Животные, содержащие гуманизированную дипептидилпептидазу iv (dpp4)

Животные, содержащие гуманизированную дипептидилпептидазу iv (dpp4)

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА СМЕЖНЫЕ ЗАЯВКИ

Настоящая заявка испрашивает приоритет по предварительной заявке на патент США №62/005,476, поданной 30 мая 2014 г., предварительной заявке на патент США №62/051,626, поданной 17 сентября 2014 г., и предварительной заявке на патент США №62/072,692, поданной 30 октября 2014 г., причем описания каждой из заявок полностью включены в настоящий документ путем ссылки.

ОБЛАСТЬ ПРИМЕНЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Не относящиеся к человеку животные, содержащие нуклеотидные последовательности, кодирующие белок дипептидилпептидазу IV (DPP4), который содержит человеческую последовательность. Трансгенные не относящиеся к человеку животные, содержащие ген DPP4, который полностью или частично является человеческим. Не относящиеся к человеку животные, которые экспрессируют человеческие или гуманизированные белки DPP4. Способы получения и использования не относящихся к человеку животных, содержащих человеческие или гуманизированные нуклеотидные последовательности DPP4.

ПРЕДПОСЫЛКИ СОЗДАНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Дипептидилпептидаза IV (DPP4) представляет собой мишень для терапевтического воздействия при лечении различных заболеваний, расстройств или состояний у человека, включая, например, гипергликемию (см., например, Gerich (2013) Pathogenesis and Management of Postpandrial Hyperglycemia: Role of Incretin-Based Therapies, Intl. J. Gen. Med. 6:877-895) и инфекцию коронавируса ближневосточного респираторного синдрома (MERS-CoV) (см., например, Raj et al. (2013) Dipeptidyl Peptidase 4 is a Functional Receptor for the Emerging Human Coronovirus-EMC, Nature 495(7440):251-254).

По отношению к не относящимся к человеку животным, например грызунам, таким как мыши или крысы, на регулярной основе выполняется оценка фармакокинетики (ФК) и фармакодинамики (ФД) терапевтических молекул, которые специфически воздействуют на человеческий белок DPP4. Однако ФД таких молекул невозможно правильно определить у некоторых не относящихся к человеку животных, если эти терапевтические молекулы также не воздействуют на эндогенный белок Dpp4.

Более того, оценку in vivo терапевтической эффективности специфичных к человеческому DPP4 низкомолекулярных, пептидных или белковых (т.е. биологических) антагонистов в моделях заболеваний с использованием не относящихся к человеку животных сложно выполнить у некоторых не относящихся к человеку животных, у которых видоспецифичный антагонист не взаимодействует с эндогенным белком Dpp4. Кроме того, оценку in vivo терапевтической эффективности низкомолекулярных, пептидных или белковых (т.е. биологических) антагонистов, воздействующих на молекулы-мишени, которые специфически взаимодействуют с человеческим белком DPP4, также сложно выполнить у некоторых не относящихся к человеку животных, у которых сама терапевтическая молекула-мишень не взаимодействует с эндогенным белком Dpp4.

Таким образом, существует потребность в не относящихся к человеку животных, например грызунах, таких как мыши или крысы, которые содержат человеческий или гуманизированный ген DPP4. Например, существует потребность в не относящихся к человеку животных, например грызунах, таких как мыши или крысы, у которых ген Dpp4 не относящегося к человеку животного является полностью или частично гуманизированным или заменен (например в эндогенных нечеловеческих локусах) на человеческий ген DPP4, содержащий последовательности, кодирующие человеческий или гуманизированный белок DPP4.

Также существует потребность в не относящихся к человеку животных, содержащих ген DPP4 (например человеческий или гуманизированный), у которых ген DPP4 контролируется нечеловеческими регуляторными элементами (например эндогенными регуляторными элементами), например, во 5'-фланкирующей области, например промоторе или энхансере (-ах), или в 3'-нетранслируемой области гена DPP4.

Также существует потребность в не относящихся к человеку животных, содержащих ген DPP4 (например человеческий или гуманизированный), у которых ген DPP4 контролируется человеческими регуляторными элементами, например, во 5'-фланкирующей области, например промоторе или энхансере (-ах), или в 3'-нетранслируемой области человеческого гена DPP4.

