Композиции и способы применения для определения не4а

Композиции и способы применения для определения не4а

Иллюстрации

Показать все

Реферат

[0001] Изобретение включает композиции и способы для определения, диагностики, определения тяжести, определения стадии, получения прогноза и предсказания и мониторинга восприимчивости к лечению у субъектов, у которых подозревают наличие и/или которые имеют рак яичников. Также предложены варианты иммуноанализа, связывающие агенты, антитела и способы для определения рака яичников путем определения присутствия полноразмерного НЕ4а в образцах, полученных от пациентов.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0002] Продукт гена WFDC2 (НЕ4/НЕ4а) является членом семейства стабильных белков, содержащих 4 дисульфидные связи в коровой части. НЕ4 представляет собой секретируемый гликозилированный белок, который впервые был обнаружен в ткани эпидидимиса человека (белок 4 эпидидимиса человека; НЕ4); его сверхэкспрессия наблюдается при некоторых видах рака, включая рак яичников. Характеристика белков и нуклеиновых кислот НЕ4/НЕ4а представлена, например, в работах Kirchhoff C, Habben I, Ivell R, Krull N (Mar 1992). "A major human epididymis-specific cDNA encodes a protein with sequence homology to extracellular proteinase inhibitors". Biol Reprod 45 (2): 350-7 Schummer M, Ng WV, Bumgamer RE, Nelson PS, Schummer B, Bednarski DW, Hassell L, Baldwin RL, Karlan BY, Hood L (Dec 1999). "Comparative hybridization of an array of 21,500 ovarian cDNAs for the discovery of genes overexpressed in ovarian carcinomas". Gene 238 (2): 375-85; Kirchhoff С (1998). "Molecular characterization ofepididymal proteins." Rev. Reprod. 3 (2): 86-95.; Kirchhoff С, OsterhoffC, Habben I, et al. (1990). "Cloning and analysis ofmRNAs expressed specifically in the human epididymis." Int. J. Androl. 13 (2): 155-67; Hellstrom I, et al; Cancer Res. 2003 Jul 1:63(13):3695-700. Сверхэкспрессия НЕ4/НЕ4а в раковых клетках указывает на то, что этот белок и его различные изоформы могут использоваться в качестве биомаркера для определения рака и для идентификации пациентов с повышенной вероятностью рака. О способах и композициях, относящихся к применению молекулярных маркеров, таких как НЕ4/НЕ4а, сообщалось ранее, включая заявки US 7270960; US 20100311099; US 20080020473; US 20070286865; US 20100047818; US 20090104684 и US 20030108965, содержание которых полностью включено в настоящую заявку.

[0003] Ссообщалось, что белки НЕ4/НЕ4а имеют различные изоформы в результате альтернативного сплайсинга, а также различные гликоформы как результат различных паттернов гликозилирования. В свете вышеизложенного, в данной области техники существует потребность в композициях и связывающих агентах (например, антителах), способных к определению сверхэкспрессии биомаркеров, таких как НЕ4а, и их вариантов, сплайс-изоформ и гликоформ, для диагностики рака.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0004] Настоящее изобретение включает композиции и способы диагностики рака яичников у субъекта и определения субъектов с повышенной вероятностью рака яичников. Композиции включают моноклональные антитела, их варианты и фрагменты, специфично связывающиеся с растворимыми и находящимися на клеточной поверхности формами НЕ4/НЕ4а, которые сверхэкспрессируются при карциноме яичников. Также предложены моноклональные антитела, имеющие связывающие характеристики раскрытого антитела против НЕ4а. Также предложены клеточные линии гибридомы, продуцирующие моноклональное антитело к НЕ4/НЕ4а. Композиции согласно настоящему изобретению имеют применение в способах диагностики, а также в способах скрининга для определения субъектов с повышенной вероятностью рака яичников. В частности, способы диагностики могут включать иммуногистохимический (ИГХ) анализ или анализ методом двойного непрямого («сэндвич») твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA). Также предложены наборы, включающие одно или более из раскрытых моноклональных антител к НЕ4а для практической реализации способов согласно настоящему изобретению. Также раскрыты полипептиды, содержащие аминокислотную последовательность эпитопа НЕ4а, и способы применения этих полипептидов в получении антител.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

[0005] На Фигуре 1 показан пример реализации слитого белка НЕ4а, содержащего домен НЕ4а и IgG человека/мыши.

