Рекомбинантные белки и их применения в терапевтических целях

Рекомбинантные белки и их применения в терапевтических целях

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

[0001] Настоящее раскрытие относится к области рекомбинантных белков для применения при лечении заболеваний.

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

[0002] Согласно настоящей заявке испрашивается приоритет по заявке на патент США с серийным номером 61/563128, поданной 23 ноября 2011 года, под названием "ИММУНОГЕННЫЕ ИСКУССТВЕННЫЕ РЕКОМБИНАНТНЫЕ БЕЛКИ" (IMMUNOGENIC SYNTHETIC RECOMBINANT PROTEINS) и заявке на патент США с серийным номером 61/654401, поданной 1 июня 2012 года, под названием "ИММУНОГЕННЫЕ ИСКУССТВЕННЫЕ РЕКОМБИНАНТНЫЕ БЕЛКИ" (IMMUNOGENIC SYNTHETIC RECOMBINANT PROTEINS), каждая из которых включена в данный документ посредством ссылки в полном объеме.

ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0003] Иммунология рака представляет собой область науки, занимающуюся изучением взаимодействий между иммунной системой и раковыми клетками, такими как опухоли или новообразования. Особый интерес представляет запуск иммунного ответа, такой как узнавание специфических для раковых клеток антигенов, которые экспрессируются опухолями у человека и не экспрессируются в нормальных тканях. В целом, способы контроля деления и пролиферации злокачественных клеток заключались в выделении этих антигенов и презентировании их так, чтобы они распознавались иммунной системой как "чужие" антигены и вызывали специфический иммунный ответ.

[0004] В настоящее время идентифицировано значительное количество факторов роста, и было показано, что большинство, если не все, являются важными медиаторами пролиферации клеток в различных видах рака в дополнение к тому, что они вовлечены в другие болезненные состояния. Как правило, факторы роста являются растворимыми сывороточными белками, которые распознаются и связываются группой рецепторов факторов роста, расположенных на поверхностях клеток. Определенные факторы роста могут быть специфическими в отношении отдельного рецептора или могут связываться с несколькими близкородственными рецепторами с различными аффинностями. Сходным образом, некоторые рецепторы связывают только один лиганд, представляющий собой фактора роста, в то время как другие могут связывать множество родственных факторов роста, опять же, как правило, с отличающимися аффинностями. При связывании со своим природным рецептором цитоплазматический домен рецептора фосфорилируется, и это инициирует внутриклеточный сигнальный каскад, который приводит в результате к изменению транскрипции одного или нескольких генов и, в конечном счете, к прохождению по клеточному циклу и к пролиферации клеток.

[0005] Факторы роста и их рецепторы являются важными компонентами нормальных процессов роста, развития и восстановления, а их профили распределения в тканях и уровни экспрессии непосредственно регулируют клеточный рост. Как было показано с помощью множества исследований, факторы роста могут стимулировать пролиферацию множества клеточных типов как in vitro, так и in vivo (Cohen S., Carpenter G., PNAS USA 72, 1317, 1975, Witsch E et al: Physiology: 25(2):85-101, (2010)). Более того, было показано, что определенные факторы роста стимулируют пролиферацию в некоторых линиях раковых клеток, например, эпидермальный фактор роста (EGF) может стимулировать клетки некоторых видов немелкоклеточного рака легких (Osborne C. K. et al. Can Res. 40, 2. 361 (1980)). Другие факторы роста, такие как фактор роста эндотелия сосудов (VEGF), фактор роста фибробластов (FGF) и тромбоцитарный фактор роста (PDGF), важны при некоторых онкологических заболеваниях, таких как немелкоклеточный рак легкого (NSCLC) (Ballas MS, Chachoua A., Onco Targets and Therapy: 4, 43-58 (201 1)), рак предстательной железы (Cox ME et al; Prostate 69 (l):33-40 (2009)) и рак молочной железы (Law J et al, Cancer Res; 68,24: 10238-10346 (2008)).

[0006] В злокачественных тканях были обнаружены высокие уровни различных рецепторов факторов роста. Например, рецептор эпидермального фактора роста (EGFR) был обнаружен в необычайно больших количествах в злокачественных опухолях эпителиального происхождения, таких как рак легких, рак молочной железы, рак мочевого пузыря, рак яичников, рак наружных женских половых органов, рак толстой кишки, рак легкого, рак головного мозга и рак пищевода. Роль, которую играют факторы роста и их рецепторы в регуляции развития опухоли, неизвестна, но существуют предположения, что экспрессия рецептора фактора роста в опухолевых клетках обеспечивает механизм аутокринной стимуляция роста, что приводит к неконтролируемой пролиферации (Schlessinger J., Schreiber A. B., Levi A., Liberman T., Yarden Y. Crit. Rev. Biochem. 1983, 14 (2) 93-1 11). Кроме того, в работах Liao Y et al; Hum Pathol 36(1 1): 1186-1 196 (2005) и Cox ME et al; Prostate: 69(1) 33-40 (2009) описано значение повышенного количества рецепторов и фактора роста островковых клеток при метастатическом раке предстательной железы.

