Связывающие белки, ингибирующие взаимодействие vegf-a рецептора

Связывающие белки, ингибирующие взаимодействие vegf-a рецептора

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область изобретения

Изобретение касается рекомбинантных связывающих белков, специфичных к VEGF-A, а также нуклеиновых кислот, кодирующих такие VEGF-A связывающие белки, фармацевтических композиций, содержащих такие белки, и применения таких белков в лечении опухолей и заболеваний глаз.

Предпосылки создания изобретения

Ангиогенез, рост новых кровеносных сосудов из уже существующих сосудов, является ключевым процессом в ряде патологических состояний, включая рост опухоли и заболевания глаз, в частности глазные болезни, связанные с неоваскуляризацией, такие как возрастная макулярная дегенерации (AMD) или диабетический макулярный отек (DME) (Carmeliet, P., Nature 438, 932-936, 2005). Сосудистые эндотелиальные факторы роста (VEGF) стимулируют ангиогенез и лимфангиогенез путем активации VEGF рецепторных (VEGFR) тирозинкиназ в клетках эндотелия (Ferrara, N., Gerber, Н.P. and LeCouter, J., Nature Med. 9, 669-676, 2003).

Семейство VEGF млекопитающих состоит из пяти гликопротеинов, известных под названием VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D (также известный как FIGF), и фактора роста плаценты (P1GF, также известный как PGF). VEGF-A, как было показано, является эффективной мишенью для антиангиогенной терапии (Ellis, L. М. and Hicklin, D.J., Nature Rev. Cancer 8, 579-591, 2008). VEGF-A лиганды связываются и активируют три структурно подобные рецепторные тирозинкиназы типа III, названные VEGFR-1 (также известная как FLT1), VEGFR-2 (также известная как KDR) и VEGFR-3 (также известная как FLT4). VEGF лиганды обладают отличительными связывающими особенностями для каждой из этих рецепторных тирозинкиназ, которые способствуют разнообразию их функций.

В ответ на связывание лиганда, VEGFR тирозинкиназа активирует сеть различных сигнальных нисходящих путей. VEGFR-1 и VEGFR-2 обнаруживаются, главным образом, на сосудистом эндотелии, в то время как VEGFR-3, в основном, обнаруживается на лимфатическом эндотелии. У всех этих рецепторов есть внеклеточный домен, один трансмембранный участок и консенсусная тирозинкиназная последовательность, прерванная доменом киназной вставки. Совсем недавно нейропилин (NRP-1), первоначально определенный в качестве рецептора для медиаторов нейронов семейства семафорина/коллапсина, как показано, действует в качестве изоформ-специфического рецептора к VEGF-A.

Различные изоформы VEGF-A, как известно, получают путем альтернативного сплайсинга из восьми экзонов в VEGF-A гене. Все изоформы содержат экзоны 1-5 и терминальный экзон, экзон 8. Экзоны 6 и 7, которые кодируют гепарин-связывающие домены, могут быть включены или исключены. Это дает начало семейству белков, называемых в соответствии с их номером аминокислоты: VEGF-A165, VEGF-A121, VEGF-A189, и так далее. Однако экзон 8 состоит из двух 3' сайтов сращивания в нуклеотидных последовательностях, которые могут быть использованы клеткой для создания двух семейств изоформ с одинаковой длиной, но разными С-терминальными аминокислотными последовательностями (Varey, A.H.R. et al., British J. Cancer 98, 1366-1379, 2008). VEGF-Axxx ("xxx" обозначает номер аминокислоты зрелого белка), проангиогенное семейство изоформ получается при использовании наиболее проксимальной последовательности в экзоне 8 (что приводит к включению экзона 8а). Совсем недавно описанные антиангиогенные VEGF-Axxxb изоформы получаются при использовании дистального сайта сплайсинга, 66 bp, дальше вдоль гена от проксимального сайта сплайсинга. Это приводит к сплайсингу из экзона 8а и производству последовательностей мРНК, кодирующих семейство VEGF-Axxxb. VEGF-A 165 является преобладающей проангиогенной изоформой и обычно сверхэкспрессируется в различных человеческих солидных опухолях. VEGF-A165b было первой из установленных кодируемых экзоном 8b изоформ и, как показано, обладает антиангиогенными эффектами (Varey et al., loc. cit.; Konopatskaya, O. et al., Molecular Vision 12, 626-632, 2006). Это эндогенная ингибиторная форма VEGF-A, которая уменьшает VEGF-A индуцированную пролиферацию и миграцию клеток эндотелия. Хотя он может связываться с VEGFR-2, VEGF-A165b связывание не приводит к фосфорилированию рецептора или активации нисходящих сигнальных путей.

