Антиген, ассоциированный с ревматоидным артритом

Антиген, ассоциированный с ревматоидным артритом

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Настоящее изобретение относится к детекции и лечению ревматоидного артрита (РА). Изобретение включает применение связывающего элемента, который связывает изоформу ED-A фибронектина, в частности, связывающего элемента, который связывает домен ED-A фибронектина.

Ревматоидный артрит (РА) является хроническим воспалительным и деструктивным заболеванием суставов, которое поражает 0,5-1% населения в индустриальном мире и обычно приводит к существенной потере трудоспособности и последующему ухудшению качества жизни.

Считается, что ангиогенез в синовиальной мембране пациентов с РА является важной ранней стадией в патогенезе и в сохранении заболевания (Taylor, 2002). Как и в неопластическом заболевании, ангиогенез питает распространение синовиальной мембраны (Walsh et al., 1998). Вероятно, рост кровеносных сосудов способствует пролиферации воспалительного синовиального паннуса, а также вхождению воспалительных лейкоцитов в синовиальную ткань. Синовиальная мембрана пациентов с РА содержала увеличенные количества фактора роста фибробластов (FGF-2) и фактора роста эндотелия сосудов (VEGF) (Koch, 2003). Сывороточные концентрации VEGF коррелируют с активностью заболевания и уменьшаются, когда синовит успешно подавляется терапией (Taylor, 2002).

Фибронектин (FN) является гликопротеином и широко экспрессируется в различных нормальных тканях и жидкостях тела. Он является компонентом внеклеточного матрикса (ECM) и играет роль во многих биологических процессах, включающих клеточную адгезию, клеточную миграцию, гемостаз, тромбоз, заживление ран, дифференцировку ткани и злокачественную трансформацию.

Различные изоформы FN генерируются альтернативным сплайсингом трех областей (ED-A, ED-B, IIICS) первичного транскрипта пре-мРНК FN, процессом, который модулируется цитокинами и внеклеточным рН (Balza 1988; Carnemolla 1989; Borsi 1990; Borsi 1995). Фибронектин содержит два глобулярных экстрадомена типа-III, которые подвергаются альтернативному сплайсингу: ED-A и ED-B (ffrench-Constant 1995, Hynes 1990, Kaspar et al. 2006). ED-A фибронектина мыши и фибронектина человека являются на 96,7% идентичными (только 3 аминокислоты отличаются между этими двумя состоящими из 90 аминокислот последовательностями, смотрите фиг.2).

Имеются сообщения об экспрессии ED-А фибронектина в опухолевых клетках и в солидных опухолях на уровне мРНК в раке молочной железы (Jacobs et al. 2002, Matsumoto et al. 1999) и раке печени (Oyama et al. 1989, Tavian et al. 1994) и на уровне выделенного белка в фибросаркоме, рабдосаркоме и меланоме (Borsi et al. 1987).

На иммуногистохимическом уровне, присутствие ED-A детектировали во внеклеточном матриксе (ECM) одонтогенных опухолей (Heikinheimo et al. 1991) и гепатоцеллюлярной карциномы (Koukoulis et al. 1995). В отличие от этого, ED-A детектировали в строме злокачественных неоплазм молочной железы (Koukoulis et al. 1993) и в кровеносных сосудах и базальных мембранах хорошо дифференцированного рака почки (Lohi et al. 1995). Однако, в менее дифференцированном раке почки (Lohi et al. 1995) и папиллокарциноме щитовидной железы (Scarpino et al. 1999) ED-A детектировали в кровеносных сосудах, базальных мембранах и строме опухоли. Сообщалось также о присутствии ED-A в сосудистой сети глиом (Borsi et al. 1998). Таким образом, распространение экспрессии ED-A, о котором сообщалось для различных типов опухолей, является высоко вариабельным.

Направленная доставка на основе антител к местам ангиогенеза является привлекательной терапевтической стратегией для лечения рака, но она является в значительной степени неисследованной в отношении хронических воспалительных заболеваний. Авторы настоящего изобретения демонстрировали ранее, что домен ED-B фибронектина, маркер ангиогенеза, экспрессируется в псориатических повреждениях у пациентов и в мышиной модели псориаза, а также в артритных лапках в коллаген-индуцированной модели ревматоидного артрита мыши. С использованием как радиоактивных, так и флуоресцентных способов, было обнаружено, что моноклональное антитело L19, специфическое в отношении EDB, селективно локализуется в местах воспаления in vivo после внутривенного введения. Эти результаты позволяют предположить терапевтический потенциал в отношении селективной доставки на основе L19 биологически активных соединений в местам воспаления (Trachsel, 2007; PCT/EP2007/004044).

