Варианты альбумина

Варианты альбумина

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Настоящая заявка содержит Перечень последовательностей в электронном виде, который включен сюда в виде ссылки.

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение касается вариантов альбумина либо их фрагментов или слитых полипептидов, содержащих варианты альбумина или их фрагменты с измененным сродством связывания с FcRn и/или измененным временем полужизни по сравнению с альбумином, его фрагментами или слитыми полипептидами, содержащими альбумин или его фрагмент. Изобретение позволяет адаптировать сродство связывания и/или период полужизни альбумина к требованиям и пожеланиям клиента или к его применению.

Уровень техники

Альбумин - это белок, который естественным образом присутствует в плазме крови млекопитающих, где он является самым распространенным белком. Он играет важную роль в поддержании требуемого осмотического давления крови, а также в транспорте различных веществ в кровотоке. Изучены альбумины из многих видов, включая человека, свиней, мышей, крыс, кроликов и коз, и все они обладают высокой степенью гомологичности последовательности и структурной гомологии.

Альбумин связывается in vivo со своим рецептором, неонатальным Fc-рецептором (FcRn) "Brambell", и это взаимодействие важно для полужизни альбумина в плазме. FcRn является мембранным белком, который экспрессируется во многих типах клеток и тканей. Установлено, что FcRn спасает альбумин от внутриклеточного распада (Roopenian D.C. and Akilesh S. (2007) Nat. Rev. Immunol. 7, 715-725). FcRn является бифункциональной молекулой, которая способствует поддержанию высокого уровня IgGs и альбумина в сыворотке млекопитающих и человека.

В то время как взаимодействие FcRn-иммуноглобулин (IgG) было подробно описано в предшествующем уровне техники, взаимодействие FcRn-альбумин изучено не столь хорошо. Основной сайт связывания FcRn локализован в DIII (381-585), см. Andersen et al. (2010) Clinical Biochemistry 43, 367-372. Данные указывают на то, что IgG и альбумин связываются некооперативным образом с разными участками на FcRn (Andersen et al. (2006) Eur. J. Immunol. 36, 3044-3051; Chaudhury et al. (2006) Biochemistry 45, 4983-4990).

Известно, что мышиный FcRn связывает IgG мыши и человека, в то время как FcRn человека является более разборчивым (Ober et al. (2001) Int. Immunol. 13, 1551-1559). В работе Andersen et al. (2010) Journal of Biological Chemistry 285(7): 4826-36 описано сродство FcRn человека и мыши для каждого альбумина мыши и человека (все возможные комбинации). При физиологическом рН не наблюдалось никакого связывания альбумина из обоих видов ни с каким рецептором. При кислом рН наблюдалось 100-кратное различие по сродству связывания. Во всех случаях связывание альбумина и IgG из обоих видов с обоими рецепторами было аддитивным.

Сывороточный альбумин человека (HSA) хорошо изучен, и представляет собой полипептид из 585 аминокислот, последовательность которого приведена в Peters Т., Jr. (1996) All about Albumin: Biochemistry, Genetics and Medical Applications, pp.10, Academic Press, Inc., Orlando (ISBN 0-12-552110-3). Ему присуще характерное связывание со своим рецептором FcRn, с которым он связывается при рН 6,0, но не при рН 7,4.

Время полужизни HSA в плазме составляет примерно 19 дней. Обнаружен природный вариант с меньшим временем полужизни в плазме (Peach R.J. and Brennan S.O. (1991) Biochim. Biophys. Acta 1097: 49-54), который содержит замену D494N. Эта замена создает сайт N-гликозилирования у этого варианта, которого нет у альбумина дикого типа. Неизвестно, что именно - гликозилирование или аминокислотная замена ответственна за изменение времени полужизни.

Альбумин обладает длительным временем полужизни в плазме и вследствие этого свойства его предлагали использовать для доставки лекарственных препаратов. Альбумин конъюгировали с фармацевтически полезными соединениями (WO 2000/69902 A) и оказалось, что у конъюгатов сохраняется длительное время полужизни альбумина в плазме. При этом время полужизни в плазме у конъюгатов обычно было значительно больше, чем у данных терапевтических соединений самих по себе.

Кроме того, альбумин подвергали генетическому слиянию с терапевтически полезными пептидами (WO 2001/79271 А и WO 2003/59934 А), при этом оказалось, что продукт слияния обладает активностью терапевтически полезного пептида и значительно большим временем полужизни в плазме, чем у терапевтически полезных пептидов самих по себе.