Также существует потребность в не относящихся к человеку животных, которые экспрессируют человеческий или гуманизированный белок DPP4 на поверхности иммунных клеток, например Т-клеток, и/или на поверхности клеток в одной или более тканях, например плацентарной, почечной, легочной, печеночной, скелетно-мышечной, сердечной, мозговой и/или панкреатической ткани, в концентрации, аналогичной концентрации белка Dpp4 на поверхности иммунных клеток, например Т-клеток, и/или на поверхности клеток в одной или более тканях, например плацентарной, почечной, легочной, печеночной, скелетно-мышечной, сердечной, мозговой и/или панкреатической ткани, у не относящегося к человеку животного такого же возраста, которое экспрессирует функциональный белок Dpp4, но не содержит человеческий или гуманизированный ген DPP4.

Кроме того, существует потребность в не относящихся к человеку животных, которые экспрессируют человеческий или гуманизированный белок DPP4 на поверхности иммунных клеток, например Т-клеток, и/или на поверхности клеток в одной или более тканях, например плацентарной, почечной, легочной, печеночной, скелетно-мышечной, сердечной, мозговой и/или панкреатической ткани, в концентрации, которая больше или меньше концентрации белка Dpp4 на поверхности иммунных клеток, например Т-клеток, и/или на поверхности клеток в одной или более тканях, например плацентарной, почечной, легочной, печеночной, скелетно-мышечной, сердечной, мозговой и/или панкреатической ткани, у не относящегося к человеку животного такого же возраста, которое экспрессирует функциональный белок Dpp4, но не содержит человеческий или гуманизированный ген DPP4.

В настоящем описании приводятся ссылки на различные патенты, заявки на патент и другие типы публикаций (например статьи в журналах, записи в электронных базах данных и т.п.). Описания всех патентов, заявок на патент и других публикаций, упомянутых в настоящем документе, полностью включены в настоящий документ путем ссылки для любых целей.

ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Предложены не относящиеся к человеку животные, содержащие нуклеотидные последовательности, кодирующие белок DPP4, который содержит человеческую последовательность.

Предложены трансгенные не относящиеся к человеку животные, содержащие ген DPP4, который полностью или частично является человеческим.

Предложены не относящиеся к человеку животные, которые экспрессируют человеческий или гуманизированный белок DPP4.

Предложены не относящиеся к человеку животные, у которых полностью или частично заменен эндогенный ген Dpp4 не относящегося к человеку животного.

Предложены не относящиеся к человеку животные, содержащие полностью или частично гуманизированный DPP4 в локусе эндогенного нечеловеческого Dpp4.

Предложены не относящиеся к человеку животные, которые имеют человеческий или гуманизированный ген DPP4, причем не относящиеся к человеку животные не экспрессируют эндогенный белок Dpp4, и при этом они экспрессируют человеческий или гуманизированный белок DPP4 на поверхности иммунных клеток, например Т-клеток, и/или на поверхности клеток в одной или более тканях, включая плацентарную, почечную, легочную, печеночную, скелетно-мышечную, сердечную, мозговую и/или панкреатическую ткань, в концентрации, аналогичной концентрации белка Dpp4 на поверхности иммунных клеток, например Т-клеток, и/или на поверхности клеток в одной или более тканях, включая плацентарную, почечную, легочную, печеночную, скелетно-мышечную, сердечную, мозговую и/или панкреатическую ткань, у не относящегося к человеку животного такого же возраста, которое экспрессирует функциональный эндогенный белок Dpp4, но не содержит замены.

В одном аспекте предложены не относящиеся к человеку животные, содержащие человеческую или гуманизированную нуклеотидную последовательность DPP4.

В одном аспекте предложены генетически модифицированные не относящиеся к человеку животные, у которых в эндогенном локусе Dpp4 ген, кодирующий эндогенный белок Dpp4, заменен на ген, кодирующий человеческий или гуманизированный белок DPP4. Предложены грызуны, например мыши или крысы, у которых эндогенный ген Dpp4 в эндогенном локусе Dpp4 заменен на человеческий ген DPP4. В одном варианте осуществления грызун является гетерозиготным по замененному участку в эндогенном локусе Dpp4 эндогенного гена Dpp4, кодирующего кодирующий человеческий или гуманизированный белок DPP4. В одном варианте осуществления грызун является гомозиготным по замененному участку в эндогенном локусе Dpp4 эндогенного гена Dpp4, кодирующего кодирующий человеческий или гуманизированный белок DPP4. В одном варианте осуществления грызун представляет собой мышь. В одном варианте осуществления грызун представляет собой крысу.