Перед гибридизацией in situ было показано, что в образцах артрита человека может присутствовать домен фибронектина, отличный от ED-B, а также ED-A (Berndt et al., 1998; Kriegsmann et al., 2004).

В настоящем документе авторы настоящего изобретения показывают, что анти-EDA-антитело, такое как описанное здесь антитело F8, способно давать более сильное распределение окрашивания на артритных пробах человека в сравнении с анти-EDB-антителом L19 и анти-тенасцин-C-антителами F16 и G11.

Кроме того, было обнаружено, что при использовании как радиоактивных, так и флуоресцентных способов моноклональное антитело человека F8, специфическое в отношении ED-A, селективно локализуется в местах воспаления in vivo после внутривенного введения.

Таким образом, ED-A фибронектина может быть использован в качестве сосудистого маркера ревматоидного артрита.

Связывающие молекулы, такие как молекулы антител, которые связывают A-FN и/или ED-A фибронектина, представляют новые агенты, которые могут быть использованы для приготовления лекарственного средства для лечения ревматоидного артрита (РА).

Настоящее изобретение обеспечивает применение связывающего элемента, например, молекулы антитела, которая связывает изоформу Экстра-Домена-А (ED-A) фибронектина (A-FN), для приготовления лекарственного средства для лечения ревматоидного артрита. Настоящее изобретение обеспечивает также применение связывающего элемента, например, молекулы антитела, которая связывает ED-A фибронектина, для приготовления лекарственного средства для лечения ревматоидного артрита.

Настоящее изобретение дополнительно обеспечивает применение связывающего элемента, например, молекулы антитела, которая связывает изоформу ED-A фибронектина, для доставки к местам ревматоидного артрита молекулы, конъюгированной с этим связывающим элементом. Настоящее изобретение обеспечивает также применение связывающего элемента, например, молекулы антитела, которая связывает ED-A фибронектина, для доставки к местам ревматоидного артрита молекулы, конъюгированной с этим связывающим элементом. Этот связывающий элемент может быть использован для приготовления лекарственного средства для доставки такой молекулы.

Настоящее изобретение обеспечивает применение связывающего элемента, например, молекулы антитела, которая связывает изоформу ED-A фибронектина, для производства диагностического продукта для применения в диагностике ревматоидного артрита. Настоящее изобретение обеспечивает также применение связывающего элемента, например, молекулы антитела, которая связывает ED-A фибронектина, для производства диагностического продукта для применения в диагностике ревматоидного артрита.

Настоящее изобретение обеспечивает дополнительно способ детекции или диагностики ревматоидного артрита у человека или животного, предусматривающий:

(a) введение этому человеку или животному связывающего элемента, например, молекулы антитела, которая связывает ED-A фибронектина, и

(b) определение присутствия или отсутствия этого связывающего элемента в местах ревматоидного артрита тела человека или животного;

где локализация связывающего элемента в местах ревматоидного артрита указывает на наличие ревматоидного артрита.

Настоящее изобретение обеспечивает способ лечения ревматоидного артрита у индивидуума, предусматривающий введение индивидууму терапевтически эффективного количества лекарственного средства, содержащего связывающий элемент, например, молекулу антитела, которая связывает изоформу ED-A фибронектина. Настоящее изобретение обеспечивает также способ лечения ревматоидного артрита у индивидуума, предусматривающий введение индивидууму терапевтически эффективного количества лекарственного средства, содержащего связывающий элемент, например, молекулу антитела, которая связывает ED-A фибронектина.

Настоящее изобретение обеспечивает композицию, содержащую связывающий элемент, например, молекулу антитела, которая связывает изоформу ED-A фибронектина, для применения в способе лечения ревматоидного артрита у индивидуума, предусматривающем введение индивидууму терапевтически эффективного количества лекарственного средства, содержащего связывающий элемент, например, молекулу антитела, которая связывает изоформу ED-A фибронектина. Настоящее изобретение обеспечивает также композицию, содержащую связывающий элемент, например, молекулу антитела, которая связывает ED-A фибронектина, для применения в способе лечения ревматоидного артрита у индивидуума, предусматривающем введение индивидууму терапевтически эффективного количества лекарственного средства, содержащего связывающий элемент, например, молекулу антитела, которая связывает ED-A фибронектина.

Настоящее изобретение обеспечивает способ доставки молекулы к новообразованной сосудистой сети участков ревматоидного артрита у человека или животного, предусматривающий введение человеку или животному связывающего элемента, например, молекулы антитела, которая связывает изоформу ED-A фибронектина, где связывающий элемент конъюгирован с этой молекулой. Настоящее изобретение обеспечивает также способ доставки молекулы к новообразованной сосудистой сети участков ревматоидного артрита у человека или животного, предусматривающий введение человеку или животному связывающего элемента, например, молекулы антитела, которая связывает ED-A фибронектина, где связывающий элемент конъюгирован с этой молекулой.

