Лиофилизированные липосомы

Лиофилизированные липосомы

Реферат

Родственные заявки

По настоящей заявке испрашивается приоритет заявки на патент США № 61/550047, зарегистрированной 21 октября 2011 года, содержание которой включено в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме.

Область техники

Изобретение относится к композиции и способам производства лиофилизированных липосом, которые содержат по меньшей мере два терапевтических или диагностических агента, которые могут храниться в течение пролонгированных промежутков времени. В одном аспекте изобретение относится к липосомам с низким содержанием холестерина, по желанию во внешней среде содержится криопротектор, имеющий устойчивость к замораживанию/таянию и дегидратационному разрушению липосом, таким образом сохраняя их размер и целостность.

Уровень техники, предшествующий изобретению

Липосомы представляют собой замкнутые везикулы, имеющие по меньшей мере один липидный бислой, окружающий водное ядро. Внутрилипосомальное пространство и липидный слой(и) могут удерживать большое разнообразие веществ, включая лекарственные средства, косметические средства, диагностические реагенты, генетический материал и биоактивные соединения. Так как нетоксичные липиды служат в качестве основы для липосом, они в основном проявляют низкую токсичность. Низкая токсичность вместе со способностью липосом повышать продолжительность циркуляции в плазме агентов делает липосомы пригодными в качестве носителей, особенно для доставки фармацевтически активных агентов. Во многих случаях доставляемые липосомой лекарственные средства приводят к превосходной клинической эффективности вместе с уменьшенной токсичностью.

Практическое применение липосомальных препаратов в качестве носителей для доставки лекарственного средства ограничено химической и физической стабильностью препарата. Для промышленного выпуска требуется стабильность в течение длительного промежутка времени как на химическом, так и на физическом уровне. Применение замороженных или высушенных замораживанием (лиофилизированных) препаратов для избежания разрушения лабильного лекарственного средства и/или липидных компонентов обеспечивает некоторое улучшение стабильности. Однако, во время процесса лиофилизирования, образование кристаллов льда может привести к механическому разрыву, агрегированию липосом и слиянию (приводя к увеличенному размеру липосом). Более того, когда липосомы, содержащие лекарственное средство, лиофилизируют и затем воспроизводят при комнатной температуре, часто происходят изменения в структуре их бислоя(ев), что приводит к ускоренной утечке лекарственного средства.

Предшествующие попытки приготовления лиофилизированных липосомальных композиций были основаны на стандартных липосомах, которые, как правило, находятся в жидкой фазе при температуре тела, перемещение липидов является текучим и неконтролируемым. Такие общепринятые липосомы делятся на две категории. Первые сохраняются в жидком состоянии из-за того, что они содержат липиды, где температура перехода из геля в жидкий кристалл (T_c) ниже температуры тела (т.е. они будут в жидкой фазе при температуре тела). Эти липосомы регулярно применяются в данной области, однако оборотной стороной текучести является то, что они обладают плохим удерживанием лекарственного средства для многих инкапсулированных агентов.

Второй тип общепринятых липосом никогда не подвергается превращению из жидкости в гель, так как они содержат высокие количества придающих жесткость мембране агентов, таких как холестерин (например, 30-45% мол.). Холестерин действует для увеличения толщины бислоя и текучести, при этом понижая проницаемость мембраны, белковые взаимодействия и липопротеиновую дестабилизацию липосомы. Такие высокие количества холестерина наиболее часто применяются в липосомальных исследованиях и ранее рассматривались как необходимые для достаточной стабильности в сыворотке и удерживания лекарственного средства in vivo, хотя не все лекарственные средства могут быть в достаточной степени удерживаемыми. Некоторые лекарственные средства проявляют лучшее лекарственное удерживание как в in vitro, так и в in vivo липосомах, по существу не содержащих холестерин. См., например, Dos Santos, et al., Biochim. Biophs. Acta, (2002) 1561:188-201.