В одном аспекте предложены генетически модифицированные грызуны, например мыши или крысы, у которых выполнена гуманизация эндогенного гена Dpp4 грызуна, причем гуманизация включает замену в эндогенном локусе Dpp4 грызуна гена грызуна, кодирующего экзон гена Dpp4, на нуклеотидную последовательность, кодирующую по меньшей мере один экзон человеческого гена DPP4, с получением модифицированного гена DPP4, при этом экспрессия модифицированного гена DPP4 находится под контролем регуляторных элементов грызуна в эндогенном локусе Dpp4 грызуна.

В одном варианте осуществления грызун является гетерозиготным по нуклеотидной последовательности, кодирующей по меньшей мере один экзон человеческого гена DPP4, с образованием модифицированного гена DPP4. В одном варианте осуществления грызун является гомозиготным по нуклеотидной последовательности, кодирующей по меньшей мере один экзон человеческого гена DPP4, с образованием модифицированного гена DPP4.

В одном варианте осуществления грызун представляет собой мышь или крысу. В одном варианте осуществления грызун представляет собой мышь. В одном варианте осуществления грызун представляет собой крысу.

В одном варианте осуществления человеческий ген DPP4, кодирующий человеческий или гуманизированный белок DPP4, содержит экзоны 2-26 человеческого гена DPP4.

В одном варианте осуществления гуманизированный белок DPP4 содержит внеклеточный домен человеческого белка DPP4.

В одном варианте осуществления гуманизированный белок DPP4 содержит трансмембранный домен и цитоплазматический домен мышиного белка DPP4.

В одном варианте осуществления грызун представляет собой мышь, которая неспособна экспрессировать мышиный белок Dpp4.

В одном варианте осуществления грызун представляет собой мышь, причем непрерывный геномный фрагмент мышиной последовательности Dpp4, кодирующей экзоны 2-26 мышиного Dpp4, заменен на непрерывный геномный фрагмент человеческой последовательности DPP4, кодирующей экзоны 2-26 человеческого DPP4.

В одном аспекте предложены генетически модифицированные грызуны, например мышь или крыса, которые экспрессируют человеческий или гуманизированный белок DPP4, причем грызун, который экспрессирует человеческий или гуманизированный белок DPP4, имеет нормальную иммунную систему, т.е. число иммунных клеток, например Т-клеток, в крови, плазме или сыворотке грызуна, экспрессирующего человеческий или гуманизированный белок DPP4, аналогично числу иммунных клеток, например Т-клеток, в крови, плазме или сыворотке грызуна, экспрессирующего функциональный эндогенный белок Dpp4. В одном варианте осуществления грызун представляет собой мышь. В одном варианте осуществления грызун представляет собой крысу.

В одном варианте осуществления кровь грызуна, который экспрессирует человеческий или гуманизированный белок DPP4, имеет аналогичное число иммунных клеток, например Т-клеток, что и грызун, который экспрессирует функциональный эндогенный белок Dpp4, например мыши или крысы дикого типа. В одном варианте осуществления грызун представляет собой мышь. В одном варианте осуществления грызун представляет собой крысу.

В одном варианте осуществления у мыши, экспрессирующей человеческий или гуманизированный DPP4 на поверхности Т-клеток, количество Т-клеток, присутствующих в крови, составляет по меньшей мере приблизительно 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%, 190% или 200% от количества Т-клеток, присутствующих в крови мыши такого же возраста, которая экспрессирует функциональный эндогенный белок Dpp4, но не содержит человеческого гена DPP4 вместо эндогенного гена Dpp4 в локусе эндогенного мышиного Dpp4.

В одном варианте осуществления у мыши, экспрессирующей человеческий или гуманизированный белок DPP4 на поверхности Т-клеток, количество Т-клеток в крови находится в диапазоне от приблизительно 20% до приблизительно 200%, от приблизительно 40% до приблизительно 160% или от приблизительно 80% до приблизительно 120% от количества Т-клеток, присутствующих в крови мыши такого же возраста, которая экспрессирует функциональный эндогенный белок Dpp4, но не содержит человеческого гена DPP4 вместо эндогенного гена Dpp4 в локусе эндогенного мышиного Dpp4.

В одном аспекте предложены генетически модифицированные грызуны, например мышь или крыса, которые экспрессируют человеческий или гуманизированный белок DPP4, причем грызун экспрессирует человеческий или гуманизированный белок DPP4 на поверхности иммунных клеток, например Т-клеток, и/или на поверхности клеток в одной или более тканях, например плацентарной, почечной, легочной, печеночной, скелетно-мышечной, сердечной, мозговой и/или панкреатической ткани, грызуна такого же возраста, который экспрессирует функциональный эндогенный белок Dpp4. В одном варианте осуществления грызун представляет собой мышь. В одном варианте осуществления грызун представляет собой крысу.

