Резистентный к насекомым и устойчивый к гербицидам трансформант сои рdab9582.816.15.1

Резистентный к насекомым и устойчивый к гербицидам трансформант сои рdab9582.816.15.1

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Притязание на приоритет: В настоящей заявке испрашивается приоритет предварительной заявки на патент США 61/663700, поданной 25 июня, 2012. Содержание этой заявки во всей своей полноте вводится в настоящее описание посредством ссылки.

Предшествующий уровень техники

Гены, кодирующие Cry1F и Cry1Ac synpro (Cry1Ac), способны сообщать трансгенным растениям резистентность к насекомым, например, резистентность к чешуекрылым насекомым, а ген, кодирующий PAT (фосфинотрицин-ацетилтрансферазу), способен сообщать трансгенным растениям устойчивость к гербициду фосфинотрицину (глюфозинату). Ген PAT был успешно экспрессирован в сое и использован в качестве селективного маркера для промышленного продуцирования резистентных к насекомым трансгенных культур и для сообщения этим трансгенным растениям устойчивости к гербициду глюфозинату.

Известно, что экспрессия трансгенов в растениях зависит от локализации трансгенов в геноме растения, что, вероятно, обусловлено хроматиновой структурой (например, гетерохроматином) или близостью элементов регуляции транскрипции (например, энхансеров) к сайту интеграции (Weising et al., Ann. Rev. Genet 22:421-477, 1988). В то же время, присутствие трансгена в различных участках генома так или иначе зависит от общего фенотипа растения. По этой причине часто бывает необходимым прибегать к скринингу большого числа трансген-содержащих трансформантов для идентификации трансген-специфического трансформанта, характеризующегося оптимальной экспрессией представляющего интерес встроенного гена. Так, например, в этих растениях и в других организмах может наблюдаться широкая вариабельность в уровнях экспрессии гена, встроенного в эти трансформанты. Могут также наблюдаться различия в пространственных или временных профилях экспрессии, например, различия в относительных уровнях экспрессии трансгена в различных тканях растений, где указанные различия могут не соответствовать предполагаемым профилям элементов регуляции транскрипции, присутствующих во встроенной генной конструкции. По этой причине, обычно продуцируют от ста до тысячи различных трансформантов и скринируют их в поиске одного трансформанта, который имеет нужные уровни и профили экспрессии трансгена, и который может быть использован в промышленных целях. Трансформант, который имеет нужные уровни или профили экспрессии трансгена, может быть использован для интрогрессии этого трансгена в генетическое окружение другого вида путем полового ауткроссинга с применением стандартных методов скрещивания. Потомство таких кроссов сохраняет уровни экспрессии трансгена, характерные для исходного трансформанта. Эта стратегия применяется для обеспечения надежной экспрессии гена в различных сортах, хорошо адаптированных к условиям культивирования в определенной местности.

Для того, чтобы определить, содержит ли потомство полового кросса представляющий интерес трансген или группу таких трансгенов, желательно иметь возможность детектировать наличие конкретной генетической трансформации. Кроме того, способ детектирования конкретного трансформанта должен удовлетворять нормам, установленным Регуляторными органами для его апробации до выхода на рынок, а пищевые продукты, полученные из рекомбинантных сельскохозяйственных культур, должны, например, иметь соответствующую маркировку, либо такой способ может быть применен для мониторинга качества окружающей среды, мониторинга качества сельскохозяйственных культур, выращенных в полевых условиях, или для мониторинга продуктов, полученных после сбора урожая, а также его проведение должно удовлетворять нормам, утвержденным Регуляторными органами или сторонами договора.

При этом, присутствие трансформанта может быть детектировано любым методом детектирования нуклеиновых кислот, известным специалистам, включая, но не ограничиваясь ими, полимеразную цепную реакцию (ПЦР) или гибридизацию ДНК с использованием нуклеиновокислотных зондов. Такие методы детектирования обычно направлены на часто используемые генетические элементы, такие как промоторы, терминаторы, маркерные гены и т.п., поскольку для многих ДНК-конструкций, кодирующие области являются одинаковыми. Поэтому, такие методы не могут быть использованы для дифференциации различных трансформантов, особенно тех трансформантов, которые продуцируются с использованием одних и тех же ДНК-конструкций или почти аналогичных конструкций, за исключением лишь тех случаев, когда известна последовательность фланкирующей ДНК, смежной со встроенной гетерологичной ДНК. Так, например, в заявке на патент США 2006/0070139, относящийся к трансформанту кукурузы DAS-59122-7, описан трансформант-специфический ПЦР-анализ. Исходя из вышесказанного, очевидно, что необходимо разработать простой и дифференциальный метод идентификации трансформанта сои PDAB9582.816.15.1.