С другой стороны, липосомы в гелевой фазе являются более стабильными и проявляют улучшенное лекарственное удерживание. Изобретение использует преимущество липосом, которые находятся в гелевой фазе при температуре тела (т.е. температура тела ниже T_c липосом). Липосомы в гелевой фазе могут быть приготовлены из ряда липидов; однако для липосом, приготовленных с более насыщенной ацильной боковой цепью фосфатидильных липидов, таких как гидрогенизированный соевый PC, дипальмитоил фосфатидилхолин (DPPC) или дистеароил фосфатидилхолин (DSPC), требуется не менее чем 30% холестерина для того, чтобы получить гелевые фазы при температуре тела. Примером общепринятых липосом, которые не находятся в гелевых фазах при температуре тела, являются приготовленные из яичного фосфатидилхолина (EPC), которые являются допускающими значительную утечку.

В предшествующих попытках приготовления лиофилизированных липосомальных композиций с применением общепринятых липосом были задействованы или пустые липосомы, или липосомы, содержащие только единственный агент. В них может быть применен криопротектор, как правило, сахарид, как внутри, так и снаружи липосом, или большой осмотический градиент через липосомальную мембрану.

Например, криопротекторы применяли для защиты от разрушения замораживанием/таянием 'жидких' липосом EPC, инкапсулирующих единственный агент, когда он представлен в достаточных количествах как внутри, так и снаружи липосом, идеально, когда эти количества равны. См., например, патенты США №№ 5077056 и 4883665. Наличие 1-10% криопротектора во внутренней липосомальной среде сохраняет состав лиофилизированных EPC липосом, инкапсулирующих доксорубицин, где внутренняя осмотическая концентрация предпочтительно близка к физиологической осмотической концентрации. См., например, патент США № 4927571. Нарушение включения криопротектора во внутреннем пространстве липосомы, как было продемонстрировано, приводит к потере целостности липосомы при воспроизведении, особенно с точки зрения удержания инкапсулированного агента. Как описано, "для предотвращения утечки требуется присутствие сахара как внутри, так и снаружи липосомы" (Lowery, M. (June 2002) Drug Development and Delivery, Vol. 2, № 4).

В одном случае, о защите от агрегирования и слияния везикул, а также от потери удерживаемого лекарственного средства сообщалось также для липосом гидрогенизированный соевый PC:холестерин:DSPE-mPEG (молярное соотношение 51:44:5), где липосомный препарат содержит 44% мол. холестерина, а также криопротектор и высокую концентрацию соли во внешней среде. Наличие 44% холестерина означает, что липосомы будут в жидкой фазе при или ниже температуры тела. Более того, защитный эффект реализуется, только если существует большой осмотический градиент через мембрану, такой, что осмотическая концентрация снаружи липосомы значительно выше, чем внутренняя осмотическая концентрация. См., например, WO 01/05372.

Связанные с мембраной криопротекторы также дополнительно улучшают устойчивость к замораживанию и лиофилизированию этих липосом в негелевой фазе. В частности, сообщается, что сахара, трансплантированные на поверхности липосомальных мембран EPC или EPC:холестерин (молярное соотношение 1:1) посредством олиго(этиленоксид) линкеров, состоящих из от одного до трех повторяющихся блоков, являются криозащитными для липосом, содержащих флуоресцентную пробу. См., например, Bendas, et al., Eur. J. Pharm. Sci. (1996) 4:211-222; Goodrich, et al., Biochem. (1991) 30:5313-5318; патент США № 4915951. Baldeschwieler, et al., сообщают, что в отсутствие терминальной сахарной группы липосомы, приготовленные с олигоэтиленоксидным линкером, сами по себе были не способны предоставлять защиту от слияния после замораживания. Патент США № 4915951.

Трегалоза во внешней среде липосомного состава PC, инкапсулирующего единственный агент, обеспечивает устойчивость к липосомальному агрегированию и слиянию. Патент США № 6319517. Для других способов производства малых липосом, стабилизированных от агрегирования, требуется образование пустых липосом PC:холестерин (молярное соотношение 1:1), к которым добавлен раствор сахара и единственный реагент, и которые затем высушены. Во время процесса высушивания внутри липосомы удерживается процентное содержание реагента. Эти липосомы, как сообщается, являются более стабильными при хранении, чем в отсутствие сахара. См., например, WО 99/65465.