[0006] На Фигуре 2 показаны некоторые особенности связывания вариантов моноклональных антител (антитела 12А2 и 14Е2) с полноразмерным НЕ4а, доменами НЕ4а-V4 и HE4a-V2 в НЕ4а. В данном примере MAT 12A2 и 14Е2 связываются с вариантом НЕ4а-V4 и полноразмерным НЕ4а, но не связываются с доменом HE4a-V2. Это указывает на то, что MAT 12A2 и 14Е2 связываются с доменом N-WFDC в НЕ4а.

[0007] На Фигуре 3 показаны особенности связывания моноклональных антител сравнения (антител 2Н5 и 3D8) со слитыми белками. В данном примере MAT сравнения связываются с доменом HE4a-V2 и полноразмерным НЕ4а, но не связываются с доменом HE4a-V4, что указывает на то, что они распознают эпитопы в домене C-WFDC в НЕ4а.

[0008] На Фигуре 4 показана нуклеотидная (SEQ ID NO:6) и пептидная (SEQ ID NO:1) последовательности НЕ4а, включая домены N-WFDC и C-WFDC в НЕ4а.

[0009] На Фигуре 5 показано связывающее взаимодействие типичных моноклональных антител (12A2) с N-WFDC и C-WFDC. В данном примере специфичность связывания 12A2 демонстрируют, используя формат фагового анализа ELISA, где MAT реагирует только со слитым белком N-WFDC НЕ4а и фагового белка pVIII.

[0010] На Фигуре 6 показана способность MAT 14E2 реагировать с денатурированным и восстановленным слитым белком HE4a-hIg. Связывание с денатурированным и восстановленным слитым белком HE4a-hIg указывает на то, что MAT 14E2 распознает линейный эпитоп белка НЕ4а.

[ООН] На Фигуре 7 показана кривая доза-эффект иммуноанализа «сэндвич» с использованием 14E2 в качестве иммобилизованного MAT и MAT 3D8 или 12A2 в качестве детектирующего МАТ. Результат для комбинации MAT 14E2 и 12A2 указывает на то, что они способны связываться одновременно и, таким образом, детектировать независимые эпитопы домена N-WFDC в НЕ4а.

[0012] На Фигуре 8 показан пример иммуноанализа в модификации «сэндвич» и связывание MAT 12A2 и 14E2 в комбинации с MAT 2H5. В данном примере MAT 12A2 и 14E2 реагируют только с полноразмерным НЕ4а, тогда как комбинация MAT 3D8 и 2H5 реагирует как с полноразмерным НЕ4а (FL НЕ4а), так и с вариантом HE4a-V2. Этот результат дополнительно указывает на то, что MAT 12A2 и 14E2 распознают эпитоп, экспонированный на домене N-WFDC в НЕ4а.

[0013] На Фигуре 9 показана кривая доза-эффект ферментативного иммуноанализа (EIA) полноразмерного НЕ4а. В основе данного анализа лежало использование MAT 2H5 в качестве иммобилизованного антитела и MAT 12A2, конъюгированного с пероксидазой хрена, в качестве детектирующего МАТ. Процедуру проводили, как описано в Примере 3.

[0014] На Фигуре 10 показаны уровни НЕ4а у здоровых объектов, пациентов с доброкачественными гинекологическими заболеваниями и с раком яичников, определенные методом EIA на FL НЕ4а, как описано в Примере 3.

[0015] На Фигуре 11 показан пример иммуноанализа полноразмерного НЕ4а для мониторинга клинического течения болезни рака яичников. (СЗ = Стабильное заболевание; ПЛ = поддается лечению; ПЗ = прогрессирующее заболевание). В данном примере полноразмерный НЕ4а демонстрировал, что полноразмерный НЕ4а можно применять для отслеживания клинического течения болезни у пациентов с диагнозом рак яичников.