Связывающим элементом для применения в настоящем изобретении может быть антитело, которое связывает изоформу ED-A фибронектина и/или ED-A фибронектина, содержащее один или несколько определяющих комплементарность областей (CDR) антитела H1, B2, C5, D5, E5, C8, F8, F1, B7, E8 или G9 или их вариантов. Предпочтительно, связывающим элементом для применения в настоящем изобретении является антитело, которое связывает изоформу ED-A фибронектина и/или ED-A фибронектина, содержащее один или несколько определяющих комплементарность областей (CDR) антитела B2, C5, D5, C8, F8, B7 или G9 или их вариантов. Наиболее предпочтительно, связывающим элементом для применения в настоящем изобретении является антитело, которое связывает изоформу ED-A фибронектина и/или ED-A фибронектина, содержащее один или несколько определяющих комплементарность областей (CDR) антитела F8 или их вариантов.

Связывающий элемент для применения в настоящем изобретении может содержать набор CDR H и/или L антитела H1, B2, C5, D5, E5, C8, F8, F1, B7, E8 или G9 или набор CDR H и/или L антитела H1, B2, C5, D5, E5, C8, F8, F1, B7, E8 или G9 с десятью или менее, например, одной, двумя, тремя, четырьмя или пятью аминокислотными заменами в указанном наборе CDR H и/или L. Предпочтительно, связывающий элемент для применения в настоящем изобретении содержит набор CDR H и/или L антитела B2, C5, D5, C8, F8, B7 или G9 с десятью или менее, например, одной, двумя, тремя, четырьмя или пятью аминокислотными заменами в указанном наборе CDR H и/или L. Предпочтительно, связывающий элемент для применения в настоящем изобретении содержит набор CDR H и/или L антитела F8 с десятью или менее, например, одной, двумя, тремя, четырьмя или пятью аминокислотными заменами в указанном наборе CDR H и/или L.

Замены могут быть потенциально произведены в любом остатке в этих наборах CDR и могут находиться в CDR1, CDR2 и/или CDR3.

Например, связывающий элемент для применения в настоящем изобретении может содержать один или несколько CDR, описанных здесь, например, CDR3, и необязательно также CDR1 и CDR2, для образования набора CDR.

Связывающий элемент для применения в настоящем изобретении может также содержать молекулу антитела, например, молекулу антитела человека. Связывающий элемент обычно содержит домен VH и/или VL антитела. Домены VH связывающих элементов также обеспечены для применения в настоящем изобретении. В каждом из этих доменов VH и VL находятся определяющие комплементарность области ("CDR") и каркасные области ("FR"). Домен VH содержит набор HCDR, а домен VL содержит набор LCDR. Молекула антитела может содержать домен VH антитела, содержащий CDR1, CDR2 и CDR3 и каркас VH. Она может альтернативно или также содержать домен VL антитела, содержащий CDR1, CDR2 и CDR3 и каркас VL. Здесь описаны домены VH и VL и CDR антител H1, B2, C5, D5, E5, C8, F8, F1, B7, E8 и G9. Все последовательности VH и VL, последовательности CDR, наборы CDR и наборы HCDR и наборы LCDR, описанные здесь, представляют варианты связывающего элемента для применения в настоящем изобретении. В настоящем документе, "набор CDR" содержит CDR1, CDR2 и CDR3. Так, набор HCDR относится к HCDR1, HCDR2 и HCDR3, а набор LCDR относится к LCDR1, LCDR2 и LCDR3. Если нет другого указания, "набор CDR" включает HCDR и LCDR.

Связывающий элемент для применения в настоящем изобретении может содержать домен VH антитела, содержащий определяющие комплементарность области HCDR1, HCDR2 и HCDR3 и каркас, где HCDR1 является SEQ ID NO:3, 23, 33, 43, 53, 63, 73, 83, 93, 103 или 113, и где необязательно HCDR2 является SEQ ID NO:4 и/или HCDR3 является SEQ ID NO:5. Предпочтительно, HCDR1 является SEQ ID NO:23, 33, 43, 53, 73, 83 или 103. Наиболее предпочтительно, HCDR1 является SEQ ID NO:83.

Обычно, домен VH спарен с доменом VL для обеспечения антигенсвязывающего сайта антитела, хотя, как обсуждается дополнительно ниже, домен VH или VL, один, может быть использован для связывания антигена. Таким образом, связывающий элемент для применения в настоящем изобретении может дополнительно содержать домен VL антитела, содержащий определяющие комплементарность области LCDR1, LCDR2 и LCDR3 и каркас, где LCDR1 является SEQ ID NO:6, 26, 36, 46, 56, 66, 76, 86, 96, 106 или 116 и где, необязательно, LCDR2 является SEQ ID NO:7 и/или LCDR3 является SEQ ID NO:8. Предпочтительно, LCDR1 является SEQ ID NO:26, 36, 46, 56, 76, 86 или 106. Наиболее предпочтительно, LCDR1 является SEQ ID NO:86.