Существует несколько подходов к ингибированию VEGF-сигнализации, в том числе нейтрализация лиганда или рецептора антителами, и блокирование активации и сигнализации VEGF-A рецептора с помощью ингибиторов тирозинкиназы. VEGF-A-направленная терапия, как было показано, является эффективной в качестве монотерапии при AMD, DME, почечно-клеточной карциноме и гепатоцеллюлярной карциноме, а то время как она приносит пользу только в комбинации с химиотерапией у пациентов с метастатическим колоректальным раком, немелкоклеточным раком легких и метастатическим раком молочной железы (Narayanan, R. et al., Nat Rev. Drug Discov. 5, 815-816,2005; Ellis and Hicklin, loc. cit).

Помимо антител, для нейтрализации лиганда или рецептора могут быть использованы другие связывающие домены (Skerra, A., J. Mol. Recog. 13, 167-187, 2000; Binz, Н.К., Amstutz, P. and Pliickthun, A., Nat. Biotechnol. 23, 1257-1268, 2005). Один из таких новых классов связывающих доменов основан на спроектированных повторных доменах (WO 02/20565; Binz, Н.К., Amstutz, P., Kohl, A., Stumpp, М.Т., Briand, С., Forrer, P., Grütter, М.G., and Pliickthun, A., Nat. Biotechnol. 22, 575-582, 2004). WO 02/20565 описывает, насколько большие библиотеки повторных белков могут быть построены и их общее применение. Тем не менее, WО 02/20565 не раскрывает ни выбора повторных доменов со специфичностью связывания с VEGF-Axxx, ни конкретных повторных мотивов последовательности повторных доменов, которые специфически связываются с VEGF-Axxx.

Таргетинг VEGF-A с помощью имеющихся в настоящее время терапий не является эффективным у всех пациентов или от всех болезней (например, EGFR-экспрессирующие типы рака). Стало даже более очевидно, что терапевтический эффект, связанный с VEGF-A направленной терапией, является сложным и, вероятно, включает в себя несколько механизмов (Ellis and Hicklin, loc. cit.). Например, присутствующие на рынке анти-VEGF препараты, такие как бевацизумаб (Авастин®) или ранибизумаб (Lucentis®) (см. WO 96/030046, WO 98/045331 и WO 98/045332), или препараты в клинической разработке, такие как VEGF-Trap® (WO 00/075319) не делают различий между про- и антиангиогенными формами VEGF-A, так что они ингибируют обе. Как результат, они подавляют ангиогенез, а также лишают здоровые ткани существенного фактора выживания, а именно VEGF-Axxxb, что приводит к развитию цитотоксичности и ограничивающих дозу побочных эффектов, которые в свою очередь ограничивают эффективность. Побочные эффекты, которые присущи текущим анти-VEGF-A видам терапии, включают желудочно-кишечные перфорации, кровотечение, гипертензию, тромбоэмболии и протеинурию (Kamba, Т. and McDonald, D.M., Br. J. Cancer 96, 1788-95, 2007). Таким образом, существует необходимость улучшения антиангиогенных препаратов для лечения рака и других патологических состояний.

Технические проблемы, лежащие в основе изобретения, заключаются в выявлении новых антиангиогенных агентов, таких как повторные домены со специфичностью связывания с VEGF-Axxx, для улучшения лечения рака и других патологических состояний, например глазных болезней, таких как AMD или DME. Решение этой технической задачи достигается путем предоставления вариантов осуществления, которые характеризуются в формуле изобретения.

Краткое описание изобретения

Изобретение касается связывающего белка, включающего связывающий домен, в котором указанный связывающий домен ингибирует связывание VEGF-Axxx с VEGFR-2 и в котором температура денатрурации средней точки (Tm) указанного связывающего домена превышает 40°С при термальном развертывании, и он образует менее 5% (по весу) нерастворимых агрегатов при концентрации до 10 г/л в течение инкубации при температуре 37°С в течение 1 дня в PBS. Более конкретно, изобретение касается рекомбинантного связывающего белка, содержащего, по меньшей мере, один повторный домен, причем указанный повторный домен связывается с VEGF-Axxx с K_d ниже 10^-7 М и ингибирует связывание VEGF-Axxx с VEGFR-2. В частности, такой связывающий белок ингибирует прорастание сфероидов HUVEC со значением IC₅₀ ниже 10 нМ и такой связывающий белок имеет константу диссоциации для взаимодействия с VEGF-Axxxb, которая, по крайней мере, в 10 раз выше по сравнению с K_d для взаимодействие с VEGF-Axxx.