В одном варианте осуществления на поверхности иммунных клеток, например Т-клеток, грызуна, который экспрессирует человеческий или гуманизированный белок DPP4, находится приблизительно такая же концентрация белка DPP4, что и у иммунных клеток, например Т-клеток, грызуна, который экспрессирует функциональный эндогенный белок Dpp4, например мыши или крысы дикого типа. В одном варианте осуществления грызун представляет собой мышь. В одном варианте осуществления грызун представляет собой крысу.

В одном варианте осуществления мышь экспрессирует человеческий или гуманизированный белок DPP4 на поверхности иммунных клеток, например Т-клеток, в концентрации, составляющей по меньшей мере приблизительно 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%, 190% или 200% от концентрации белка Dpp4 на поверхности иммунных клеток, например Т-клеток, у мыши такого же возраста, которая экспрессирует функциональный эндогенный белок Dpp4, но не содержит человеческого гена DPP4 вместо эндогенного гена Dpp4 в локусе эндогенного мышиного Dpp4.

В одном варианте осуществления мышь экспрессирует человеческий или гуманизированный белок DPP4 на поверхности иммунных клеток, например Т-клеток, в концентрации, находящейся в диапазоне от приблизительно 20% до приблизительно 200%, от приблизительно 40% до приблизительно 160% или от приблизительно 80% до приблизительно 120% от концентрации мышиного белка Dpp4 на поверхности иммунных клеток, например Т-клеток, у мыши такого же возраста, которая экспрессирует функциональный эндогенный белок Dpp4, но не содержит человеческого гена DPP4 вместо эндогенного гена Dpp4 в локусе эндогенного мышиного Dpp4.

В одном варианте осуществления на поверхности клеток в одной или более тканях, например плацентарной, почечной, легочной, печеночной, скелетно-мышечной, сердечной, мозговой и/или панкреатической ткани, грызуна, который экспрессирует человеческий или гуманизированный белок DPP4, находится приблизительно такая же концентрация белка DPP4, что и у клеток в одной или более тканях, например плацентарной, почечной, легочной, печеночной, скелетно-мышечной, сердечной, мозговой и/или панкреатической ткани, грызуна, который экспрессирует функциональный эндогенный белок Dpp4, например мыши или крысы дикого типа. В одном варианте осуществления грызун представляет собой мышь. В одном варианте осуществления грызун представляет собой крысу.

В одном варианте осуществления мышь экспрессирует человеческий или гуманизированный белок DPP4 на поверхности клеток в одной или более тканях, например плацентарной, почечной, легочной, печеночной, скелетно-мышечной, сердечной, мозговой и/или панкреатической ткани, в концентрации, составляющей по меньшей мере приблизительно 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%, 190% или 200% от концентрации белка Dpp4 на поверхности клеток в одной или более тканях, например плацентарной, почечной, легочной, печеночной, скелетно-мышечной, сердечной, мозговой и/или панкреатической ткани, у мыши такого же возраста, которая экспрессирует функциональный эндогенный белок Dpp4, но не содержит человеческого гена DPP4 вместо эндогенного гена Dpp4 в локусе эндогенного мышиного Dpp4.

В одном варианте осуществления мышь экспрессирует человеческий или гуманизированный белок DPP4 на поверхности клеток в одной или более тканях, например плацентарной, почечной, легочной, печеночной, скелетно-мышечной, сердечной, мозговой и/или панкреатической ткани, в концентрации, находящейся в диапазоне от приблизительно 20% до приблизительно 200%, от приблизительно 40% до приблизительно 160% или от приблизительно 80% до приблизительно 120% от концентрации мышиного белка Dpp4 на поверхности клеток в одной или более тканях, например плацентарной, почечной, легочной, печеночной, скелетно-мышечной, сердечной, мозговой и/или панкреатической ткани, у мыши такого же возраста, которая экспрессирует функциональный эндогенный белок Dpp4, но не содержит человеческого гена DPP4 вместо эндогенного гена Dpp4 в локусе эндогенного мышиного Dpp4.

В одном аспекте предложен генетически модифицированный грызун, содержащий гуманизированный ген DPP4, который содержит человеческую последовательность, кодирующую внеклеточный домен DPP4, вместо последовательности грызуна, кодирующей внеклеточный домен Dpp4, причем гуманизированный ген DPP4 содержит трансмембранную последовательность Dpp4 грызуна и цитоплазматическую последовательность Dpp4 грызуна, при этом гуманизированный ген DPP4 контролируется регуляторными элементами эндогенного Dpp4 грызуна в эндогенном локусе Dpp4.