Связывающий элемент для применения в настоящем изобретении может быть выделенной молекулой антитела для ED-A фибронектина, содержащей домен VH и домен VL, где домен VH содержит каркас и набор определяющих комплементарность областей HCDR1, HCDR2 и HCDR3 и где домен VL содержит определяющие комплементарность области LCDR1, LCDR2 и LCDR3 и каркас, и где

HCDR1 имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:3, 23, 33, 43, 53, 63, 73, 83, 93, 103 или 113,

HCDR2 имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:4,

HCDR3 имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:5,

LCDR1 имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:6, 26, 36, 46, 56, 66, 76, 86, 96, 106 или 116;

LCDR2 имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:7; и

LCDR3 имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:8.

Один или несколько CDR или набор CDR антитела могут быть трансплантированы в каркас (например, каркас человека) для обеспечения молекулы антитела для применения в настоящем изобретении. Каркасные области могут содержать последовательности сегментов генов зародышевой линии человека. Таким образом, этот каркас может быть включен в клетки зародышевой линии, посредством чего один или несколько остатков в этом каркасе изменяются для соответствия остаткам в эквивалентном положении в наиболее сходном каркасе зародышевой линии человека. Связывающий элемент для применения в настоящем изобретении может быть выделенной молекулой антитела, имеющей домен VH, содержащий набор HCDR в каркасе зародышевой линии человека, например, DP47. Обычно, связывающий элемент имеет также домен VL, содержащий набор LCDR, например, в каркасе зародышевой линии человека. Этим каркасом зародышевой линии человека домена VL может быть DPK22.

Домен VH для применения в настоящем изобретении может иметь аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1, 21, 31, 41, 51, 61, 71, 81, 91, 101 или 111. Предпочтительно, домен VH для применения в настоящем изобретении имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:21, 31, 41, 51, 71, 81 или 101. Наиболее предпочтительно, домен VH для применения в настоящем изобретении имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:81. Домен VL для применения в настоящем изобретении может иметь аминокислотную последовательность SEQ ID NO:2, 22, 32, 42, 52, 62, 72, 82, 92, 102 или 112. Предпочтительно, домен VL для применения в настоящем изобретении имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:22, 32, 42, 52, 72, 82 или 102. Наиболее предпочтительно, домен VL для применения в настоящем изобретении имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:82.

Связывающий элемент для применения в настоящем изобретении может быть одноцепочечным Fv или содержать одноцепочечный Fv (scFv), содержащий домен VH и домен VL, соединенные пептидным линкером. Квалифицированный в данной области специалист может выбрать подходящие длину и последовательность линкера, например, длину по меньшей мере 5 или 10 аминокислот и до длины приблизительно 15, 20 или 25 аминокислот. Этот линкер может иметь аминокислотную последовательность GSSGG (SEQ ID NO:28). scFv может состоять из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:9 или содержать аминокислотную последовательность SEQ ID NO:9.

Одноцепочечный Fv (scFv) может содержаться в мини-иммуноглобулине или малом иммунопротеине (SIP), например, как описано в (Li et al., 1997). SIP может содержать молекулу scFv, слитую с доменом CH4 секреторной изоформы IgE-S2 антитела IgE человека (ε_S2-CH4; Batista et al., 1996) с образованием молекулы антитела в виде гомодимерного мини-иммуноглобулина.

Альтернативно, связывающий элемент для применения в настоящем изобретении может содержать антигенсвязывающий сайт в молекуле не-антитела, обычно обеспечиваемый одним или несколькими CDR, например, набором CDR, в белковом каркасе, не являющемся антителом. Связывающие элементы, включающие молекулы не-антитела и молекулы антитела, описаны более подробно в настоящем документе.

Связывающий элемент для применения в настоящем изобретении, может быть конъюгирован с молекулой, которая имеет биоцидную, цитотоксическую, иммуносупрессивную или противовоспалительную активность. Интерлейкин-10 является предпочтительной молекулой для конъюгации со связывающим элементом в соответствии с настоящим изобретением. Кроме того, связывающий элемент для применения в настоящем изобретении может быть конъюгирован с радиоактивным изотопом, детектируемой меткой или фотосенсибилизатором.

Эти и другие аспекты настоящего изобретения описаны более подробно ниже.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ФИГУР

Фиг.1 показывает результаты иммуногистохимии на артритных пробах человека с использованием антител, направленных на маркеры ангиогенеза. Более темное окрашивание указывает сильную экспрессию этого антигена, визуализированную белыми стрелками. F8 является молекулой антитела, которое связывает ED-A, описанный здесь, L19 является молекулой антитела, которое связывает ED-B (например, Pini et al. 1998), F16 и G11 являются молекулами, которые связывают домены А1 и С Тенасцина-С, соответственно (WO2006/050834).

