Гены и белки для синтеза алканоил-соа

Гены и белки для синтеза алканоил-соа

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Перекрестная ссылка на родственную заявку

Настоящая заявка относится к патентным притязаниям по Предварительной Заявке США с номером USSN 61/507,331, поданной 13 июля 2011 г., содержание которой полностью включено в настоящий документ.

Область изобретения

Настоящее изобретение относится к молекулам нуклеиновой кислоты и белков, участвующих в синтезе тиоэфиров алканоил-кофермента-А, и к использованию молекул и белков нуклеиновой кислоты для инженерного биосинтеза каннабиоидов в растениях, микроорганизмах или бесклеточных системах и для получения конопли с повышенным или пониженным содержанием каннабиоидов.

Уровень техники

Конопля посевная L. (каннабис, конопля, марихуана) - это одно из самых распространенных древнейших одомашненных растений, которое в настоящее время используется в медицинских, пищевых, косметических и промышленных целях. Конопля также известна тем, что она применяется в качестве нелегального наркотического средства по причине содержания в ней психоактивных каннабиоидов (например, Δ⁹-тетрагидроканнабинол, Δ⁹-ТНС). Проводится исследование терапевтического применения каннабиоидов и прочих наркотических веществ, действующих через каннабиоидные рецепторы млекопитающих, для лечения различных состояний, например, хронических болей, рассеянного склероза и эпилепсии.

Биосинтез каннабиоидов происходит как в поликетидном, так и в терпеноидном метаболизме. Канабиоиды называются терпенофенолами или пренилированными поликетидами (Page J., Nagel J. (2006) Биосинтез терпенофенолов в хмеле и конопле. JT Romeo, ред. Интегративная растительная биохимия. Том 40. Elsevier, Оксфорд, стр. 179-210.). Биосинтез каннабиоидов в основном происходит в грандулярных трихомах, которые плотно покрывают женские цветы. Каннабиоиды образуются в биосинтетическом процессе, состоящем из трех этапов: образование поликетида, ароматическое пренилирование и циклизация (см. Фигуру 1 (Figure 1)).

Первый энзимный этап в биосинтезе каннабиоидов - это образование оливетоловой кислоты с помощью фермента поликетид-синтазы, которая катализирует конденсацию гексаноил-кофермента-А (СоА) тремя молекулами малонил-кофермента-А. Основные каннабиоиды, в т.ч. Δ⁹-тетрагидроканнабиноловая и каннабидиоловая кислоты, образуются из прекурсора гексаноил-кофермент-А, который является жирным акил-коферментом А средней цепи (см. Фигуру 1). Прочие каннабиоиды с разными боковыми цепями образуются из альфатических коферментов А разной длины (например, Δ⁹-тетрагидроканнабивариновая кислота образуется из затравки n-бутирил-кофермент-А).

Гексаноил-кофермент-А и прочие акил-кофермент-А-теоэфиры в растениях синтезируются акил-активирующими энзимами (ААЭ, также называемыми акил-кофермент-А-синтетазами), которые катализируют активность субстратов карбоновой кислоты с помощью АТР. Эти энзимы активизируются на разных карбоксилатных кислотах короткой, средней, длинной и очень длинной цепи, прекурсорах жасмоната, кислотах производных фенилпропаноида (например, коричной кислоты) и прочих органических кислотах, например, малоновой, ацетатной и лимонной. В природе найдено очень мало акил-кофермент-А-синтетаз средней цепи. Было выявлено, что три растительных энзима A. thaliana, ААЕ7, At4g05160 и At5g63380 образуют гексаноил-кофермент-А из гексаноата (Шнейдер К и др. (2005). Новый тип пероксимальной акил-кофермент-А-синтетазы из Arabidopsis thaliana обладает каталитической способностью активировать биосинтетические прекурсоры жасмоновой кислоты. Журнал биологической химии 280: 13962-72; Shockey JM, Fulda MS, Browse J (2003). Arabidopsis содержит крупное суперсемейство акил-активирующих ферментов. Филогенетический и биохимический анализ выявил новый класс акил-коэнзим-синтетаз. Физиология растений 132: 1065-76.) Было выявлено, что акил-кофермент-А-синтетазы в Pseudomonas spp. активируются на жирных кислотах средней цепи, например, на гексаноате (Fernandez-Valverde M, Reglero A, Martinez-Bianco H, Luengo JM (1993) Очищение акил-коэнзим-А-лигазы Pseudomonas putida активируется целым рядом алифатических и ароматических субстрат. Прикладная микробиология окружающей среды 59: 1149-1154.)