[0016] На Фигуре 12 показана ИГХ доброкачественных и злокачественных тканей яичников, с использованием примера MAT, специфичного к домену N-WFDC в НЕ4а. В данном примере типичное MAT 12A2 связывается строго с раковыми клетками при раке яичников, но не связывается с клетками доброкачественных опухолей. А: Серозная аденокарцинома; В: Серозная адено карцинома; С: Эндометроидная карцинома яичников; D: Серозная аденокарцинома; Е: Фиброма; F: Фибротекома.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0017] Предложены различные композиции и способы диагностики рака яичников у субъекта и определения субъектов с повышенной вероятностью рака яичников. Композиции включают моноклональные антитела, способные связываться с НЕ4/НЕ4а - белком, который, как было показано, сверхэкспрессируется в клетках рака яичников. Композиции включают моноклональные антитела и их варианты и фрагменты, специфично связывающиеся с растворимыми и находящимися на клеточной поверхности формами НЕ4/НЕ4а, которые сверхэкспрессируются при карциноме яичников. Также предложены моноклональные антитела, обладающие характеристиками связывания антитела против НЕ4а согласно настоящему изобретению. Также предложены клеточные линии гибридомы, продуцирующие моноклональные антитела согласно настоящему изобретению. В частности, предложены клеточные линии гибридомы, продуцирующие моноклональные антитела, связывающиеся с доменом N-WFDC в НЕ4а. Также предложены наборы, включающие описанные моноклональные антитела. Изобретение также включает полипептиды, содержащие аминокислотную последовательность эпитопа НЕ4а, и способы применения этих полипептидов в продукции антител. Композиции находят практическое применение в «сэндвич» вариантах ELISA или ИГХ для диагностики рака яичников у субъекта и в методах скрининга для определения объектов с повышенной вероятностью наличия рака яичников.

[0018] В одном аспекте настоящего изобретения предложено моноклональное антитело, способное специфично связываться с НЕ4а. В одном варианте реализации моноклональное антитело продуцируется линией клеток гибридомы 12А2, депонированной в ЕСАСС, депозитарный №10091401. В другом варианте реализации моноклональное антитело продуцируется линией клеток гибридомы 14Е2, депонированной в ЕСАСС, депозитарный №11022202. В другом варианте реализации моноклональное антитело связывается с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:17 НЕ4а N-WFDC (EKTGVCPELQADQNCTQECVSDSECADNLKCCSAGCATFCSLPND).

[0019] В другом аспекте настоящее изобретение обеспепечивает набор для диагностики рака яичников, включающий моноклональное антитело, связывающееся с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:17 НЕ4а N-WFDC, и дополнительное моноклональное антитело, связывающееся с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:19 НЕ4а C-WFDC. (KEGSCPQVNINFPQLGLCRDQCQVDS QCPGQMKCCRNGCGKVSCVTPNF). Также предложен набор для диагностики рака яичников у пациента, включающий: захватывающее антитело, иммобилизованное на твердой подложке, причем захватывающее антитело представляет собой первое антитело к НЕ4а, и меченое антитело, причем меченое антитело представляет собой второе антитело к НЕ4а, меченое детектируемым веществом; где указанное первое или указанное второе антитело к НЕ4а представляет собой моноклональное антитело, при этом моноклональное антитело продуцируется линией клеток гибридомы 14Е2, депонированной в ЕСАСС под депозитарным №11022202, и/или связывается с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:17 НЕ4а N-WFDC (EKTGVCPELQADQN CTQECVSDSECADNLKCCSAGCATFCSLPND).

[0020] Согласно настоящему изобретению также предложен способ получения моноклональных антител к НЕ4а, включающий: иммунизацию животного полипептидом в условиях, в которых возникает иммунный ответ, причем полипептид содержит аминокислотную последовательность, представленную как SEQ ID NO:1, 3 и 5 (НЕ4а; НЕ4а V2; HE4a-V4), и ее варианты; выделение продуцирующих антитело клеток из животного, гибридизацию продуцирующих антитело клеток с иммортализованными клетками в культуре с образованием продуцирующих антитело клеток гибридомы; культивирование клеток гибридомы; и выделение моноклональных антител из культуры.

[0021] Согласно настоящему изобретению также предложен агент, связывающийся с НЕ4а, который связывает: (а) домен N-WFDC в НЕ4а; (b) аминокислотную последовательность, кодируемую SEQ ID NO:1 НЕ4а. В одном варианте реализации связывающий агент представляет собой анти-НЕ4а антитело или антиген НЕ4а-связывающий фрагмент. В другом варианте реализации связывающий агент селективно связывается с N-WFDC в НЕ4а (SEQ ID NO:17). В еще одном варианте реализации связывающий агент представляет собой поликлональное, моноклональное, биспецифичное, химерное или гуманизированное антитело или их антиген-связывающий фрагмент. В другом варианте реализации связывающий агент представляет собой агент, меченный с помощью детектируемого маркера.

[0022] Настоящее изобретение также включает очищенную аминокислотную последовательность по меньшей мере на 90% идентичную аминокислотной последовательности моноклонального антитела, продуцируемого линией клеток гибридомы 12А2, депонированной в ЕСАСС под депозитарным номером 10091401.

[0023] В другом аспекте предложена очищенная аминокислотная последовательность, причем последовательность имеет по меньшей мере 90% идентичность с аминокислотной последовательностью моноклонального антитела, продуцируемого линией клеток гибридомы 14Е2, депонированной в ЕСАСС, депозитарный №11022202.