Как указано ранее, большинство предшествующих технологий лиофилизации были направлены на лиофилизацию или пустых липосом, или липосом, инкапсулирующих единственный агент. Лиофилизация с сохранением целостности, когда два или более агента являются инкапсулированными, является более сложной, особенно если реагенты отличаются по их характеристикам растворимости. Инкапсулирование двух или более агентов часто выгодно, так как многие опасные для жизни заболевания, такие как рак, вызываются множеством молекулярных механизмов, и из-за их сложности лечение единственным агентом имело ограниченный успех. Следовательно, почти во всех способах лечения рака задействованы комбинации более чем одного терапевтического агента. Это также верно для лечения других состояний, включая инфекции и хронические заболевания.

В публикации согласно PCT WО03/041681, включенной в данный документ посредством ссылки, сообщается, что липосомы в гелевой фазе с температурами превращения 38°C или более могут быть приготовлены с использованием насыщенных фосфатидильных липидов, таких как DPPC и DSPC, и уменьшенных количеств (0-20%) холестерина, если по меньшей мере 1% мол. фосфоинозитола (PI) или фосфатидилглицерина (PG) включен в композиции. Было продемонстрировано, что эти липосомы при содержании комбинации инкапсулированных иринотекана и флоксуридина (FUDR) являлись стабильными при замораживании при -20°C. Простое замораживание в основном является менее жестким и менее деструктивным для целостности липосомы, чем лиофилизация.

Применение липосом в качестве носителей для доставки этих комбинаций является выгодным, особенно, если липосомы включают и способны к сохранению соотношения агентов, которые являются неантагонистическими. Этот общий подход подробно описан в патенте США 7850990, включенном в данный документ посредством ссылки. В этом патенте описывается, как определить неантагонистические или синергические соотношения различных терапевтических агентов, включая антинеопластичные противоопухолевые агенты, которые сохраняют неантагонизм или синергизм при широком диапазоне концентраций. В этом патенте описывается, что является существенным для доставки лекарственных средств во вводимом соотношении и сохранения этого соотношения, позволяя носителям для доставки регулировать фармакокинетику. В этом патенте проиллюстрированы липосомы, которые содержат, при сохранении соотношений, неантагонистические или синергические соотношения двух или более терапевтических агентов, включая иринотекан и FUDR. Такие комбинации, инкапсулированные в липосомы, будут иметь преимущество при хранении в лиофилизированной форме, если при воспроизведении целостность липосом и концентрации агентов и их соотношения сохраняются. Особенно пригодна комбинация цитарабина и даунорубицина, инкапсулированная в липосомы, описанная в патенте США 8022279, также включенном в данный документ посредством ссылки.

Применение этих комбинаций в терапевтических протоколах с неожиданно хорошими результатами описано в публикации PCT WО 2007/050784 и публикации PCT WО 2008/101214. Дополнительные составы со способами доставки лекарственного средства с липосомальной инкапсуляцией описаны в WО 2009/097011 и WО 2009/070761, а также WО 2010/043050. Эти составы являются простым примером пригодных композиций, в которых два или более терапевтических агента содержатся в липосомах для доставки пациенту.

Как описано выше, в целом приготовление стабильных лиофилизированных композиций липосом, которые сохраняют их целостность при воспроизведении, являлось сложным и непредсказуемым. Получение таких стабильных липосомальных композиций для комбинации двух или более агентов является даже более затруднительным. Таким образом, успешность способа по изобретению в получении лиофилизированных липосом, где липосомы содержат два или более терапевтических или диагностических агента и где они сохраняют их целостность при воспроизведении, является исключительным достижением.

Раскрытие изобретения

Соответственно было сообщено, что криопротектор требуется как внутри, так и снаружи липосом для того, чтобы сохранять целостность липосомы при воспроизведении после лиофилизации, особенно для того, чтобы обеспечивать удерживание инкапсулированного агента. Авторы данного открытия идентифицировали стабильные липосомы, для которых не требуется какой-либо внутренний криопротектор для успешной лиофилизации липосом, инкапсулирующих не только один, но два или более активных агентов.