Краткое описание сущности изобретения

В некоторых своих вариантах, настоящее изобретение относится к новым трансгенным растениям трансформированной сои, резистентным к насекомым и устойчивым к гербицидам, а в частности, настоящее изобретение относится к трансформанту сои, обозначенному pDAB9582.816.15.1 и содержащему описанные здесь гены crylF v3 (cryIF), crylAc synpro (cry1Ac) и pat v6 (pat), встроенные в специфический сайт в геноме клеток сои. Репрезентативные семена сои были депонированы в Американской коллекции типовых культур (АТСС) под депозитарным номером No. РТА-12588 23 февраля 2012 г. компанией Dow AgroSciences LLC.

ДНК растений сои, содержащих такой трансформант, включает последовательности стыка/фланкирующие последовательности, описанные в настоящей заявке, которые указывают на локализацию встроенной ДНК в геноме сои. SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 2 являются диагностическим признаком присутствия трансформанта сои pDAB9582.816.15.1. Более конкретно, последовательности, окружающие область стыка в положениях п.о. 1273/1274 SEQ ID NO: 1, и в положениях п.о. 175/176 и п.о. 316/317 SEQ ID NO: 2, являются диагностическим признаком присутствия трансформанта сои pDAB9582.816.15.1. Ниже описаны примеры последовательностей, содержащих такие стыки, которые являются характерными для ДНК сои, содержащей трансформант сои pDAB9582.816.15.1. В одном из своих вариантов, настоящее изобретение относится к растению сои или к его части, которые являются резистентными к Pseudoplusia includens (соевой пяденице), и которые имеют геном, содержащий одну или более последовательностей, выбранных из группы, состоящей из п.о. в положениях 1258-1288 SEQ ID NO: 1; п.о. в положениях 1223-1323 SEQ ID NO: 1; п.о. в положениях 1173-1373 SEQ ID NO: 1; п.о. в положениях 1073-1473 SEQ ID NO: 1; п.о. в положениях 160-190 SEQ ID NO: 2; п.о. в положениях 125-225 SEQ ID NO: 2; и п.о. в положениях 75-275 SEQ ID NO: 2, и их комплементов. В другом своем варианте, настоящее изобретение относится к семенам таких растений.

В другом своем варианте, настоящее изобретение относится к способу борьбы с насекомыми, который включает заражение насекомыми растений сои, резистентных к насекомым, где указанные растения сои имеют геном, содержащий одну или более последовательностей, выбранных из группы, состоящей из п.о. в положениях 1258-1288 SEQ ID NO: 1; п.о. в положениях 1223-1323 SEQ ID NO: 1; п.о. в положениях 1173-1373 SEQ ID NO: 1; п.о. в положениях 1073-1473 SEQ ID NO: 1; п.о. в положениях 160-190 SEQ ID NO: 2; п.о. в положениях 125-225 SEQ ID NO: 2; и п.о. в положениях 75-275 SEQ ID NO: 2, и их комплементов, где указанные последовательности является характерными признаками присутствия трансформанта сои pDAB9582.816.15.1, резистентного к насекомым. Присутствие генов cryIF v3 {cryIF) и cry1Ac synpro (crylAc) в трансформанте сои pDAB9582.816.15.1 сообщает такому растению резистентность, например, к Pseudoplusia includens (соевой пяденице), Anticarsia gemmatalis (листовертке фасоли), Epinotia aporema, Omoides indicatus, Rachiplusia nu, Spodoptera frugiperda, Spodoptera cosmoides, Spodoptera eridania, Heliothis virescens, Heliocoverpa zea, Spilosoma virginica и Elasmopalpus lignosellus.

В другом своем варианте, настоящее изобретение относится к способу борьбы с сорняками сои, который включает обработку сельскохозяйственной культуры сои гербицидом глюфозинатом, где указанная сельскохозяйственная культура сои включает растения сои, имеющие геном, содержащий одну или более последовательностей, выбранных из группы, состоящей из п.о. в положениях 1258-1288 SEQ ID NO: 1; п.о. в положениях 1223-1323 SEQ ID NО: 1; п.о. в положениях 1173-1373 SEQ ID NО: 1; п.о. в положениях 1073-1473 SEQ ID NО: 1; п.о. в положениях 160-190 SEQ ID NO: 2; п.о. в положениях 125-225 SEQ ID NO: 2; и п.о. в положениях 75-275 SEQ ID NO: 2, и их комплементов, где указанные последовательности являются диагностическими признаками присутствия трансформанта сои pDAB9582.816.15.1. Присутствие гена pat в трансформанте сои pDAB9582.816.15.1 сообщает устойчивость к гербициду глюфозинату.

В другом своем варианте, настоящее изобретение относится к способу детектирования трансформанта сои pDAB9582.816.15.1 в образце, содержащем соевую ДНК, где указанный способ включает:

(a) контактирование указанного образца с первым праймером длиной по меньшей мере в 10 п.о., который селективно связывается с фланкирующей последовательностью в положениях п.о. 1-1273 SEQ ID NO: 1 или с ее комплементом, и со вторым праймером длиной по меньшей мере в 10 п.о., который селективно связывается с последовательностью вставки в положениях п.о. 1274-1577 SEQ ID NO: 1 или с ее комплементом; и проведение анализа на ампликон, образующийся между указанными праймерами; или

(b) контактирование указанного образца с первым праймером длиной по меньшей мере в 10 п.о., который селективно связывается с последовательностью вставки в положениях п.о. 1-175 SEQ ID NO: 2 или с ее комплементом, и со вторым праймером длиной по меньшей мере в 10 п.о., который селективно связывается с фланкирующей последовательностью в положениях п.о. 176-1687 SEQ ID NO: 2 или с ее комплементом; и

(c) проведение анализа на ампликон, образующийся между указанными праймерами.