Каннабиоиды - это ценные природные продукты. Гено-кодирующие энзимы, которые участвуют в биосинтезе каннабиоидов, пригодны для метаболической инженерии конопли с целью получения растений, которые содержат очень низкий уровень или нулевой уровень ТНСА (tetrahydrocannabinolic acid) и прочих каннабиоидов, в результате реализации целевого мутагенеза (например, через «TILLING») или прочих методов нокаута генов. Такие гены могут также пригодиться для создания, посредством маркерного отбора, специфичных разновидностей конопли, используемых для каннабиоидо-содержащих лекарственных средств, или для биосинтеза каннабиоидов в таких гетерологичных организмах, как бактерии или дрожжи, или для получения каннабиоидов в бесклеточных системах, с применением рекомбинантных белков.

В биосинтезе каннабиоидов, энзимы, участвующие в кодировании генов, также могут применяться для синтеза аналогов и прекурсоров каннабиоидов. В прошлом уже были синтезированы аналоги каннабиоидов, используемые в фармацевтике.

В науке до сих пор существует потребность идентифицировать энзимы и нуклеотидные последовательности, кодирующие эти энзимы, которые участвуют в синтезе ароматических поликетидов.

Сущность изобретения

В конопле были обнаружены два новых гена, которые кодируют ранее неизвестные алканоил-кофермент-А-синтетазы. Эти две новые алканоил-кофермент-А-синтетазы в настоящем документе обозначены как «Конопля посевная гексаноил-кофермент-А-синтетаза 1» (или «CsHCS1») и «Конопля посевная гексаноил-кофермент-А-синтетаза 2» (или «CsHCS2»).

Таким образом, в первом аспекте изобретения представлена изолированная или очищенная молекула нуклеиновой кислоты, содержащая нуклеотидную последовательность, имеющую идентичность с последовательностью SEQ ID NO: 1 по меньшей мере на 75%, или кодоновую вырожденную последовательность.

В втором аспекте изобретения представлена изолированная или очищенная молекула нуклеиновой кислоты, содержащая нуклеотидную последовательность, имеющую идентичность с последовательностью SEQ ID NO: 3 по меньшей мере на 75%, или кодоновую вырожденную последовательность.

В третьем аспекте изобретения представлен изолированный или очищенный полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую идентичность с последовательностью SEQ ID NO: 2 по меньшей мере на 85%, или консервативно замещенную аминокислотную последовательность.

В четвертом аспекте изобретения представлен изолированный или очищенный полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую идентичность с последовательностью SEQ ID NO: 4 по меньшей мере на 85%, или консервативно замещенную аминокислотную последовательность.

В пятом аспекте изобретения представлен вектор, конструкция или экспрессирующая система, содержащие молекулу нуклеиновой кислоты изобретения.

В шестом аспекте изобретения представлена клетка-акцептор, трансформированная молекулой нуклеиновой кислоты изобретения.

В седьмом аспекте изобретения представлен процесс синтезирования алканоил-кофермента-А в присутствии энзима изобретения.

В восьмом аспекте изобретения представлен процесс изменения уровня каннабиоидных соединений в организме, клетке или ткани с помощью молекулы нуклеиновой кислоты настоящего изобретения, или ее части, для подавления в организме, клетке или ткани гена, который кодирует энзим, катализирующий синтез алканоил-кофермента-А.

В девятом аспекте изобретения представлен процесс изменения уровня каннабиоидных соединений в организме, клетке или ткани, мутированием генов в организме, клетке или ткани, и с помощью молекулы нуклеиновой кислоты настоящего изобретения, с целью отбора организмов, клеток или тканей, которые содержат мутанты или варианты генов, кодирующих энзим, которые катализируют синтез алканоил-кофермента-А.

В десятом аспекте изобретения представлен процесс изменения уровня каннабиоидных соединений в организме, клетке или ткани, с помощью экспрессии или сверхэкспресии молекулы нуклеиновой кислоты изобретения в организме, клетке или ткани, относительно такого же вида организмов, клеток или тканей, выращиваемых в таких же условиях, но без экспрессии или сверхэкспрессии молекулы нуклеиновой кислоты.

В одиннадцатом аспекте изобретения представлен процесс изменения уровня каннабиоидных соединений в организме, клетке или ткани, с помощью экспрессии или сверхэкспрессии молекула нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид изобретения в организме, клетке или ткани, относительно такого же вида организмов, клеток или тканей, выращиваемых в таких же условиях, но без экспрессии или сверхэкспрессии молекулы нуклеиновой кислоты.