В одном варианте осуществления грызун является гетерозиготным по гуманизированному гену DPP4. В одном варианте осуществления грызун является гомозиготным по гуманизированному гену DPP4.

В одном варианте осуществления грызун представляет собой мышь или крысу. В одном варианте осуществления грызун представляет собой мышь. В одном варианте осуществления грызун представляет собой крысу.

В одном варианте осуществления мышь неспособна экспрессировать мышиный белок Dpp4.

В одном варианте осуществления регуляторные элементы или последовательности грызуна в локусе эндогенного Dpp4 грызуна взяты у мыши или крысы.

В одном варианте осуществления регуляторные элементы или последовательности грызуна представляют собой эндогенные регуляторные элементы или последовательности грызуна в локусе Dpp4 грызуна и взяты у мыши или крысы.

В одном аспекте предложено не относящееся к человеку животное, например грызун, такой как мышь или крыса, которое экспрессирует человеческий или гуманизированный белок DPP4, причем не относящееся к человеку животное экспрессирует человеческий или гуманизированный белок DPP4 из локуса эндогенного нечеловеческого Dpp4. В варианте осуществления не относящееся к человеку животное относится к семейству грызунов. В варианте осуществления грызун представляет собой мышь. В варианте осуществления грызун представляет собой крысу. В одном варианте осуществления грызун является гетерозиготным по локусу эндогенного нечеловеческого Dpp4, который экспрессирует человеческий или гуманизированный белок DPP4. В одном варианте осуществления грызун является гомозиготным по локусу эндогенного нечеловеческого Dpp4, который экспрессирует человеческий или гуманизированный белок DPP4.

В одном аспекте предложена генетически модифицированная мышь, которая экспрессирует человеческий или гуманизированный белок DPP4 из локуса эндогенного мышиного Dpp4, причем эндогенный мышиный ген Dpp4 полностью или частично заменен на человеческий ген DPP4.

В одном варианте осуществления приблизительно 78,8 тыс.п.н. в локусе эндогенного мышиного Dpp4, включая участок от экзона 2 до стоп-кодона в экзоне 26, удалены и заменены на человеческую последовательность гена DPP4 размером приблизительно 81,8 тыс.п.н., содержащей участок от экзона 2 до экзона 26 и участок нетранслируемой последовательности со стороны 3'-конца человеческого гена DPP4. В конкретном варианте осуществления человеческий ген DPP4 содержит участок от экзона 2 до экзона 26 и участок нетранслируемой последовательности со стороны 3'-конца человеческого гена DPP4 человеческой ВАС RP11-68L22. В конкретном варианте осуществления ген DPP4 содержит регуляторные элементы со стороны 5'-конца мышиного гена Dpp4, экзон 1 мышиного Dpp4, включая первые две аминокислоты метионин и лизин мышиного белка Dpp4, и регуляторные элементы со стороны 3'-конца Dpp4, экзон 1 мышиного Dpp4, включая первые две аминокислоты метионин и лизин мышиного белка Dpp4, и регуляторные элементы со стороны 3'-конца мышиного гена Dpp4 (например нетранслируемую последовательность со стороны 3'-конца) и участок человеческого гена DPP4 от экзона 2 до экзона 26, т.е. последовательности, кодирующие человеческий белок DPP4, за исключением первых двух аминокислот, которые взяты от экзона 1 мышиного Dpp4.

В одном аспекте предложена генетически модифицированная мышь, которая содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую человеческий или гуманизированный белок DPP4, причем нуклеотидная последовательность, кодирующая человеческий или гуманизированный белок DPP4, полностью или частично заменяет эндогенную нуклеотидную последовательность, кодирующую эндогенный мышиный белок Dpp4.

В одном варианте осуществления мышь является гетерозиготной по нуклеотидной последовательности, кодирующей человеческий или гуманизированный белок DPP4. В одном варианте осуществления мышь является гомозиготной по нуклеотидной последовательности, кодирующей человеческий или гуманизированный белок DPP4.

В одном аспекте предложен способ получения грызуна с гуманизированным DPP4, включающий замену последовательности гена Dpp4 грызуна, кодирующей белок Dpp4 грызуна, человеческой последовательностью гена DPP4, содержащей один или более экзонов человеческой последовательности гена DPP4, кодирующей человеческий или гуманизированный белок DPP4, причем замена выполнена в локусе эндогенного Dpp4 грызуна, и человеческая последовательность гена DPP4, содержащая один или более экзонов человеческой последовательности гена DPP4, кодирующей человеческий или гуманизированный белок DPP4, функционально связана с регуляторными элементами или последовательностями грызуна в локусе эндогенного Dpp4 грызуна.