В работе Otagiri et al. (2009) Biol. Pharm. Bull. 32(4), 527-534, описано более 70 вариантов альбумина, из них 25 содержат мутации в домене III. Природный вариант, у которого отсутствуют 175 аминокислот на С-конце, обладает пониженным временем полужизни (Andersen et al. (2010) Clinical Biochemistry 43, 367-372). Iwao et al. (2007) исследовали время полужизни природных вариантов альбумина человека на мышиной модели и обнаружили, что К541Е и К560Е обладают меньшим временем полужизни, Е501К и Е570К обладают большим временем полужизни, а время полужизни К573Е почти не меняется (Iwao et al. (2007) B.B.A. Proteins and Proteomics 1774, 1582-1590).

В работе Galliano et al. (1993) Biochim. Biophys. Acta 1225, 27-32 описан природный вариант Е505К. В работе Minchiotti et al (1990) описан природный вариант К536Е. В работе Minchiotti et al. (1987) Biochim. Biophys. Acta 916, 411-418 описан природный вариант K574N. В работе Takahashi et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 4413-4417 описан природный вариант D550G. В работе Carlson et al. (1992) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 89, 8225-8229 описан природный вариант D550A.

В WO 2011/051489 (РСТ/ЕР 2010/066572) описан целый ряд точечных мутаций у альбумина, которые модулируют связывание альбумина с FcRn, в WO 2010/092135 описан ряд точечных мутаций у альбумина, которые увеличивают количество тиолов, доступных для конъюгирования в альбумине, но в описании ничего не говорится о влиянии мутаций на связывание альбумина с FcRn. В WO 2011/103076 описаны варианты альбумина, которые содержат замены в домене III HSA.

Альбумин обладает способностью к связыванию ряда лигандов, при этом они становятся связанными (связываются) с альбумином. Это свойство было использовано для продления времени полужизни в плазме у лекарственных средств, обладающих способностью к нековалентному связыванию с альбумином. Это может осуществляться и путем связывания фармацевтически полезного соединения, почти или совсем не обладающего свойством связываться с альбумином, с молекулой, обладающей свойством связываться с альбумином. См. обзорную статью и приведенные в ней ссылки: Kratz (2008) Journal of Controlled Release 132, 171-183.

Альбумин используется при получении препаратов фармацевтически полезных соединений, причем такие препараты могут включать, без ограничения, наночастицы или микрочастицы альбумина. При этом доставка фармацевтически полезного соединения или смеси соединений может получить выгоду от изменения сродства альбумина к своему рецептору, если полезное соединение действительно связывается с альбумином как средством доставки.

Пока не ясно, чем определяется время полужизни в плазме у образующихся ассоциатов (таких, к примеру, как Levemir^®, см. Kurtzhals P. et al., Biochem. J. 1995, 312: 725-731), конъюгатов или слитых полипептидов, но, по-видимому, это является результатом комбинации альбумина с выбранным фармацевтически полезным соединением или полипептидом. Желательно иметь возможность контролировать время полужизни в плазме у данных конъюгатов, ассоциатов альбумина или слитых полипептидов альбумина с тем, чтобы можно было увеличивать или уменьшать время полужизни в плазме по сравнению с таковым у компонентов ассоциации, конъюгирования или слияния, для того, чтобы иметь возможность разработать определенный препарат в соответствии с особенностями показаний, подлежащих лечению.

Известно, что альбумин накапливается и подвергается катаболизму в опухолях, а также накапливается в воспаленных суставах больных ревматоидным артритом. См. обзорную статью и приведенные в ней ссылки: Kratz (2008) Journal of Controlled Release 132, 171-183. Предполагается, что варианты HSA с повышенным сродством к FcRn окажутся выгодными для доставки полезных соединений.

Также было бы желательно иметь варианты альбумина, почти или совсем не обладающие способностью связываться с FcRn, чтобы обеспечить более короткое время полужизни или контролируемую фармакокинетику в сыворотке, как описано Kenanova et al. (2009) J. Nucl. Med. 50 (Suppl. 2): 1582).