[0007] Одна стратегия лечения с целенаправленным воздействием на передачу сигнала с участием фактора роста при противораковой терапии предусматривала применение пассивной иммунотерапии, например, с помощью моноклональных антител к определенному задействованному рецептору/рецепторам. Такие исследования показали, что специфическое узнавание антителом рецептора, что может ингибировать связывание лиганда, может обладать ингибирующим действием на митогенную стимуляцию злокачественных клеток (SATO J. D., et al. Methods in Enzymology, vol. 146 pp 63-81, 1987). Тем не менее, антитела мышиного происхождения будут, как правило, вызывать ответ с участием человеческих антител к антителу мыши (HAMA), что, таким образом, ограничивает их до однократного введения.

[0008] Другие стратегии лечения предусматривали применение активной иммунотерапии с помощью вакцин, которые содержали представляющий интерес фактор роста, для индукции иммунного ответа против молекулы с целью ингибирования пролиферативного действия фактора роста на опухоли. В патенте США № 5984018, Davila et al, под названием "Вакцинная композиция, содержащая аутогенный эпидермальный фактор роста или его фрагмент или его производное, обладающая противоопухолевой активностью, и ее применение в терапии злокачественных заболеваний" (Vaccine Composition Comprising Autologous Epidermal Growth Factor or a Fragment or a Derivative Thereof having Anti-tumor Activity and use Thereof in the Therapy of Malignant Diseases) раскрыто, например, применение вакцины, которая содержит смесь фактора роста и иммуногенный (т. е. не являющийся человеческим) белок-носитель, химически конъюгированные вместе с помощью глутарового альдегида. Тем не менее, не желая привязываться к какой-либо определенной теории, полагают, что химическая конъюгация препятствует иммунным ответам против вакцины.

[0009] Это технически затруднительный подход, поскольку он требует, чтобы хозяин вырабатывал иммунный ответ к "собственному антигену", а иммунные системы позвоночных развивались так, чтобы предупреждать возникновение таких ответов. В тех случаях, когда сильный иммунный ответ вырабатывается против "собственного антигена", например, такой, который включает активацию Т-хелперных клеток, обычно это приводит к развитию аутоиммунного болезненного состояния. В течение многих лет предполагали, что некоторые аутоиммунные нарушения, например, волчанка, рассеянный склероз (MS), диабет и т.д., могут вызываться ранним воздействием фактора окружающей среды, который включает иммуногенные эпитопы (T-клеточные эпитопы), которые полностью имитируют собственные эпитопы хозяина. Это может приводить к стимуляции T-хелперных клеток, характеризующихся перекрестной реактивностью с эпитопами хозяина. Последующее воздействие фактора окружающей среды может впоследствии приводить к аутоиммунному ответу (Albert, L.J., and Inman, R.D New England Journal of Medicine, Dec. 30th pp 2068-2074, 1999). С тех пор было показано, что вирусный антиген может в действительности вызывать аутоиммунный ответ против белка нервных клеток (Levin, M.C. et. al, Nature Medicine vol 8 (5) pp 509-513, 2002).

[0010] В публикации патента США № 2006/0251654, Casimiro et al, под названием "Способы лечения злокачественных и инфекционных хронических заболеваний" (Method for Treatment of Malignant and Infectious Chronic Diseases) (публикация '654) раскрыт способ лечения субъекта, страдающего злокачественным или инфекционным хроническим заболеванием, включающий способ иммунизации субъекта вакциной, содержащей "собственный антиген", ассоциированный со злокачественным или инфекционным хроническим заболеванием, который связан с белком-носителем; лечение субъекта иммуномодулирующим средством; и вторичную иммунизацию субъекта вакциной этапа 1 и соответствующим адъювантом, выбранным из гидроксида алюминия и Montanide ISA 51 (Seppic, Париж, Франция). К сожалению, получение вакцины химической конъюгацией, как полагают, тормозит иммунный ответ.