В одном варианте осуществления грызун является гетерозиготным по нуклеотидной последовательности, кодирующей человеческий или гуманизированный белок DPP4. В одном варианте осуществления грызун является гомозиготным по нуклеотидной последовательности, кодирующей человеческий или гуманизированный белок DPP4.

В одном варианте осуществления грызун представляет собой мышь или крысу. В одном варианте осуществления грызун представляет собой мышь. В одном варианте осуществления грызун представляет собой крысу.

В одном варианте осуществления регуляторные элементы или последовательности грызуна взяты от мыши. В одном варианте осуществления регуляторные элементы или последовательности грызуна взяты от крысы.

В одном варианте осуществления регуляторные элементы или последовательности грызуна представляют собой эндогенные регуляторные элементы или последовательности грызуна в локусе Dpp4 грызуна. В одном варианте осуществления грызун представляет собой мышь. В одном варианте осуществления грызун представляет собой крысу.

В одном варианте осуществления человеческая последовательность гена DPP4, заменяющая последовательность гена Dpp4 грызуна, содержит по меньшей мере один экзон человеческой последовательности гена DPP4. В других вариантах осуществления человеческая последовательность гена DPP4, заменяющая последовательность гена Dpp4 грызуна, содержит по меньшей мере 2, по меньшей мере 3, по меньшей мере 4, по меньшей мере 5, по меньшей мере 6, по меньшей мере 7, по меньшей мере 8, по меньшей мере 9, по меньшей мере 10, по меньшей мере 11, по меньшей мере 12, по меньшей мере 13, по меньшей мере 14, по меньшей мере 15, по меньшей мере 16, по меньшей мере 17, по меньшей мере 18, по меньшей мере 19, по меньшей мере 20, по меньшей мере 21, по меньшей мере 22, по меньшей мере 23, по меньшей мере 24 или по меньшей мере 25 экзонов человеческой последовательности гена DPP4. В одном варианте осуществления человеческая последовательность гена DPP4, заменяющая последовательность гена Dpp4 грызуна, содержит все 26 экзонов человеческой последовательности гена DPP4. В одном варианте осуществления грызун представляет собой мышь. В одном варианте осуществления грызун представляет собой крысу.

В одном варианте осуществления человеческая или гуманизированная последовательность гена DPP4, заменяющая последовательность гена Dpp4 грызуна, кодирует белок, который приблизительно на 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или приблизительно 99% идентичен человеческому DPP4.

В одном варианте осуществления человеческая или гуманизированная последовательность гена DPP4, заменяющая последовательность гена Dpp4 грызуна, содержит по меньшей мере один экзон человеческой последовательности гена DPP4, кодирующей внеклеточный домен человеческого белка DPP4. В других вариантах осуществления человеческая последовательность гена DPP4, заменяющая последовательность гена Dpp4 грызуна, содержит по меньшей мере 2, по меньшей мере 3, по меньшей мере 4, по меньшей мере 5, по меньшей мере 6, по меньшей мере 7, по меньшей мере 8, по меньшей мере 9, по меньшей мере 10, по меньшей мере 11, по меньшей мере 12, по меньшей мере 13, по меньшей мере 14, по меньшей мере 15, по меньшей мере 16, по меньшей мере 17, по меньшей мере 18, по меньшей мере 19, по меньшей мере 20, по меньшей мере 21, по меньшей мере 22 или по меньшей мере 23 экзона человеческой последовательности гена DPP4, кодирующей внеклеточный домен человеческого белка DPP4. В одном варианте осуществления человеческая последовательность гена DPP4, заменяющая последовательность гена Dpp4 грызуна, содержит все 24 экзона человеческой последовательности гена DPP4, кодирующей внеклеточный домен человеческого белка DPP4. В одном варианте осуществления грызун представляет собой мышь. В одном варианте осуществления грызун представляет собой крысу.

В одном варианте осуществления человеческая или гуманизированная последовательность гена DPP4, заменяющая последовательность гена Dpp4 грызуна, кодирует внеклеточный домен белка DPP4, который приблизительно на 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или приблизительно 99% идентичен внеклеточному домену человеческого белка DPP4.

В одном варианте осуществления замена выполнена в локусе эндогенного Dpp4 грызуна, и человеческая последовательность гена DPP4, содержащая один или более экзонов человеческой последовательности гена DPP4, кодирующей человеческий или гуманизированный белок DPP4, функционально связана с эндогенными регуляторными элементами или последовательностями грызуна в локусе эндогенного Dpp4 грызуна.