В частности, изобретение касается рекомбинантного связывающего белка, включающего связывающий домен со специфичностью к VEGF-A, который представляет собой повторный домен, например анкириновый повторный домен, в частности анкириновый повторный домен, включающий повторный модуль с анкириновым повторным мотивом последовательности

где 1, 2, 3, 4, 5, 6 и 7, представляют, независимо друг от друга, аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из A, D, Е, F, Н, I, К, L, М, N, Q, R, S, Т, V, W и Y.

Изобретение также касается рекомбинантного связывающего белка, включающего повторный домен со специфичностью связывания к VEGF-A, который имеет по крайней мере 70% идентичность аминокислотной последовательности с анкириновым повторным доменом настоящего изобретения или который включает в себя повторный модуль по крайней мере с 70% идентичностью аминокислотной последовательности с анкириновым повторным модулем настоящего изобретения, или в котором один или более аминокислотных остатков анкириновых повторных модулей обмениваются на аминокислотный остаток, обнаруженный в соответствующей позиции при выравнивании анкиринового повторного звена.

Изобретение также касается связывающих белков, включающих рекомбинантный связывающий белок изобретения, связанный с одним или несколькими дополнительными фрагментами, например фрагментом, который также связывается с VEGFR-2 или другой мишенью, фрагментом мечения, фрагментом, который облегчает очистку белка, или фрагментом, который обеспечивает улучшенную фармакокинетику, например полиэтиленгликолевый фрагмент. В некоторых вариантах изобретения дополнительный фрагмент представляет собой белковый фрагмент. В некоторых других вариантах изобретения дополнительный фрагмент представляет собой небелковый полимерный фрагмент.

Кроме того, изобретение касается молекул нуклеиновой кислоты, кодирующих рекомбинантные связывающие белки настоящего изобретения, а также фармацевтической композиции, содержащей один или несколько из вышеупомянутых связывающих белков или молекул нуклеиновых кислот.

Кроме того, изобретение касается способа лечения рака и других патологических состояний, например глазных болезней, таких как AMD или DME, с использованием белков изобретения.

Краткое описание фигур

Фигура 1. Специфическое связывание собачьего VEGF-Al64 выбранных спроектированных анкириновых повторных белков.

Взаимодействие выбранных клонов с собачьим VEGF-A164 (VEGF) и белком отрицательного контроля (МВР, мальтоза-связывающий белок Е. coli) показан с помощью ИФА неочищенного экстракта. Биотинилированный собачий VEGF-A164 и МВР были иммобилизированы над NeutrAvidin. Номера относятся к отдельным клонам DARPin, выбранных в рибосомном дисплее в сравнении с собачьим VEGF-A164 или соответствующим человеческим VEGF-A165. А = абсорбция. Белые колонки указывают на связывание с собачьим VEGF-A164, черные колонки показывают неспецифическое фоновое связывание с МВР.

Фигура 2. Ингибирование прорастания сфероидов выбранным DARPin.

Длина прорастаний в анализе ингибирования прорастания сфероидов показана в присутствии различных концентраций (a) DARPin №30 (SEQ ID NO: 29), DARPin со специфичностью к VEGF-Axxxx, или (b) DARPin NC, DARPin отрицательного контроля без специфичности к VEGF-Axxx.

Фигура 3. Специфичное распознавание VEGF-изоформ.

Анализ поверхностного плазмонного резонанса (SPR) связывающих белков на VEGF-A изоформах.

(а) и (b): SPR анализ Avastin®. 250 нМ Авастина® внесли в проточную ячейку с иммобилизованным собачьим VEGF-A164 (а) или собачьим VEGF-A164b (b) на 100 секунд, с последующей промывкой потоком буфера.

(с) и (d): SPR анализ DARPin №27 (SEQ ID NO: 16). 250 нМ DARPin №27 внесли в проточную ячейку с иммобилизованным собачьим VEGF-A164 (с) или собачьим VEGF-A164b (d) на 100 секунд, с последующей промывкой потоком буфера. RU = единицы резонанса.