[0011] Большинство описанных выше вакцин характеризуются рядом ограничений, главным образом, обусловленных способом получения и возможным отсутствием однородности и гомологии белкового продукта. Описанные выше вакцины, как правило, содержат смесь рекомбинантного белка-носителя и полипептидов человеческого происхождения, которые химически связаны с помощью глутарового альдегида. К сожалению, этот реакционно-способный реагент может образовывать нежелательные ковалентные поперечные связи между различными химическими группами и, как правило, приводит к получению весьма неоднородного продукта. Таким образом, полученные вакцины могут включать не только молекулы белков-носителей с различными количествами прикрепленных к ним целевых полипептидов человека (например, 0, 1, 2, 3 и т. д.), но и каждый из полипептидов человека может быть прикреплен к носителю посредством различных атомов, а также в различных положениях и в различных ориентациях. Кроме того, как целевой полипептид, так и молекулы белков-носителей могут связываться сами с собой, что приводит к образованию разнообразных гомомультимеров, которые могут не обладать клинической эффективностью и могут не способствовать выработке противоопухолевого иммунного ответа у пациента.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ

[0012] Настоящее раскрытие относится к рекомбинантным белкам и соответствующим способам их получения, описанию рекомбинантных белков и терапевтических способов применения рекомбинантных белков для лечения хронических заболеваний, таких как, например, рак легких, рак молочной железы, рак мочевого пузыря, рак предстательной железы, рак яичников, рак наружных женских половых органов, рак толстой кишки, рак ободочной и прямой кишки, рак кишечника, рак легкого, рак головного мозга, рак пищевода, другие виды рака и другие заболевания.

[0013] В иллюстративном варианте осуществления рекомбинантный белок представляет собой иммуногенную белковую молекулу, включающую одну или несколько последовательностей, которые сворачиваются в физическую структуру, например, включающую одну или несколько последовательностей белкового холерного токсина B (CT-B) из Vibrio cholera или его искусственного эквивалента, и включающую одну или несколько последовательностей одного или нескольких эпитопов факторов роста человека. Включения факторов роста или их частей могут присутствовать в нескольких участках, в виде отдельного антигена, в паре и/или в виде более длинных цепей антигенной молекулы(молекул) на участок.

[0014] В другом иллюстративном варианте осуществления рекомбинантный белок представляет собой иммуногенную белковую молекулу, включающую одну или несколько последовательностей, которые сворачиваются в физическую структуру, например, включающую одну или несколько последовательностей белкового холерного токсина B (CT-B) из Vibrio cholera или его искусственного эквивалента, и включающую одну или несколько последовательностей одного или нескольких опухолевых антигенов или их частей. Рекомбинантный белок может также включать одну или несколько последовательностей одного или нескольких факторов роста или их частей и/или одну или несколько последовательностей одного или нескольких рецепторов или их частей.

[0015] В другом иллюстративном варианте осуществления рекомбинантный белок представляет собой иммуногенную белковую молекулу, включающую одну или несколько последовательностей, которые сворачиваются в физическую структуру, например, включающую одну или несколько последовательностей белкового холерного токсина B (CT-B) из Vibrio cholera или его искусственного эквивалента, и включающую одну или несколько последовательностей одного или нескольких рецепторов или их частей. Рекомбинантный белок может также включать одну или несколько последовательностей одного или нескольких факторов роста или их частей и/или одну или несколько последовательностей одного или нескольких опухолевых антигенов или их частей.

[0016] В данных иллюстративных вариантах осуществления включения опухолевого антигена(ов) или их частей, рецептора(ов) или их частей и/или фактора(ов) роста или их частей могут присутствовать в нескольких участках в виде отдельного антигена или рецептора, в паре и/или в виде более длинных цепей антигенной или рецепторной молекулы(молекул) на участок.

[0017] В иллюстративном варианте осуществления последовательность опухолевого антигена может включать в себя последовательность простатического специфического антигена (PSA) или его части. В иллюстративном варианте осуществления последовательность рецептора может включать в себя последовательность рецептора эпидермального фактора роста человека 2 (Her2) или его части и/или рецептора эпидермального фактора роста человека 3 (Her3) или его части.