В другом своем варианте, настоящее изобретение относится к способу детектирования трансформанта сои pDAB9582.816.15.1, где указанный способ включает:

(a) контактирование указанного образца с первым праймером, который селективно связывается с фланкирующей последовательностью, выбранной из группы, состоящей из п.о. в положениях 1-1273 SEQ ID NO: 1 и п.о. в положениях 176-1687 SEQ ID NO: 2, или с их комплементами, и со вторым праймером, который селективно связывается с SEQ ID NО: 3 или с ее комплементом;

b) осуществление полимеразной цепной реакции указанного образца; и

c) проведение анализа на ампликон, образующийся между указанными праймерами.

В другом своем варианте, настоящее изобретение относится к способу скрещивания растения сои, где указанный способ включает скрещивание первого растения сои со вторым растением сои с получением третьего растения сои, где указанное первое растение содержит ДНК, включающую одну или более последовательностей, выбранных из группы, состоящей из в п.о. в положениях 1258-1288 SEQ ID NO: 1; п.о. в положениях 1223-1323 SEQ ID NO: 1; п.о. в положениях 1173-1373 SEQ ID NO: 1; п.о. в положениях 1073-1473 SEQ ID NO: 1; п.о. в положениях 160-190 SEQ ID NO: 2; п.о. в положениях 125-225 SEQ ID NO: 2; и п.о. в положениях 75-275 SEQ ID NO: 2, и их комплементов; и проведение анализа указанного третьего растения сои на присутствие ДНК, включающей одну или более последовательностей, выбранных из группы, состоящей из в п.о. в положениях 1258-1288 SEQ ID NO: 1; п.о. в положениях 1223-1323 SEQ ID NO: 1; п.о. в положениях 1173-1373 SEQ ID NO: 1; п.о. в положениях 1073-1473 SEQ ID NO: 1; п.о. в положениях 160-190 SEQ ID NO: 2; п.о. в положениях 125-225 SEQ ID NO: 2; и п.о. в положениях 75-275 SEQ ID NO: 2, и их комплементов.

В другом своем варианте, настоящее изобретение относится к выделенной молекуле ДНК, которая является диагностическим признаком присутствия трансформанта сои pDAB9582.816.15.1. Такими молекулами, помимо SEQ ID NOS: 1 и 2, являются молекулы длиной по меньшей мере 25 п.о., содержащие п.о. в положениях 1273-1274 SEQ ID NO: 1 и по меньшей мере 10 п.о. SEQ ID NO: 1 в каждом направлении от п.о. 1273/1274 в области стыка; ампликоны длиной по меньшей мере 25 п.о., содержащие п.о. в положениях 175 - 176 SEQ ID NO: 2 и по меньшей мере 10 п.о. SEQ ID NO: 2 в каждом направлении от п.о. 175/176 в области стыка. Примерами являются п.о. в положениях l258-1288 SEQ ID NO: 1; п.о. в положениях 1223-1323 SEQ ID NO: 1; п.о. в положениях 1173-1373 SEQ ID NO: 1; п.о. в положениях 1073-1473 SEQ ID NO: 1; п.о. в положениях 160-190 SEQ ID NO: 2; п.о. в положениях 125-225 SEQ ID NO: 2; и п.о. в положениях 75-275 SEQ ID NO: 2, и их комплементы.

В другом своем варианте, настоящее изобретение относится к способу борьбы с насекомыми-вредителями соевых бобов, семян или муки из семян, в которых содержится трансформант сои pDAB9582.816.15.1, где указанные бобы, семена или мука из семян содержат ДНК, включающую одну или более последовательностей, выбранных из группы, состоящей из п.о. в положениях l258-1288 SEQ ID NO: 1; п.о. в положениях 1223-1323 SEQ ID NO: 1; п.о. в положениях 1173-1373 SEQ ID NO: 1; п.о. в положениях 1073-1473 SEQ ID NO: 1; п.о. в положениях 160-190 SEQ ID NO: 2; п.о. в положениях 125-225 SEQ ID NO: 2; и п.о. в положениях 75-275 SEQ ID NO: 2, и их комплементов.

Варианты осуществления изобретения также относятся к клеткам растений сои и к частям растений сои, включая, но не ограничиваясь ими, пыльцу, овули, цветки, побеги, корни и листья, ядра вегетативных клеток, клетки пыльцы, семена и муку из семян, а также яйцеклетку, содержащие трансформант сои pDAB 9582.816.15.1.