В одном аспекте предложен способ получения мыши с гуманизированным DPP4, включающий замену последовательности мышиного гена Dpp4, кодирующей мышиный белок Dpp4, человеческой последовательностью гена DPP4, кодирующей человеческий или гуманизированный белок DPP4.

В одном варианте осуществления замена выполнена в локусе эндогенного Dpp4 мыши, и человеческий ген DPP4, кодирующий человеческий или гуманизированный белок DPP4, функционально связан с регуляторными элементами или последовательностями мыши в локусе эндогенного Dpp4 мыши.

В одном варианте осуществления замена выполнена в локусе эндогенного Dpp4 мыши, и человеческий ген DPP4, кодирующий человеческий или гуманизированный белок DPP4, функционально связан с эндогенными регуляторными элементами или последовательностями мыши в локусе эндогенного Dpp4 мыши.

В различных аспектах генетически модифицированные не относящиеся к человеку животные, например грызуны, такие как мыши или крысы, описанные в настоящем документе, содержат генетические модификации в их зародышевой линии.

В одном аспекте предложен эмбрион не относящегося к человеку животного, например грызуна, такого как мышь или крыса, содержащий генетическую модификацию, описанную в настоящем документе.

В одном аспекте предложен эмбрион-носитель не относящегося к человеку животного, например грызуна, такого как мышь или крыса, который содержит донорскую клетку, которая содержит генетическую модификацию, описанную в настоящем документе.

В одном аспекте предложена плюрипотентная или тотипотентная клетка не относящегося к человеку животного, например грызуна, такого как мышь или крыса, содержащая генетическую модификацию, описанную в настоящем документе. В одном варианте осуществления клетка представляет собой клетку грызуна. В одном варианте осуществления клетка представляет собой клетку мыши. В одном варианте осуществления клетка представляет собой эмбриональную стволовую (ЭС) клетку грызуна. В одном варианте осуществления клетка представляет собой ЭС-клетку.

В одном аспекте предложена яйцеклетка не относящегося к человеку животного, например грызуна, такого как мышь или крыса, причем яйцеклетка не относящегося к человеку животного содержит эктопическую хромосому не относящегося к человеку животного, при этом эктопическая хромосома не относящегося к человеку животного содержит генетическую модификацию, описанную в настоящем документе. В одном варианте осуществления не относящееся к человеку животное относится к семейству грызунов. В одном варианте осуществления грызун представляет собой мышь. В одном варианте осуществления грызун представляет собой крысу.

В одном аспекте мышиный эмбрион, яйцеклетка или клетка, генетически модифицированная с внедрением человеческого гена DPP4, представляет собой эмбрион, яйцеклетку или клетку мыши линии C57BL, которую выбирают из C57BL/A, C57BL/An, C57BL/GrFa, C57BL/KaLwN, C57BL/6, C57BL/6J, C57BL/6ByJ, C57BL/6NJ, C57BL/10, C57BL/10ScSn, C57BL/10Cr и C57BL/01a. В другом варианте осуществления мышь представляет собой мышь линии 129, которую выбирают из группы, состоящей из 129Р1, 129Р2, 129Р3, 129X1, 129S1 (например, 129S1/SV, 129Sl/Svlm), 129S2, 129S4, 129S5, 129S9/SvEvH, 129S6 (129/SvEvTac), 129S7, 129S8, 129Т1, 129Т2 (см., например, Festing et al. (1999) Revised nomenclature for strain 129 mice, Mammalian Genome 10:836, см. также Auerbach et al (2000) Establishment and Chimera Analysis of 129/SvEv- and C57BL/6-Derived Mouse Embryonic Stem Cell Lines). В конкретном варианте осуществления генетически модифицированная мышь представляет собой смесь вышеупомянутой линии 129 и вышеупомянутой линии C57BL/6. В другом конкретном варианте осуществления мышь представляет собой смесь вышеупомянутых линий 129 или смесь вышеупомянутых линий BL/6. В конкретном варианте осуществления линия 129 смеси представляет собой линию 129S6 (129/SvEvTac). В другом варианте осуществления мышь представляет собой мышь линии BALB, например линии BALB/c. В другом варианте осуществления мышь представляет собой смесь линии BALB с другой вышеупомянутой линией. В одном варианте осуществления мышь представляет собой швейцарскую мышь или швейцарскую мышь Вебстер.