[0024] Настоящее изобретение также включает способ получения последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид НЕ4а, включающий: а) амплификацию нуклеиновой кислоты из образца с набором праймеров, включающим прямой и обратный праймеры, причем набор праймеров выбирают из группы, состоящей из SEQ ID NO:21 V4 F и SEQ ID NO:23_V4 R, SEQ ID NO:25 V2F и SEQ ID NO:27 V2R; b) выделение амплифицированной нуклеиновой кислоты.

[0025] Настоящее изобретение также включает изолированную молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую связывающий белок, который связывается с последовательностью SEQ ID NO 17 НЕ4а N-WFDC, причем аминокислотная последовательность связывающего белка имеет по меньшей мере 90% идентичность с аминокислотной последовательностью моноклонального антитела, продуцируемого гибридомой 12А2, депонированной в ЕСАСС, депозитарный №10091401, или клеточной линией 14Е2, депонированной в ЕСАСС, депозитарный №11022202, и/или связывается с аминокислотной последовательностью, изложенной в SEQ ID NO:17 НЕ4а N-WFDC (EKTGVCPELQADQNCTQECVSDSECADNLKCCSAGCATFCSLPND).

[0026] В другом аспекте предложены векторы и клетки-хозяева, содержащие изолированную молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую связывающий белок, который связывается с последовательностью SEQ ID NO:17 НЕ4а N-WFDC.

[0027] Согласно настоящему изобретению также предложен изолированный слитый белок, включающий гетерологичный полипептид НЕ4а, соединенный с полипептидом Fc-рецептора, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:17 НЕ4а N-WFDC. В одном варианте реализации изолированный слитый белок получают путем амплификации нуклеиновой кислоты с использованием праймеров, кодируемых последовательностями SEQ ID NO:29 W1F; SEQ ID NO:31 W1R; SEQ ID NO:33 W2F, SEQ ID NO:35 W2R. В другом варианте реализации слитый белок включает гетерологичный антигенный полипептид НЕ4а, который представляет собой сплайс-вариант.

[0028] Изобретение также включает способ скрининга наличия рака яичников у субъекта, включающий: контактирование биологического образца от субъекта с по меньшей мере одним антителом, специфичным к антигенному полипептиду НЕ4а, с определением присутствия в биологическом образце молекулы, в норме присутствующей в образце в растворимой форме и содержащей антигенную детерминанту, взаимодействующую с по меньшей мере одним антителом, в условиях и в течение времени, достаточных для определения связывания антитела с антигенной детерминантой, с последующим определением наличия рака яичников. В одном варианте реализации биологический образец выбирают из группы, состоящей из крови, сыворотки, серозной жидкости, плазмы, лимфы, мочи, спинномозговой жидкости, слюны, секрета слизистых, вагинального секрета, жидкости брюшной полости, плевральной жидкости, перикардиальной жидкости, перитонеальной жидкости, абдоминальной жидкости, культуральной среды, кондиционированной культуральной среды и лаважной жидкости.

[0029] Согласно настоящему изобретению также предложен способ скрининга наличия рака яичников у субъекта, включающий: контактирование биологического образца, содержащего клетку от субъекта, с по меньшей мере одним антителом, специфичным к антигенному полипептиду НЕ4а, с определением присутствия в биологическом образце молекулы клеточной поверхности, содержащей антигенную детерминанту, взаимодействующую с по меньшей мере одним антителом, в условиях и в течение времени, достаточных для определения связывания антитела с антигенной детерминантой, и, соответственно, определения наличия рака яичников. В одном варианте реализации антитело снабжено детектируемой меткой. В другом варианте реализации антитело не снабжено детектируемой меткой, и определение связывания антитела с антигенной детерминантой является непрямым (опосредованным).

[0029а] Настоящее изобретение также включает моноклональные антитела, которые распознают эпитопы в домене C-WFDC НЕ4а, продуцируемые клеточной линией гибридомы 2Н5, депонированной в ЕСАСС, депозитарный №13070301, и клеточной линией гибридомы 3D8, депонированной в ЕСАСС, депозитарный №13070304.