Фигура 4. Эффективное ингибирование человеческого VEGF-A165 в глазу кролика. Кроличья модель сосудистой утечки для демонстрации эффективности DARPin в ингибировании человеческого VEGF-A165 в глазу по сравнению с Lucentis®. На 1-й день либо PBS, DARPin №30 или Lucentis® вводили путем интравитреальной инъекции в один глаз каждого кролика (обработанный глаз). На 4-й день или 30-й день в оба глаза каждого кролика ввели путем интравитреальной инъекции 500 нг человеческого VEGF-A165. Оба глаза оценивали через 48 часов после инъекции VEGF-А165 путем измерения содержания флуоресцеина в стекловидном теле и сетчатке глаза через один час после внутривенного введения натрия флуоресцеина. R = соотношение измерений флуоресцеина в обработанном глазу/необработанном глазу. Стандартные отклонения показаны планкой погрешностей. 4-PBS = соотношение через 4 дня после инъекции PBS (контроль); 4-D = соотношение через 4 дня после введения DARPin №30; 30-D = соотношение через 30 дней после введения DARPin №30; 4-L = соотношение через 4 дня после введения Lucentis®; 30-L = соотношение через 30 дней после введения Lucentis®.

Подробное описание изобретения

VEGF-A млекопитающих существует в виде двух семейств альтернативных сплайсинговых изоформ: (I) проангиогенные «VEGF-Аххх» изоформы, полученные путем проксимального сплайсинга экзона 8, и (II) антиангиогенные «VEGF-Axxxb» изоформы, полученные путем дистального сплайсинга экзона 8. Предпочтительно, связывающий домен в соответствии с изобретением является специфическим для проангиогенного VEGF-Axxx собаки, кроликов, обезьян или человеческого происхождения. Более предпочтительно, связывающий домен в соответствии с изобретением является специфическим для проангиогенного VEGF-Axxx человеческого происхождения. Наиболее предпочтительно, связывающий домен в соответствии с изобретением является специфическим для человеческого VEGF-A165.

Термин «белок» касается полипептида, в котором по крайней мере часть полипептида имеет или может приобрести определенное трехмерное расположение путем формирования вторичных, третичных и четвертичных структур внутри и/или между полипептидной(-ыми) цепью (-ями). Если белок состоит из двух или более полипептидов, отдельные полипептидные цепи могут быть связаны нековалентно или ковалентно, например, с помощью дисульфидных связей между двумя полипептидами. Часть белка, каждая из которых имеет или может приобрести определенное трехмерное расположение путем формирования вторичной или третичной структуры, называется «домен белка». Такие домены белка хорошо известны практикующим специалистам в данной области.

Термин «рекомбинантный», используемый в терминах рекомбинантный белок, рекомбинантный домен белка и подобных означает, что указанные полипептиды производятся с использованием рекомбинантных ДНК-технологий, хорошо известных практикующим специалистам в соответствующих областях. Например, рекомбинантная молекула ДНК (например, полученная путем генного синтеза), кодирующая полипептид, может быть клонирована в бактериальную плазмиду экспрессии (например, pQE30, Qiagen). Когда такая сконструированная рекомбинантная плазмида экспрессии вставляется в бактерии (например, Е. coli), такие бактерии могут вырабатывать полипептид, кодируемый этой рекомбинантной ДНК. Соответственно, вырабатываемый полипептид называется рекомбинантным полипептидом.

Термин «полипептидный тег» касается аминокислотной последовательности, присоединенной к полипептиду/белку, отличающейся тем, что указанная аминокислотная последовательность используется для очистки, обнаружения или таргетирования указанного полипептида/белка, или в которой указанная аминокислотная последовательность улучшает физико-химическое поведение полипептида/белка, или отличающейся тем, что указанная аминокислотная последовательность обладает эффекторной функцией. Отдельные полипептидные теги, фрагменты и/или домены связывающего белка могут быть связаны друг с другом непосредственно или с помощью полипептидных линкеров. Эти полипептидные теги хорошо известны в данной области и в полной мере доступны для специалиста в данной области. Примеры полипептидных тегов включают малые полипептидные последовательности, например, His, myc, FLAG или Strep-теги или фрагменты, такие как ферменты (например, ферменты, такие как щелочная фосфатаза), которые позволяют обнаруживать указанный полипептид/белок, или фрагменты, которые могут быть использованы для таргетинга (например, иммуноглобулины или их фрагменты) и/или в качестве эффекторных молекул.