У Kenanova et al. (2010, Protein Engineering, Design & Selection 23(10): 789-798; WO 2010/118169) описана модель стыковки, которая включает структурную модель домена III HSA (выполненную при рН 7-8) и структурную модель FcRn (выполненную при рН 6,4). У Kenanova et al. сказано, что позиции 464, 505, 510, 531 и 535 в домене III способны взаимодействовать с FcRn. Согласно Chaudhury et al. (2006), особый интерес представляют гистидины в положениях 464, 510 и 535, которые, согласно Kenanova (2010), обладают значительно меньшим сродством и меньшим временем полужизни у мышей. Однако работа Kenanova et al. ограничивается доменом III HSA и поэтому рассматривает HSA не в его естественной интактной конфигурации. Кроме того, выявленные позиции приводят к снижению сродства к рецептору FcRn.

В международной патентной заявке WO 2011/051489 (РСТ/ЕР 10/066572) описан первый класс вариантов альбумина с модулированным (например, повышенным или пониженным) сродством связывания с рецептором FcRn вследствие одной или нескольких точечных мутаций в последовательности альбумина. В международной патентной заявке WO 2011/124718 (РСТ/ЕР 2011/055577) описан второй класс вариантов альбумина с модулированным сродством связывания с рецептором FcRn, которые содержат домен III альбумина с одним или несколькими другими доменами альбумина и необязательно содержат одну или несколько точечных мутаций.

Представленные в настоящем изобретении варианты с модулированным сродством связывания с рецептором FcRn и, путем получения целого ряда молекул, позволяют адаптировать сродство связывания, (а тем самым) и время полужизни к различным требованиям. Такая подгонка может варьировать от большого увеличения сродства связывания с FcRn и/или времени полужизни до небольшого увеличения сродства связывания с FcRn и/или времени полужизни, от небольшого уменьшения сродства связывания с FcRn и/или времени полужизни до большого уменьшения сродства связывания с FcRn и/или времени полужизни. Таким образом, молекулы альбумина можно использовать для подгонки сродства связывания с FcRn и/или времени полужизни слитых полипептидов, конъюгатов, ассоциатов, наночастиц и композиций, содержащих молекулы альбумина.

Сущность изобретения

Изобретением предусмотрен способ идентификации и/или проектирования вариантов альбумина, обладающих лучшими свойствами по сравнению с исходным альбумином. В WO 2011/051489 (РСТ/ЕР 2010/066572) описан ряд точечных мутаций у альбумина, модулирующих связывание альбумина с FcRn. Эти точечные мутации использовали для разработки модели стыковки, включающей HSA и FcRn. Модель стыковки использовали для идентификации тех участков альбумина, которые взаимодействуют с FcRn при связывании, а тем самым и тех мутаций, которые будут изменять сродство связывания между альбумином и FcRn по отношению к сродству связывания между HSA дикого типа и FcRn.

Изобретением предусмотрены варианты альбумина с улучшенными свойствами по сравнению с исходным или контрольным альбумином. В частности, изобретением предусмотрены варианты альбумина с измененным сродством связывания с FcRn и/или измененным временем полужизни в плазме по сравнению с исходным или контрольным альбумином.

Таким образом, изобретение касается выделенных вариантов альбумина либо их фрагментов или слитых полипептидов, содержащих варианты альбумина или их фрагменты, из исходного или контрольного альбумина, содержащего изменения по одному или нескольким положениям, соответствующим тем положениям в альбумине, которые эквивалентны положениям в SEQ ID NO: 2, выбранным из: (а) 492-538; (b) 505, 531, 524, 472, 108, 190, 197 и 425; (с) 186-201; (d) 457-472; (e) 414-426; (f) 104-120; (g) 75-91; (h) 144-150; (i) 30-41, (j) 550-585 и (k) 276, 410 и 414, на одно или несколько из числа А, С, D, E, F, G, H, I, К, L, M, N, P, Q, R, S, Т, V, W, Y и/или стоп-кодон в положении от 497 до 585;

