Многоканальный конфокальный микроскоп

Многоканальный конфокальный микроскоп

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Многоканальный конфокальный микроскоп (МКМ) относится к области приборостроения, связанной с производством оптико-электронной аппаратуры для анализа, исследования и визуализации различных характеристик материалов и биологических объектов.

Использование в микроскопах конфокальной схемы предложил Марвин Минский в 1961 году (заявка US 3013467 A, 1961-12-19). Конфокальный микроскоп имеет повышенное по сравнению с обычным микроскопом разрешение, как латеральное (поперечное), так и по глубине. Это достигается путем оптической фильтрации фонового света, идущего из глубины образца, с помощью дополнительной (конфокальной) диафрагмы. Следующим шагом в развитии конфокальной микроскопии стало создание сканирующих конфокальных микроскопов. Например, известны схемы, предложенные в патентах RU 2018891 C1, RU 2140661 C1 и заявке RU 2007131539 A. Основной недостаток таких схем - низкая скорость сканирования исследуемых объектов, поскольку сканирование осуществляется единственным световым лучом (луч лазера), а прием сигналов, соответственно, одним фотодатчиком.

Отмеченный недостаток устраняется в предлагаемых в последнее время многоканальных конфокальных микроскопах, в которых свет источника осветительного блока микроскопа преобразуется в совокупность (матрицу) независимых лучей, число которых определяет количество одновременно сканируемых точек исследуемого объекта, при этом для одновременного приема информации от множества сканирующих лучей применяются многоканальная детектирующая схема на основе регистрирующей матрицы фотоприемников.

Наиболее близким к предлагаемому решению является устройство, в отношении которого ранее было получено решение о выдаче патента на изобретение «Многоканальный конфокальный микроскоп (варианты)» (патент № RU 2574863 C1, второй вариант). В этом варианте предложена схема лазерного многоканального конфокального микроскопа, который способен быстро строить конфокальное изображение объекта за счет своей многоканальности. Микроскоп содержит осветительный, регистрирующий и нормировочный блоки, в осветительном блоке микроскопа коллимированный свет лазерного источника расщепляется в матрицу лучей, направляемых на исследуемый объект через последовательно расположенные оптические элементы: светоделительный кубик, матрицу конфокальных диафрагм, модуль сканирования на основе двух преломляющих плоскопараллельных пластин с использованием гальваносканеров, формирующую и фокусирующую оптику, отраженные от объекта лучи возвращаются в обратном направлении до светоделительного кубика, проходят через него в регистрирующий блок, содержащий модуль сканирования, аналогичный модулю сканирования, установленному в осветительном канале, формирующую и фокусирующую оптику и регистрирующую матрицу фотодетекторов, а настройка лучей по интенсивности выполняется в нормировочном блоке.

В процессе исследовательских работ, проводимых с использованием реализованного по вышеуказанному патенту микроскопа, выявились некоторые эксплуатационные трудности, главная из которых заключается в обеспечении необходимой точной фазовой синхронизации работы двух сканирующих устройств, в составе которых, кроме оптических элементов, присутствуют элементы электромеханики (сканирующие устройства на основе гальванометрических сканеров). В предлагаемой схеме микроскопа указанные трудности устранены. Это достигнуто за счет построения оптической схемы микроскопа, в которой измерительные (подаваемые на исследуемый объект) лучи и отраженные от объекта лучи после их прохождения ряда оптических элементов проходят через один модуль сканирования. Этим достигается синхронизация работы осветительного и регистрирующего каналов, необходимая для построения конфокального изображения.

Другой недостаток связан с неоптимальным соотношением сигнала к шуму, связанным с тем, что при существовании небольших остаточных отражений от элементов схемы осветительного блока, расположенных на оптическом пути после светоделительного кубика, и от материала исследуемого образца часть лазерного света от этих отражений может попадать в регистрирующий блок через светоделительный кубик, что приводит к паразитной фоновой засветке на матрице фотодетекторов.