В двенадцатом аспекте изобретения представлен процесс синтезирования а естественных каннабиоидного соединения или искусственного аналога каннабиоидного соединения в организме, клетке или ткани, с помощью экспрессии молекулы нуклеиновой кислоты изобретения в организме, клетке или ткани в присутствии карбоновой кислоты и кофермента-А.

В тринадцатом аспекте настоящего изобретения представлен процесс синтезирования алканоил-кофермента-А с помощью бесклеточной реакции in vitro. В этот процесс входит реакция карбоновой кислоты с в присутствии энзима изобретения: коэнзима А.

К настоящему моменту были идентифицированы и описаны полипептиды, являющиеся энзимами, которые катализируют синтез алканоил-кофермента-А, и нуклеотидные последовательности, которые кодируют эти энзимы. Нуклеотидные последовательности могут применяться для получения, через выведение, селекцию или генетическую инженерию, конопли, которая имеет большее или меньшее содержание каннабиоидных соединений, их аналогов или комбинаций. Эти нуклеотидные последовательности могут также применяться, отдельно или в сочетании с генами, которые кодируют прочие этапы синтеза каннабиоидов, для инженерного биосинтеза каннабиоидов в прочих растениях или микроорганизмах (например, дрожжи, бактерии, грибки) или прочих прокариотических или эукариотических организмах или бесклеточных системах. Кроме того, блокирование или снижение экспрессии этих генов в конопле может применяться для блокирования биосинтеза каннабиоидов, тем самым снижая содержание каннабиоидов.

Дополнительные характеристики изобретения будут описаны или станут очевидны по ходу изложения нижеследующего детального описания.

Краткое описание чертежей

Чтобы изобретение было более понятным, далее детально описаны его воплощения в виде примеров, со ссылкой на сопроводительные чертежи, а именно:

На фигуре 1 изображен предлагаемый каскад реакций для получения основных каннабиоидов типа Конопля посевная. Аббревиатуры: ТНСА-синтаза - это синтаза Δ⁹-тетрагидроканнабиноловой кислоты; CBDA-синтаза - это синтаза каннабидиоловой кислоты; СВСА-синтаза - это синтаза каннабихроменовой кислоты.

На фигурах 2A-2F изображен анализ с помощью метода «хроматография жидкости-спектрометрия массы/спектрометрия массы», или LC-MS/MS-анализ, энзимной активности Конопли посевной гексаноил-кофермент-А-синтаз. На фигурах 2A-2F показаны распространенность ионов (m/z 866>359) по вертикальной оси и время (минуты) по горизонтальной оси. На Фигурах 2А и 2B изображено время удержания аутентичного стандарта гексаноил-кофермента-А. На фигуре 2С изображены анализ содержания белка CsHCS1, кофермента-А, MgCl₂, натрия гексаноата, АТР, и буфера HEPES, где был получен и выявлен гексаноил-кофермент-А. На Фигуре 2D изображен анализ содержания, в котором находится белок CsHCS2, кофермент-А, MgCl₂, натрий гексаноат, АТР, и буфер HEPES, где был получен гексаноил-кофермент-А. На фигуре 2Е изображен анализ, в котором находится белок CsHCS1 дезактивированный кипячением при температуре °C в течение 15 минут, кофермент-А, натрий гексаноат, АТР, и буфер HEPES, где не был получен гексаноил-кофермент-А. На фигуре 2F изображен анализ содержания, в котором находится белок CsHCS1 дезактивированный кипячением при температуре 95°С в течение 15 минут, кофермент-А, натрий гексаноат, АТР, и буфер HEPES, где не был получен гексаноил-кофермент-А.

На фигуре 3 изображены два графика, иллюстрирующих субстраты карбоновой кислоты, используемых энзимами изобретения. На Фигуре 3А изображены субстраты карбоновой кислоты, используемые CsHCS1. На Фигуре 3В изображены субстраты карбоновой кислоты, используемые CsHCS2.

