе, в который вставлена ДНК объекта MON 87411, и выводят первое инбредное растение вместе со вторым инбредным растением, которое не несет ДНК MON 87411. Оба варианта родительских инбредных растений будут иметь одно или несколько выгодных свойств, желательных для семян потомства, то есть, для гибридных семян.

Особенно желательным является трансгенное свойство или аллель, придающий некий дополнительный признак растению, содержащему ДНК объекта MON 87411. Такие трансгенные аллели включают в себя другие трансгенные объекты, придающие устойчивость к злаковым корневым червям, и включают в себя без ограничения такие объекты как DAS-59122-7, MIR604 и 5307. Каждый из этих объектов дает дополнительный агент, токсичный для злаковых корневых червей (DAS-59122-7 обеспечивает PS149B1 (Cry34/Cry35), обладающий свойствами токсичности для корневых червей и толерантности к гербициду глюфозинату; MIR604 обеспечивает модифицированный Cry3Aa, проявляющий свойства токсичности для корневых червей; объект 5307 обеспечивает ген FR8a, проявляющий свойства токсичности для корневых червей). Наличие дополнительных признаков устойчивости к злаковым корневым червям, например, наличие вышеперечисленных признаков, может снижать вероятность развития устойчивости к какому-либо представленному агенту, токсичному для злаковых корневых червей. Другие желательные признаки включают в себя признаки урожайности и устойчивости к стрессу или переносимости стресса, признаки фиксации азота, признаки, модулирующие использование воды, устойчивости к грибковому поражению, устойчивости к гербицидам, таким как дикамба (MON 87427), глюфозинат и т.п., а также признаки устойчивости к чешуекрылым вредителям. Признаки устойчивости к чешуекрылым вредителям были рассмотрены в данной области техники и включают в себя объекты трансгенной кукурузы (и соответствующие активные белки чешуекрылых) MON810 (Cry1Ab), MON 89034 (Cry1A.105 и Cry2Ab); TC1507 (Cry1Ac и Cry1Fa); DAS- 06275-8, также известный как TC-6275 (Cry1Fa и bar (придающий устойчивость к глюфозинату)); MIR162 (Vip3Aa), Bt176 (Cry1Ab) и BT11 (Cry1Ab). Альтернативой наличия в одном растении какой-либо комбинации или всех из перечисленных признаков, в частности, признаков устойчивости к насекомым, относящихся к объекту MON 87411, других перечисленных признаков устойчивости к злаковым корневым червям или признаков устойчивости к чешуекрылым, будет наличие упомянутых признаков в различные комбинациях смесей семян, в которых определенные семена в смеси содержат признаки MON 87411 и некую комбинацию исключительно из перечисленных признаков устойчивости к жесткокрылым, и совместно действуют под землей для предотвращения поражения злаковыми корневыми червями, в то время как другие семена в смеси содержат только признаки устойчивости к чешуекрылым и придают устойчивость к поражению кукурузы чешуекрылыми вредителями над землей. Таким образом, семена в смеси обеспечивают убежище для друга, то есть семена и растения с защитой от жесткокрылых действуют как убежище для растений, придающих устойчивость к чешуекрылым, и наоборот.

Вместе с тем, обычно эти признаки будут представлены в какой-либо комбинации или в пакете признаков, где признаки MON 87411 будут представлены совместно в одном растении с помощью выведения с одним или несколькими признаками устойчивости к чешуекрылым, для обеспечения полного пакета устойчивости к вредителям урожая в поле, и небольшой процент семян (возможно от 1 до 20 процентов, или любое количество, включающее в себя 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 или 19 процентов) будет иметь только признаки толерантности к гербициду и не будет иметь каких-либо признаков защиты от вредителей, и будут высажены в поле в рандомизированной смеси с семенами с признаками устойчивости к вредителям или в виде структурированного (отдельного) насаждения культур, и будут действовать в качестве убежища как от вредителей, которые поражают растения кукурузы над землей, так и от вредителей, которые поражают растения кукурузы под землей.