В некоторых вариантах осуществления изобретения, трансформанту сои pDAB 9582.816.15.1 могут быть сообщены и другие признаки, включая, например, другой(ие) ген(ы) устойчивости к гербицидам и/или белки-ингибиторы насекомых и последовательности регуляции транскрипции (то есть, РНК-интерферирующий агент, дцРНК, факторы транскрипции и т.п.). Дополнительные признаки могут быть внесены в геном растения путем скрещивания растений, ретрансформации трансгенного растения, содержащего трансформант сои pDAB 9582.816.15.1, либо путем сообщения новых признаков благодаря нацеленной интеграции посредством гомологичной рекомбинации.

Другие варианты осуществления изобретения включают вырезание полинуклеотидных последовательностей, которые содержат трансформант сои pDAB9582.816.15.1, включая, например, кластер для экспрессии гена pat. После вырезания полинуклеотидной последовательности, модифицированный трансформант может быть перенацелен в специфический сайт хромосомы, где дополнительные полинуклеотидные последовательности присутствуют вместе с трансформантом сои pDAB9582.816.15.1.

В одном из своих вариантов, настоящее изобретение охватывает сайт-мишень хромосомы сои, локализованный на хромасоме 03 между фланкирующими последовательностями, представленными в SEQ ID NOS: 1 и 2.

В одном из своих вариантов, настоящее изобретение относится к способу получения трансгенного растения сои, где указанный способ включает инсерцию гетерологичной нуклеиновой кислоты в положении на хромосоме 03 между геномными последовательностями, представленными в SEQ ID NOS: 1 и 2, то есть, между п.о. в положениях 1-1273 SEQ ID NO: 1 и п.о. в положениях 176-1687 SEQ ID NO: 2.

Кроме того, варианты осуществления изобретения также относятся к анализам, включающим детектирование присутствия рассматриваемого трансформанта в образце (например, сои). Эти анализы могут быть осуществлены на основе последовательности ДНК рекомбинантной конструкции, встроенной в геном сои, и на основе геномных последовательностей, фланкирующих сайт инсерции. Настоящее изобретение также относится к наборам для проведения анализов в соответствующих условиях.

В частности, варианты осуществления изобретения также относятся к клонированию и анализу последовательностей ДНК граничных областей, полученных после инсерции Т-ДНК от pDAB9582 в линиях трансгенной сои. Эти последовательности являются уникальными. Исходя из последовательностей вставки и стыка могут быть идентифицированы и сконструированы трансформант-специфические праймеры. ПЦР-анализ продемонстрировал, что эти трансформанты могут быть идентифицированы с помощью анализа ПЦР-ампликонов, полученных с использованием наборов трансформант-специфических праймеров. Таким образом, эти и другие родственные методы могут быть применены для уникальной идентификации линий сои, содержащих трансформант согласно изобретению.

Один из вариантов осуществления изобретения относится к способу борьбы с насекомыми, который включает заражение насекомыми растений сои, резистентных к насекомым, где указанные растения сои включают ДНК, содержащую последовательность, выбранную из группы, состоящей из п.о. в положениях 1258-1288 SEQ ID NO: 1; п.о. в положениях 1223-1323 SEQ ID NO: 1; п.о. в положениях 1173-1373 SEQ ID NO: 1; п.о. в положениях 1073-1473 SEQ ID NO: 1; п.о. в положениях 160-190 SEQ ID NO: 2; п.о. в положениях 125-225 SEQ ID NO: 2; и п.о. в положениях 75-275 SEQ ID NO: 2, где указанные последовательности является диагностическими признаками присутствия трансформанта сои pDAB9582.816.15.1, резистентного к насекомым.

Один из вариантов осуществления изобретения относится к способу борьбы с насекомыми Pseudoplusia includens, Anticarsia gemmatalis или Spodoptera frugiperda, где указанный способ включает заражение резистентных к насекомым растений сои насекомыми Pseudoplusia includens, Anticarsia gemmatalis, Heliothis virescens или Spodoptera frugiperda, где указанные растения сои включают ДНК, содержащую последовательность, выбранную из группы, состоящей из п.о. в положениях 1258-1288 SEQ ID NO: 1; п.о. в положениях 1223-1323 SEQ ID NO: 1; п.о. в положениях 1173-1373 SEQ ID NO: 1; п.о. в положениях 1073-1473 SEQ ID NO: 1; п.о. в положениях 160-190 SEQ ID NO: 2; п.о. в положениях 125-225 SEQ ID NO: 2; и п.о. в положениях 75-275 SEQ ID NO: 2, где указанная последовательность является диагностическим признаком присутствия трансформанта сои pDAB9582.816.15.1, резистентного к насекомым.