[0030] Настоящее изобретение также включает способ скрининга наличия рака яичников у субъекта, включающий: контактирование биологического образца от субъекта с по меньшей мере одним иммобилизованным первым антителом, специфичным к антигенному полипептиду НЕ4а, с определением присутствия молекулы в образце, в условиях и в течение времени, достаточных для специфичного связывания первого антитела с антигенным полипептидом НЕ4а с образованием иммунного комплекса; удаление компонентов образца, которые не связались специфично с первым антителом; и контактирование иммунного комплекса с по меньшей мере одним вторым антителом, специфичным к антигенному полипептиду НЕ4а, где антигенсвязывающий сайт второго антитела не ингибирует конкурентно антигенсвязывающий сайт иммобилизованного первого антитела, в условиях и в течение времени, достаточных для определения специфичного связывания второго антитела с антигенным полипептидом НЕ4а, и, соответственно, определение наличия рака яичников. В одном варианте реализации первое иммобилизованное антитело выбирают из группы, состоящей из 12А2, 14Е2, 2Н5 и 3D8. В одном варианте реализации второе антитело выбирают из группы, состоящей из 12А2, 14Е2, 2Н5 и 3D8. В другом варианте реализации первое иммобилизованное антитело представляет собой 14Е2. В еще одном варианте реализации второе антитело представляет собой 12А2.

[0031] Также раскрыт способ диагностики у субъекта рака яичников, включающий: определение антигена НЕ4а в исследуемом образце, полученном от субъекта; контактирование исследуемого образца с антителом, имеющим антигенсвязывающий домен, который связывается с N-WFDC в НЕ4а, в течение времени и в условиях, достаточных для образования комплексов антитело/антиген; и определение присутствия комплексов на дисплее, причем присутствие комплексов, свидетельствующее о присутствии НЕ4а в исследуемом образце, коррелирует с наличием рака яичников. В одном варианте реализации антитело включает антигенсвязывающий домен, который связывается с аминокислотами N-WFDC в НЕ4а. В другом варианте реализации антитело представляет собой моноклональное антитело, продуцируемое линией клеток гибридомы, в ЕСАСС депозитарный №10091401.

[0032] Настоящее изобретение также включает способ диагностики у субъекта рака яичников, включающий: определение антигена НЕ4а в исследуемом образце, полученном от субъекта; контактирование исследуемого образца с первым антителом, содержащим антигенсвязывающий домен, связывающийся с аминокислотами N-WFDC в НЕ4а, в течение времени и в условиях, достаточных для образования комплексов первое антитело/антиген; добавление конъюгата к комплексам первое антитело/антиген, где конъюгат включает второе антитело, связанное с генерирующим сигнал соединением, способным генерировать детектируемый сигнал, в течение времени и в условиях, достаточных для образования комплексов первое антитело/антиген/второе антитело; и определение присутствия сигнала, образуемого генерирующим сигнал соединением, на дисплее, причем наличие сигнала, свидетельствующее о присутствии антигена НЕ4а в исследуемом образце, коррелирует с наличием рака яичников. В одном варианте реализации антитело содержит антигенсвязывающий домен, который связывается с аминокислотами N-WFDC в НЕ4а. В другом варианте реализации антитело представляет собой моноклональное антитело, продуцируемое линией клеток гибридомы, депонированной в ЕСАСС под депозитарным номером 10091401.

[0033] Настоящее изобретение также включает способ получения прогноза для субъекта с раком яичников, включающий: определение антигена НЕ4а в исследуемом образце, полученном от субъекта; контактирование исследуемого образца с антителом, содержащим антигенсвязывающий домен, связывающийся с аминокислотами N-WFDC в НЕ4а, в течение времени и в условиях, достаточных для образования комплексов антитело/антиген; и определение присутствия комплексов на дисплее, причем присутствие комплексов, свидетельствующее о присутствии антигена НЕ4а в исследуемом образце, коррелирует со стадиями рака яичников. В одном варианте реализации антитело включает антигенсвязывающий домен, который связывается с аминокислотами N-WFDC в НЕ4а. В другом варианте реализации антитело представляет собой моноклональное антитело, продуцируемое линией клеток гибридомы, депонированной в ЕСАСС под депозитарным номером 10091401.

[0034] Настоящее изобретение также включает способ получения прогноза для субъекта с раком яичников, включающий: определение антигена НЕ4а в исследуемом образце, полученном от субъекта; контактирование исследуемого образца с первым антителом, содержащим антигенсвязывающий домен, связывающийся с аминокислотами N-WFDC в НЕ4а, в течение времени и в условиях, достаточных для образования комплексов первое антитело/антиген; добавление конъюгата к комплексам первое антитело/антиген, где конъюгат включает второе антитело, связанное с генерирующим сигнал соединением, способным генерировать детектируемый сигнал, в течение времени и в условиях, достаточных для образования комплексов первое антитело/антиген/второе антитело; и определение наличия сигнала, образуемого генерирующим сигнал соединением, на дисплее, причем наличие сигнала, свидетельствующее о присутствии антигена НЕ4а в исследуемом образце, коррелирует со стадиями рака яичников. В одном варианте реализации антитело включает антигенсвязывающий домен, который связывается с аминокислотами N-WFDC в НЕ4а. В другом варианте реализации антитело представляет собой моноклональное антитело, продуцируемое линией клеток гибридомы, имеющей ЕСАСС депозитарный №10091401.