На фигуре 4 изображен высокоэффективный хроматографический анализ жидкости продуктов, полученных сдвоенным анализом энзимного содержания, состоящего из Конопли посевной гексаноил-кофермент-А-синтетазы CsHCS2, малонил-кофермент-А-синтетазы (MCS), Конопли посевной оливетол-синтаза/поликетид-синтазы, и Конопли посевной синтазы оливетоловой кислоты. Элютированные соединения были выявлены с помощью адсорбции на уровне 263 нм и идентифицированы по одинаковому времени удержания в качестве изолированных стандартов, и по их массе, с помощью одиночного квадрупольного масс-детектора. Выявление оливетола и оливетоловой кислоты означает, что CsHCS2 способно обеспечить достаточно субстраты гексаноил-кофермента-А для синтеза оливетоловой кислоты. При проведении анализа без CsHCS2, кофермента-А или гексаноата, поликетидные продукты не были получены. HTAL = гексаноил-ацетил-ацето-уксусный лактон, PDAL = рентил-ацето-уксусный лактон, OA = оливетоловая кислота, OL = оливетол.

На Фигуре 5 изображен график получения оливетоловой кислоты в клетках дрожжей, модифицированных для выработки оливетоловой кислоты, используя CsHCS1 и CsHCS2 для синтеза гексаноил-кофермента-А, а также соединения коноплянной «оливетол-синтазы»/поликетид-синтазы (PKS) и синтазы оливетоловой кислоты (OAS) для формирования оливетоловой кислоты.

На Фигуре 6 изображен qRT-PCR-анализ экспрессии синтаз CsHCS1, CsHCS2 и CBDA в разных тканях культурного сорта конопли «Finola». Значения экспрессии гена относительно актина указаны как разница в складках и листьях, с принятым значением экспрессией в листе = 1. Во вставках изображена генная экспрессия в женских цветках с трихомами и без них, со значениями, также указанными, как разница в складках и листьях, R, корнях; S, стеблях; L, листьях; FF+, женских цветках с трихомами; FF-, женских цветках, где трихомы удалены по методу Бидбитера; Т, трихом; MF, мужских цветках. Средния значения: ±SD, n=3.

Описание предпочтительных воплощений

Была установлена последовательность генотеки трихом-специфичных сДНК конопли, с получением 9157 маркерных экспрессирующих последовательностей («EST»), которые были собраны в 4113 уникальные последовательности (1227 контигов, 2886 синглтонов). Унигены были аннотированы через сравнение с базой данных белков UniProt™ с помощью поиска в интернете и инструмента сравнения, который называется «blastx». Конопляные акил-активирующие энзимные белки были идентифицированы с помощью Arabidopsis акил-активирующих энзимных последовательностей, для осуществления запроса по собранным конопляным EST в интернет-поисковике и инструменте сравнения, который называется «tblastn». Были определены одиннадцать акил-активирующих энзима, и названы в соответствии с их транскриптной распространенностью в генотеке сДНК. Синтаза CsHCS1 была самым распространенным акил-активирующим энзимом по уровню транскрипции (42 EST); CsHCS2 имела меньшую распространенность (5 EST). В виду более высокого уровня транскрипции в трихомах и локализации CsHCS1 в цитоплазме, вероятно, этот энзим является акил-активирующим энзимом, участвующим в поставке гексаноил-кофермента-А в каннабиоидный каскад реакций. CsHCS2, которая локализуется в пероксисомах, возможно не участвует в образовании каннабиоидов. Однако, благодаря своим кинетическим свойствам, это -энзим, пригодный для синтезирования гексаноил-кофермента-А в гетерологичных акцепторах или бесклеточных системах.

Далее показана последовательность гена CsHCS1:

Конопля посевная CsHCS1-2163 bp (SEQ ID NO: 1)

Далее показана последовательность гена CsHCS2:

Конопля посевная CsHCS2-1547 bp (SEQ ID NO: 3)

CsHCS1 и CsHCS2 были усилены с помощью PCR, как описано в Примере 1 и активность алканоил-кофермента-А-синтетазы или кофермент-А-лигазы была измерена, как описано в Примере 2. Как показано на Фигуре 2, CsHCS1 и CsHCS2 катализируют получение алканоил-кофермента-А из карбоновой кислоты и кофермента-А.

Некоторые воплощения настоящего изобретения относятся к изолированной или очищенной молекуле нуклеиновой кислоты, молекуле, в которой содержится последовательность SEQ ID NO: 1 или имеется идентичность с SEQ ID NO: 1 по меньшей мере на 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99%.

Некоторые воплощения настоящего изобретения относятся к изолированной или очищенной молекуле нуклеиновой кислоты, в которой содержится последовательность SEQ ID NO: 3 или имеется идентичность с SEQ ID NO: 3 по меньшей мере на 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99%.

