Иммуногены для вакцинации против вич

Иммуногены для вакцинации против вич

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Настоящее изобретение относится к новым иммуногенам на основе перекрывающихся пептидов (OLP) и происходящих из них пептидов. Оно также относится к выделенным нуклеиновым кислотам, экспрессирующим эти иммуногены, а также векторам и клеткам, включающим такие нуклеиновые кислоты. Соединения настоящего изобретения применимы в качестве вакцин, особенно для предупреждения и лечения СПИД и заболеваний, вызываемых условно-патогенными организмами.

ПРЕДПОСЫЛКИ СОЗДАНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

ВИЧ инфекция индуцирует сильные и широко направленные, с ограничением по HLA (МНС) класса I T-клеточные реакции, специфические эпитопы и ограничивающие аллели HLA для которых, как было установлено, вовлечены в относительный in vivo контроль. Смотрите Brander C, et al., Current Opinion Immunol. 2006; 18: 1-8. Хотя большая часть противовирусной CTL (ЦТЛ) реакции, по-видимому, с ограничением по HLA-B, относительный вклад вирусных участков-мишеней и ограничивающих молекул HLA в эффективность этих реакций остается неясным. Смотрите Kiepiela P, et al., Nature 2004; 432: 769-775 и Ngumbela K, et al., AIDS Res. Hum. Retroviruses 2008; 24: 72-82.

Кроме того, неясна роль, которую играет многообразие последовательностей ВИЧ в значимости in vivo вирус-специфического T-клеточного иммунитета, поскольку функциональные ограничения вариантов ускользания, частота использования кодона в отдельных положениях белков, гибкость T-клеточного рецептора (TCR) и возможность функциональной авидности и перекрестной реактивности могут все вносить вклад в общую эффективность специфической T-клеточной реакции. Смотрите Brockman M, et al., J. Virol. 2007; 81: 12608-12618 и Yerly D, et al., J. Virol. 2008; 82: 3147-3153. Следует отметить, что T-клеточные реакции на Gag ВИЧ наиболее последовательно сопровождались уменьшением вирусных нагрузок в группах, инфицированных ВИЧ и клада B, и клада C. Смотрите Zuniga R, et al., J. Virol. 2006; 80:3122-3125 и Kiepiela P, et al., Nat. Med. 2007; 13: 46-53.

Однако ни один из этих анализов не оценил роль реакций на более короткие участки белка(ов)-мишеней, которые могут индуцировать особенно эффективные реакции. Кроме того, неясно, обусловлена ли относительная полезность Gag каким-либо другим специфическим свойством этого белка, таким как уровень экспрессии, аминокислотный состав и внутренне большая иммуногенность. Таким образом, вероятно, что могут быть идентифицированы белковые субъединицы вне Gag и внутри этих специфических, коротких, богатых эпитопами участков, которые: i) индуцируют реакции, отмечаемые преимущественно у индивидуумов, контролирующих ВИЧ, и ii) которые могли бы быть выявлены у индивидуумов с различными типами HLA, без ограничения индивидуумами, экпрессирующими аллели, ранее связанные с эффективным вирусным контролем.

Хотя некоторые из предшествующих исследований действительно сдерживали возможную сверхпрезентацию происходящих из Gag эпитопов на «хороших» аллелях HLA класса I, остается опасение, что вакцина против ВИЧ на основе только Gag может в основном приносить пользу тем людям, которые имеют выгодный генотип HLA, и в ней не будет использоваться преимущество потенциально полезных мишеней вне Gag. Смотрите Kiepiela, 2007, выше, и Honeyborne I, et al., J. Virol. 2007; 81: 3667-3672. Кроме того, исследования ускользания от CTL и вирусной приспособленности были почти совершенно ограничены происходящими из Gag эпитопами, презентируемыми в связи с относительно защитными аллелями HLA, такими как HLA-B57 и -B27. Смотрите Schneidewind A, et al., J. Virol. 2007; 81: 12382-12393 и Leslie A, et al., Nat. Med. 2004; 10: 282-289. Таким образом, имеющиеся сведения не могут обеспечить соответствующую информацию о последовательностях иммуногенов, предназначенных для защиты генетически многообразного большинства популяции людей-хозяев.

Кроме того, многие исследования были сосредоточены только на иммунодоминантных мишенях, несмотря на то, что некоторые недавние исследования ВИЧ и ВИО инфекции показывают решающий вклад соподчиненных реакций в in vivo вирусный контроль, среди них мишени, находящиеся вне Gag. Смотрите Frahm N, et al., Nat. Immunol. 2006; 7: 173-178 и Friedrich T, et al., J. Virol. 2007; 81: 3465-3476. В совокупности, современная точка зрения по вопросу, что может создавать протективный клеточный иммунный ответ на ВИЧ, совершенно возможно, является, таким образом, необъективной, смещенной в сторону сосредоточения на иммунодоминантных ответах и на ответах, ограниченных частыми аллелями HLA класса I и аллелями HLA, связанными с лучшим исходом заболевания. По этой причине разработка вакцин против ВИЧ ограничена, отчасти, отсутствуем иммуногенов, способных к индукции широкого иммунного ответа. Настоящее изобретение берется за разработку таких иммуногенов.

КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В первом аспекте настоящее изобретение относится к иммуногенному полипептиду, имеющему аминокислотную последовательность, включающую последовательности SEQ ID NO: 1-16 или варианты указанных SEQ ID NO: 1-16, причем каждый из указанных вариантов имеет длину, составляющую по меньшей мере 8 аминокислот, с условиями, что указанная аминокислотная последовательность не включает какие-либо участки последовательностей, происходящие из генома ВИЧ, длиной, составляющей 8 или более аминокислот, отличные от аминокислотной последовательности в соответствии с любой из SEQ ID NO: 1-16 или их вариантами.

Во втором аспекте настоящее изобретение относится к иммуногенному полипептиду, имеющему аминокислотную последовательность, включающую по меньшей мере одну последовательность, выбираемую из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1-16 или их вариантов, причем указанный вариант имеет длину, составляющую по меньшей мере 8 аминокислот, с условиями, что:

i) аминокислотная последовательность указанного иммуногена не включает какие-либо участки последовательностей, происходящие из генома ВИЧ, длиной, составляющей 8 или более аминокислот, отличные от аминокислотной последовательности в соответствии с любой из SEQ ID NO: 1-16 или ее вариантом или фрагментом, и

ii) когда иммуноген включает только одну последовательность, выбираемую из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1-16, то эту последовательность не выбирают из группы, состоящей из SEQ ID NO: 3, 5, 6 и 16.

В дальнейшем аспекте настоящее изобретение относится к нуклеиновым кислотам, кодирующим иммуногены первого аспекта и второго аспекта, и к экспрессионным кассетам, векторам, вирусам и клеткам, включающим указанные нуклеиновые кислоты.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к вакцине, включающей иммуногенный полипептид в соответствии с любым из пунктов 1-11 формулы изобретения и один или более адъювантов.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к иммуногенному полипептиду, нуклеиновой кислоте, экспрессионной кассете, экспрессионному вектору, вирусу или клетке третьего аспекта, или вакцине на основе композиции для применения в медицине.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к иммуногенному полипептиду, нуклеиновой кислоте, экспрессионной кассете, экспрессионному вектору, вирусу или клетке третьего аспекта, или вакцине на основе композиции для применения для предупреждения или лечения ВИЧ инфекции или заболевания, связанного с ВИЧ инфекцией.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к набору, включающему иммуноген первого и/или второго аспектов, нуклеиновую кислоту, экспрессионную кассету, экспрессионный вектор, вирус или клетку третьего аспекта, или композицию четвертого аспекта.

ДЕПОНИРОВАНИЕ МИКРООРГАНИЗМОВ

Плазмидая ДНК 298H GMCSF-HIVACAT была депонирована 13 января 2012, под идентификационным номером DSM 25555 в DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen, Inhoffenstrabe 7 B, D-38124 Braunschweig, Федеративная Республика Германии.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Фиг. 1. Схематическое представление гена, включенного в экспрессионную плазмиду. Точки определяют инициирующий кодон и стоп-кодон.

Фиг. 2. Клеточные иммунные реакции, исследованные в объединенных спленоцитах с помощью проточного цитометрического анализа. Представлены частота всех специфических в отношении Gag, Pol и Nef-Tat-Vif ответов в виде продукции интерферона-γ среди групп в (А) и распределение CD4 и CD8 реакций в (В).

Фиг. 3. Ответы на Gag, Pol, NTV и последовательность Т-клеточного иммуногена HIVACAT, измеренные с помощью анализа ELISpot для интерферона-γ в мышиных спленоцитах. Отдельных мышей иммунизировали плазмидами, кодирующими полноразмерные полипептиды Gag, Pol и Nef-Tat-Vif. Представлен вклад ответов, специфических в отношении участков, включенных в Т-клеточный иммуноген HIVACAT, в общий Gag-Pol-NTV-специфический ответ в виде продукции интерферона-γ.

Фиг. 4. Сравнение широты в (А) и величины в (В) ответов в виде продукции интерферона-γ, специфических в отношении Т-клеточного иммуногена HIVACAT, у иммунизированных мышей. Субъектов подвергали воздействию плазмид, кодирующих или полноразмерные белки, или минимальную Т-клеточную последовательность.