[0018] В иллюстративном варианте осуществления последовательность фактора роста может включать в себя последовательность эпидермального фактора роста (EGF) или значительную часть соответствующей кодирующей области(ей) EGF, включающей нейтрализующий домен EGF, в одном или нескольких положениях в рекомбинантном белке. В других иллюстративных вариантах осуществления последовательность фактора роста может включать в себя цепь полной длины или ее часть одного или нескольких из приведенных далее факторов роста и/или альтернативных "собственных антигенов", таких как, без ограничения, другие факторы роста, включая, без ограничения, EGF, IGF-1, IGF-2, FGF, TGF-β, TGF-α, VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, PDGF, NGF, EGF, HGF, BMP и IL 1-6. В пределах объема настоящего раскрытия подразумевают, что факторы роста могут быть выбраны из факторов роста, которые имеют человеческое и нечеловеческое происхождение. В пределах объема настоящего раскрытия также подразумевают, что указанная последовательность факторов роста может быть практически подобной факторам роста либо человеческого, либо нечеловеческого происхождения, или указанная последовательность может содержать их функциональные части. Кроме того, рекомбинантный белок может включать один или несколько включений других последовательностей, которые можно применять для функционального моделирования части или всех факторов роста в пределах последовательности рекомбинантного иммуногенного белка. В одном варианте осуществления можно включить или добавить дополнительные фланкирующие остатки к минимальной последовательности, что обеспечивает присутствие целостного нейтрализующего домена молекулы в естественной конформации и обеспечивает его доступность для клеток иммунной системы.

[0019] В контексте настоящего раскрытия "нейтрализующий домен" означает область или области одного или двух членов пары специфического связывания, например, фактора роста и его родственного рецептора, при этом связывание третьей молекулы, которая не является членом пары специфического связывания, с вышеупомянутой областью(ями) будет препятствовать последующему связыванию двух членов пары специфического связывания. Третья молекула может быть другой белковой молекулой, в том числе, без ограничения, антителом, или может быть малой небелковой молекулой и по происхождению может быть либо природной, либо искусственной. Нейтрализующий домен будет, как правило, включать те области членов пары специфического связывания, которые вступают в непосредственный контакт при связывании, и будет также включать области за пределами указанных областей, при этом при связывании с третьей молекулой, привносится достаточное стерическое несоответствие для препятствования непосредственному связыванию членов пары специфического связывания.

[0020] Из уровня техники хорошо известно, что специфическое узнавание лиганда его родственным рецептором определяется взаимодействием между участком связывания рецептора и конкретным "молекулярным портретом" (эпитопом) лиганда. Таким образом, антитело, которое либо связывает, либо другим образом блокирует участок связывания рецептора или связывает или другим образом блокирует эпитоп узнавания у лиганда, будет препятствовать лиганд-рецепторным взаимодействиям. Такие антитела описаны как "нейтрализующие". В контексте настоящего раскрытия желательно, чтобы нейтрализующие антитела вырабатывались хозяином при введении рекомбинантного белка, и, таким образом, последовательность белка может содержать или включать одно или несколько из любого из фактора роста или опухолевого антигена, или соответствующей полученной из них последовательности, такие, чтобы эпитопы, необходимые для связывания с рецептором, присутствовали в функциональной (нативной) конформации.

[0021] Помимо включения множественных копий отдельного опухолевого антигена, рецептора и/или фактора роста, представленных в виде отдельного опухолевого антигена, рецептора и/или фактора роста или его части на физический участок, и/или в виде цепей повторяющихся последовательностей опухолевого антигена, рецептора и/или фактора роста (например, n=1 или несколько), белок в соответствии с настоящим раскрытием может также включать в себя включения одного или нескольких эпитопов или участков связывания из двух или более различных опухолевых антигенов, рецепторов и/или факторов роста, которые представлены в виде отдельных таковых или в виде цепей в различных положениях в пределах последовательности рекомбинантного белка.

[0022] Полученный белок может быть отдельным полипептидом, включающим опухолевый антиген, рецептор и/или фактор роста или один или несколько их эпитопов или участков связывания в пределах последовательности рекомбинантного белка. В иллюстративном варианте осуществления последовательность рекомбинантного белка включает одну или нескольких частей последовательности CT-B и представляет собой включение(ия) последовательности(ей) опухолевого антигена, рецептора и/или фактора роста или одно или несколько включений их эпитопов или участков связывания на поверхности рекомбинантного белка в естественной конформации.

[0023] В другом иллюстративном варианте осуществления раскрыт способ получения состава с белком. В данном иллюстративном варианте осуществления способ включает сборку одного или нескольких отдельных моновалентных или поливалентных мономеров вместе с получением поливалентной вакцины, включающей рекомбинантный белок, включающий один или несколько опухолевых антигенов, рецепторов и/или факторов роста или их части.