Кроме того, сюда включены молекулы нуклеиновой кислоты, которые гибридизируются с вышеописанными последовательностями нуклеиновой кислоты. Условия гибридизации могут быть ужесточены тем, что гибридизация будет происходить, только если будет идентичность, по меньшей мере на 90%, 95% или 97%, с последовательностью в молекуле нуклеиновой кислоты, которая кодирует энзим настоящего изобретения. Ужесточенные условия могут означать также условия, применяемые в известных «южных» гибридизациях, таких как, например, инкубация в течение ночи при температуре 42°С в растворе 50% формамида, 5× SSC (150 mM NaCl, 15 mМ тринатрий-цитрата), 50 mM натрий-фосфат (pH 7.6), 5× раствор Денгардта, 10% декстран-сульфат и 20 микрограмм/миллиметр денатурированный ДНК из молок лососевых, с последующим вымыванием опоры гибридизации в 0.1× SSC при температуре около 65°С. Прочие условия гибридизации хорошо известны и описаны в литературе Sambrook и др., Молекулярное клонирование: Лабораторный справочник, Третье издание, Cold Spring Harbor, N.Y. (2001).

Специалист данной сферы заметит, что незначительные изменения последовательности нуклеиновой кислоты не обязательно изменят аминокислотную последовательность закодированного полипептида. Специалисты данной сферы поймут, что изменения в идентичности нуклеотидов в специфичной генной последовательности, которые изменяют аминокислотную последовательность закодированного полипептида, могут привести к снижению или улучшению эффективности генов, и что, в некоторых применениях (например, анти-смысловая цепь, косупрессия, или PHKi), частичные последовательности зачастую работают так же эффективно, как и при полной последовательности. Способы, которыми нуклеотидная последовательность может быть изменена или укорочена, хорошо известны специалистам данной области, так же, как и способы определения эффективности измененных генов. В некоторых воплощениях, эффективность может быть легко протестирована, например, с помощью традиционной газовой хроматографии. Таким образом, в описание настоящего патентного раскрытия входят все такие вариации генов.

Как будет подтверждено специалистом данной сферы, длина молекулы нуклеиновой кислоты, описанная выше, будет зависеть от планируемого применения. Например, если планируемое применение - это использование в качестве затравки или пробы, например, для усиления с помощью PCR или для скрининга генотеки, длина молекулы нуклеиновой кислоты будет меньше, чем длина всей последовательности, например, 15-50 нуклеотидов. В этих воплощениях, затравки или пробы могут быть значительно идентичны высоко-сохранившейся части последовательности нуклеиновой кислоты или могут быть значительно идентичны цепи на 5' или 3' от конца последовательности ДНК. В некоторых случаях, эти затравки или пробы могут использовать универсальные базы в некоторых позициях, становясь «значительно идентичными», но все же обеспечивающими гибкость при распознании последовательности. Необходимо отметить, что в этой сфере хорошо известны подходящие состояния гибридизации затравок и проб.

В настоящее изобретение также включен энзим CsHCS1. Этот энзим обладает следующей аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 2):

Некоторые воплощения относятся к изолированному или очищенному полипептиду, в котором присутствует SEQ ID NO: 2, или имеется идентичность с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 2 по меньшей мере на 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99%.

В настоящее изобретение также входит энзим CsHCS2. Этот энзим имеет следующую аминокислотную последовательность (SEQ ID NO: 4)

Некоторые воплощения относятся к изолированному или очищенному полипептиду, в котором присутствует SEQ ID NO: 4, или имеется идентичность аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 4 по меньшей мере на 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99%.

Некоторые воплощения относятся к вектору, конструкции или экспрессирующей системе, содержащих изолированный или очищенный полинуклеотид, в котором присутствует последовательность SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 3, или имеется идентичность последовательности SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 3 по меньшей мере на 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99%. Также, представлен метод подготовки вектора, конструкции или экспрессирующей системы, включающих такую последовательность, или ее часть, для введения в клетку последовательности или части последовательности в смысловой или анти-смысловой ориентации, или в дополнении.

В некоторых воплощениях, изолированная и/или очищенная молекула нуклеиновых кислот, или векторы, конструкции или экспрессирующие системы, в которые входят эти изолированные и/или очищенные молекулы нуклеиновых кислот, могут применяться для получения трансгенных организмов или клеток организмов, которые образуют полипептиды, катализирующие синтез ароматических поликетидов. Таким образом, одно из воплощений относится к трансгенным организмам, клеткам или микробным тканям организма, в которые входит изолированная и/или очищенная молекула нуклеиновой кислоты, с последовательностью SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 3, или с последовательностью, имеющей идентичность с SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 3 по меньшей мере на 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99%.