Изобретение относится к успешно лиофилизированным липосомальным препаратам в гелевой фазе, которые содержат более одного терапевтического и/или диагностического агента и не содержат внутренний криопротектор. Таким образом, в одном аспекте изобретение направлено на лиофилизированную липосомальную композицию, где указанные липосомы стабильно ассоциированы с по меньшей мере двумя терапевтическими и/или диагностическими агентами и где, когда указанная композиция воспроизведена, сохраняется средний диаметр липосом по сравнению с предлиофилизационным состоянием, и процентное содержание каждого из агентов, которые остаются инкапсулированными в липосомах, сохраняется на удовлетворяющем уровне. Целостность липосом, таким образом, измеряется как процентное содержание инкапсулированных агентов, удерживаемое после воспроизведения липосом. Дополнительным параметром, применяемым в качестве критерия для удовлетворяющей лиофилизации, является минимальное изменение распределения размеров. Особенно важным вариантом осуществления является тот, в котором агенты инкапсулированы внутри липосом в определенном соотношении, и где соотношение этих агентов сохраняется, когда лиофилизированные формы воспроизводятся.

Типичные условия для достижения этого результата содержат применение липосом в гелевой фазе с температурами превращения из геля в жидкий кристалл (T_c), которые по меньшей мере равны комнатной температуре и могут быть равны или выше температуры тела человека. Считается, что температура тела составляет приблизительно 37°C. Липосомы могут являться липосомами с низким содержанием холестерина, которые являются стабилизированными фосфатидилглицерином и/или фосфоинозитолом. Липосомы по существу не содержат внутренний криопротектор, но могут содержать внешний криопротектор на их поверхности и, таким образом, могут быть лиофилизированы при наличии среды, содержащей криопротектор. Подразумевается, что термин "по существу нет внутреннего криопротектора" включает липосомы, которые не содержат внутренний криопротектор, а также липосомы, которые содержат количество криопротектора, которое не влияет на процесс замораживания и/или лиофилизации указанных липосом (т.е. 125 мМ криопротектора или менее, которое является "неактивным" количеством). Следовательно, "по существу нет внутреннего криопротектора" определено как составляющее приблизительно 0-125 мМ криопротектора внутри липосом. Важно отметить, что предотвращение утечки лекарственного средства после процесса лиофилизирования является значительно более сложным, чем сохранение размера липосом. Как упомянуто выше, лекарственное удерживание после лиофилизации ранее достигалось посредством применения криопротектора как внутри, так и снаружи липосом.

Таким образом, в одном варианте осуществления липосомы имеют температуры превращения из геля в жидкий кристалл (T_c) мембраны больше, чем комнатная температура, или более 25°C или 37°C для того, чтобы по меньшей мере при комнатной температуре, например 25°C, липидная мембрана являлась достаточно гелеобразной для содействия удержанию лекарственных средств. Композиции предоставляют возможность удерживания инкапсулированных агентов и уменьшенного агрегирования и слияния при лиофилизации и воспроизведении, посредством этого предоставляя пригодные к употреблению композиции с продленным сроком хранения. Улучшенная защита от процесса лиофилизирования не зависит от осмотического потенциала. Эти липосомы сохраняют их распределение размеров и профили инкапсуляции лекарственного средства в течение длительных периодов времени при фармацевтически релевантных условиях.

Способы приготовления композиции лиофилизированных липосом, таким образом, могут содержать криопротектор, внешний по отношению к липосомам с выбранной концентрацией, где температура липосомальной мембраны перед замораживанием и лиофилизацией ниже ее температуры фазового перехода T_c. Предпочтительно, липосомы являются замороженными при температуре, которая ниже температуры стеклования (T_g) раствора, который содержит липосомы с инкапсулированным лекарственным средством, а также экстралипосомальную среду, которая содержит криопротектор.

Изобретение также в других аспектах направлено на способы приготовления лиофилизированных липосом, содержащих два или более терапевтических и/или диагностических агента в соответствии с вариантами осуществления, изложенными выше, способы воспроизведения указанных лиофилизированных композиций, способы введения воспроизведенных липосом пациентам и способы лечения пациентов, пораженных, подверженных заболеванию или с подозрением на поражение (например, рак).

Краткое описание чертежей

Фиг. 1 демонстрирует профиль размеров частиц липосом CPX-1 перед замораживанием.

Фиг. 2 демонстрирует профиль размеров частиц воспроизведенных липосом CPX-1 непосредственно после замораживания, лиофилизирования и воспроизведения.

Фиг. 3 демонстрирует профиль размеров частиц воспроизведенных липосом CPX-1 после 1 месяца хранения.

Фиг. 4A-4C демонстрируют профили размеров частиц воспроизведенных липосом CPX-1 после 6 месяцев хранения.