Фиг. 5. Равновесие ответов в виде продукции интерферона против Gag, Pol, Vif или Nef в случае мышей, иммунизированных 20 мкг плазмид, кодирующих весь Gag, Pol плюс полипептид Nef-Tat-Vif и Т-клеточный иммуноген HIVACAT. Доминирование Gag-специфических ответов представлено на панели (А) в случае мышей, иммунизированных полноразмерными белками, тогда как более сбалансированный спектр, наблюдается на панели (В) в случае мышей, иммунизированных Т-клеточным иммуногеном HIVACAT.

Фиг. 6. Антитела, связывающиеся с p24, p37 и p55, детектированные с помощью Вестерн-блоттинга, используя экстракты клеток HEK 293, трансфецированных 1 мг векторов для экспрессии gag и gag-pol, (демонстрирующие p55 gag и процессированные субъединицы p24, p37 и p55 gag), разделенные в 12% ПААГ с SDS, и исследуя мембраны с использованием a) сывороток ВИЧ-инфицированного пациента, b) объединенных сывороток мышей, иммунизированных высокими дозами иммуногена, и c) объединенных сывороток мышей, иммунизированных низкими дозами иммуногена (все в разведении 1:100).

Фиг. 7. А) Титры в конечной точке специфических в отношении gag-p24 связывающих антител от мышей, подвергнутых воздействию. Определение было выполнено с помощью ELISA, исходя из индивидуальных последовательно 4-кратно разводимых образцов объединенных сывороток. В) ELISA для р55 gag собственной разработки, используя рекомбинантный белок pr55 gag ВИЧ-1IIIB (каталожный № 3276, NIH Reagent Program, Bethesda, MD, США). Определение было выполнено в сыворотках отдельных мышей в разведении 1:100.

Фиг. 8. А) Схематическое представление иммунизаций мышей. Группы из шести мышей C57BL/6 использовались для сравнения иммуногенности различных гетерологичных комбинаций (2xДНК примирований в сравнение с 3xДНК примированиями с последующим 1xMVA бустингом), используя или 100 мкг пДНК-HIVACAT, или 10⁶ pfu MVA-HIVACAT, вводимых с помощью внутримышечной инъекции, В) Сравнение широты и величины ответов в виде продукции IFNγ, специфических в отношении Т-клеточного иммуногена HIVACAT, у отдельных иммунизированных мышей, С) Распределение специфических в отношении Gag, Pol, Vif и Nef ответов у отдельных иммунизированных мышей, D) Распределение между 8 белковыми субъединицами, включенными в Т-клеточный иммуноген HIVACAT (р17 Gag, р24 Gag, p2p7p1p6 Gag, Pol-протеаза, Pol-RT, Pol-интеграза, Vif и Nef) в различных группах иммунизации представлено.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ НАСТОЯЩЕГО ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение раскрывает несколько иммуногенных соединений, эффективных в индукции сильного иммунного ответа против ВИЧ у широкого ряда субъектов. В частности, ВИЧ-специфические CD4⁺ и CD8⁺ T-клеточные реакции на ключевые, кодируемые ВИЧ эпитопы были получены с помощью этих соединений.

1. Определения общих терминов и выражений

Используемый в настоящем изобретении термин «адъювант» относится к иммунологическому средству, которое модифицирует эффект иммуногена, при обладании, если вообще обладает, малочисленными непосредственными эффектами при введении самого по себе. Его часто включают в вакцины для усиления иммунного ответа у реципиента на привносимый антиген, при ограничении до минимума вводимого чужеродного материала. Адъюванты добавляют к вакцинам для стимуляции ответа иммунной системы на антиген-мишень, но они сами не придают иммунитет. Неограничивающие примеры применимых адъювантов включают минеральные соли, полинуклеотиды, полиаргинины, ISCOM, сапонины, монофосфорил липид A, имиквимод, ингибиторы CCR-5, токсины, полифосфазены, цитокины, белки-иммунорегуляторы, иммуностимулирующие слитые белки, костимулирующие молекулы и их комбинации. Минеральные соли включают, но без ограничения, AIK(SO₄)₂, AlNa(SO₄)₂, AlNH(SO₄)₂, диоксид кремния, квасцы, Al(OH)₃, Ca₃(PO₄)₂, каолин или уголь. Применимые иммуностимулирующие полинуклеотиды включают, но без ограничения, содержащие CpG олигонуклеотиды с иммуностимулирующими комплексами (ISCOM) или без них, содержащие CpG олигонуклеотиды с полиарнинином или без него, поли-IC или поли-AU кислоты. Токсины включают холерный токсин. Сапонины включают, но без ограничения, QS21, QS17 или QS7. Примером применимого иммуностимулирующего слитого белка является белок IL-2, слитый с Fc-фрагментом иммуноглобулина. Применимые иммунорегулирующие молекулы включают, но без ограничения, CD40L и лиганд CD1a. Цитокины, применимые в качестве адъювантов, включают, но без ограничения, IL-1, IL-2, IL-4, GMCSF, IL-12, IL-15, IGF-1, IFN-α, IFN-β и интерферон гамма. Также их примерами являются мурамилдипептиды, N-ацетилмурамил-L-треонил-D-изоглютамин (thr-DMP), N-ацетилнорнурамил-L-аланил-D-изоглютамин (CGP 11687, также называемый nor-MDP), N-ацетилмурамил-L-аланил-D-изоглютаминил-L-аланин-2-(1'2'-дипалмитоил-sn-глицеро-3-гидроксифосфорилокси)-этиламин (CGP 19835A, также называемый MTP-PE), RIBI (MPL+TDM+CWS) в 2% эмульсии сквален/TWEEN® 80, липополисахариды и их различные производные, в том числе липид A, полный адъювант Фрейнда (FCA), неполный адъювант Фрейнда, адъювант 65 Merck, полинуклеотиды (например, поли-IC и поли-AU кислоты), парафин D из Mycobacterium tuberculosis, вещества, обнаруживаемые в Corynebacterium parvum, Bordetella pertussis и членах рода Brucella, Titermax, Quil A, ALUN, производные липида A, производные холерного токсина, производные HSP, производные LPS, синтетические матрицы для пептидов или GMDP, Монтанид ISA-51 и QS-21, содержащие CpG олигонуклеотиды, поли-I:C, и GMCSF. Смотрите Osol A., Ed., Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Co., Easton, PA, US, 1980, pp. 1324-1341), Hunter R, патент США с № 5554372 и Jager E, Knuth A, WO1997028816. Также могут использоваться комбинации адъювантов.