Фиг.2 показывает результаты анализа иммунофлуоресценции на артритных пробах человека с использованием молекулы антитела F8, направленного против домена ED-A фибронектина. Белое окрашивание указывает сильную экспрессию этого антигена.

Фиг.3 показывает выравнивание между А: ED-A человека (верхняя последовательность) и B: ED-A мыши (нижняя последовательность). Звездочки указывают положения аминокислот, в которых аминокислоты ED-A человека и ED-A мыши являются идентичными.

Фиг.4А показывает нуклеотидную последовательность тяжелой цепи (VH) анти-ED-A-антитела Н1 (SEQ ID NO:12). Нуклеотидная последовательность CDR1 тяжелой цепи анти-ED-A-антитела Н1 подчеркнута. Нуклеотидная последовательность CDR2 тяжелой цепи анти-ED-A-антитела H1 показана курсивом и подчеркнута. Нуклеотидная последовательность CDR3 тяжелой цепи анти-ED-A-антитела H1 показана жирным шрифтом и подчеркнута.

Фиг.4В показывает нуклеотидную последовательность линкерной последовательности анти-ED-A-антитела H1 (SEQ ID NO:14).

Фиг.4С показывает нуклеотидную последовательность легкой цепи (VL) анти-ED-A-антитела H1 (SEQ ID NO:13). Нуклеотидная последовательность CDR1 легкой цепи анти-ED-A-антитела Н1 подчеркнута. Нуклеотидная последовательность CDR2 легкой цепи анти-ED-A-антитела H1 показана курсивом и подчеркнута. Нуклеотидная последовательность CDR3 легкой цепи анти-ED-A-антитела H1 показана жирным шрифтом и подчеркнута.

Фиг.5А показывает аминокислотную последовательность тяжелой цепи (VH) анти-ED-A-антитела Н1 (SEQ ID NO:1). Аминокислотная последовательность CDR1 тяжелой цепи (SEQ ID NO:3) анти-ED-A-антитела Н1 подчеркнута. Аминокислотная последовательность CDR2 тяжелой цепи (SEQ ID NO:4) анти-ED-A-антитела H1 показана курсивом и подчеркнута. Аминокислотная последовательность CDR3 тяжелой цепи анти-ED-A-антитела H1 показана жирным шрифтом и подчеркнута.

Фиг.5В показывает аминокислотную последовательность линкерной последовательности анти-ED-A-антитела H1 (SEQ ID NO:11).

Фиг.5С показывает аминокислотную последовательность легкой цепи (VL) анти-ED-A-антитела H1 (SEQ ID NO:2). Аминокислотная последовательность CDR1 легкой цепи (SEQ ID NO:6) анти-ED-A-антитела Н1 подчеркнута. Аминокислотная последовательность CDR2 легкой цепи (SEQ ID NO:7) анти-ED-A-антитела H1 показана курсивом и подчеркнута. Нуклеотидная последовательность CDR3 легкой цепи (SEQ ID NO:8) анти-ED-A-антитела H1 показана жирным шрифтом и подчеркнута.

Фиг.6 показывает последовательность конструкции нуклеиновой кислоты, включающей кодирующую последовательность для F8-IL10. Эта структура является HINDIII-секреторная последовательность-F8-(14aa-линкер)-линкер (SSSSG)₃-IL10-Стоп-NotI, показанной следующим образом: сайт рестрикции HINDIII является подчеркнутым, последовательность, кодирующая сигнал секреции, показана курсивом, VH-кодирующая последовательность F8 показана жирным шрифтом после последовательности сигнала секреции, последовательность, кодирующая линкер из 14 аминокислот, показана строчными буквами, VL-кодирующая последовательность F8 показана жирным шрифтом после линкерной последовательности из 14 аминокислот, линкерная последовательность (SSSSG)₃, которая следует после кодирующей последовательности F8, подчеркнута и показана курсивом, последовательность, кодирующая IL-10, подчеркнута двойной линией; затем следует стоп-кодон, показанный строчными буквами, с последующим сайтом рестрикции NotI, который является подчеркнутым.

Фиг.7 показывает аминокислотную последовательность конъюгата антитело scFv (F8)-IL-10, включающего линкеры, имеющего структуру: VH-линкер-VL-линкер-IL-10. Домены VH и VL показаны жирным шрифтом, линкер scFv показан строчными буквами, линкер между scFv и IL-10 показан строчными буквами и курсивом, последовательность IL-10 подчеркнута.