Один из вариантов осуществления изобретения относится к способу борьбы с сорняками сои, который включает обработку сельскохозяйственной культуры сои гербицидом глюфозинатом, где указанная сельскохозяйственная культура сои включает растения сои, содержащие ДНК, включающую последовательность, выбранную из группы, состоящей из п.о. в положениях 1258-1288 SEQ ID NO: 1; п.о. в положениях 1223-1323 SEQ ID NО: 1; п.о. в положениях 1173-1373 SEQ ID NО: 1; п.о. в положениях 1073-1473 SEQ ID NО: 1; п.о. в положениях 160-190 SEQ ID NO: 2; п.о. в положениях 125-225 SEQ ID NO: 2; и п.о. в положениях 75-275 SEQ ID NO: 2, где указанная последовательность является диагностическим признаком присутствия трансформанта сои pDAB9582.816.15.1.

Один из вариантов осуществления изобретения относится к выделенной последовательности ДНК, содержащей одну или более последовательностей, выбранных из группы, состоящей из п.о. в положениях 1258-1288 SEQ ID NO: 1; п.о. в положениях 1223-1323 SEQ ID NО: 1; п.о. в положениях 1173-1373 SEQ ID NО: 1; п.о. в положениях 1073-1473 SEQ ID NО: 1; п.о. в положениях 160-190 SEQ ID NO: 2; п.о. в положениях 125-225 SEQ ID NO: 2; и п.о. в положениях 75-275 SEQ ID NO: 2.

Один из вариантов осуществления изобретения относится к способу скрещивания растения сои, где указанный способ включает скрещивание первого растения сои со вторым растением сои с получением третьего растения сои, где указанное первое растение содержит ДНК, включающую одну или более последовательностей, выбранных из группы, состоящей из в п.о. в положениях 1258-1288 SEQ ID NO: 1; п.о. в положениях 1223-1323 SEQ ID NO: 1; п.о. в положениях 1173-1373 SEQ ID NO: 1; п.о. в положениях 1073-1473 SEQ ID NO: 1; п.о. в положениях 160-190 SEQ ID NO: 2; п.о. в положениях 125-225 SEQ ID NO: 2; и п.о. в положениях 75-275 SEQ ID NO: 2, и их комплементов; и проведение анализа указанного третьего растения сои на присутствие ДНК, включающей одну или более последовательностей, выбранных из группы, состоящей из в п.о. в положениях 1258-1288 SEQ ID NO: 1; п.о. в положениях 1223-1323 SEQ ID NO: 1; п.о. в положениях 1173-1373 SEQ ID NO: 1; п.о. в положениях 1073-1473 SEQ ID NO: 1; п.о. в положениях 160-190 SEQ ID NO: 2; п.о. в положениях 125-225 SEQ ID NO: 2; и п.о. в положениях 75-275 SEQ ID NO: 2, и их комплементов.

Один из вариантов осуществления изобретения относится к выделенной молекуле ДНК, содержащей последовательность стыка, включающую по меньшей мере одну последовательность, выбранную из группы, состоящей из п.о. в положениях 1258-1288 SEQ ID NO: 1; п.о. в положениях 1223-1323 SEQ ID NО: 1; п.о. в положениях 1173-1373 SEQ ID NО: 1; п.о. в положениях 1073-1473 SEQ ID NО: 1; п.о. в положениях 160-190 SEQ ID NO: 2; п.о. в положениях 125-225 SEQ ID NO: 2; и п.о. в положениях 75-275 SEQ ID NO: 2, и их комплементов. Один из вариантов осуществления изобретения относится к растению сои или его части, которые являются резистентными к Pseudoplusia includens (соевой пяденице) и содержат ДНК, имеющую по меньшей мере одну нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из п.о. в положениях 1258-1288 SEQ ID NO: 1; п.о. в положениях 1223-1323 SEQ ID NО: 1; п.о. в положениях 1173-1373 SEQ ID NО: 1; п.о. в положениях 1073-1473 SEQ ID NО: 1; п.о. в положениях 160-190 SEQ ID NO: 2; п.о. в положениях 125-225 SEQ ID NO: 2; и п.о. в положениях 75-275 SEQ ID NO: 2, и их комплементов.

Один из вариантов осуществления изобретения относится к композиции, полученной из растения сои или его частей, где указанной композицией является пищевой продукт, выбранный из группы, состоящей из кормовой соевой муки, пищевой муки, белкового концентрата и масла.

Один из вариантов осуществления изобретения относится к способу борьбы с насекомыми-вредителями соевых бобов, семян, кормовой муки или пищевой муки, в которых содержится трансформант сои pDAB9582.816.15.1, где указанные бобы, семена, кормовая мука или пищевая мука содержат ДНК, включающую одну или более последовательностей, выбранных из группы, состоящей из п.о. в положениях l258-1288 SEQ ID NO: 1; п.о. в положениях 1223-1323 SEQ ID NO: 1; п.о. в положениях 1173-1373 SEQ ID NO: 1; п.о. в положениях 1073-1473 SEQ ID NO: 1; п.о. в положениях 160-190 SEQ ID NO: 2; п.о. в положениях 125-225 SEQ ID NO: 2; и п.о. в положениях 75-275 SEQ ID NO: 2, и их комплементов.