Используемый в настоящем изобретении термин «СПИД» относится к симптоматической фазе ВИЧ инфекции и включает как синдром приобретенного иммунного дефицита (общеизвестный как СПИД), так и «ARC» или связанный со СПИД комплекс. Смотрите Adler M, et al., Brit. Med. J. 1987; 294: 1145-1147. Иммунологические и клинические проявления СПИД хорошо известны в данной области техники и включают, например, оппортунистические инфекции и раки, являющиеся следствием иммунного дефицита.

Используемый в настоящем изобретении термин «аминокислотный линкер» относится к аминокислотной последовательности, отличной от таковой, обнаруживаемой в конкретном положении во встречающемся в природе белке, и его, как правило, разрабатывают так, чтобы он был гибким или включался в структуру, такую как α-спираль, между двумя белковыми фрагментами. Линкер также называют спейсером. Линкер типично является неантигенным и может быть по существу любой длины (например, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 или более аминокислот). Линкером может также быть положение или последовательность, в котором клеточная система процессирования антигена может инициировать деградацию иммуногенного полипептида без разрушения сильных T-клеточных эпитопов).

Используемый в настоящем изобретении термин «сайт мутации резистентности к антиретровирусному агенту» относится к сайту, который после мутирования, придает резистентность к антиретровирусному агенту. Такие сайты можно идентифицировать посредством добычи известных баз данных, таких как Stanford University HIV Drug Resistance Database, в которых можно отыскать, например, последовательности и лечения против вирусов с конкретными мутациями или данные, касающиеся лекарственной чувствительности для изолятов с выбранными мутациями. Анализы для проверки лекарственной чувствительности ВИЧ хорошо известны в данной области техники. Смотрите Dong J, US 20040106136 и Shafer R, Assay for Antiretroviral Resistance, HIV InSite Knowledge Base Chapter (http://hivinsite.ucsf.edu/InSite?page=kb-02-02-03, January 2012). Уже известные сайты мутаций резистентности к антиретровирусным агентам в ВИЧ регулярно публикуются Всемирной организацией здравоохранения или Международным обществом по противовирусному исследованию - США (например, Johnson V, et al., ISA-USA Topics Antiviral Med. 2011; 19(4): 153-164.

Используемое в настоящем изобретении выражение «клеточный иммунный ответ» описывает иммунный ответ против чужеродного антигена(ов), который опосредуется T-клетками и их продуктами секреции.

Используемый в настоящем изобретении термин «последовательность центра древа» или «COT» относится к последовательности, от которой среднее эволюционное расстояние до каждого верхнего конца диаграммы филогенетического древа родственных вариантных последовательностей было минимизировано. Смотрите Nickle D, et al., Science 2003; 299, 1515-1517.

Используемый в настоящем изобретении термин «с оптимизацией кодонов» относится к изменению кодонов в молекулах нуклеиновых кислот для воспроизведения использования типичных кодонов организма-хозяина без изменения кодируемого ДНК полипептида, для увеличения экспрессии. Ранее сообщалось о множестве способов и программных средств для оптимизации кодонов. Смотрите Narum D, et al., Infect. Immun. 2001; 69(12): 7250-7253, Outchkourov N, et al., Protein Expr. Purif. 2002; 24(l): 18-24, Feng L, et al., Biochemistry 2000; 39(50): 15399-15409, и Humphreys D, et al., Protein Expr. Purif. 2000; 20(2): 252-2.