Фиг.8 иллюстрирует клонирование, экспрессию и очистку F8-IL10 и HyHel10-IL10:

Фиг.8а показывает схематическое представление вектора pcDNA3.1, содержащего элементы слитых белков F8-IL10. Часть IL10 человека слита с С-концом фрагмента антитела scFv линкером из 15 аминокислот (SSSSG)₃. Для секреции рекомбинантных белков необходима последовательность секреции на N-конце.

Фиг.8b показывает результаты анализа электрофорезом в ДСН-ПААГ очищенных слитых белков: Дорожка 1, маркер молекулярной массы; дорожки 2 и 3, F8-IL10 при невосстанавливающих и восстанавливающих условиях. Ожидается, что мономерный белок имеет молекулярную массу 46 кДа.

Фиг.8c показывает профиль вытеснительной хроматографии очищенного F8-IL10 (Супердекс 200). Пик элюции при объеме удерживания 13 мл соответствует нековалентной гомодимерной форме F8-IL10, меньший пик при объеме удерживания 14 мл соответствует мономерной фракции.

Фиг.8d показывает результаты анализа активности F8-IL10. Активность F8-IL10 сравнивали с активностью рекомбинантного IL10 человека на клетках МС/9.

ТЕРМИНОЛОГИЯ

Фибронектин

Фибронектин является антигеном, подверженным альтернативному сплайсингу, и известен ряд альтернативных изоформ фибронектина, как описано в настоящем документе. Экстра Домен-А (EDA или ED-A) известен также как ED, повтор А экстра типа III (EIIIA) или EDI. Последовательность ED-A человека была опубликована Kornblihtt et al. (1984), Nucleic Acids Res. 12, 5853-5868 и Paolella et al. (1988), Nucleic Acids Res. 16, 3545-3557. Последовательность ED-A человека доступна также в базе данных SwissProt в виде аминокислот 1631-1720 (фибронектин типа-III 12; экстра домен 2) аминокислотной последовательности, депонированной под номером доступа P02751. Последовательность ED-A мыши доступна из базы данных SwissProt в виде аминокислот 1721-1810 (фибронектин типа-III 13; экстра домен 2) аминокислотной последовательности, депонированной под номером доступа P11276.

Изоформа ED-A фибронектина (A-FN) содержит Экстра Домен-A (ED-A). Последовательность A-FN человека может быть расшифрована из соответствующей последовательности-предшественника фибронектина человека, которая доступна из базы данных SwissProt под номером доступа P02751. Последовательность A-FN мыши может быть расшифрована из соответствующей последовательности-предшественника фибронектина человека, которая доступна из базы данных SwissProt под номером доступа P11276. A-FN может быть изоформой ED-A фибронектина человека. ED-A может быть Экстра Доменом-А фибронектина человека.

ED-A является содержащей 90 аминокислот аминокислотной последовательностью, которая встраивается в фибронектин (FN) альтернативным сплайсингом и расположена между доменом 11 и 12 FN (Borsi et al., 1987, J. Cell Biol., 104, 595-600). ED-A в основном отсутствует в плазматической форме FN, но имеется в изобилии во время эмбриогенеза, при ремоделировании ткани, фиброзе, трансплантации сердца и росте солидных опухолей.

Альтернативный сплайсинг

Альтернативным сплайсингом называют наличие отличающегося характера сплайсинга первичного РНК-транскрипта ДНК с получением отличающихся мРНК. После вырезания интронов, отбор может определить, какие экзоны сплайсируются вместе с образованием этой мРНК. Альтернативный сплайсинг приводит к получению различных изоформ, содержащих различные экзоны и/или различные количества экзонов. Например, одна изоформа может содержать дополнительную аминокислотную последовательность, соответствующую одному или нескольким экзонам, которые могут содержать один или несколько доменов.

Связывающий элемент

Этот термин обозначает один элемент пары молекул, которые связываются друг с другом. Элементы пары связывания могут быть природно полученными или полностью или частично синтетически полученными. Один элемент пары молекул имеет площадь на его поверхности, или впадину, которая связывается с конкретной пространственной и полярной организацией или комплементарна конкретной пространственной и полярной организации другого элемента пары молекул. Примерами типов пар связывания являются пары антиген-антитело, биотин-авидин, гормон-рецептор гормона, рецептор-лиганд, фермент-субстрат. Настоящее изобретение относится к реакциям типа антиген-антитело.

Связывающий элемент обычно содержит молекулу, имеющую антигенсвязывающий сайт. Например, связывающий элемент может быть молекулой антитела или белком, не являющимся антителом, который содержит антигенсвязывающий сайт.