[0035] Также раскрывается способ мониторинга субъекта, проходящего лечение от рака яичников, включающий: определение антигена НЕ4а в исследуемом образце, полученном от субъекта; контактирование исследуемого образца с антителом, содержащим антигенсвязывающий домен, связывающийся с N-WFDC в НЕ4а в течение времени и в условиях, достаточных для образования комплексов антитело/антиген; и определение присутствия комплексов на дисплее, причем присутствие комплексов, свидетельствующее о присутствии антигена НЕ4а в исследуемом образце, коррелирует с восприимчивостью к лечению. В одном варианте реализации антитело включает антигенсвязывающий домен, который связывается с аминокислотами N-WFDC в НЕ4а. В другом варианте реализации антитело представляет собой моноклональное антитело, продуцируемое линией клеток гибридомы, имеющей ЕСАСС депозитарный №10091401.

[0036] Согласно настоящему изобретению также предложен способ мониторинга субъекта, проходящего лечение от рака яичников, включающий: определение антигена НЕ4а в исследуемом образце, полученном от субъекта; контактирование исследуемого образца с первым антителом, имеющим антигенсвязывающий домен, связывающийся с аминокислотами N-WFDC в НЕ4а, в течение времени и в условиях, достаточных для образования комплексов первое антитело/антиген; добавление конъюгата к комплексам первое антитело/антиген, где конъюгат включает второе антитело, связанное с генерирующим сигнал соединением, способным генерировать детектируемый сигнал, в течение времени и в условиях, достаточных для образования комплексов первое антитело/антиген/второе антитело; и определение наличия сигнала, образуемого генерирующим сигнал соединением, на дисплее, причем наличие сигнала, свидетельствующее о присутствии антигена НЕ4а в исследуемом образце, коррелирует с восприимчивостью к лечению. В одном варианте реализации антитело включает антигенсвязывающий домен, которые связывается с аминокислотами N-WFDC в НЕ4а. В другом варианте реализации антитело представляет собой моноклональное антитело, продуцируемое линией клеток гибридомы, имеющей ЕСАСС депозитарный №10091401.

[0037] Настоящее изобретение также предлагает способ определения наличия или отсутствия рака яичников у пациента, включающий: контактирование исследуемого образца ткани яичников, полученной от субъекта, с антителом, специфично связывающимся с полипептидом, представленным в любой из SEQ ID NOs:1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 или 15 (НЕ4); определение количества антител, которое связывается с полипептидом в исследуемом образце ткани яичников; и сравнение количества антител, которое связывается с полипептидом в исследуемом образце ткани яичников, с установленным ранее граничным значением, где исследуемый образец ткани яичников является положительным по раку яичников, если количество антител, которое связывается с полипептидом в исследуемом образце ткани яичников больше, чем установленное ранее граничное значение, и, соответственно, определение наличия или отсутствия рака яичников у субъекта. В одном варианте осуществления количество антител, связывающиеся с полипептидом в исследуемом образце ткани яичников, определяют иммуногистохимическими методами.

[0038] Способы, раскрытые в настоящей заявке, имеют отношение к НЕ4/НЕ4а, члену семейства белков, «содержащих 4 дисульфидные связи в коровой части», как было описано. Семейство белков, «содержащих 4 дисульфидные связи в коровой части», включает гетерогенную группу небольших молекул, устойчивых к кислоте и нагреванию, с разнообразными функциями, которые включают эпидидимальный белок человека, содержащий 4 дисульфидные связи в коровой части, или «НЕ4» (Kirchhoff et al., 1991 Biol. Reprod. 45:350-357; Wang et al., 1999 Gene 229:101; Schummer et al., 1999 Gene 238:375). кДНК НЕ4 была впервые изолирована из эпидидимиса человека (Kirchhoff et al., 1991 Biol. Reprod. 45:350-357), и позже кДНК НЕ4 была определена с высокой частотой в библиотеках кДНК, сконструированных из карциномы яичников (Wang et al., 1999 Gene 229:101; Schummer et al., 1999 Gene 238:375). Откорректированная последовательность НЕ4а была раскрыта в Hellstrom et al., 2003, Cane. Res. 63:3695-3700 и в патенте США 7,270,960. НЕ4а имеет аминокислотную последовательность, которая является высоко подобной, но отличной, от расшифрованной последовательности молекулы, которую в ранних публикациях именовали как НЕ4.