Термин «полипептидный линкер» касается аминокислотной последовательности, которая может связать, например, два белковых домена, полипептидный тег и домен белка, домен белка и не-полипептидный фрагмент, такой как полиэтиленгликоль или две тега последовательности. Такие дополнительные домены, теги, не полипептидные фрагменты и линкеры известны специалистам в соответствующей области. Список примеров приводится в описании патентной заявки WO 02/20565. Конкретные примеры таких линкеров включают глицин-сериновые линкеры разной длины, предпочтительно, длина указанных линкеров составляет от 2 до 16 аминокислот.

В контексте настоящего изобретения термин «полипептид» касается молекулы, состоящей из одной или нескольких цепей множества, то есть двух или более, аминокислот, связанных с помощью пептидных связей. Предпочтительно, полипептид состоит более чем из восьми аминокислот, связанных с помощью пептидных связей.

Термин «связывающий белок» касается белка, включающего один или несколько связывающих доменов, как далее описывается ниже. Предпочтительно, указанный связывающий белок составляет до четырех связывающих доменов. Более предпочтительно, указанный связывающий белок содержит до двух связывающих доменов. Наиболее предпочтительно, указанный связывающий белок содержит только один связывающий домен. Кроме того, любой такой связывающий белок может содержать дополнительные домены белка, которые не являются связывающими доменами, фрагментами мультимеризации, полипептидными тегами, полипептидными линкерами и/или не белковыми полимерными молекулами.

Примеры фрагментов мультимеризации включают иммуноглобулиновые тяжелоцепочечные константные участки, которые спариваются, чтобы обеспечить функциональные иммуноглобулиновые Fc домены, и лейциновые зипперы или полипептиды, содержащие свободный тиол, который образует межмолекулярную дисульфидную связь между двумя такими полипептидами. Примеры небелковых полимерных молекул включают гидроксиэтилкрахмал (ГЭК), полиэтиленгликоль (ПЭГ), полипропиленгликоль или полиоксиалкилен.

Термин «пегилированный» означает, что ПЭГ фрагмент ковалентно связанный, например, с полипептидом изобретения.

Термин «связывающий домен» означает домен белка, имеющий ту же «складку» (трехмерное расположение), что и белковая платформа и с заданным свойством, как это определено ниже. Такой связывающий домен может быть получен путем рациональных, или чаще всего, комбинаторных методов белковой инженерии, техник, которые известны в данной области (Skerra, 2000, loc. cit.; Binz et al., 2005, loc. cit.). Например, связывающий домен с заданным свойством можно получить с помощью метода, включающего стадии: (а) предоставление разнообразной коллекции белковых доменов, имеющих ту же «складку», что и белковая платформа, как это определено ниже, и (б) скрининг указанной разнообразной коллекции и/или выбор из указанной разнообразной коллекции для получения по крайней мере одного домена белка, обладающего указанным заданным свойством. Разнообразная коллекция белковых доменов может быть предоставлена с помощью нескольких методов в соответствии с используемой системой скрининга и/или выбора и может включать в себя использование методов, хорошо известных специалистам в данной области, таких как фаговый дисплей или рибосомный дисплей.

Термин «белковая платформа» означает белок с открытыми площадями поверхности, в которых хорошо переносятся аминокислотные вставки, замены или делеции. Примеры белковых платформ, которые могут быть использованы для создания связывающих доменов настоящего изобретения, представляют собой антитела или их фрагменты, такие как одноцепочечные Fv или Fab фрагменты, белок А из Staphylococcus aureus, билин-связывающий белок из Pieris brassicae или другие липокалины, анкириновые повторные белки или другие повторные белки и человеческий фибронектин. Белковые платформы известны специалистам в данной области (Binz et al., 2005, loc. cit.; Binz et al., 2004, loc. cit.).

Термин «заданное свойство» касается свойства, такого как связывание с мишенью, блокирование мишени, активация мишень-опосредованной реакции, ферментативная активность, и связанные с ними другие свойства. В зависимости от типа желаемого свойства, специалист с обычными навыками сможет определить формат и необходимые шаги для проведения скрининга и/или выбора связывающего домена с нужным свойством. Предпочтительно, указанное заданное свойство является связыванием с мишенью.

Предпочтительно, связывающий белок из изобретения не представляет собой антитело или его фрагмент, такой как Fab или ScFv фрагменты. Антитела и их фрагменты хорошо известны специалистам в данной области. Также желательно, чтобы связывающий домен изобретения не содержал иммуноглобулиновой складки, как в антителах и/или фибронектиновом домене типа III. Иммуноглобулиновая складка является характерной складкой для всех β-белков, которая состоит из 2-слойного сэндвича из примерно 7 антипараллельных β-нитей, расположенных в два β-листа. Иммуноглобулиновые складки хорошо известны специалистам в данной области. Например, такие связывающие домены, включающие иммуноглобулиновую складку, описаны в WO 07/080392 и WO 08/097497.