В качестве организма рекомендуется выбрать растение, микроорганизм или насекомое. Из растений рекомендуется выбирать Cannabis, например, Конопля посевная L., Cannabis indica Lam. и Cannabis ruderalis Janisch. Особенно рекомендуется растение Конопля посевная. Из микроорганизмов рекомендуются бактерии (например, Escherichia coli) или дрожжи (например, Saccharomyces cerevisiae). Из насекомых рекомендуется Spodoptera frugiperda.

Организмы, клетки и микробные ткани этого воплощения могут изменить уровень содержания каннабиоидных соединений. По Фигуре 1 специалист данной области определит, что экспрессия или сверхэкспрессия молекулы нуклеиновой кислоты настоящего изобретения приводит к экспрессии или сверхэкспрессии энзима, который катализирует синтез гексаноил-кофермента-А, который, в сочетании с прочими энзимами, может привести к образованию или повышенному образованию каннабиоидных соединений, таких как каннабигероловая кислота (CBGA), Δ⁹-тетрагидроканнабиноловая кислота (ТНСА), каннабидиоловая кислота (CBDA), каннабихроменовая кислота (СВСА), Δ⁹-тетрагидроканнабинол (ТНС), каннабидиол (CBD), каннабихромен (CBC) и т.д. Подобным же образом, в зависимости от используемой субстраты, экспрессия или сверхэкспрессия молекулы нуклеиновых кислот настоящего изобретения, приводящая к экспрессии или сверхэкспрессии энзима, которая катализирует синтез гексаноил-кофермента-А, может привести к образованию или повышенному образованию аналогов каннабиоидных соединений, или аналогов прекурсоров таких соединений.

Подавление гена в организме, клетке или ткани приведет к недостаточной экспрессии энзима, что может привести к аккумуляции таких прекурсоров, как гексановая кислота (шесть углеродов), октановая кислота (восемь углеродов), нонановая кислота (девять углеродов), валериановая кислота (паять углеродов), гептановая кислота (семь углеродов) или прочие карбоновая кислоты, и/или снижение таких каннабиоидов, как ТНСА (прекурсор ТНС) или CBDA (прекурсор CBD).

Настоящее изобретение включает себя процесс изменения уровня каннабиоидных соединений в организме, клетке или ткани через экспрессию или сверхэкспрессию экзогенного энзима изобретения в организме, клетке или ткани, относительно такого же вида организма, клетки или ткани, выращиваемых в тех же условиях, но без экспрессии или сверхэкспрессии экзогенного энзима изобретения.

Экспрессия или сверхэкспрессия молекул нуклеиновых кислот изобретения может быть осуществлена в сочетании с экспрессией или сверхэкспрессией одной и нескольких прочих нуклеиновых кислот, которые кодируют один и более энзимов в каннабиоидном биосинтетическом каскаде реакций. Некоторые примеры прочих нуклеиновых кислот включают в себя кислоты, которые кодируют: поликетид-синтазу III типа, поликетид-циклазу, ароматическую пренилтрансферазу и каннабиоид-формирующую оксидоциклазу. Конкретные примеры этих энзимов включают в себя «оливетол-синтазу»/поликетид-синтазу, синтазу оливетоловой кислоты, геранилпирофосфатюливетолат геранилтрансферазу, синтазу Δ⁹-тетрагидроканнабиноловой кислоты, синтазу каннабидиоловой кислоты или синтазу каннабихроменовой кислоты. Синтез алканоил-кофермента-А в присутствии энзимного полипептида настоящего изобретения может быть осуществлено in vivo или in vitro. Как упомянуто выше, такие синтезы in vivo могут осуществляться через экспрессию или сверхэкспрессию молекул нуклеиновой кислоты изобретения в организме, клетке или ткани.

Синтез алканоил-кофермента-А in vitro может осуществляться в бесклеточной системе. В бесклеточной системе in vitro, карбоновая кислота и энзим настоящего изобретения могут быть смешаны вместе в посуде, подходящей для реакций.

In vitro, полипептиды настоящего изобретения могут применяться в сочетании с прочими энзимами для осуществления полного синтеза каннабиоидных соединений из прекурсоров. Например, такие прочие энзимы могут быть использованы в каннабиоидном биосинтезе, как описано на Фигуре 1, (например, «оливетол-синтаза»/PKS, синтаза оливетоловой кислоты, ароматическая пренилтрансфераза, ТНСА-синтаза, CBDA-синтаза, СВСА-синтаза).