[0039] Сообщалось о ряде изоформ белка НЕ4, которые приведены в Таблице 1 ниже. Специалисты в данной области техники понимают, что моноклональное антитело к НЕ4/НЕ4а согласно настоящему изобретению может связываться с более чем одной изоформой НЕ4, поскольку каждая изоформа включает соответствующую последовательность эпитопа для конкретного антитела к НЕ4/НЕ4а.

ТАБЛИЦА 1:
ИЗОФОРМЫ НЕ4
Изоформа НЕ4	Учетный №.	Идентификатор последовательности
1	NP_006094	SEQ ID NO:1
2	AAL37488	SEQ ID NO:3
3	AAL37487	SEQ ID NO:5
4	AAL37486	SEQ ID NO:7
5	AAL37485	SEQ ID NO:9
6	ААН46106	SEQ ID NO:11
7	AAO52683	SEQIDNO:13
8	САА44869	SEQ ID NO:15

[0040] В настоящей заявке термин «субъект» относится к животному, которое представляет собой объект лечения, наблюдения или эксперимента. «Животное» включает холодно- и теплокровных позвоночных, таких как рыбы, моллюски, рептилии и, в частности, млекопитающие. «Млекопитающие» включают, без ограничений, мышей, крыс, кроликов, морских свинок, собак, кошек, овец, коз, коров, лошадей, приматов, таких как макаки, шимпанзе и обезьяны, и человека.

[0041] Способы, раскрытые в настоящей заявке, также включают композиции и способы определения находящихся на клеточной поверхности и/или растворимых форм НЕ4а, которые в норме присутствуют у субъекта, включая повышенные уровни этих полипептидов у объектов, имеющих определенные виды рака. Соответственно, в настоящем раскрытии предложены полезные композиции и способы для определения и диагностики злокачественного заболевания (например, рака яичников) у субъекта путем специфичного определения таких полипептидов НЕ4а, находящихся на клеточной поверхности и/или растворимых.

[0042] Также предложен способ иммуноанализа и получения моноклональных антител для определения полноразмерного антигена НЕ4а, и применение способов иммуноанализа и моноклональных антител для серологической диагностики рака яичников, мониторинга клинического течения заболевания и диагноза рака яичников путем анализа НЕ4а в тканях. Создание новых моноклональных антител к эпитопов, специфичных домену N-WFDC в НЕ4а, и комбинирование этих антител с антителами против домена C-WFDC в НЕ4а, обеспечивает возможность разработки процедуры специфичных способов иммуноанализа для определения полноразмерного НЕ4а.

[0043] В соответствии со способами, раскрытыми в настоящей заявке, антигенный полипептид НЕ4а человека (или полипептид НЕ4а) может быть определен в биологическом образце, полученном от субъекта или из биологического источника. Биологические образцы могут быть получены путем отбора образцов крови, биопсийных проб, эксплантатов ткани, культур органов, биологических жидкостей или любых других препаратов из объекта или биологического источника. Объект или биологический источник может представлять собой человека или животное, не являющееся человеком, первичную клеточную культуру или культуру адаптированной клеточной линии, включая, но не ограничиваясь перечисленными: созданные методами генной инженерии клеточные линии, которые могут содержать интегрированные в хромосомы или эписомные рекомбинантные последовательности нуклеиновой кислоты, иммортализованные или способные к иммортализации клеточные линии, гибридные клеточные линии соматических клеток, дифференцированные или способные к дифференцировке клеточные линии, трансформированные клеточные линии и тому подобное. В некоторых вариантах реализации способов, раскрытых в настоящей заявке у субъекта или биологического источника могут подозревать наличие рака яичников или риск наличия рака яичников.