Один из вариантов осуществления изобретения относится к семенам сои, содержащим в своем геноме последовательность ДНК, выбранную из группы, состоящей из п.о. в положениях l258-1288 SEQ ID NO: 1; п.о. в положениях 1223-1323 SEQ ID NO: 1; п.о. в положениях 1173-1373 SEQ ID NO: 1; п.о. в положениях 1073-1473 SEQ ID NO: 1; п.о. в положениях 160-190 SEQ ID NO: 2; п.о. в положениях 125-225 SEQ ID NO: 2; и п.о. в положениях 75-275 SEQ ID NO: 2, и ее комплементы. Другой вариант осуществления изобретения относится к семенам сои, содержащим в своем геноме гены crylF, crylAc и pat трансформанта сои pDAB9582.816.15.1, и к репрезентативным семенам сои, депонированным в Американской коллекции типовых культур под регистрационным номером PTA-12588. Другой вариант осуществления изобретения относится к растению сои, выращенному путем культивирования семян сои согласно любому из этих двух вариантов. Другой вариант осуществления изобретения относится к семенам сои, продуцированным этим растением сои, где указанные семена содержат в своем геноме гены crylF, crylAc и pat трансформанта сои pDAB9582.816.15.1, которые присутствуют в семенах сои, депонированных в Американской коллекции типовых культур под регистрационным номером PTA-12588. Другой вариант осуществления изобретения относится к части этого растения сои, где указанная часть выбрана из группы, состоящей из пыльцы, овулей, цветков, побегов, корней и листьев, и где указанная часть содержит указанный трансформант. Другой вариант осуществления изобретения относится к композиции, полученной из растения сои или его части, где указанной композицией является пищевой продукт, выбранный из группы, состоящей из кормовой соевой муки, пищевой муки и масла.

В другом варианте осуществления изобретения, растение сои содержит последовательность ДНК, которая по меньшей мере на 95% идентична последовательности SEQ ID NO: 14. Один из вариантов осуществления изобретения относится к потомству растения сои согласно вышеуказанному варианту, где указанное растение обладает устойчивостью к гербициду глюфозинату, где указанная устойчивость обусловлена экспрессией белка, кодируемого в указанном трансформанте или в указанном геноме.

Другой вариант осуществления изобретения относится к семенам сои, содержащим геном, включающий последовательность ДНК, которая по меньшей мере на 95% идентична последовательности SEQ ID NO: 14. Другой вариант осуществления изобретения относится к растению, выращенному путем культивирования этих семян сои.

Один из вариантов осуществления изобретения относится к трансгенному растению сои или к его части, включающим трансформант сои pDAB9582.816.15.1, где репрезентативные семена сои, содержащие трансформант сои pDAB9582.816.15.1, были депонированы в Американской коллекции типовых культур под регистрационным номером PTA-12588.

Депонирование семян

За время разработки настоящего изобретения, по меньшей мере 2500 семян линии сои, содержащей трансформант pDAB9582.816.15.1, были депонированы в Американской коллекции типовых культур (ATCC), 10801 University Boulevard, Manassas, VA, 20110, и являются общедоступными без каких-либо ограничений (но в соответствии с патентным правом). Этот депозит был зарегистрирован в ATCC под депозитарным номером No. PTA-12588 23 февраля 2012 г. компанией Dow AgroSciences LLC. Указанный депозит был положен на хранение согласно Будапештскому договору о депонировании семян в целях проведения патентной процедуры.

Краткое описание последовательностей

SEQ ID NO: 1 представляет собой 5'-фланкирующую граничную последовательность ДНК трансформанта сои pDAB9582.816.15.1. Нуклеотиды 1-1273 составляют геномную последовательность. Нуклеотиды 1274-1577 составляют последовательность вставки.

SEQ ID NO: 2 представляет собой 3'-фланкирующую граничную последовательность ДНК трансформанта сои pDAB9582.816.15.1. Нуклеотиды 1-175 составляют последовательность вставки. Нуклеотиды 176-316 составляют реаранжированную последовательность pDAB9582. Нуклеотиды 317-1687 составляют геномную последовательность.

SEQ ID NO: 3 представляет собой последовательность T-цепи ДНК pDAB9582, которая указана ниже в таблице 1.

SEQ ID NO: 4 представляет собой олигонуклеотидный праймер 81615_FW2 для подтверждения 5'-граничной геномной ДНК.

SEQ ID NO: 5 представляет собой олигонуклеотидный праймер 81516_RV1 для подтверждения 3'-граничной геномной ДНК.

SEQ ID NO: 6 представляет собой олигонуклеотидный праймер 81516_RV2 для подтверждения 3'-граничной геномной ДНК.

SEQ ID NO: 7 представляет собой олигонуклеотид 81516_RV3 для подтверждения 3'-граничной геномной ДНК.

SEQ ID NO: 8 представляет собой олигонуклеотидный праймер 5'IREnd-01 для подтверждения 5'-граничной геномной ДНК.