Используемый в настоящем изобретении термин «включающий» или «включает» отражает также «состоящий из» в соответствии с общепринятой патентной практикой.

Используемое в настоящем изобретении выражение «заболевание, связанное с ВИЧ инфекцией», включает состояние, когда у субъекта уже развился СПИД, но также включает состояние, когда субъект, инфицированный ВИЧ, еще не продемонстрировал какой-либо признак или симптом заболевания. Таким образом, вакцина настоящего изобретения, при введении субъекту, у которого нет клинических признаков инфекции, может обладать превентивной активностью, поскольку она может предотвратить возникновение заболевания. Иммуногенные композиции способны к предотвращению или замедлению инфекции и уничтожению здоровых CD4+ T-клеток у такого субъекта. Она также относится к предотвращению и замедлению возникновения симптомов синдрома приобретенного иммунного дефицита, таких как крайне низкое количество CD4+ T-клеток и повторяющиеся инфекции, вызванные условно-патогенными микроорганизмами, такими как Mycobacteria spp., Pneumocystis carinii и Pneumocystis cryptococcus. Благотворные или желаемые клинические результаты включают, но без ограничения, увеличение абсолютного числа необученных CD4+ T-клеток (диапазон 10-3520), увеличение процента CD4+ T-клеток к общему количеству циркулирующих иммуноцитов (диапазон 1-50%) и/или увеличение количества CD4+ T-клеток в виде процента от нормального количества CD4+ T-клеток у неинфицированного субъекта (диапазон 1-161%).

Используемые в настоящем изобретении термины «вариант» или «фрагмент» относится к полипептиду, происходящему из любой из SEQ ID NO: 1-16 в результате делеции одной или более концевых аминокислот на N-конце или на C-конце отдельной SEQ ID NO. Варианты или фрагменты предпочтительно имеют длину, составляющую по меньшей мере 8 аминокислот или вплоть до 10%, вплоть до 20%, вплоть до 30%, вплоть до 40%, вплоть до 50%, вплоть до 60%, вплоть до 70%, вплоть до 80%, вплоть до 90% или вплоть до 99% от соответствующей им SEQ ID NO.

Используемый в настоящем изобретении термин «геном ВИЧ» относится к последовательности РНК длиной, составляющей приблизительно 8749 нуклеотидов, защищенной капсидом ВИЧ и кодирующей гены gag, pol, env, tat, rev, vif, nef, vpr, vpu, vpx и необязательно tev. Геномная последовательность ВИЧ лежит в основе высокой вариабельности, по этой причине геном ВИЧ, на который ссылаются в настоящем изобретении, не ограничивается какой-либо конкретной последовательностью. Предпочтительными последовательностями являются последовательности типов и подтипов ВИЧ, перечисленных в настоящем описании.

Используемый в настоящем изобретении термин «вирус иммунодефицита человека» или «ВИЧ» относится, в общем, к вирусам иммунодефицита человека и включают ВИЧ типа 1 («HIV-1»), ВИЧ типа 2 («ВИЧ-2») и другие вирусы ВИЧ, включающие, например, ВИЧ-1, ВИЧ-2, возникающие и другие подтипы ВИЧ и варианты ВИЧ, такие как широко распространенные или географически изолированные варианты и вирус иммунодефицита обезьян («ВИО»). Например, анцестральная вирусная последовательность гена может быть определена для генов env и gag ВИЧ-1, такого как ВИЧ-1 подтипов A, B, C, D, E, F, G, H, J и K, и межподтиповых рекомбинантов, таких как AG, AGI, и для групп M, N, O или для вирусов ВИЧ-2 или ВИЧ-2 подтипов A или B. ВИЧ-1, ВИЧ-2 и ВИО включают, но без ограничения, экстраклеточные вирусные частицы и формы вирусов, связанные с соответствующими им инфицированными клетками.

Используемый в настоящем изобретении термин «гуморальный иммунный ответ» описывает иммунный ответ против чужеродного антигена(ов), который опосредуется антителами, продуцируемыми B-клетками.

Используемый в настоящем изобретении термин «иммуногенная композиция» относится к композиции, которая вызывает иммунную реакцию, которая продуцирует антитела или клеточно-опосредованные иммунные ответы против конкретного иммуногена.

Используемый в настоящем изобретении термин «иммуногенный полипептид» или «иммуноген» относится к полипептидному антигену, который способен к индукции адаптивного иммунного ответа (т.е. гуморального или клеточно-опосредованного иммунного ответа), в случае его введения самого по себе или вместе с адъювантом.