Антигенсвязывающий сайт может быть обеспечен посредством расположения определяющих комплементарность областей (CDR) на каркасах белка, не являющегося антителом, такого как фибронектин или цитохром В и т.д. (Haan & Maggos, 2004; Koide 1998; Nygren 1997), или рандомизацией или мутированием аминокислотных остатков петли в белковом каркасе для придания связывающей специфичности в отношении желаемой мишени. Каркасы для конструирования новых связывающих сайтов в белках обсуждались подробно Nygren et al. (1997). Белковые каркасы для миметиков антител описаны в WO/0034784, который включен в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме, в котором авторы изобретения описывают белки (миметики антител), которые включают домен фибронектина типа III, имеющий по меньшей мере одну рандомизированную петлю. Подходящий каркас, в который можно трансплантировать один или несколько CDR, например, набор HCDR, может быть обеспечен любым элементом-доменом суперсемейства генов иммуноглобулинов. Этот каркас может быть белком человека или белком не человека. Преимуществом каркаса белка не антитела заключается в том, что он может обеспечивать антигенсвязывающий сайт в молекуле каркаса, который меньше и/или может быть легче получен, чем по меньшей мере некоторые молекулы антител. Малый размер связывающего элемента может придавать полезные физиологические свойства, такие как способность входить в клетки, проникать глубоко в ткани или достигать мишеней внутри других структур или связываться во впадинах белка антигена-мишени. Применение антигенсвязывающих сайтов в каркасах белков не антител обсуждается в Wess, 2004. Типичными являются белки, имеющие стабильный скелет молекулы и одну или несколько вариабельных петель, в которых аминокислотная последовательность этой петли или этих петель является специфически или случайным образом мутированной для создания антигенсвязывающего сайта, который связывает антиген-мишень. Такие белки включают IgG-связывающие домены белка А из S. aureus, трансферрин, тетранектин, фибронектин (например, 10-ый домен фибронектина типа III) и липокалины. Другие подходы включают синтетические "Микротела" (Selecore GmbH), которые основаны на циклотидах - малых белках, имеющих внутримолекулярные дисульфидные связи.

Кроме последовательностей антител и/или антигенсвязывающего сайта, связывающий элемент для применения в настоящем изобретении может содержать другие аминокислоты, например, образующие пептид или полипептид, такие как уложенный домен, или придающие этой молекуле другую функциональную характеристику, наряду со способностью связывать антиген. Связывающие элементы для применения в настоящем изобретении могут нести детектируемую метку или могут быть конъюгированы с токсином или нацеливающей частью или ферментом (например, через пептидильную связь или линкер). Например, связывающий элемент может содержать каталитический сайт (например, в домене фермента), а также антигенсвязывающий сайт, где этот антигенсвязывающий сайт связывается с антигеном и, следовательно, нацеливает этот каталитический сайт на этот антиген. Этот каталитический сайт может ингибировать биологическую функцию этого антигена, например, посредством расщепления.

Хотя, как отмечалось, CDR могут находиться на каркасах не антител, структурой, несущей CDR или набор CDR, будет обычно последовательность тяжелой или легкой цепи антитела или ее существенная часть, в которой расположены CDR или набор CDR в местоположении, соответствующем CDR или набору CDR природных вариабельных доменов VH и VL антитела, кодируемых реаранжированными генами иммуноглобулина. Эти структуры и местоположения вариабельных доменов иммуноглобулина могут быть определены со ссылкой на Kabat 1987 и более поздние переиздания, доступные в настоящее время в Интернете (в immuno.bme.nwu.edu или могут быть найдены на "Kabat" с использованием любой поисковой системы).

Под терминами область CDR или CDR имеются в виду гипервариабельные области тяжелой и легкой цепей иммуноглобулина, как определено Kabat et al. (1987), (Kabat 1991a и более поздние издания). Антитело обычно содержит 3 CDR тяжелой цепи и 3 CDR легкой цепи. Термины CDR или CDR во множественном числе используются в настоящем описании для указания, согласно этому случаю, одной из этих областей или нескольких или даже всех из этих областей, которые содержат большинство аминокислотных остатков, ответственных за связывание посредством аффинности антитела в отношении антигена или эпитопа, который оно узнает.

Среди шести коротких CDR-последовательностей, третий CDR тяжелой цепи (HCDR3) имеет вариабельность большего размера (большее разнообразие, в основном обусловленное механизмом расположения генов, которые его вызывают). Он может быть таким коротким, как 2 аминокислоты, хотя самым длинным размером является 26. Функционально, HCDR3 играет роль отчасти в определении специфичности этого антитела (Segal 1974; Amit 1986; Chothia 1987; Chothia 1989; Caton 1990; Sharon 1990a; Sharon 1990b; Kabat et al., 1991b).