при этом предпочтительно, если полипептид содержит одно или несколько изменений, выбранных из (i) группы, состоящей из позиций 417, 464, 492, 493, 494, 495, 496, 499, 500, 501, 503, 504, 505, 506, 510, 535, 536, 537, 538, 540, 550, 573, 574, 575, 577, 578, 579, 580, 581, 582 и 584, и/или (ii) группы, состоящей из позиций 34, 38,40, 75, 76, 80, 82, 83, 86, 90, 91, 104, 113, 115, 116, 200, 461, 471, 496, 498, 501, 503, 504, 505, 506, 512, 514, 538, 550, 558, 559, 560, 562, 564, 565, 567, 573, 574, 577, 578, 579, 580, 581, 582, 584, 585 (в особенности замены одной или нескольких из позиций 34, 38, 40, 76, 80, 82, 83, 86, 104, 113, 115, 116, 471, 496, 498, 501, 503, 504, 505, 506, 512, 538, 550, 560, 562, 564, 565, 573, 574, 577, 578, 579, 580, 581, 582, 584, 585 из природного остатка (например, не остатка Cys) на Cys и/или делеции или замены одной или нескольких из позиций 91, 200, 461, 514, 558, 559, 567 из Cys на остаток не Cys), и/или (iii) группы, состоящей из позиций 63, 82, 84, 87, 90, 106, 114, 119, 146, 464, 201, 494, 501, 503, 505, 510, 513, 518, 525, 529, 533, 535, 536, 537, 550, 550, 557, 560, 563, 565, 570, 573, 574, 574, 584 (в особенности одной или нескольких из D63N, Е82К, Е84К, D87N, L90P, К106Е, R114G, Е119К, V146E, Н464А, H464N, C201F, D494N, Е501К, Е503К, Е505К, Н510А, I513N, D518N, К525Е, Е529К, V533M, Н535А, К536Е, I537N, D550G, D550A, V557M, К560Е, D563N, Е565К, Е570К, К573Е, K574N, К574Е, К584Е); то полипептид также содержит одно или несколько изменений в положениях, выбранных из группы, состоящей из позиций 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 276, 410, 411, 414, 415, 416, 418, 419, 420, 421, 422, 423, 424, 425, 426, 457, 458, 459, 460, 461, 462, 463, 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471, 472, 497, 498, 502, 507, 508, 509, 511, 512, 513, 514, 515, 516, 517, 518, 519, 520, 521, 522, 523, 524, 525, 526, 527, 528, 529, 530, 531, 532, 533, 534, 551, 552, 553, 554, 555, 556, 557, 558, 559, 560, 561, 562, 563, 564, 565, 567, 568, 569, 570, 571, 572, 576, 583, 585, и/или стоп-кодон, вставленный или замещенный в положении, выбранном из позиций 497-585.

Изобретение также включает введение стоп-кодона в положение от остатка 497 до 585, т.е. в любое из позиций 497, 498, 499, 500, 501, 502, 503, 504, 505, 506, 507, 508, 509, 510, 511, 512, 513, 514, 515, 516, 517, 518, 519, 520, 521, 522, 523, 524, 525, 526, 527, 528, 529, 530, 531, 532, 533, 534, 535, 536, 537, 538, 539, 540, 541, 542, 543, 544, 545, 546, 547, 548, 549, 550, 551, 552, 553, 554, 555, 556, 557, 558, 559, 560, 561, 562, 563, 564, 565, 566, 567, 568, 569, 570, 571, 572, 573, 574, 575, 576, 577, 578, 579, 580, 581, 582, 583, 584, 585 (или эквивалентных позиций относительно SEQ ID NO: 2). Введение стоп-кодона может осуществляться вместо или вместе с одним или несколькими из приведенных здесь изменений.

Изобретением предусмотрены варианты альбумина либо их фрагменты с измененным сродством связывания с FcRn по сравнению с исходным или контрольным альбумином, которые содержат изменения (как-то замены, делеции или вставки) по:

(a) одному или нескольким положениям, соответствующим позициям в SEQ ID No: 2 из числа позиций 30, 31, 32, 33, 35, 36, 37, 39, 41, 77, 78,79, 81, 84, 85, 87, 88, 89, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 117, 118, 120, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197; и/или

(b) одному или нескольким положениям, соответствующим позициям в SEQ ID No: 2 из числа позиций 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 276; и/или

(c) одному или нескольким положениям, соответствующим позициям в SEQ ID No: 2 из числа позиций 410, 411, 414, 415, 416, 418, 419, 420, 421, 422, 423, 424, 425, 426, 457, 458, 459, 460, 462, 463, 465, 466, 467, 468, 469, 470, 472, 497, 498, 502, 507, 508, 509, 511, 515, 516, 517, 518, 519, 520, 521, 522, 523, 524, 525, 526, 527, 528, 529, 530, 531, 532, 534, 551, 552, 553, 554, 555, 556, 557, 561, 566, 568, 569, 570, 571, 572, 576, 583;

причем измененное сродство связывания у варианта или его фрагмента будет относительно сродства связывания у контрольного альбумина, типа исходного альбумина или его фрагмента, не содержащего изменений.