[0024] В еще одном иллюстративном варианте осуществления раскрыт способ лечения пациента. В данном иллюстративном варианте осуществления способ включает введение пациенту отдельно одного или нескольких моновалентных или поливалентных искусственных белков на основе одного опухолевого антигена, рецептора и/или фактора роста в один день или в чередующиеся дни или разы на протяжении периода вакцинации.

[0025] В следующем иллюстративном варианте осуществления раскрыт способ лечения пациента. В данном иллюстративном варианте осуществления способ включает введение пациенту отдельно одного или нескольких моновалентных или поливалентных вакцинных искусственных белков на основе одного опухолевого антигена, рецептора и/или фактора роста в фармацевтически приемлемом носителе, включающем адъювант для повышения иммунного ответа.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

[0026] Варианты осуществления, описанные в настоящем раскрытии, проиллюстрированы на фигурах сопроводительных графических материалов, которые предназначены для иллюстрации, а не ограничения, на которых одинаковые позиции подразумевают как относящиеся к одинаковым или соответствующим частям и в которых:

[0027] на фигуре 1 показана таблица последовательностей и структур молекул EGF ряда организмов;

[0028] на фигуре 2 показан вариант осуществления структуры молекулы EGF человека, включающий нейтрализующий домен EGF;

[0029] на фигуре 3 показан вариант осуществления упрощенной линейной структуры цистеиновых пар молекулы EGF, включающей нейтрализующий домен EGF;

[0030] на фигуре 4 показан вариант осуществления минимальной последовательности молекулы EGF, которая представляет собой нейтрализующий домен EGF в правильной конформации;

[0031] на фигуре 5 показан вариант осуществления структуры модифицированной искусственной молекулы, включающей нейтрализующий домен EGF;

[0032] на фигуре 6 показана гистограмма связывания mAb 10825 и mAb 10827 с rHuEGF с оптической плотностью (OD), измеряемой при 450 нм;

[0033] на фигуре 7 показана гистограмма связывания mAb 10825 и mAb 10827 с rHuEGF в конкуренции со свободным растворимым пептидом, полученным из нейтрализующего домена;

[0034] на фигуре 8 показана линейная диаграмма связывания mAb 10827 к нейтрализующему домену EGF с 6 искусственными белками EGF-CT-B, адсорбированными непосредственно на планшетах для ELISA;

[0035] на фигуре 9 показана линейная диаграмма связывания mAb 10827 к нейтрализующему домену EGF с 6 искусственными белками EGF-CT-B, захваченными антителом кролика к CT-B;

[0036] на фигуре 10 показаны результаты вестерн-блоттинга 6 моновалентных искусственных белков EGF-CT-B, прогнанных на SDS-геле при нативных (без кипячения) условиях и детектированных с помощью антитела к CT-B;

[0037] на фигуре 11 показана линейная диаграмма связывания mAb 10827 к нейтрализующему домену EGF с искусственными белками EGF-CT-B, включающими либо 2 полноразмерные последовательности EGF (E2), либо две частичные последовательности EGF (B2);

[0038] на фигуре 12 показаны результаты вестерн-блоттинга бивалентных искусственных белков EGF-CT-B, прогнанных на гелях для неденатурирующего SDS-PAGE;

[0039] на фигуре 13 показана последовательность искусственного белка, включающая две полноразмерные последовательности EGF (подчеркнутые) и последовательность CT-B (курсив);

[0040] на фигуре 14 показана последовательность искусственного белка, включающая две последовательности нейтрализующего домена EGF (подчеркнутые) и последовательность CT-B (курсив);

[0041] на фигуре 15 показана последовательность искусственного белка, включающая две частичные последовательности молекулы EGF, включающей нейтрализующий домен EGF, Cys6 - Cys31 (подчеркнутый), и последовательность CT-B (курсив);

[0042] на фигуре 16 показаны результаты вестерн-блоттинга, демонстрирующие влияние сдвига pH на мультимеризацию нативного белка CT-B; образцы в правой части геля инкубировали в течение 5 мин при pH, указанном дальше, перед анализом в геле; образцы в левой части инкубировали при pH, указанном дальше, в течение 5 мин, затем нейтрализовали до pH 7,0 в течение 1 часа перед анализом в геле;

[0043] на фигуре 17 показана таблица конструктов T1-T6, E2 и B2, включающих последовательности, содержащие EGF и CT-B;

[0044] на фигуре 18 показаны результаты вестерн-блоттинга конструктов E2 и B2;

[0045] на фигуре 19 показаны конструкты E2, E2N и E2C, включающие последовательности, содержащие EGF и CT-B;