Далее предпочтительно, чтобы связывающий домен изобретения не содержал иммуноглобулин-подобный домен, который содержится в VEGFR-1 или VEGFR-2. Такие связывающие домены описаны в WO 00/075319.

Предпочтительный связывающий домен является связывающим доменом с антиангиогенным эффектом. Антиангиогенный эффект связывающего домена может быть определен анализами, которые хорошо известны специалисту в данной области, такими как анализ прорастания сфероидов HUVEC, описанный в Примере 2.

Далее предпочтительным является связывающий домен, содержащий от 70 до 300 аминокислот, в частности 100-200 аминокислот.

Далее предпочтительным является связывающий домен, лишенный свободного остатка Cys. Свободный остаток Cys не участвует в образовании дисульфидных связей. Еще более предпочтительным является связывающий домен без каких-либо остатков Cys.

Предпочтительный связывающий домен изобретения представляет собой повторный домен или спроектированный повторный домен, предпочтительно, как описано в WO 02/20565.

Особенно предпочтительным связывающим доменом является спроектированный анкириновый повторный домен (Binz, Н. К. et al., 2004, loc. cit.), желательно, как описано в WO 02/20565. Примеры спроектированных анкириновых повторных доменов показаны в примерах.

Определения в дальнейшем для повторных белков основаны на указанных в патентной заявке WO 02/20565. Патентная заявка WO 02/20565 дополнительно содержит общее описание характеристик, методов и применений повторных белков.

Термин «повторный белок» касается белка, включающего один или несколько повторных доменов. Предпочтительно, каждый из указанных повторных белков составляет до четырех повторных доменов. Более предпочтительно, каждый из указанных повторных белков содержит до двух повторных доменов. Наиболее предпочтительно, каждый из повторных белков включает в себя только один повторный домен. Кроме того, указанный повторный белок может содержать дополнительные неповторные белковые домены, полипептидные теги и/или полипептидные линкеры.

Термин «повторный домен» касается домена белка, состоящего из двух или более последовательных повторяющихся звеньев (модулей) в качестве структурных звеньев, причем указанные структурные звенья имеют ту же складку и компонуются плотно, для создания, например, сверхспиральной структуры, имеющей совместное гидрофобное ядро.

Термин «спроектированный повторный белок» и «спроектированный повторный домен» касается повторного белка или повторного домена, соответственно, полученного в результате изобретательской процедуры, объясненной в патентной заявке WO 02/20565. Спроектированные повторные белки и спроектированные повторные домены являются синтетическими, а не взятыми из природы. Они представляют собой полученные человеком белки или домены, соответственно, полученные путем экспрессии соответственно спроектированных нуклеиновых кислот. Предпочтительно, экспрессия осуществляется в эукариотических или прокариотических клетках, например бактериальных клетках, или с помощью бесклеточных систем экспрессии in vitro.

Термин «структурное звено» касается локально упорядоченной части полипептида, образованной путем трехмерных взаимодействий между двумя или более сегментами вторичной структуры, которые расположены вблизи друг друга вдоль полипептидной цепи. Такое структурное звено имеет структурный мотив. Термин «структурный мотив» касается трехмерного расположения элементов вторичной структуры, присутствующих хотя бы в одном структурном звене. Структурные мотивы хорошо известны специалистам в данной области. Структурные звенья сами по себе не в состоянии приобрести определенное трехмерное расположение, однако их последовательное расположение, например, в виде повторных модулей в повторном домене приводит к взаимной стабилизации соседних звеньев, что приводит к образованию сверхспиральной структуры.

Термин «повторное звено» касается аминокислотных последовательностей, включающих повторные мотивы последовательности из одного или нескольких природных повторных белков, причем указанные «повторные звенья» находятся в нескольких копиях, и которые обладают определенной топологией складывания, общей для всех указанных мотивов, определяющих складывание белка. Такие повторяющиеся звенья содержат каркасные остатки и остатки взаимодействия. Примерами таких повторяющихся единиц являются повторяющиеся звенья броненосца, лейцин-богатые повторяющиеся звенья, анкириновые повторяющиеся звенья, тетратрикопептидные повторяющиеся звенья, повторяющиеся звенья HEAT, и богатые лейцином вариантные повторяющиеся звенья. Природные белки, содержащие два или более таких повторяющихся звеньев, называют «природными повторными белками». Аминокислотные последовательности отдельных повторных звеньев повторного белка могут иметь значительное число мутаций, замен, добавлений и/или делеций при сравнении друг с другом, в то же время существенно сохраняя общий характер или мотив из повторяющихся звеньев.