SEQ ID NO: 9 представляет собой олигонуклеотидный праймер 5'IREnd-02 для подтверждения 5'-граничной геномной ДНК.

SEQ ID NO: 10 представляет собой олигонуклеотидный праймер AtUbi10RV1 для подтверждения 5'-граничной геномной ДНК.

SEQ ID NO: 11 представляет собой олигонуклеотидный праймер AtUbi10RV2 для подтверждения 5'-граничной геномной ДНК.

SEQ ID NO: 12 представляет собой олигонуклеотидный праймер 3'ATEnd05 для подтверждения 3'-граничной геномной ДНК.

SEQ ID NO: 13 представляет собой олигонуклеотидный праймер 3'TATEnd06 для подтверждения 3'-граничной геномной ДНК.

SEQ ID NO: 14 представляет собой предполагаемую последовательность трансформанта сои pDAB9582.816.15.1. Эта последовательность включает геномную 5'-фланкирующую последовательность, последовательность-вставку T-цепи pDAB9582 и 3'-фланкирующую геномную последовательность.

Краткое описание графического материала

На фигуре 1 представлена карта плазмиды pDAB9582, содержащей кластеры экспрессии генов cry1F v3, cry1Ac synpro и pat v6.

На фигуре 2 указана локализация праймеров для подтверждения 5'- и 3'-граничной последовательности трансформанта сои pDAB9582.816.15.1.

На фигуре 3 представлена геномная последовательность, расположенная в определенном порядке в трансформанте сои pDAB9582.816.15.1.

Подробное описание настоящего изобретения

Оба конца последовательности-вставки трансформанта сои pDAB9582.816.15.1 были секвенированы и охарактеризованы. Были разработаны трансформант-специфические анализы. Этот трансформант был также картирован по геному сои (хромосоме сои 03). Данный трансформант может быть подвергнут интрогрессии с получением более элитных линий.

Как упоминалось выше в разделе «Предшествующий уровень техники», встраивание и интеграция трансгена в геном растения включает некоторые случайные события (и следовательно, слово «событие» включает такое встраивание). То есть, многие методы трансформации, такие как трансформация агробактерией, биобаллистическая трансформация (то есть, посредством «выстреливания» генов) и трансформация, опосредуемая карбидом кремния (то есть, WHISKERS™), не позволяют предсказать, в какой участок генома встраивается данный трансген. Таким образом, идентификация фланкирующей геномной ДНК растения на обеих сторонах вставки может иметь важное значение для идентификации растения, имеющего данную вставку. Так, например, могут быть сконструированы ПЦР-праймеры, которые генерируют ПЦР-ампликон по всей области стыка вставки и генома хозяина. Этот ПЦР-ампликон может быть использован для идентификации уникальной вставки или вставки другого типа.

Для лучшего понимания вариантов изобретения и для облегчения практического осуществления этих вариантов специалистом в данной области, в описании настоящего изобретения приводятся определения терминов и примеры. Если это не оговорено особо, то такие термины имеют общепринятые значения, известные специалисту в области, к которой относится настоящее изобретение. Номенклатура оснований ДНК приводится в соответствии со ст. 37 Кодекса законов США (CFR) в §1.822.

Используемый здесь термин «потомство» означает потомство любого поколения родительского растения, которое содержит трансформант сои pDAB9582.816.15.1.

«Трансгенное растение с генной модификацией» [или «трансформант»] («event») получают путем трансформации клеток растений гетерологичной ДНК, то есть, конструкцией нуклеиновой кислоты, включающей представляющие интерес трансгены; регенерации популяции растений, полученных после встраивания трансгена в геном растения; и отбора конкретного растения, отличающегося тем, что оно имеет инсерцию в конкретном положении генома. Термин «трансгенное растение с генной модификацией» («event») означает исходный трансформант и потомство трансформанта, которые включают гетерологичную ДНК. Термин «трансгенное растение с генной модификацией» («event») также означает потомство растения, продуцированного посредством полового ауткроссинга трансформанта и растения другого сорта, включающего геномную/трансгенную ДНК. Даже после повторного возвратного скрещивания с рекуррентным родителем, встроенная трансгенная ДНК и фланкирующая геномная ДНК (геномная/трансгенная ДНК), происходящая от трансформированного родителя, присутствует в потомстве этого кросса в том же самом хромосомном участке. Термин «трансформант» («event») также означает ДНК исходного трансформанта и его потомства, содержащих встроенную ДНК и фланкирующую геномную последовательность, расположенную в непосредственной близости от встроенной ДНК, которая, как предполагается, должна передаваться потомству, приобретающему эту встроенную ДНК, включая представляющий интерес трансген, в результате полового скрещивания одной родительской линии, которая содержит встроенную ДНК (например, исходного трансформанта и его потомства, продуцируемого после самоопыления), и родительской линии, которая не содержит встроенную ДНК.