Полипептиды настоящего изобретения могут применяться, in vivo или in vitro, для синтеза аналогов каннабиоидных соединений, который не возникают в акцепторах в естественной среде. Такие аналоги могут быть получены с помощью соединений карбоновой кислоты, за исключением тех, которые применяются для получения природных каннабиоидных соединений в растениях. Например, уксусная кислота, маслянная кислота, октановая кислота, декановая кислота, лауровая кислота, миристиновая кислота, пальмитиновая кислота; кислоты с ответленными цепями, например, изовалерьяновая кислота; и гидрокси-коричные кислоты, например, коричная кислота.

Термины:

Для упрощения описания патентуемых воплощений, далее приведены разъяснения специфических терминов:

Алканоил-кофермент-А (СоА): Алканоил-кофермент-А - это алифатическое карбониловое соединение, в котором половина коэнзима-А связана с атомом углерода карбониловой группы сульфидным мостом. Предпочтительные соединения алканоил-кофермента-А включают в себя от 2 до 10 атомов углерода в алифатической карбониловой части соединения. Более предпочтительно, когда алканоил-кофермент-А - это кофермент-А-S-С(O)-(СН₂)_n-CH₃, где n - это целое число от 0 до 8. Несколько примеров соединений алканоил-коферментов-А: ацетил-кофермент-А, бутирил-кофермент-А, гексаноил-кофермент-А и октаноил-кофермент-А. Использование ацетил-кофермента-А дает метиловую боковую цепь в полученном ароматическом поликетиде; использование бутирил-кофермента-А дает пропиловую боковую цепь; и использование гексаноил-кофермента-А дает пентиловую боковую цепь. Гексаноил-кофермент-А высоко предпочтителен. В конопле также присутствуют каннабиоиды с более короткими боковыми цепями (например, тетрагидроканнабивариновая кислота, в которой вместо пентиловой боковой цепи ТНСА находится пропиловая боковая цепь).

Вырожденность кодона: В данное патентное раскрытие включено применение вырожденности кодона, как станет ясно для специалиста данной области и как показано в Таблице 1.

Комплементарная нуклеотидная последовательность: «Комплементарная нуклеотидная последовательность» в последовательности - это любая молекула нуклеиновой кислоты, нуклеотиды которой комплементарны к молекулам последовательности, раскрытым в настоящем документе, и ориентация которых обратная (антипараллельная последовательность).

Консервативные замещения: Специалист данной области понимает под термином «консервативные замещения» аминокислотную последовательность полипептида без нарушения трехмерной структуры и функции полипептида. Соответственно, настоящее изобретение включает в себя полипептиды, содержащие консервативно замещенные CsHCS1 и CsHCS2. Консервативные замещения осуществляются специалистом данной области путем замещения одной аминокислоты на другую с одинаковой гидрофобностью, полярностью, и длиной R-цепи. Кроме того, при сравнении выровненных последовательностей гомологичных белков, взятых от разных видов, консервативные замещения могут быть идентифицированы с помощью локализации остатков аминокислот, которые мутировали между видами без изменения базовых функций закодированных белков. В таблице 2 приведен пример консервативных замещений.

Степень или доля гомологии в последовательности: Термин «степень или дола гомологии в последовательности» относится к степени или доли идентичных частей в двух последовательностях после оптимального выравнивания.

Гомологичная изолированная и/или очищенная последовательность: «Гомологичная изолированная и/или очищенная последовательность» - это изолированная и/или очищенная последовательность, в которой имеется частичная идентичность с основными нуклеотидными последовательностями, или последовательностями аминокислотных полипептидов, по меньшей на 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 99.6%, или 99.7%. Эта доля исключительно статистическая, и разницу можно распределить между двумя нуклеотидными или аминокислотными последовательностями случайным образом или по всей их длине. Идентичность последовательности может быть определена, например, с помощью компьютерных программ, предназначенных для единичного или множественного выравнивания последовательностей.

Увеличение, уменьшение, модулирование, изменение или т.п.: Специалист данной сферы знает, что эти термины относятся к сравнению схожих вариаций или штаммов, выращиваемых в одинаковых условиях, но без модификации, которая приводит к увеличению, уменьшению, модуляции или изменению. В отдельных случаях, это может нетрансформированный контроль, симулируемый трансформированный контроль, или векторный трансформированный контроль.

Изолированные: Специалисты рассматриваемой сферы используют термин «изолированные» в отношении полипептидов или нуклеиновых кислот, которые были «изолированы» из их родной среды.