Молекула антитела

Этот термин описывает иммуноглобулин, природный или частично или полностью синтезированный. Этот термин относится также к любому полипептиду или белку, содержащему антигенсвязывающий сайт антитела. Должно быть понятно здесь, что настоящее изобретение не относится к антителам в природной форме, то есть они не находятся в их природном окружении, но они могут быть выделены или получены очисткой из природных источников или получены генетической рекомбинацией или химическим синтезом, и что они могут тогда содержать неприродные аминокислоты, как будет описано далее. Фрагменты антител, которые содержат антигенсвязывающий сайт антитела, включают, но не ограничиваются ими, такие молекулы антител, как Fab, Fab’, Fab’-SH, scFv, Fv, dAb, Fd и диатела.

Можно использовать моноклональные и другие антитела и использовать способы технологии рекомбинантных ДНК для получения других антител или химерных молекул, которые связывают антиген-мишень. Такие способы могут включать введение ДНК, кодирующей вариабельную область иммуноглобулина, или CDR, антитела в константные области или константные области плюс каркасные области другого иммуноглобулина. Смотрите, например, EP-A-184187, GB 2188638A или EP-A-239400 и большой объем последующей литературы. Гибридома или другая клетка, продуцирующая антитело, может быть подвергнута генетической мутации или другим изменениям, которые могут изменять или могут не изменять связывающую специфичность полученных антител.

Поскольку антитела могут быть модифицированы различными путями, термин "молекула антитела" должен пониматься как термин, включающий любой связывающий элемент или любое связывающее вещество, имеющие антигенсвязывающий сайт антитела с требуемыми специфичностью и/или связыванием с антигеном. Таким образом, этот термин включает фрагменты и производные антител, в том числе любой полипептид, содержащий антигенсвязывающий сайт антитела, независимо от того, является ли он природным или полностью или частично синтетическим. Таким образом, в этот термин включены химерные молекулы, содержащие антигенсвязывающий сайт антитела, или, эквивалентно, слитые с другим полипептидом (например, произведенным из другого вида или принадлежащим к другому классу или подклассу антител). Клонирование и экспрессия химерных антител описаны в EP-A-0120694 и EP-A-0125023 и большом объеме последующей литературы.

Дополнительные способы, доступные в области конструирования антител, сделали возможным выделение антител человека и гуманизированных антител. Например, гибридомы человека могут быть получены, как описано Kontermann & Dubel (2001). Фаговый дисплей, другой установленный способ генерирования связывающих элементов, был описан подробно во многих публикациях, таких как WO92/01047 (обсуждаемый дополнительно ниже), и патентах США US5969108, US5565332, US5733743, US5858657, US5871907, US5872215, US5885793, US5962255, US6140471, US6172197, US6225447, US6291650, US6492160, US6521404 и Kontermann & Dubel (2001). Могут быть использованы трансгенные мыши, в которых гены антител мыши инактивированы и функционально заменены генами антител человека с оставлением интактными других компонентов иммунной системы мыши (Mendez 1997).

Синтетические молекулы антител могут быть созданы экспрессией из генов, генерированных с использованием олигонуклеотидов, синтезированных и собранных в подходящих экспрессирующих векторах, например, как описано Knappik et al. (2000) или Krebs et al. (2001).

Было показано, что фрагменты полного антитела могут выполнять функцию связывания антигенов. Примерами связывающих фрагментов являются (i) Fab-фрагмент, состоящий из доменов VL, VH, CL и CH1; (ii) Fd-фрагмент, состоящий из доменов VH и CH1; (iii) Fv-фрагмент, состоящий из доменов VL и VH одного антитела; (iv) dAb-фрагмент (Ward 1989; McCafferty 1990; Holt 2003), который состоит из домена VH или VL; (v) выделенные области CDR; (vi) F(ab’)₂-фрагмент, бивалентный фрагмент, содержащий два связанных Fab-фрагмента, (vii) одноцепочечные молекулы Fv (scFv), в которых домен VH и домен VL связаны пептидным линкером, который позволяет этим двум доменам ассоциироваться с образованием антигенсвязывающего сайта (Bird 1988; Huston 1988); (viii) биспецифические одноцепочечные димеры Fv (PCT/US92/09965) и (ix) "диатела", мультивалентные или мультиспецифические фрагменты, сконструированные слиянием генов (WO94/13804; Holliger 1993a). Молекулы Fv, scFv или диател могут быть стабилизированы включением дисульфидных мостиков, связывающих домены VH и VL (Reiter 1996). Могут быть также генерированы минитела, содержащие scFv, присоединенный к домену CH3 (Hu 1996). Другими примерами связывающих фрагментов являются Fab’, которые отличаются от Fab-фрагментов добавлением нескольких остатков на карбоксильном конце домена СН1 тяжелой цепи, в том числе одного или нескольких цистеинов из шарнирной области антитела, и Fab’-SH, которы