В различных аспектах не относящихся к человеку животных, содержащих человеческую или гуманизированную нуклеотидную последовательность DPP4, выбирают из млекопитающих или птиц. В одном варианте осуществления не относящиеся к человеку животные представляют собой млекопитающих. В одном варианте осуществления млекопитающие представляют собой грызунов. В одном варианте осуществления грызуны представляют собой мышей или крыс.

В одном аспекте предложен грызун, который содержит нуклеотидную последовательность, содержащую человеческий ген DPP4 или его фрагмент, причем человеческий ген DPP4 или его фрагмент содержит по меньшей мере один экзон человеческого гена DPP4, и при этом человеческий ген DPP4 или его фрагмент кодирует человеческий или гуманизированный белок DPP4.

В одном варианте осуществления человеческий ген DPP4 или его фрагмент содержит по меньшей мере 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 или 25 экзонов человеческого гена DPP4.

В одном варианте осуществления человеческий ген DPP4 или его фрагмент содержит все 26 экзонов человеческого гена DPP4.

В одном варианте осуществления нуклеотидная последовательность дополнительно содержит 5'-фланкирующую область человеческого гена DPP4. В одном варианте осуществления человеческий ген DPP4 или его фрагмент функционально связан с 5'-фланкирующей областью человеческого гена DPP4. В одном варианте осуществления длина 5'-фланкирующей области человеческого гена DPP4 составляет по меньшей мере 1 тыс.п.н. (например, длина составляет по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 40, 50 тыс.п.н. или более). В одном варианте осуществления длина 5'-фланкирующей области человеческого гена DPP4 составляет по меньшей мере 10 тыс.п.н. В одном варианте осуществления длина 5'-фланкирующей области человеческого гена DPP4 составляет по меньшей мере 40 тыс.п.н.

В одном варианте осуществления экспрессия человеческого гена DPP4 или его фрагмента контролируется 5'-фланкирующей областью человеческого гена DPP4.

В одном варианте осуществления человеческий или гуманизированный белок DPP4 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 24 или ее фрагмент.

В одном варианте осуществления грызун экспрессирует человеческий или гуманизированный белок DPP4 на поверхности Т-клеток в концентрации, составляющей по меньшей мере приблизительно 20% (например, по меньшей мере приблизительно 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% или более) от концентрации белка Dpp4 грызуна, присутствующего на поверхности Т-клеток грызуна такого же возраста, который экспрессирует функциональный эндогенный белок Dpp4 грызуна, но не содержит человеческого гена DPP4 или его фрагмента.

В одном варианте осуществления грызун экспрессирует человеческий или гуманизированный белок DPP4 на поверхности клеток в одной или более тканях, выбранных из группы, состоящей из плацентарной, почечной, легочной, печеночной, скелетно-мышечной, сердечной, мозговой и панкреатической ткани, в концентрации, составляющей по меньшей мере приблизительно 20% (например, по меньшей мере приблизительно 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% или более) от концентрации белка Dpp4 грызуна, присутствующего на поверхности одной или более тканей грызуна такого же возраста, который экспрессирует функциональный эндогенный белок Dpp4 грызуна, но не содержит человеческого гена DPP4 или его фрагмента.

В одном варианте осуществления грызун экспрессирует функциональный эндогенный белок Dpp4 грызуна.

В одном варианте осуществления грызун представляет собой мышь или крысу.

В одном аспекте предложен способ получения гуманизированного трансгенного грызуна, включающий встраивание нуклеотидной последовательности, содержащей один или более экзонов человеческой последовательности гена DPP4, в хромосому грызуна, причем один или более экзонов человеческой последовательности гена DPP4 кодируют человеческий или гуманизированный белок DPP4.

В одном варианте осуществления человеческий ген DPP4 или его фрагмент содержит по меньшей мере 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 или 25 экзонов человеческого гена DPP4.

В одном варианте осуществления человеческий ген DPP4 или его фрагмент содержит все 26 экзонов человеческого гена DPP4.

В одном варианте осуществления нуклеотидная последовательность дополнительно содержит 5'-фланкирующую область человеческого гена DPP4.

В одном варианте осуществления человеческая последовательность гена DPP4 функционально связана с 5'-фланкирующей областью человеческого гена DPP4.

В одном варианте осуществления человеческий или гуманизированный белок DPP4 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 24 или ее фрагмент.

В одном варианте осуществления грызун представляет собой мышь или крысу. В дополнительных аспектах предложены способы определения in vivo терапевтической эффективности специфичного для человека антагониста DPP4 у любого из грызунов с гуманизированным DPP4, описанных в настоящем документе, включаю