Способы воплощения изобретения

Изобретение впервые обеспечивает лиофилизированные липосомальные композиции в гелевой фазе, которые содержат два или более терапевтических и/или диагностических агента, таких, что характеристики и свойства воспроизведенной лиофилизированной композиции по существу соответствуют характеристикам и свойствам композиции перед лиофилизацией. Эти характеристики могут содержать средний диаметр, распределение размеров и емкость липосом. Емкость липосом относится к удерживанию агентов; в некоторых вариантах осуществления соотношения агентов также сохраняются.

Хотя липосомы содержат терапевтические и/или диагностические агенты, в данной заявке термин "лекарственные средства" иногда применяется в качестве краткого обозначения этого.

Липосомы в гелевой фазе содержат один или более липидных бислоев, окружающих внутренний компартмент. Эти липосомы могут являться двухслойными или однослойными везикулами. Однослойные липосомы (также известные как однослойные везикулы или "ULV") окружают единственный внутренний водный компартмент и классифицируются как или малые однослойные везикулы (SUV), или крупные однослойные везикулы (LUV). LUV и SUV варьируются в размере от приблизительно 50 до 500 нм и 20 до 50 нм, соответственно. Двухслойные липосомы имеют две липидные мембраны, где внутренняя мембрана окружает единственный внутренний водный компартмент, и вторая большая внешняя мембрана окружает внутреннюю мембрану, таким образом создавая второй внутренний водный компартмент.

Поддержание распределения размеров липосом в гелевой фазе может быть оценено экспериментально получением профилей размера частиц, таких как приведенные на фиг.1-4 в данном документе. Распределение размеров, определенное квазиупругим светорассеянием, как правило, представлено в виде гистограммы, демонстрирующей средний диаметр липосом. Значимыми измерениями распределения размеров, наиболее часто используемыми в данной области, являются D10, D90, D99 или стандартное отклонение или индекс полидисперсности. Величины "D99" означают, что 99% липосом имеют размер, меньший, чем референсный размер, или больший, чем референсный размер. Это особенно пригодно, если, например, важно исключить или верхний, или нижний размер. Например, в некоторых вариантах осуществления желательно обеспечивать то, чтобы не было представлено липосом со средним диаметром более 200 нм.

Специфический пример, в котором присутствует величина D99 178 нм, применяется для иллюстрации. Величина D99 для измерения 178 нм (как видно в таблице 1 примера 2) обеспечивает, что по меньшей мере 99% липосомной совокупности меньше чем 178 нм. Величины D10 и D90 для средних диаметров, также широко используемые, являются величинами, для которых не более чем 10% совокупности меньше минимального референсного размера (т.е. D10), и для D90, где 90% совокупности имеют размер меньше, чем верхний предел референсного размера. Например, как видно в группах 1 и 2, величина D10 составляет 68 нм, так что не более чем 10% совокупности липосом меньше чем 68 нм. Величина D90 демонстрирует, что 90% совокупности имеют размер менее чем 135 или 137 нм для групп 1 и 2, соответственно. Поддержание распределения размеров липосом после лиофилизации и воспроизведения определяется в данном документе как демонстрирующее, что референтная величина выбранных D величин изменяется на не более чем 50%, 25%, 20%, 15%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6% или 5% при воспроизведении по сравнению с величиной перед замораживанием и/или лиофилизацией. Выбранные величины D могут составлять 99, 98, 94 и промежуточные целочисленные значения для 90 или D10.

Одна характеристика лиофилизированных липосом относится к среднему диаметру липосом в композиции. Средний диаметр липосомальной композиции сохраняется при воспроизведении, когда средний диаметр липосом не увеличивается более чем на 50%, 25%, на основе объемной массы 20%, 15%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6% или 5% после лиофилизации и при воспроизведении на основании диаметра перед замораживанием. Сопутствующая величина, такая как 10% увеличение среднего липосомального диаметра вместе с 10% увеличением для референта для D90 (или другая D величина, такая как приведенные выше), является одной из мер для обеспечения того, что распределение размеров частицы (например, липосомальной) не изменилось. Общий характер распределения может также быть оценен предпочтительно на основе объемной массы, как продемонстрировано на фиг.1-4.