Термин «каркасные остатки» касается аминокислотных остатков повторяющихся звеньев или соответствующих аминокислотных остатков повторных модулей, которые способствуют топологии складывания, т.е. которые вносят вклад в складывание указанного повторного звена (или модуля), или которые способствуют взаимодействию с соседним звеном (или модулем). Такой вклад может представлять собой взаимодействие с другими остатками в повторном звене (модуле), или влияние на конформацию полипептидной основы, которые содержатся в α-спирали или β-листах, или аминокислотных отрезков, образующих линейные полипептиды или петли.

Термин «остатки мишеневого взаимодействия» касается аминокислотных остатков повторяющихся звеньев или соответствующих аминокислотных остатков повторный модулей, которые способствуют взаимодействию с мишеневыми веществами. Такой вклад может представлять собой прямое взаимодействие с мишеневыми веществами, или влияние на другие, непосредственно взаимодействующие остатки, например, путем стабилизации конформации полипептида повторного звена (модуля), чтобы разрешить или повысить взаимодействие непосредственно взаимодействующих остатков с указанной мишенью. Такие остатки взаимодействия каркаса и мишени могут быть идентифицированы путем анализа структурных данных, полученных физико-химическими методами, такими как рентгеновская кристаллография, ЯМР и/или CD-спектроскопия, или путем сравнения с известной и связанной структурной информацией, хорошо известной практикующим специалистам в структурной биологии и/или биоинформатике.

Предпочтительно, чтобы повторные звенья, используемые для вывода повторного мотива последовательности, представляли собой гомологичные повторяющиеся звенья, в которых повторяющиеся звенья содержат тот же структурный мотив и в которых более 70% каркасных остатков указанных повторяющихся звеньев гомологичны друг другу. Предпочтительно, более 80% каркасных остатков указанных повторяющихся звеньев являются гомологичными. Наиболее предпочтительно, более 90% каркасных остатков указанных повторяющихся звеньев являются гомологичными. Компьютерные программы для определения процента гомологии между полипептидами, такие как Fasta, Blast или Gap, известны специалисту в данной области. Далее предпочтительно, чтобы повторные звенья, используемые для вывода повторного мотива последовательности, представляли собой гомологичные повторяющиеся звенья, полученные из повторных доменов, выбранных на мишени, например, как описано в Примере 1 и имеющих ту же мишень-специфичность.

Термин «повторный мотив последовательности» касается аминокислотной последовательности, которая выводится из одного или нескольких повторяющихся звеньев. Предпочтительно, указанные повторные звенья получают из повторных доменов, имеющих специфичность связывания для одной и той же мишени. Такие повторные мотивы последовательности содержат положения каркасных остатков и положения остатков мишеневых взаимодействий. Указанные положения каркасных остатков соответствуют положениям остатков мишеневого взаимодействия повторяющихся звеньев. Кроме того, указанные положения остатков мишеневого взаимодействия соответствуют положениям остатков мишеневого взаимодействия повторяющихся звеньев. Повторные мотивы последовательности содержат фиксированные положения и рандомизированные положения. Термин «фиксированное положение» касается положения аминокислоты в повторном мотиве последовательности, причем указанное положение установлено в конкретной аминокислоте. Чаще всего такие фиксированные положения соответствуют положениям каркасных остатков и/или положениям остатков мишеневых взаимодействий, которые являются специфическими для определенной мишени. Термин «рандомизированное положение» означает положение аминокислоты в повторном мотиве последовательности, в котором две или более аминокислот допускаются в указанном положении аминокислоты, например, в котором допускается любая из обычных двадцати природных аминокислот или в котором допускается большинство из двадцати природных аминокислот, таких как аминокислоты, отличные от цистеина, или аминокислоты, отличные от глицина, цистеина и пролина. Чаще всего такие рандомизированные положения соответствуют положениям остатков мишеневых взаимодействий. Однако могут быть также рандомизированы некоторые положения каркасных остатков.

Термин «топология складывания» касается третичной структуры указанных повторяющихся единиц. Топология складывания будет определяться участками аминокислот, образующими по крайней мере части α-спиралей или β-листов, или аминокислотных отрезков, образующих линейные полипептиды или петли, или любую комбинацию α-спиралей, β-листов и/или линейных полипептидов/петель.