Конструкция, вставленная в объект MON 87411, дает особые преимущества по сравнению с кассетой экспрессии EPSPS. Во- первых, присутствие этой кассеты облегчает выведение трансгенных объектов, в которые была встроена эта конструкция. Во-вторых, кассета обеспечивает контроль сорняков в поле, на котором были посажены семена, соответствующие объекту MON 87411. Поле, содержащее эти растения MON 87411, можно обрабатывать путем распыления эффективного количества глифосата для контроля роста на этом поле сорняков, которые являются чувствительными к глифосату. Для сорняков, которые не чувствительны к глифосату, как отмечено выше, можно выводить другие трансгенные объекты, которые обеспечивают толерантность к другим гербицидам, таким как дикамба или глюфозинат, создавая единый гибрид вместе с объектом MON 87411, и таким образом получать эффективное средство для борьбы с сорняками в поле путем применения двух или нескольких гербицидов, таких как глифосат, дикамба или глюфозинат, поскольку маловероятно присутствие сорняков, обладающих устойчивостью к двум или нескольким из упомянутых гербицидов, и в этом случае урожай кукурузы будет состоять из гибридов, которые проявляют устойчивость к такому применению комбинаций гербицидов.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Фиг. 1 схематически изображает трансгенную вставку в геном объекта кукурузы MON 87411: [А] представляет собой SEQ ID NO: 1, которая является непрерывная последовательность трансгенной ДНК-вставки, интегрированной в геном кукурузы LH244, и 5' и 3' геномные ДНК, фланкирующие вставленную ДНК; [B] и [C] соответствуют относительным положениям SEQ ID NO: 2 и 3, которые образуют 5' и 3' сочленяющие последовательности трансгенной/геномной ДНК объекта MON 87411, соответственно; [D] показывает SEQ ID NO: 4, которая представляет собой последовательность трансгенной ДНК-вставки, интегрированной в геном, и в результате получают объект MON 87411; [E] соответствует относительным положениям SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 и SEQ ID NO: 7, каждая из которых охватывает 5'-сочленение между терминальными концами трансгенной ДНК- вставки и фланкирующей геномной ДНК; [F] соответствует относительным положениям SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 и SEQ ID NO: 10, каждая из которых охватывает 3'-сочленение между терминальными концами трансгенной ДНК-вставки и фланкирующей геномной ДНК; [G], [H] и [I], соответственно, представляют собой три разные экспрессионные кассеты, соответствующие трансгенной ДНК-конструкции, вставленной в геном растения кукурузы, результатом чего является объект MON 87411; [J] и [K] представляют собой олигонуклеотидные праймеры, олигонуклеотидные зонды и ампликоны ДНК, соответствующие сочленениям в объекте MON 87411.

Фиг. 2 показывает одиннадцать разных конструкций ДНК (417, 416, 418, 419, 402, 403, 404, 423, 405, 406 и 890), сконструированных для экспрессии до трех различных кассет, включающих в себя две кассеты с инкорпорированными протектантами растений (PIP), нацеленными на блошек длинноусых западных (WCR), и одну кассету устойчивости к гербицидам. Две PIP кассеты включают в себя (а) кассету экспрессии для 240-мерного инвертированного повтора Dv_Snf7o, и (b) кассету экспрессии для белка Cry3Bb. Каждая из показанных конструкций содержит эти кассеты экспрессии в вариабельном порядке и ориентации. Конструкции 405 и 406 не содержат кассету устойчивости к гербицидам, и конструкция 890 содержит только одну кассету экспрессии для 240-мерного инвертированного повтора Dv_Snf7o. Эти три конструкции содержат в общей сложности шестнадцать генетических элементов от левой границы (LB) до правой границы (RB): [1] LB; [2] 3'-нетранслируемая область (UTR) Ps.RbcS2-Е9; [3] 240-мерный Dv_Snf7o инвертированный повторяемый ген; [4] кукурузный интрон DnaK; [5] лидер CaMV 35S; [6] промотор eCaMV 35S; [7] промотор кукурузы PIIG; [8] лидер пшеницы Lhcb1; [9] интрон риса Act1; [10] открытая рамка считывания (ORF) Cry3Bb; [11] 3'UTR пшеницы Hsp17​​; [12] TubA риса (промотор, лидер, интрон); [13] цитоплазматический пептид CTP; [14] CP4 EPSPS; [15] 3'UTR TubA риса; и [16] RB.