Более подробно, композиция липосом содержит диапазон размеров, как правило, следующий кривой Гаусса. Средний диаметр липосом может увеличиться на не более чем приблизительно 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6% или 5% от его исходного размера при воспроизведении после замораживания или лиофилизации и воспроизведения. Например, образец липосом, средний диаметр которых составляет 90 нм, будет считаться устойчивым к эффектам замораживания и/или лиофилизации, если при воспроизведении средний диаметр составляет не более чем на 30% больше, т.е. составляет приблизительно 117 нм. Если размер увеличивается больше, чем приведено, это предполагает, что произошло агрегирование и слияние липосом. Достаточно чувствительная технология измерения может быть применена для измерения изменения в распределении размеров или среднего диаметра так, что изменения менее чем 10% могут быть измерены.

Другим критерием сохранения целостности является удерживание инкапсулированных агентов. В отличие от среднего диаметра распределения размеров и лекарственного соотношения, которые оцениваются относительно предлиофилизационных величин, лекарственное удерживание оценивается относительно общего содержания лекарственного средства как такового после воспроизведения, т.е. на основании общего содержания лекарственного средства в лиофилизированной композиции. Процентное содержание лекарственного средства, инкапсулированного внутри липосом, или процентное содержание лекарственного средства во внешней среде снаружи липосом (% "неинкапсулированный") соотносится с общим количеством лекарственного средства в композиции. В одном варианте осуществления по меньшей мере приблизительно 75% инкапсулированных агентов удерживается в инкапсулированном виде после лиофилизации и при воспроизведении. По меньшей мере приблизительно 85% каждого может удерживаться в инкапсулированном виде и/или по меньшей мере приблизительно 90% или 95%. Это может подобным образом быть измерено посредством количества неинкапсулированного лекарственного средства в окружающей среде, которое не должно составлять больше чем 25%, 20%, 15%, 10% или 5% от исходных инкапсулированный количеств при воспроизведении лиофилизированных липосом.

Соотношения инкапсулированных терапевтических и/или диагностических агентов сохраняются при воспроизведении, если соотношения не варьируются больше чем на 20%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6% или 5% от соотношения в предлиофилизированной композиции самой по себе. Соотношения выражаются в виде молярных соотношений.

В одном варианте осуществления средний диаметр липосом после лиофилизации и при воспроизведении указанных липосом будет увеличен на не более чем 25% по сравнению с указанной величиной, измеренной перед лиофилизацией. В другом варианте осуществления средний диаметр липосом после лиофилизации и при воспроизведении указанных липосом изменяется не более чем на 15% по сравнению с указанной величиной, измеренной перед лиофилизацией. В других вариантах осуществления средний диаметр липосом после лиофилизации и при воспроизведении указанных липосом изменяется не более чем на 10%, 9%, 8%, 7%, 6% или 5% по сравнению с указанной величиной, измеренной перед лиофилизацией.

В некоторых вариантах осуществления процент неинкапсулированного лекарственного средства составляет не более чем 25% от исходно инкапсулированного при воспроизведении указанных липосом. В других вариантах осуществления процент неинкапсулированного лекарственного средства составляет не более чем 15% от исходно инкапсулированного при воспроизведении указанных липосом. В других вариантах осуществления процент неинкапсулированного лекарственного средства составляет не более чем 10% или составляет не более чем 9%, 8%, 7%, 6% или 5% от исходно инкапсулированного при воспроизведении указанных липосом.

Иными словами, в некоторых вариантах осуществления процент удерживаемых инкапсулированных лекарственных средств составляет не менее чем 75% при воспроизведении указанных липосом. В других вариантах осуществления процент каждого инкапсулированного лекарственного средства составляет не менее чем 85% или 90% или 95% при воспроизведении указанных липосом.

Комбинации этих параметров также включены. Например, средний диаметр может увеличиться не более чем на 25%, и процентное содержание инкапсулированного лекарственного средства составляет по меньшей мере 90%, или средний диаметр может увеличиться не более чем на 10%, и процентное содержание инкапсулированного лекарственного средства составляет по меньшей мере 90%.

В некоторых вариантах осуществления распределение размеров липосом изменяется не более чем на 25% после лиофилизации и при воспроизведении указанных липосом по сравнению с предшествующим лиофилизации. В других вариантах осуществления распределение размеров липосом изменяется не более чем на 15%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6% или 5% после лиофилизации и при воспроизведении указанных липосом по сравнению с предшествующим лиофилизации.