Термин «последовательный» касается расположения, в котором повторяющиеся звенья или повторные модули расположены в тандеме. В спроектированных повторных белках существует по крайней мере 2, как правило, от 2 до 6, в частности по меньшей мере, 6, часто 20 или более повторных звеньев. В большинстве случаев повторяющиеся звенья будут обладать высокой степенью идентичности последовательности (те же самые аминокислотные остатки в соответствующих положениях) или сходством последовательности (аминокислотные остатки разные, но имеют сходные физико-химические свойства), а некоторые из аминокислотных остатков могут быть ключевыми остатками, которые сильно сохраняются в различных повторных звеньях, обнаруженных в природных белках. Однако высокая степень изменчивости последовательности аминокислотными вставками и/или делециями, и/или заменами между различными повторными звеньями, обнаруженными в природных белках, будет возможной до тех пор, пока поддерживается общая топология складывания.

Методы прямого определения топологии складывания повторных белков физико-химическими средствами, такими как рентгеновская кристаллография, ЯМР-спектроскопия или CD-спектроскопия, хорошо известны практикующим специалистам в данной области. Методы для выявления и определения повторяющихся звеньев или повторных мотивов последовательности или для выявления семейств родственных белков, включающих такие повторяющиеся звенья или мотивы, как поиск гомологии (BLAST и др.), хорошо зарекомендовали себя в области биоинформатики и хорошо известны практикующим специалистам в данной области. Шаг очистки начального повторного мотива последовательность может включать итеративный процесс.

Термин «повторные модули» касается повторных аминокислотных последовательностей спроектированных повторных доменов, которые изначально получены из повторных звеньев природных повторных белков. Каждый модуль, содержащийся в повторном домене, происходит от одного или нескольких повторяющихся звеньев семейства или подсемейства природных повторных белков, например семейства повторных белков броненосца или анкириновых повторных белков.

«Повторные модули» могут включать положения с аминокислотными остатками, присутствующими во всех копиях соответствующих повторных модулей («фиксированные положения»), и положения с различными или «рандомизированными» аминокислотными остатками («рандомизированные положения»).

Термин «кеппинг-модуль» касается полипептида, слитого с N- или С-терминальным повторным модулем повторного домена, в котором указанный кеппинг-модуль образует жесткие третичные взаимодействия с указанным повторным модулем, тем самым обеспечивая покрытие, прикрывающее гидрофобное ядро указанного повторного модуля на стороне, не контактирующей с последовательным повторным модулем, от растворителя. Указанный N- и/или С-терминальный «кеппинг-модуль» может быть получен из кеппинг-единицы или другого домена, обнаруженного в природном повторном белке, соседствующем с повторным звеном. Термин «кеппинг-единица» касается природного сложенного полипептида, в котором указанный полипептид определяет особенности структурной единицы, которая N- или С-терминально слитая с повторным звеном, причем указанный полипептид формирует жесткие третичные взаимодействия с указанным повторным звеном, тем самым обеспечивая покрытие, прикрывающее гидрофобное ядро указанного повторного звена с одной стороны от растворителя. Такие кеппинг-единицы могут иметь сходство с последовательностью указанного повторного мотива последовательности. Кеппинг-модули и кеппинг-повторы описаны в WO 02/020565. Например, N-терминальный кеппинг-модуль SEQ ID NO: 21 кодируется аминокислотами из положения с 1 по 32.

Также предпочтительным является такой N-терминальный кеппинг-модуль, содержащий глициновый или аспартатный остаток в положении 5.

Термин «мишень» касается отдельной молекулы, такой как молекула нуклеиновой кислоты, полипептид или белок, углевод или любая другая природная молекула, включая любую часть такой отдельной молекулы или комплексы двух или более таких молекул. Мишень может представлять собой целую клетку или образец ткани, или может представлять собой любую не-природную молекулу или фрагмент. Предпочтительно, мишень представляет собой природный или неприродный полипептид или полипептид, содержащий химические модификации, например, модифицированный путем природного или неприродного фосфорилирования, ацетилирования или метилирования. В частном применении настоящего изобретения мишень представляет собой VEGF-Axxx или VEGFR-2.

Термин «консенсусная последовательность» касается аминокислотной последовательности, причем указанная консенсусная последовательность получается путем структурного выравнивания и/или выравнивания последовательности нескольких по