В предлагаемом устройстве этот недостаток также устранен. Технический результат подавления паразитного отраженного света от оптических элементов осветительного блока и повышения соотношения сигнал/шум в регистрирующем блоке достигается за счет использования лазера с линейно поляризованным излучением и введения в осветительный блок дополнительного поляризационного элемента: фазосдвигающей двулучепреломляющей пластинки, расположенной на входной апертуре объектива, а на входе регистрирующего блока установлен поляризационный фильтр, настроенный на подавление только линейно поляризованного света осветителя. В то же время данный поляризационный фильтр пропускает линейно поляризованный сигнальный свет от исследуемого объекта, так как плоскость его линейной поляризации ортогонально повернута по отношению к поляризации осветителя.

Схема предлагаемого многоканального конфокального микроскопа иллюстрируется графическим материалом:

фиг. 1. Структурная схема предлагаемого устройства,

фиг. 2. Фотоснимок экспериментального макета (номера элементов соответствуют обозначениям на структурной схеме),

фиг. 3. Фотоснимок отсканированного изображения, полученного с помощью экспериментального макета.

Многоканальный конфокальный микроскоп, показанный на схеме фиг. 1, состоит из трех блоков (20, 21, 22), выделенных пунктирными линиями. Осветительный блок 20 содержит: лазер 1; расширитель луча 2; дифракционный оптический элемент (ДОЭ) 3; светоделительный кубик 4; матрицу конфокальных диафрагм 5; светоделительную пластинку 6; модуль сканирования 23, состоящий из преломляющих плоскопараллельных пластин 7 с оптически просветленными гранями, установленных на ортогонально расположенных относительно друг друга осях роторов электродвигателей или гальвано-сканеров и формирующей оптики (тубусной линзы) 8; фазосдвигающую четвертьволновую пластинку 9; фокусирующий объектив 10; исследуемый объект 11. Регистрирующий блок 21 содержит: поляризационный фильтр 12; оптический элемент, оборачивающий изображение по двум ортогональным осям (призма с крышей) 13; проекционный объектив 14; поворотное зеркало 15; преломляющие плоскопараллельные пластины 7; проекционный объектив 16; регистрирующую матрицу фотодетекторов 17. Нормировочный блок 22 состоит из проекционного объектива 18 и регистрирующей матрицы фотодетекторов 19.

Данная схема обеспечивает одновременную синхронизацию развертки лучей осветительного блока на объекте 11 и лучей регистрирующего блока на матрице фотодетекторов 17. В своих центральных положениях по углу поворота относительно осей электродвигателей рабочие поверхности указанных плоскопараллельных пластин 7 устанавливаются под углом к оптической оси осветительного блока 20 таким образом, чтобы угол падения света матрицы лучей после элемента 6 был равен углу падения света в регистрирующем блоке после элемента 15 для уменьшения влияния различия углов падения на коэффициент пропускания просветляющих покрытий на поверхностях пластинок, для идентичности развертки лучей на объекте и на матрице фотодетекторов, а также для уменьшения остаточных паразитных отражений от поверхностей пластинок.