Как отмечено выше, предположены различные комбинации этих параметров или критериев для успешности полного лиофилизирования и воспроизведения липосом, например, по меньшей мере 85% инкапсулированных лекарственных средств в сочетании с не более чем 15% увеличения среднего диаметра необязательно в сочетании с не более чем 5% изменением распределения размеров. Каждая из возможных комбинаций этих параметров охватывается объемом изобретения.

Липосомы в гелевой фазе могут быть образованы общепринятыми технологиями, например, способ эфирной инъекции (Deamer, et al., Acad. Sci. (1978) 308:250), способ с поверхностно-активным веществом (Brunner, et al., Biochim. Biophys. Acta (1976) 455:322), способ замораживания-оттаивания (Pick, et al., Arch. Biochim. Biophys. (1981) 212:186), способ испарения в обращенной фазе (Szoka, et al., Biochim. Biophys. Acta. (1980) 601:559-571), способ ультразвуковой обработки (Huang, et al., Biochemistry (1969) 8:344), способ этанольной инъекции (Kremer, et al., Biochemistry (1977) 16:3932), способ экструзии (Hope, et al., Biochim. Biophys. Acta (1985) 812:55-65) и способ с применением Френч-пресса (Barenholz, et al., FEBS Lett. (1979) 99:210).

Такие процессы могут быть применены в комбинации. Малые однослойные везикулы (SUV), в частности, могут быть приготовлены способом ультразвуковой обработки, способом этанольной инъекции и способом с применением Френч-пресса. Большие однослойные везикулы (LUV) могут быть приготовлены способом эфирной инъекции, способом с поверхностно-активным веществом, способом замораживания-оттаивания, способом испарения в обращенной фазе, с применением Френч-пресса или способом экструзии. Предпочтительно, LUV приготовлены в соответствии со способом экструзии.

Лиофилизирование и воспроизведение проводятся при условиях, в которых липосомы находятся в гелевой фазе. Следовательно, температура превращения из геля в жидкость липосом должна быть больше комнатной температуры, т.е. приблизительно 20-30°C, и более предпочтительно быть равной или выше температуры тела. Комнатные температуры могут существенно варьироваться, но важно, чтобы процесс лиофилизирования начинался при условиях, в которых липосомы находятся в гелевом состоянии. В некоторых вариантах осуществления T_c по меньшей мере равна температуре тела (т.е. приблизительно 37°C). В некоторых вариантах осуществления липосомы приготовлены при температуре ниже температуры фазового перехода для того, чтобы сохранять подобное гелевому состояние. Любая пригодная внутренняя среда может быть применена. Как правило, внутренняя среда является водной средой. Внутренняя среда по существу не содержит криопротектор (т.е. менее чем 125 мМ криопротектора). Внутренняя среда может содержать менее чем 100 мМ криопротектора, или менее чем 50 мМ криопротектора, или не содержать криопротектор.

Липосомные составы, которые имеют пригодные величины T_c, могут являться липосомами "с низким содержанием холестерина", т.е. приготовленными при наличии и содержащими количество холестерина, которого недостаточно для значительного изменения характеристик фазового перехода липосомы, т.е., как правило, 20% мол. или менее холестерина. Больше чем 20% мол. холестерина расширяет диапазон температур, при которых фазовый переход происходит, с исчезанием фазового перехода при более высоких уровнях холестерина. Липосома, имеющая низкое содержание холестерина, будет иметь менее чем 20% мол. или менее чем 15% мол. холестерина, или 10% мол. или 5% мол. или менее холестерина, или не будет содержать холестерин. Для таких липосом необязательно требуется по меньшей мере 1% мол. стабилизирующего агента, такого как PG или PI.