Последовательность нуклеотидов, полинуклеотидов, или нуклеиновой кислоты: «Последовательность нуклеотидов, полинуклеотидов, или нуклеиновой кислоты» - это двутяжевые или однотяжевые цепи в мономерной или димерной (так называемой, «тандемной») форме и транскрипция их продуктов.

Идентичность последовательностей: Две аминокислоты или нуклеотидные последовательности называются «идентичными», если последовательности аминокислот или нуклеотидов в двух последовательностях одинаковы, когда они выравнены для установления максимального соответствия, как описано ниже. Доля идентичности последовательности (или степень идентичности) определяется с помощью сравнения двух оптимально выравненных последовательностей в сравнительном окне, где часть пептидной или полинуклеотидной последовательности в сравнительном окне может содержать дополнительные или отсутствующие элементы (т.е. пробелы) в сравнении с образцовой последовательностью (т.е. той, которая не содержит дополнительные или отсутствующие элементы) для оптимального выравнивания двух последовательностей. Эта доля рассчитывается путем определения количества позиций, в которых находятся идентичные остатки аминокислот или основ нуклеиновой кислоты в оба/обеих последовательностях, для получения количества совпадающих позиций, с делением количества совпадающих позиций на общее количество позиций в окне сравнения и умножением результата на 100, для получения процентного выражения доли идентичной последовательности.

Оптимальное выравнивание последовательностей для проведения сравнения может быть сделано с помощью алгоритма локальной гомологии (Смит и Уотерман, Продвинутая прикладная математика 2: 482 (1981), Алгоритм выравнивания гомологии Нидлмана и Вунша, J. Мол. Биол. 48: 443 (1970), Метод поиска схожестей Пирсона и Липмэна, Proc. Natl. Acad. Sci. (США) 85: 2444 (1988), компьютерная реализация этих алгоритмов (GAP, BESTFIT, FASTA, и TFASTA, Пакет ПО Висконсина по генетике, Генетическая компьютерная группа (GCG), 575 Доктор наук, Madison, Wis.) или визуальной проверки.

Определение идентичности последовательности, описанное выше, осуществляется специалистом данной области. Сам процесс определения не нуждается в каком-либо особом алгоритме и перечисленные алгоритмы используются только для достижения оптимальных выравниваний последовательностей, а не для расчета идентичности последовательностей.

Из вышеприведенного определения следует, что существует четко установленное и единственное значение идентичности последовательностей в двух сравниваемых последовательностях, значение которой соответствует значению, полученному при наилучшем или оптимальном выравнивании.

Гибридизация в строгих условиях: Гибридизация в строгих условиях с нуклеотидной последовательностью - это гибридизация в таких условиях выбранной температуры и ионной силы, которые позволяют проводить гибридизацию двух фрагментов комплементарных молекул нуклеиновой кислоты.

Гомологи новых генов, описанных в настоящем документе, полученные из других организмов, например, растений, могут быть получены скринингом соответствующих генотек, содержащих гомологи, при этом проводится скрининг нуклеотидной последовательности специфических генов изобретения, или их частей/проб, или определяются поиском гомологии последовательностей с помощью программ выравнивания последовательностей, например, «BLAST» или «FASTA».

Изоляция и клонирование нуклеиновой кислоты - это хорошо изученная процедура. Подобным образом, изолированный ген может быть вставлен в вектор и трансформирован в клетку с помощью традиционных методов, известных специалистам рассматриваемой области. Молекулы нуклеиновой кислоты могут быть трансформированы в организм. Как известно специалистам, существует ряд способов, которыми гены, векторы, конструкции и системы экспрессии могут быть внедрены в организмы, и сочетание методов трансформация и культивации тканей были успешно интегрированы в эффективные стратегии создания трансгенных организмов. Эти методы, который могут применяться в изобретении, были описаны в другой литературе (Potrykus I (1991) Перевод генов в растения: Оценка опубликованных подходов и результатов. Ежегодный обзор физиологии растений, молекулярной биологии растений 42: 205-225; Василь И.К. (1994) Молекулярное улучшение зерновых. Растительная мол. биол. 25: 925-937. Walden R, Wingender R (1995) Генный трансферт и методы регенерации растений. Тенденции в биотехнологии 13: 324-331; Songstad DD, Somers DA, Griesbach RJ (1995) Прогресс в альтернативных методах получения ДНК. Культ, клетки растительной ткани. 40: 1-15), и они хорошо известн