[0046] на фигуре 20 показаны конструкты, включающие последовательности, содержащие EGF и CT-B и содержащие удлиненные аминокислотные линкеры;

[0047] на фигуре 21 показаны результаты вестерн-блоттинга конструктов E2, E2N и E2C;

[0048] на фигуре 22 показаны результаты вестерн-блоттинга ряда N-концевых конструктов, включающих удлиненные аминокислотные линкеры; и

[0049] на фигуре 23 показаны результаты вестерн-блоттинга ряда C-коневых конструктов, включающих удлиненные аминокислотные линкеры;

[0050] на фигуре 24 показана последовательность искусственного белка, включающая последовательности IGF1 (подчеркнутая), EGF (подчеркнутая и курсив) и CT-B (курсив);

[0051] на фигуре 25 показана гистограмма результатов ELISA с захватом, демонстрирующих одновременное присутствие последовательностей IGF, EGF и CTB на отдельном рекомбинантном белке; в виде столбцов A и B представлены результаты захвата антителом к EGF, а в виде столбца C представлены результаты антителом к IGF; белки выявляли следующим образом: в случае A антителом к CTB, в случае B антителом к IGF и в случае C антителом к CTB;

[0052] на фигуре 26 показана последовательность искусственного белка, включающая последовательность Hu-IGFl (подчеркнутая) и последовательность CT-B (курсив);

[0053] на фигуре 27 показана гистограмма результатом ELISA с захватом, при котором выявлены гетероолигомеры IGF-CTB и EGF-CTB; все образцы включают IGF, находящийся на С-конце по отношению к CTB, образцы A и B включают EGF, находящийся на С-конце по отношению к CTB, а образцы B и D включают от EGF, находящийся на N-конце по отношению к CTB; образцы A и B захватывались антителом к EGF и выявляли IGF, в то время как образцы C и D захватывались антителом к IGF и выявляли EGF;

[0054] на фигуре 28 (a-e) показаны последовательности искусственного белка, включающие последовательность CT-B (курсив) и последовательности факторов роста (подчеркнуты) a) TGF-бета 1, b) FGF2, c) HGF (NKl), d) IGF 1/2 и e) VEGF-A/C (последовательность VEGF-C подчеркнута и выделена курсивом);

[0055] на фигуре 29 показана гистограмма результатов ELISA с захватом различного спектра гибридных рекомбинантных белков, включающих последовательности, полученные из одного или нескольких факторов роста, совместно с последовательностями CTB; в каждом случае рекомбинантный белок захватывали антителом, специфическим по отношению к одной из последовательностей, а затем выявляли антителом, специфичным для отличной последовательности, как указано далее:

[0056] HGF и TGF-B1 захватывали антителами к α-HGF и α-TGF-B1 и выявляли CTB;

[0057] FGF2 захватывали антителом к α-CTB и выявляли FGF2;

[0058] VEGF A/C захватывали (i) антителом к α-VEGF-A и (ii) антителом к α-VEGF-C и в обоих случаях выявляли CTB;

[0059] IGF 1/2 захватывали антителом к α-IGF1, в обоих случаях, и выявляли (i) антителом к α-CTB и (ii) антителом к α-IGF2;

[0060] на фигуре 30 показаны результаты вестерн-блоттинга SDS-PAGE геля нативного рекомбинантного белка TGF-B1-CTB согласно фигуре 28a, из которых видно присутствие в основном пентамерного рекомбинантного белка;

[0061] на фигуре 31 показана последовательность искусственного белка, включающая a) последовательность искусственного белка, включающую последовательность TGF-B1 (подчеркнутая) и последовательность CT-B (курсив), и b) последовательность лигандсвязывающего домена рецептора TGF-бета 2 (подчеркнутая) и последовательность CT-B (курсив);

[0062] на фигуре 32 показана гистограмма результатов ELISA с захватом рекомбинантного белка, содержащего последовательности как TGF-бета R2, так и CTB; из диаграммы видно, что обе последовательности могут быть одновременно связаны в обеих ориентациях без асимметрии;

[0063] на фигуре 33 показано, что рекомбинантный белок, содержащий последовательности, полученные из TGF-бета и CTB, способен связываться с рекомбинантным белком, содержащим последовательности, полученные из лигандсвязывающего домена рецептора TGF-бета 2 и CTB;

[0064] на фигуре 34 показаны гуморальные иммунные ответы с участием IgG в сыворотках мышей группы 1 при разведении 1/100 по отношению к r-IGF после иммунизации;