Фиг. 3. На схемах [A]-[N] и [aa]-[mm] показаны функционально связанные элементы и фланкирующий кукурузный геном и их положение относительно друг друга, согласно их расположению в позиции трансгенной вставки ДНК в геном объекта кукурузы MON87411. Следующие ниже описания определяют композицию, функции и положение для каждого из элементов, показанных в SEQ ID NO: 1.

[А] Положения нуклеотидов 1-500, показанные в SEQ ID NO: 1, соответствуют геномной ДНК кукурузы, смежной с трансгенной вставленной ДНК в объекте кукурузы MON87411, которая в данном случае произвольно обозначена на 5'-конце от трансгенной вставленной ДНК.

[B] Положения нуклеотидов 807-1439, показанные в SEQ ID NO: 1, соответствуют обратно комплиментарной последовательности терминации транскрипции и сигнала полиаденилирования малой субъединицы Е9 3'-рибулозо-бис-фосфат карбоксилазы от Pisum sativum.

[C] Положения нуклеотидов 1469-2098, показанные в SEQ ID NO: 1, соответствуют обратно комплементарной последовательности, сконструированной для экспрессии в виде молекулы РНК, уложенной в 240-нуклеотидную дцРНК и 150-нуклеотидную шпилечную структуру, которая создана для нацеливания на супрессию ортолога гена дрожжей у видов Diabrotica, кодирующего белок Snf7, при его наличии в рационе видов Diabrotica. Первый 240-нуклеотидный сегмент, соответствующий части ортологичного гена snf7 от Diabrotica, присутствует в положениях нуклеотидов 1469-1708, как показано в SEQ ID NO: 1, второй 240-нуклеотидный сегмент, соответствующий в обратной комплементарности первому сегменту, расположен в позициях нуклеотидов 1850-2098, как указано в SEQ ID NO: 1, и первый и второй сегменты функционально связаны с помощью 150-нуклеотидного спейсера в положениях нуклеотидов 1709-1858, как указано в SEQ ID NO: 1.

[D] Положения нуклеотидов 2135-2938, показанные в SEQ ID NO: 1, соответствуют обратно комплиментарной последовательности интрона, происходящего из гена DnaK Zea mays.

[E] Положения нуклеотидов 2839-3298, показанные в SEQ ID NO: 1, соответствуют обратной комплементарной расширенной последовательности 35S промотора вируса мозаики цветной капусты и нетранслируемой 5'-лидерной последовательности. Указанный промотор, ассоциированный нетранслируемый лидер, элемент [D] интрона и элемент [B] терминации транскрипции и полиаденилирования регулируют экспрессию элемента [C] в клетках растений кукурузы.

[F] Положения нуклеотидов 3586-4534, показанные в SEQ ID NO: 1, соответствуют промоторной последовательности, полученной из индуцированного физическим импедансом гена белка Zea mays (Zm.PIIG). Указанный промотор, ассоциированный нетранслируемый лидер [G], элемент [Н] интрона и элемент [J] терминации транскрипции и полиаденилирования регулируют экспрессию элемента [I]. Этот промотор ориентирован относительно промотора [E] таким образом, что каждый из промоторов ([E] и [F]) будет запускать дивергентную экспрессию своих элементов ([C] и [I]) (смотрите стрелки на Фиг. 2, где эти стрелки обозначают соответствующие промоторы ([E] и [F]) в указанном направлении экспрессии из соответствующего промотора).

[G] Положения нуклеотидов 4541-4601, показанные в SEQ ID NO: 1, соответствуют нетранслируемой 5' лидерной последовательности, полученной из гена b1 светоулавливающего комплекса (Ta.Lhcb1) от Triticum aestivum.

[Н] Положения нуклеотидов 46