Используемый в настоящем изобретении термин «набор» относится к комбинации изделий, которые облегчают процесс, способ или применение. Эти наборы предоставляют материалы, необходимые для осуществления применения, описанного в настоящем изобретении.

Используемый в настоящем изобретении термин «функционально связанная», как предполагается, означает, что представляющая интерес нуклеотидная последовательность связана с регуляторной последовательностью(ями) таким образом, который создает возможность для экспрессии нуклеотидной последовательности (например, в системе in vitro транскрипции/трансляции или в клетке-хозяине, когда вектор введен в клетку-хозяина). Смотрите Auer H, Nature Biotechnol. 2006; 24: 41-43.

Используемый в настоящем изобретении термин «пептидная метка» или «метка» относится к пептиду или аминокислотной последовательности, который может использоваться для выделения или очистки указанного иммуногена. Таким образом, указанная метка способна к связыванию с одним или более лигандов, например, одним или более лигандов аффинной матрицы, такой как хроматографический носитель или гранула с высоким сродством. Иллюстративные, неограничивающие, примеры меток, применимых для выделения или очистки белка, включают Arg-метку, FLAG-метку, His-метку или Strep-метку; эпитоп, который может распознаваться антителом, такой как c-myc-метка (распознаваемая антителом против c-myc), SBP-метку, S-метку, кальмодулин-связывающий пептид, связывающийся с целлюлозой пептид, хитин-связывающий пептид, глютатион-S-трансферазу-метку, связывающийся с мальтозой белок, NusA, TrxA, DsbA или Avi-метку; аминокислотную последовательность, такую как AHGHRP (SEQ ID NO: 96), PIHDHDHPHLVIHS (SEQ ID NO: 97) или GMTCXXC (SEQ ID NO: 98); или β-галактозидазу. Смотрите Terpe K, et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 2003; 60: 523-525.

Используемые в настоящем изобретении термины «фармацевтически приемлемый носитель», «фармацевтически приемлемый разбавитель», или «фармацевтически приемлемый наполнитель», или «фармацевтически приемлемая среда» относятся к нетоксичному твердому, полутвердому или жидкому наполнителю, разбавителю, герметизирующему материалу или вспомогательному средству в препарате любого стандартного типа. Фармацевтически приемлемый носитель, по существу, нетоксичен для реципиентов в используемых дозах и концентрациях и совместим с другими ингредиентами препарата. Например, носитель для препарата, содержащего полипептиды, не будет обычно включать окислительные средства и другие соединения, которые, как известно, являются разрушительными для полипептидов. Подходящие носители включают, но без ограничения, воду, декстрозу, глицерин, солевой раствор, этанол и их комбинации. Носитель может содержать дополнительные агенты, такие как смачивающие реагенты или эмульгаторы, pH-буферные агенты или адъюванты, которые увеличивают эффективность препарата.

Используемые в настоящем изобретении термины «предупреждать» и «предупреждение» относятся к ингибированию начала или уменьшению частоты заболевания у животного. Предупреждение может быть полным (например, абсолютное отсутствие патологических клеток у субъекта). Предупреждение может также быть частичным, так что, например, возникновений патологических клеток у субъекта меньше, чем могло бы происходить без настоящего изобретения. Предупреждение также относится к уменьшенной подверженности клиническому состоянию.

Термин «сигнальный пептид для секреции» относится к очень гидрофобной аминокислотной последовательности (например, предпочтительно длиной 15-60 аминокислот) белков, которые должны пересечь мембрану, чтобы достичь расположения в клетке, где они функционируют. При связывании с распознающими сигнальный пептид частицами, эти последовательности направляют комплексы белок в стадии возникновения-рибосомы к мембране, в которую белок вставляется во время трансляции. Сигнальные пептиды предписывают поступательное внедрение белка в различные мембраны (например, эндоплазматический ретикулум, митохондрии, хлоропласт, пероксисому). Лидерные сигнальные последовательности в немембранных белках в конечном счете удаляются с помощью специфических пептидаз. Некоторые используемые сигнальные пептиды включают хемокин MCP-3, для стимуляции секреции и притяжения антигенпрезентирующих клеток; происходящий из катенина (CATE) пептид для увеличения протеасомной деградации; и лизосомальный связанный белок, LAMP1 для направленной доставки к компартменту MHC II. Смотрите Rosati M, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2009; 106: 15831-15836.

Используемое в настоящем изобретении выражение «последовательное введение» означает, что введение не является одновременным, а выполняют первое введение, за которым следует одно или более последующих введений.

Используемое в настоящем изобретении выражение «по существу сохраняются иммунологические способности иммуногенного полипептида» означает, что вариант проявляет по меньшей мере 10%, по меньшей мере 20%, по меньшей мере 30%, по меньшей мере 40%, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%), по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95% или 100% от способности иммуногенного полипептида к индукции адаптивного иммунного ответа (т.е. гуморального или клеточно-опосредованного иммунного ответа), в случае его введения самого по себе или с адъювантами.