[0065] на фигуре 35 показаны гуморальные иммунные ответы с участием IgG сывороток мышей группы 2 при разведении 1/100 по отношению к r-EGF после иммунизации;

[0066] на фигуре 36 показаны гуморальные иммунные ответы с участием IgG сывороток мышей группы 3 при разведении (a) 1/100 и (b) 1/8 по отношению к r-EGF после иммунизации;

[0067] на фигуре 37 показаны гуморальные иммунные ответы с участием IgG сывороток мышей группы 3 при разведении (a) 1/100 и (b) 1/8 по отношению к r-IGF после иммунизации;

[0068] на фигуре 38 показаны гуморальные иммунные ответы с участием IgG сывороток мышей группы 4 при разведении (a) 1/100 и (b) 1/8 по отношению к r-EGF после иммунизации;

[0069] на фигуре 39 показаны гуморальные иммунные ответы с участием IgG сывороток мышей группы 4 при разведении (a) 1/100 и (b) 1/8 по отношению к r-IGF после иммунизации;

[0070] на фигуре 40 показаны гуморальные иммунные ответы с участием IgG сывороток мышей группы 5 при разведении 1/8 (кроме образца 178, при разведении 1/100) по отношению к r-IGF после иммунизации;

[0071] на фигуре 41 показаны гуморальные иммунные ответы с участием IgG сывороток мышей группы 6 при разведении 1/100 по отношению к a) r-IGF и b) rHu-EGF после иммунизации;

[0072] на фигуре 42 показана структура моноганглиозида GM1, природного партнера связывания субъединицы B холерного токсина;

[0073] на фигуре 43 показана структура коммерчески доступной D-галактозы, связанной с твердой подложкой (Pierce); и

[0074] на фигуре 44 показан SDS-PAGE гель очистки rCTB из надосадочной жидкости культуры (среды) трех штаммов клеток E.coli, трансформированных вектором экспрессии CTB, как указано далее: дорожка 1 показывает маркерную лестницу; дорожки 2, 5 и 8 показывают неочищенную надосадочную жидкость культуры; дорожки 3, 6 и 9 показывают неочищенные периплазматические фракции; дорожки 4, 7 и 10 показывают элюированный очищенный CTB; дорожка 11 показывает His-меченный CTB, очищенный с помощью IMAC.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ

[0075] В настоящем документе раскрыты подробные варианты осуществления настоящих рекомбинантных белков или вакцин, тем не менее, следует понимать, что раскрытые варианты осуществления являются только иллюстративными и могут быть осуществлены в различных видах. Следовательно, конкретные функциональные детали, раскрытые в настоящем документе, не следует интерпретировать как ограничивающие, а лишь в качестве основы для формулы изобретения и в качестве показательной основы для того, чтобы показать специалисту в данной области различные применения рекомбинантного белка, раскрытого в настоящем документе.

[0076] Настоящее раскрытие предлагает гомогенный рекомбинантный белок для улучшения презентирования максимального количества эпитопов факторов роста, эпитопов опухолевых антигенов и/или участков связывания рецептора в качестве элементов иммуногенного рекомбинантного белка. В одном иллюстративном варианте осуществления описан рекомбинантный белок, включающий полностью или части холерного токсина B (CT-B) и эпидермального фактора роста (EGF) человека, опухолевого антигена и/или рецептора. В альтернативных иллюстративных вариантах осуществления белок может включать другие иммуногенные рекомбинантные белки, которые смоделированы на основе известных иммуногенных белков. В пределах объема настоящего раскрытия подразумевают, что такие рекомбинантные белки будут включать полипептиды, которые обладают высокой иммуногенностью по отношению к иммунной системе человека. Предпочтительно рекомбинантные белки придают дополнительные свойства гибридному белку, например, высокий выход при экспрессии и технологичность, стабильность при пероральном применении и способность поступать из желудочно-кишечного тракта в кровеносную систему и/или предварительное безопасное применение в клинической практике.

[0077] В иллюстративном варианте осуществления рекомбинантные белки, раскрытые в настоящем документе, могут содержать или включать высокую долю белковой последовательности, полученной из целевых "собственных" антигенов, относительно общего молекулярного веса. Этого можно достигнуть, например, путем применения крупной белковой модели, содержащей многочисленные эпитопы факторов роста. Данные эпитопы факторов роста могут являться множественными копиями целого или части отдельного фактора роста или копиями целого или части нескольких различных факторов роста.