[0044] В некоторых вариантах реализации биологический образец включает по меньшей мере одну клетку от субъекта или биологического источника, и в других вариантах реализации биологический образец представляет собой биологическую жидкость, включающую другой маркер опухоли. Биологические жидкости обычно представляют собой жидкости при физиологических температурах и могут включать существующие в природе жидкости, присутствующие в, отобранные от, экспрессированные или каким-либо иным способом выделенные из объекта или биологического источника. Некоторые биологические жидкости, происходящие от некоторых тканей, органов или локализированных областей, и некоторые другие биологические жидкости могут быть расположены внутри субъекта или биологического источника более глобально или системно. Не ограничивающие примеры биологических жидкостей включают кровь, сыворотку и серозные жидкости, плазму, лимфу, мочу, спинномозговую жидкость, слюну, серозные жидкости, плазму, лимфу, секрет слизистых секреторных тканей и органов, вагинальный секрет, женское молоко, слезы, также подходят асцитные жидкости, такие как ассоциированные с не солидными опухолями. Дополнительные примеры включают жидкости плевральной, перикардиальной, перитонеальной, абдоминальной и других полостей тела и тому подобное. Биологические жидкости могут также включать жидкие растворы, контактировавшие с объектом или биологическим источником, например, клеточную или органную культуральную среду, включая клеточную или органную кондиционную среду, лаважные жидкости и тому подобное. В других вариантах реализации биологический образец представляет собой свободный от клеток жидкий раствор, например, сыворотку крови, плазму или супернатант центрифугированной мочи.

[0045] В некоторых других вариантах реализации биологический образец включает интактные клетки, и в некоторых других предпочтительных вариантах реализации биологический образец включает клеточный экстракт, содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующей антигенный полипептид НЕ4а или его фрагмент, или его вариант. В других вариантах реализации способов, раскрытых в настоящей заявке, желательно, чтобы эти клетки были разрушены физическими или химическими методами или лизированы перед проведением анализа для предоставления клеточного содержимого для анализа.

[0046] В настоящей заявке «молекула, присутствующая в норме в растворимой форме» в образце, может быть растворимым белком, полипептидом, пептидом, аминокислотой или их производным, липидом, жирной кислотой или подобным соединение, или их производным, углеводом, сахаридом или подобным соединение, или их производным, нуклеиновой кислотой, нуклеотидом, нуклеозидом, пурином, пиримидином или родственной молекулой, или их производным, или подобным соединение; или любой их комбинацией, такой как, например, гликопротеин, гликолипид, липопротеин, протеолипид, или любой другой биологической молекулой, которая представляет собой растворимый или свободный от клетки компонент биологического образца, как предложено в настоящей заявке. «Молекула, существующая (присутствующая) в норме в растворимой форме», также относится к молекуле, которая находится в растворе или присутствует в биологическом образце, включая биологическую жидкость, как предложено в настоящей заявке, и которая не присоединена к поверхности интактной клетки. Например, молекула, существующая в норме в растворимой форме, может включать, с необходимостью ограничения раствором: компонент макромолекулярного комплекса, материал, который получен, секретирован или экспортирован из клетки, коллоид, микрочастицу или наночастицу, или другую соответствующую суспензионную частицу; или тому подобное.

[0047] Наличие злокачественного заболевания (например, рака яичников) у субъекта относится к присутствию диспластических, раковых и/или трансформированных клеток у субъекта, включая, например, новообразование, опухоль, не подавляемые контактом или онкогенно трансформированные клетки или подобных образований. В качестве иллюстрации, но не ограничения, в контексте раскрытых в настоящей заявке способов, злокачественные заболевания могут относиться также к присутствию в организме субъекта раковых клеток, которые способны секретировать, выделять, экспортировать или высвобождать антигенный полипептид НЕ4а (или полипептид НЕ4а), в результате чего повышенные уровни этого полипептида возможно обнаружить в биологическом образце, полученном от субъекта. В некоторых вариантах реализации например, эти опухолевые клетки представляют собой опухолевые эпителиальные клетки, такие как клетки карциномы, и в некоторых вариантах реализации такие раковые клетки представляют собой опухолевые клетки мезотелиомы, которые являются трансформированными вариантами сквамозной клетки эпителия или мезотелия, которые образуют, например, выстилку плевральной, перикардиальной, перитонеальной, абдоминальной и других полостей тела.

[0048] В одном варианте реализации опухолевые клетки яичников, наличие которых означает наличие рака яичников, могут включать первичные и метастатирующие раковые клетки яичников. Критерии для классификации злокачественных образований хорошо известны в данной области техники, также как и образование и характеристики линий карциномы яичников человека из первичных и метастатирующих опухолей. В других вариантах реализации настоящее раскрытие также предполагает, что злокачественное заболевание может представлять собой мезотелиому, карциному поджелудочной железы, немелкоклеточную карциному легких или другую форму рака, включая любую из различных карцином, каких как карциномы сквамозных клеток и аденокарциномы, а также включая карциномы и гематологические злокачественные образования (например, лейкемии, лимфомы, мие