Используемый в настоящем изобретении термин «лечить» или «лечение» относится к введению иммуногенной композиции настоящего изобретения или лекарственного средства, содержащего ее, для контролирования прогрессирования заболевания до или после появления клинических признаков. Контролирование прогрессирования заболевания, как подразумевается, означает благотворные или желательные клинические результаты, которые включают, но без ограничения, уменьшение симптомов, уменьшение продолжительности заболевания, стабилизацию патологических состояний (в особенности во избежание дополнительного ухудшения), отсрочку прогрессирования заболевания, улучшение патологического состояния и ремиссию (как частичную, так и полную). Контролирование прогрессирования заболевания также включает удлинение продолжительности существования, по сравнению с ожидаемой продолжительностью существования, если лечение не применялось.

Используемый в настоящем изобретении термин «вакцина» относится к веществу или композиции, которое устанавливает или увеличивает иммунитет к конкретному заболеванию посредством индукции адаптивного иммунного ответа, в том числе иммунологической памяти. Вакцина типично содержит агент, который имеет сходство с вызывающим заболевание микроорганизмом или его частью (например, полипептидом). Вакцины могут быть профилактическими или терапевтическими.

Используемый в настоящем изобретении термин «вариант» относится ко всем тем аминокислотным последовательностям, которые происходят из любой из SEQ ID NO: 1-16 при помощи модификаций или мутаций, в том числе замен, предпочтительно консервативных замен, вставок или неконцевых делеций, затрагивающих одну или более аминокислот, и в которых, по существу, сохраняются иммуногенные способности иммуногенного полипептида.

Используемый в настоящем изобретении термин «вектор» относится к молекуле нуклеиновой кислоты, линейной или замкнутой в круг, которая включает сегмент в соответствии с представляющей интерес нуклеиновой кислотой, функционально связанный с дополнительными сегментами, которые обеспечивают ее автономную репликацию в клетке-хозяине, представляющей интерес, или в соответствии с представляющей интерес экспрессионной кассетой.

2. Иммуногенные полипептиды настоящего изобретения

В первом аспекте настоящее изобретение относится к иммуногенному полипептиду, имеющему аминокислотную последовательность, включающую последовательности SEQ ID NO: 1-16 или варианты указанных SEQ ID NO: 1-16, причем каждый из указанных вариантов имеет длину, составляющую по меньшей мере 8 аминокислот, с условиями, что указанная аминокислотная последовательность не включает какие-либо участки последовательностей, происходящие из генома ВИЧ, длиной, составляющей 8 или более аминокислот, отличные от аминокислотной последовательности в соответствии с любой из SEQ ID NO: 1-16 или их вариантами.

В конкретном варианте осуществления иммуногенный полипептид первого аспекта имеет аминокислотную последовательность, включающую SEQ ID NO: 49.

Во втором аспекте настоящее изобретение относится к иммуногенному полипептиду, имеющему аминокислотную последовательность, включающую по меньшей мере одну последовательность, выбираемую из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1-16 или их вариантов, причем указанный вариант имеет длину, составляющую по меньшей мере 8 аминокислот, с условиями, что:

i) указанная аминокислотная последовательность не включает какие-либо участки последовательностей, происходящие из генома ВИЧ, длиной, составляющей 8 или более аминокислот, отличные от аминокислотной последовательности в соответствии с любой из SEQ ID NO: 1-16 или ее варианта или фрагмента, и

ii) когда иммуноген включает только одну последовательность, выбираемую из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1-16, то эту последовательность не выбирают из группы, состоящей из SEQ ID NO: 3, 5, 6 и 16.

Предпочтительно вариант в соответствии с первым и вторым аспектами является эквивалентным родственной ему последовательности и происходит из отличного штамма ВИЧ или представляет собой искусственную последовательность ВИЧ. Эквивалентный в этой связи означает несходный по одному или более аминокислотных остатков, но соответствующий той же последовательности (например, определяемой положением в геноме или схожестью последовательности). Другими словами, в предпочтительном варианте осуществления вариантом является «встречающийся в природе вариант», который относится к последовательностям нуклеиновых кислот, происходящим из генома циркулирующего в настоящее время или когда-то вируса ВИЧ, и можно идентифицировать, исходя из имеющихся баз данных (например, баз данных, касающихся последовательностей, GenBank и Los Alamos). Последовательность циркулирующих вирусов можно также определить с помощью методик молекулой биологии. Смотрите Brown T, "Gene Cloning" (Chapman & Hall, London, GB, 1995); Watson R, et al., "Recombinant DNA", 2nd Ed. (Scientific American Books, New York, NY, US, 1992); Sambrook J, et al., "Molecular Cloning. A Laboratory Manual" (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, US, 1989). Предпочтительно, вариант любой из SEQ ID NO: 1-16 идентичен по аминокислотной последовательности на по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% соответствующей ему последовательности (т.е. SEQ ID NO: 1-16). Примерами алгоритмов, подходящих для определения процента идентичности последовательностей и схожести последовательностей являются алгоритмы BLAST и BLAST 2.0. Смотрите Altschul S, et al., Nuc. Acids Res. 1977; 25: 3389-3402 и Altschul S, et al., J. Mol. Biol. 1990; 215: 403-410. Программы BLAST и BLAST 2.0 могут использоваться для определения процента идентичности последовательностей нуклеиновых кислот и белков настоящего изобретения. Программное обеспечение для выполнения анализов BLAST общедоступно через Национальный центр биотехнологической информации. Смотрите http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi, January 2012.