[0078] Согласно настоящему раскрытию включения эпитопов факторов роста должны быть свернуты так, чтобы их естественная конформация в значительной степени сохранялась и презентировалась компонентам иммунной системы хозяина с тем, чтобы вызывать сильный иммунный ответ хозяина к указанным эпитопам. Примеры подходящих природных белковых моделей для моделирования домена рекомбинантного белка, несущего эпитоп, включают, без ограничения, субъединицу B холерного токсина, субъединицы B термолабильных энтеротоксинов LT и LT-II E.coli, вератоксин, коклюшный токсин, энтеротоксин C. jejuni, токсин Шига, токсин Listeria, столбнячный анатоксин, дифтерийный анатоксин, наружный белок мембраны N. meningitidis, белок оболочки бактериофага, белок оболочки аденовируса и другие белки вирусной оболочки. Альтернативно, "чужой" компонент белка может иметь небольшой размер. Как минимум, "чужая" последовательность(последовательности) должна быть длиною приблизительно 9, 10, 11 или более аминокислот и включать либо целый, либо частично по меньшей мере один T-клеточный эпитоп человека. Альтернативно, можно применять неприродные "искусственные" полипептиды, которые удовлетворяют требованиям придания иммуногенности всему белку и обеспечения соответствующего презентирования фактора(ов) роста, рецепторов, опухолевых антигенов или их эпитопов по отношению к иммунной системе хозяина.

[0079] В иллюстративном варианте осуществления домен рекомбинантного белка, несущий эпитоп, вне зависимости от того, получен ли он из природной или из искусственной последовательности полипептида, должен обладать способностью к самоорганизации в олигомерные мультимеры при соответствующих химических/внешних условиях или к уменьшению до мономеров при альтернативных условиях. Оптимально, участвующие в мультимеризации домены будут собираться в стабильные мультимеры с небольшим числом субъединиц, например, димеры, тримеры, тетрамеры, пентамеры и т.д., так, чтобы образовывался продукт с частицами с равномерным размером. Примеры природных полипептидов включают, без ограничения, лейциновые застежки, белок lac-репрессор, стрептавидин/авидин, субъединицу B холерного токсина, субъединицы B других токсинов AB5, участвующий в тримеризации домен Pseudomonas и вирусные капсидные белки.

[0080] Согласно настоящему раскрытию рекомбинантные белки, независимо от того содержат ли факторы роста или их части, клеточные рецепторы или их части, опухолевые антигены или их части, относятся в широком диапазоне либо клеточных путей, задействованных при хроническом заболевании, либо видов рака к факторам роста и рецепторам и, в наиболее широком диапазоне солидных опухолей, к применению опухолевых антигенов в указанных искусственных белках. Белки представлены в форме рекомбинантного белка и могут быть пригодны при лечении хронических заболеваний, например, рака молочной железы, рака легких, рака мочевого пузыря, рака яичников, рака наружных женских половых органов, рака толстой кишки, рака легкого, рака головного мозга, рака ободочной и прямой кишки, рака кишечника, рака головы и шеи и рака пищевода. Поскольку при указанных заболеваниях могут экспрессироваться опухолевые антигены и сверхэкспрессироваться множество клеточных рецепторов и факторов роста, белки, описанные в настоящем документе, могут содержать один или несколько различных опухолевых антигенов, один или несколько различных рецепторов или факторов роста из одного или множества ассоциированных с заболеванием клеточных путей. Такие белки называют "поливалентными".

[0081] В иллюстративном варианте осуществления раскрыт белок, состоящий из гомогенного рекомбинантного белка, включающего один или нескольких нейтрализующих доменов эпидермальных факторов роста (EGF). Белок представлен в форме рекомбинантного белка и может быть пригодным при лечении хронических заболеваний, например, рака молочной железы, рака легких, рака мочевого пузыря, рака яичников, рака наружных женских половых органов, рака толстой кишки, рака легкого, рака головного мозга, рака ободочной и прямой кишки, рака головы и шеи и рака пищевода. В иллюстративном варианте осуществления белок является рекомбинантным белком, содержащим или включающим последовательности EGF и последовательности CT-B.

[0082] В другом иллюстративном варианте осуществления раскрыт белок, состоящий из гомогенного рекомбинантного белка, включающего один фактор роста фибробластов (FGF). В иллюстративном варианте осуществления белок является рекомбинантным белком, содержащим или включающим последовательности FGF и последовательности CT-B.

[0083] В дополнительном иллюстративном варианте осуществления раскрыт белок, состоящий из гомогенного рекомбинантного белка, включающего один трансформирующий фактор роста бета 1 (TGF-β1). В иллюстративном варианте осуществления белок является рекомбинантным белком, содержащим или включа