В этих способах, где применен криопротектор, криопротектор предпочтительно представлен только во внешней среде состава. Как правило, криопротекторы являются дисахаридами, такими как сахароза, мальтоза, трегалоза и лактоза. Криопротектор может являться дисахаридом, таким как сахароза, имеющим концентрацию, которая составляет приблизительно от 100 мМ до 500 мМ или приблизительно 250-400 мМ или выше 300 мМ. Внешняя среда может содержать приблизительно от 100 мМ до 500 мМ криопротектора, и внутренняя среда содержит менее чем 125 мМ криопротектора, или внешняя среда содержит приблизительно от 250 мМ до 400 мМ криопротектора, и внутренняя среда содержит менее чем 100 мМ криопротектора, или внешняя среда содержит приблизительно от 250 мМ до 400 мМ криопротектора, и внутренняя среда содержит менее чем 50 мМ криопротектора, или внешняя среда содержит приблизительно от 250 мМ до 400 мМ криопротектора, и внутренняя среда не содержит криопротектор. Криопротектор может являться сахаридом, таким как сахароза.

Гелевая фаза липосомальных составов может быть лиофилизированной или высушенной замораживанием с применением любого подходящего протокола. Начальная температура камеры для лиофилизирования предпочтительно ниже температуры стеклования (T_g) раствора, который содержит внешнюю среду, также содержащую липосомы с инкапсулированными лекарственными средствами. Например, липосомы могут быть замороженными при температуре ниже чем приблизительно -5°C, или ниже чем приблизительно -10°C, или ниже, чем приблизительно -20°C, или ниже чем приблизительно -30°C, или ниже чем приблизительно -40°C. В некоторых вариантах осуществления, когда сахароза применяется в качестве раствора криопротектора, начальная температура камеры для лиофилизирования составляет менее чем -32°C, что является T_g раствора сахарозы. "T_g" включает в себя "температуру стеклования" и "температуру перехода в стеклянную фазу", что является приблизительной средней температурой, при которой не замороженный раствор подвергается превращению из мягкого, вязкого геля в твердую и относительно ломкую форму.

Лиофилизированные липосомы могут храниться при или ниже комнатной температуры. В некоторых иллюстративных вариантах осуществления применяются липосомы, которые хранятся при или ниже 5°C. В некоторых других иллюстративных вариантах осуществления применяются липосомы, которые хранятся при 25°C. Лиофилизированный продукт остается стабильным (например, удерживается его относительный размер частиц и сохраняется инкапсулированным лекарственное средство) в течение по меньшей мере приблизительно шести месяцев, или по меньшей мере приблизительно девяти месяцев, или по меньшей мере приблизительно одного года, или по меньшей мере приблизительно от двадцати четырех до тридцати шести месяцев.

Удерживаемые агенты являются терапевтическими или диагностическими агентами, часто - противораковыми агентами. Удивительно то, что липосомальные композиции в гелевой фазе сохраняют содержимое и целостность, даже если агенты различаются по их характеристикам растворимости в воде и неводных растворителях. При применении подхода изобретения агенты, которые отличаются по log коэффициентов распределения (LogP) на вплоть до 1,0, могут являться полностью успешно удерживаемыми. Различия в log коэффициентов распределения 1,5 или 2,0 или 3,0 могут также являться переносимыми. Один из агентов может являться амфипатическим, тогда как другие являются растворимыми в воде, или один может являться гидрофобным, тогда как другие являются растворимыми в воде. Величины LogP основаны на коэффициентах разделения между октанолом и водой, т.е. являются логарифмом основания 10 соотношения количества в октаноле к количеству в воде, когда соединение подвергается фазовому разделению.

Противораковые агенты могут содержать антрациклин (например, даунорубицин, доксорубицин, эпирубицин или идарубицин). Эти агенты являются амфипатическими. Противораковые агенты могут содержать аналог нуклеозида, например цитозина арабинозид, 5-FU или FUDR, которые являются гидрофильными. Другие противораковые агенты содержат камптотецин или производное камптотецина, такое как иринотекан, которые являются амфипатическими. Как антрациклин, так и аналог нуклеозида являются инкапсулированными в некоторых случаях, или как камптотецин или производное камптотецина, так и аналог нуклеозида являются инкапсулированными. Инкапсуляция и/или загрузка агентов в липосомы может быть осуществлена с применением любых пригодных технологий загрузки, включая пассивную и активную загрузки. Важные варианты осуществления содержат описанные в вышеприведенных патенте США 7850990 и патенте США 8022279 комбинации иринотекан:флоксуридин (FUDR) в молярном соотношении 1:1 и даунорубицин:цитарабин (AraC) в молярном соотношении 1:5. Частные составы этих лекарственных средств обозначены CPX-1 и CPX-351, соответственно.

Лекарственные средства включены в вод