Поясним принцип работы предлагаемой схемы МКМ. Источником света 1 является лазер, генерирующий линейно-поляризованное излучение. Для согласования с ДОЭ 3 лазерный луч проходит через расширитель 2 (коллиматорные линзы). В ДОЭ 3 излучение разделяется на массив (матрицу) независимых лучей числом M*N, которые затем попадают на светоделительный кубик 4, отражаются от его светоделительной грани и далее проходят с целью пространственной фильтрации паразитных дифракционных порядков через отверстия матрицы конфокальных диафрагм 5 такой же размерности M×N, матрица диафрагм почернена для уменьшения паразитного отражения. После матрицы 5 лучи проходят через светоделительную пластинку 6, которая ответвляет часть излучения в нормировочный блок 22. Пройдя пластинку, лучи попадают на модуль сканирования 23, состоящий из двух преломляющих плоскопараллельных пластин 7, установленных на ортогонально расположенных относительно друг друга осях роторов электродвигателей или гальвано-сканеров и формирующей оптики 8. Данные пластинки в зависимости от угла поворота вокруг осей роторов смещают оси падающих лучей латерально по двум ортогональным координатным осям перпендикулярно оптической оси в соответствии с заданной программой. После пластинок лучи попадают на тубусную линзу, после которой распространяются под углом к оптической оси, пропорциональным величине смещения лучей пластинками. Далее матрица лучей проходит через фазовую (фазосдвигающую) пластинку 9, которая сдвигает по фазе оси ортогональных поляризаций света на четверть периода (90°). Прошедшие сквозь нее линейно-поляризованные лучи становятся циркулярно поляризованными и, пройдя через объектив 10, фокусируются на объекте 11. Отраженные лучи возвращаются обратным путем через матрицу конфокальных диафрагм 5, проходят светоделительный кубик и попадают в регистрирующий блок 21. При прохождении лучей через фазовую пластинку 9 (повторно) их плоскость поляризации становится повернутой на 90° относительно изначальной. В регистрирующем блоке поляризационный фильтр настроен на подавление паразитного отраженного света от элементов 4, 5 и пропускание линейно-поляризованного сигнального светового потока. Прошедшая через поляризационный фильтр матрица лучей поворачивается на 90° по направлению распространения, а их изображение оборачивается в двух плоскостях на 180° с помощью оборачивающего оптического элемента 13 (призма с крышей). При этом после прохождения проекционного объектива 14, поворотного зеркала 15, направление построения изображения на матрице фотодетекторов совпадает с направлением движения луча на объекте. Далее лучи проходят через преломляющие плоскопараллельные пластины 7 модуля сканирования 23 под некоторым углом к перпендикуляру к поверхности пластин 7 (15-20°) и затем, пройдя через проекционный объектив 16, который строит и масштабирует изображение прямоугольной матрицы лучей, попадают на регистрирующую матрицу фотодетекторов 17. Масштаб всего изображения зависит от положения проекционного объектива 16 относительно создаваемого объективом 14 промежуточного изображения, которое расположено между поворотным зеркалом 15 и сканерными пластинками 7. Функция матрицы конфокальных диафрагм 5 заключается в пространственном ограничении прохождения света таким образом, чтобы через нее проходил в основном только тот поток света, который исходит из областей объекта, находящихся в фокальной области фокусировки каждого осветительного луча (конфокальная схема). Это приводит к повышению контраста изображения. Также элемент 5 одновременно отсекает паразитные порядки падающего на объект света от ДОЭ.

Для построения изображения производится сканирование с помощью последовательного углового перемещения сканерными преломляющими плоскопараллельными пластинами 7 матрицы сфокусированных лучей по зоне объекта, ограниченной расстоянием между сфокусированными пятнами. Построение изображения в данной схеме возможно только в параллельном режиме, при котором происходит перемещение изображения пятен лучей по чувствительным элементам регистрирующей матрицы фотодетекторов, и полное конфокальное изображение объекта формируется за время одного кадра регистрирующей матрицы фотодетекторов 17. Нормировочный блок 22 используется для нормировки и калибровки освещающих объект лучей в режиме реального времени. Он состоит из проекционного объектива 18 и регистрирующей матрицы фотодетекторов 19. Здесь могут фиксироваться относительные значения интенсивностей света каждого луча.

Экспериментальный образец многоканального конфокального микроскопа создан в Институте автоматики и электрометрии СО РАН. На фиг. 2 приведен фотоснимок макета МКМ и показан путь распространения света. Оптические характеристики экспериментального образца:

- Диаметр луча по уровню e^-2 профиля интенсивности от максимального значения в плоскости ДОЭ - 5.4 мм.