«Последовательность стыка» или «граничная последовательность» охватывает положение, в котором ДНК, встроенная в геном, присоединена к ДНК генома нативного растения сои, фланкирующего положение вставки, причем, идентификация или детектирование одной или другой последовательности стыка в растительном генетическом материале будут достаточными для выявления такого трансформанта. Настоящее изобретение включает последовательности ДНК, которые охватывают инсерции в описанных здесь трансформантах сои и фланкирующую ДНК аналогичной длины. Конкретные примеры таких диагностических последовательностей описаны в настоящей заявке, однако, в настоящем изобретении могут быть использованы и другие диагностические последовательности, которые перекрываются с последовательностями стыка указанных вставок или с последовательностями стыка указанных вставок и геномной последовательности, и такие последовательности могут быть использованы в соответствии с вариантами осуществления изобретения.

Варианты осуществления изобретения, в частности, относятся к идентификации событий трансформации с использованием таких фланкирующих последовательностей, последовательностей стыка и последовательностей вставки. Варианты осуществления изобретения включают использование родственных ПЦР-праймеров и ампликонов. В соответствии с вариантами осуществления изобретения, для детектирования или идентификации коммерчески доступных сортов или линий трансгенной сои, выведенных из запатентованных линий трансгенной сои, могут быть применены методы ПЦР-анализа с использованием ампликонов, которые охватывают встроенную ДНК и ее граничные области.

Фланкирующие последовательности/последовательности стыка используются в качестве диагностических признаков присутствия трансформантов сои pDAB9582.816.15.1. На основе этих последовательностей были получены трансформант-специфические праймеры. ПЦР-анализ показал, что эти линии растения сои могут быть идентифицированы по различным генотипам сои путем анализа ПЦР-ампликонов, полученных с использованием наборов этих трансформант-специфических праймеров. Таким образом, эти и другие аналогичные процедуры могут быть применены для идентификации уникальности этих линий растения сои. Идентифицированные здесь последовательности являются уникальными.

Способы детектирования согласно вариантам изобретения являются особенно ценными, если их применять в комбинации со скрещиванием растений, где после определения какое именно потомство растения содержит данный трансформант, родительское растение, содержащее представляющий интерес трансформант, может быть скрещено с линией другого растения для сообщения потомству одного или более дополнительных представляющих интерес признаков. Эти методы с применением ПЦР-анализов являются предпочтительными для реализации программ по скрещиванию растений сои, а также по контролю качества, в частности, товарного семенного материала трансгенной сои. В настоящее время существуют и используются наборы для ПЦР-детектирования этих линий трансгеной сои. Это позволяет также ускорить регистрацию продукта и его поступление на реализацию.

Кроме того, для идентификации конкретной геномной локализции каждой вставки могут быть использованы фланкирующие/геномные последовательности сои. Эта информация может быть использована для получения молекулярных маркерных систем, специфичных для каждого трансформанта. Такие системы могут быть использованы для разработки ускоренной стратегии скрещивания и получения данных по сцеплению.

Кроме того, информация о фланкирующей последовательности может быть использована для исследования и характеризации процессов интеграции трансгенов, свойств сайта геномной интеграции, отбора трансформантов, стабильности трансгенов и их фланкирующих последовательностей, и экспрессии генов, (а в частности, процессов, относящихся к сайленсингу генов, профилю метилирования трансгенов, эффектам положений и к потенциальным элементам, ассоциированным с экспрессией, таким как MARS [области присоединения к матрице] и т.п.).

Исходя из всего вышесказанного, совершенно очевидно, что варианты осуществления изобретения включают семена, депонированные в АТСС под депозитарным номером No. РТА-12588 23 февраля 2012 г.компанией Dow AgroSciences LLC. Варианты осуществления изобретения также включают устойчивое к гербицидам растение сои, выращенное из семян, депонированных в АТСС под депозитарным номером No. РТА-12588 23 февраля 2012 г. компанией Dow AgroSciences LLC. Варианты осуществления изобретения также включают части указанного растения, такие как листья, образцы ткани, семена, полученные от указанного растения, пыльца и т.п. (где указанные части растения содержат cryIF, cry1Ac, pat и SEQ ID NO: 1 и 2).

Кроме того, варианты осуществления изобретения также включают потомство растений и/или потомство растений, выращенных из депонированных семян, а предпочтительно, семян растения сои, резистентного к гербицидам, где указанное растение имеет геном, содержащий описанную здесь детектируемую последовательность «стыка»/фланкирующую последовательность дикого типа. Используемый здесь термин «соя» означает растение Glycine max и включает все его сорта, которые могут быть выведены путем скрещивания одного растения сои с другим растением сои.

Настоящее изобретение также включает способы получения кроссов с использованием растения согласно изобретению в качестве по меньшей мере одного родителя. Так, например, настоящее изобретение включает F₁-гибрид растения, имеющий, в качестве одного или двух родителей, любые описанные здесь растения. Настоящее изобретение также относится к семенам, продуцированным такими F₁-гибридами согласно изобретению. Настоящее изобретение включает способ продуцирования семян F₁-гибрида путем скрещивания описанного здесь растения с другим расте