Варианты могут также содержать один или более модифицированных аминокислотных остатков (например, остатков, которые модифицированы посредством присоединения групп заместителей), или одну или более неприродных аминокислот, таких как бета-аминокислоты.

Способы определения силы клеточной реакции известны в данной области техники. Может использоваться любой способ, подходящий для оценки стимуляции T-клеток в ответ на Аг. Описанные ниже процедуры являются несколькими примерами подходящих способов:

1) Иммуноферментный спот-анализ (ELISpot): неадгезивные клетки из лунок для предварительного культивирования переносят в планшет, который покрыт желаемыми иммобилизованными антителами против цитокинов (Ат, например, против IFN, IL-10, IL-2, IL-4). Обнаружение осуществляют с помощью биотинилированных вторых Ат и стандартных колометрических или люминесцентных способов детектирования, таких как стрептавидин-щелочная фосфатаза и NBT-BCIP, и подчитывают споты. Считывания ELISpot затем представляют как спот-образующие клетки (SFC)/10⁶ введенных клеток.

2) Анализ цитокинов в супернатанте: цитокины, выброшенные в супернатант культуры, измеряют с помощью различных методов, таких как иммуноферментные твердофазные анализы (ELISA), мультиплексный иммуноанализ на основе микросфер BD Cytometric Bead Array, анализ Biorad Bio-Plex и другие.

3) Тетрамеры HLA класса I: с помощью этой процедуры детектируют Аг-реагирующие T-клетки, распознающие специфические пептидные эпитопы, используя любые имеющиеся в продаже реагенты (например, MHC Class I Dexamers, Immudex, Copenhagen, DK) или созданные своими силами реагенты (например, Novak E, et al., J. Clin. Invest. 1999; 104: R63-R67).

4) Тетрамеры HLA класса II: с помощью этой процедуры детектируют Аг-реагирующие T-клетки, распознающие специфические пептидные эпитопы, используя или имеющиеся в продаже реагенты (например, MHC Class II Ultimers™, Prolmmune Ltd, Oxford, GB) созданные своими силами реагенты (например, Novak, 1991, выше).

5) Увеличение экспрессии маркеров активации (например, CD69, CD25, CD137): с помощью этой процедуры Aг-специфические T-клеточные реакции детектируют в соответствии с дифференциальной экспрессией в них маркеров активации, выставляемых на мембране после распознавания Аг.

6) Анализы иммобилизации цитокинов: эта система является эффективной альтернативой ELISpot для визуализации Аг-специфических T-клеток в соответствии с продукцией цитокинов (Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch Gladbach, DE). Кроме того, они делают возможной непосредственную сортировку и клонирование представляющих интерес T-клеток.

7) Анализ CD154: эта процедура ограничивается детектированием Аг-специфических CD4+ T-клеток. Смотрите Chattopadhyay P, et al., Nat. Med. 2005; 11: 1113-11117 и Frentsch M, et al., Nat. Med. 2005; 11: 1118-1124.

8) Анализ CD107: эта процедура позволяет визуализировать Аг-специфические CD8+ T-клетки с цитотоксическим потенциалом. Смотрите Betts M, et al., J. Immunol. Methods 2003; 281: 65-78.

9) Анализ распределения красителя CFSE: с помощью этой процедуры детектируются Аг-специфические T-клетки (CD4+ и CD8+) в соответствии с их пролиферацией после распознавания Аг. Смотрите Mannering S, et al., J. Immunol. Methods 2003; 283: 173-183.

Способы определения силы гуморальной реакции на вариант известны в данной области техники. Может использоваться любой способ, подходящий для оценки стимуляции T-клеток в ответ на Аг. Примеры подходящих способов включают, но без ограничения, детектирование или определение относительного количества антитела, которое специфически распознает антигенный или иммуногенный агент, в сыворотке субъекта, который был подвергнут лечению иммуногенным полипептидом или вариантом, относительно количества антитела у не подвергнутого лечению субъекта. Титры антител