- Количество лазерных лучей после ДОЭ (элемент 3) - 25×25.

- Расстояние фокусировки ДОЭ - 150 мм.

- Диаметр отверстий матрицы диафрагм (элемент 5) - 50 мкм.

- Расстояние между отверстиями в матрице диафрагм - 300 мкм.

- Полный размер матрицы диафрагм - 7.2×7.2 мм

- Фокусное расстояние тубусной линзы (элемент 8) - f_t=165 мм.

- Апертура тубусной линзы (элемент 8) - 29 мм.

- Фокусное расстояние объектива (элемент 10) - f_ob=4.5 мм.

- Апертура объектива - 5.5 мм.

- Коэффициент поперечного (латерального) увеличения системы - M=f_t/f_ob=36.6.

- Размер матрицы лучей на объекте (расстояние между центрами крайних точек по одной из поперечных осей) - 196.3 мкм.

- Расстояние между соседними пятнами лучей в плоскости объекта - 8.1 мкм.

- Фокусное расстояние линзы (элемент 14) - 100 мм.

Эксперименты подтвердили работоспособность предлагаемого многоканального конфокального микроскопа. Она демонстрируется на Фиг. 3. Здесь изображено сканирование поверхности непрозрачной пленки хрома с отверстием 40 мкм, нанесенной на стеклянную подложку. Область развертки (сканирования) одного луча показана штрихованной рамкой. Также видны трещины в пленке, имеющие характерный размер порядка 1 мкм. Видно, что в области развертки одного луча вмещается восемь проходов луча по вертикальной оси (число проходов можно регулировать). Между соседними областями существует небольшой темный промежуток, размер которого может быть отрегулирован за счет амплитуды поворота пластинок сканерного модуля, а также перемещения проекционного объектива 14. Правильность развертки изображения подтверждается визуально наблюдаемой сшивкой наклонных борозд и трещин в пленке, проходящих через несколько областей. Данное изображение было построено за один кадр матрицы фотодетекторов. Таким образом, при использовании высокоскоростных камер можно получать лазерное сканирующее конфокальное изображение со скоростью в сотни кадров в секунду.

Многоканальный конфокальный микроскоп, содержащий осветительный, регистрирующий и нормировочный блоки, в осветительном блоке коллимированный свет лазерного источника расщепляется в матрицу лучей, направляемых через последовательно расположенные оптические элементы: светоделительный кубик, матрицу конфокальных диафрагм, и при последовательном отклонении или сканировании по двум ортогональным координатам модулем сканирования на основе двух преломляющих плоскопараллельных пластин, установленных на ортогонально ориентированных друг относительно друга осях роторов электродвигателей или гальвано-сканеров и формирующей оптики, попадают через фокусирующую оптику на исследуемый объект, отраженные от объекта лучи возвращаются в обратном направлении до светоделительного кубика, проходят через него в регистрирующий блок, содержащий объектив и регистрирующую матрицу фотодетекторов, а настройка лучей по интенсивности выполняется в нормировочном блоке, отличающийся тем, что в осветительном блоке упомянутая матрица световых лучей первоначально формируется дифракционным оптическим элементом из лазерного луча с линейной поляризацией, а после матрицы диафрагм проходит через светоделительную пластинку, которая часть света отклоняет в нормировочный блок, и далее после модуля сканирования проходит через фазовую четвертьволновую пластинку, а отраженный от исследуемого объекта оптический сигнал возвращается в обратном направлении, также проходит через фазовую четвертьволновую пластинку, при этом отраженный свет после светоделительного кубика попадает в регистрирующий блок и проходит через поляризационный фильтр, оптический элемент, оборачивающий изображение по двум ортогональным осям, объектив, поворотное зеркало, плоскопараллельные пластины модуля сканирования и проекционный объектив на регистрирующую матрицу фотодетекторов.