Положения, приведенные в (а) (выше), могут находиться в первом домене (например, домене I) полипептида типа альбумина, например, HSA. Положения, приведенные в (b) (выше), могут находиться во втором домене (например, домене II) полипептида типа альбумина, например, HSA. Положения, приведенные в (с) (выше), могут находиться в третьем домене (например, домене III) полипептида типа альбумина, например, HSA.

Вариант альбумина или его фрагмент может дополнительно включать изменения (например, замены или вставки) по одному или нескольким положениям, соответствующим следующим позициям в SEQ ID No: 2:

(i) из числа позиций 417, 464, 492, 493, 494, 495, 496, 499, 500, 501, 503, 504, 505, 506, 510, 535, 536, 537, 538, 540, 550, 573, 574, 575, 577, 578, 579, 580, 581, 582, 584,

(ii) из числа позиций 34, 38, 40, 75, 76, 80, 82, 83, 86, 90, 91, 104, 113, 115, 116, 200, 461, 471, 496, 498, 501, 503, 504, 505, 506, 512, 514, 538, 550, 558, 559, 560, 562, 564, 565, 567, 573, 574, 577, 578, 579, 580, 581, 582, 584, 585 (в особенности замены по одной или нескольким из позиций 34, 38, 40, 76, 80, 82, 83, 86, 104, 113, 115, 116, 471, 496, 498, 501, 503, 504, 505, 506, 512, 538, 550, 560, 562, 564, 565, 573, 574, 577, 578, 579, 580, 581, 582, 584, 585 из природного остатка (например, не остатка Cys) на Cys и/или делеции или замены по одной или нескольким из позиций 91, 200, 461, 514, 558, 559, 567 из Cys на остаток не Cys), и/или

(iii) из числа позиций 63, 82, 84, 87, 90, 106, 114, 119, 146, 464, 201, 494, 501, 503, 505, 510, 513, 518, 525, 529, 533, 535, 536, 537, 550, 550, 557, 560, 563, 565, 570, 573, 574, 574, 584 (в особенности одной или нескольких из D63N, Е82К, Е84К, D87N, L90P, К106Е, R114G, Е119К, V146E, Н464А, H464N, C201F, D494N, Е501К, Е503К, Е505К, Н510А, I513N, D518N, К525Е, Е529К, V533M, Н535А, К536Е, I537N, D550G, D550A, V557M, К560Е, D563N, Е565К, Е570К, К573Е, K574N, К574Е, К584Е).

Предпочтительно исходный альбумин и/или вариант альбумина содержит или состоит из:

(a) полипептида, по меньшей мере на 60% идентичного по последовательности зрелому полипептиду по SEQ ID NO: 2;

(b) полипептида, кодируемого таким полинуклеотидом, который гибридизуется в условиях низкой жесткости с (i) кодирующей последовательностью зрелого полипептида по SEQ ID NO: 1 или (ii) полноразмерной последовательностью, комплементарной к (i);

с) полипептида, кодируемого таким полинуклеотидом, который по меньшей мере на 60% идентичен кодирующей последовательности зрелого полипептида по SEQ ID NO: 1; и/или

(d) фрагмента зрелого полипептида по SEQ ID NO: 2.

Изменения по одному или нескольким положениям могут быть независимо выбраны из замен, вставок и делеций, причем предпочтительны замены.

Изобретение также касается выделенных полинуклеотидов, кодирующих варианты; конструкций из нуклеиновых кислот, векторов и клеток-хозяев, содержащих полинуклеотиды; и способов получения этих вариантов.

Изобретение также касается конъюгатов или ассоциатов, содержащих варианты альбумина или их фрагменты по изобретению и полезные терапевтические молекулы, или слитых полипептидов, содержащих варианты альбумина или их фрагменты по изобретению и полипептиды-партнеры по слиянию.

Изобретение также касается композиций, содержащих варианты альбумина, их фрагменты, слитые полипептиды, содержащие варианты альбумина или их фрагменты, либо конъюгаты, содержащие варианты альбумина или их фрагменты по изобретению, либо ассоциаты, содержащие варианты альбумина или их фрагменты по изобретению. Композиции предпочтительно являются фармацевтическими композициями.

Изобретение также касается фармацевтических композиций, содержащих варианты альбумина, их фрагменты, слитые полипептиды, содержащие варианты альбумина или их фрагменты, либо конъюгаты, содержащие варианты альбумина или их фрагменты, либо ассоциаты, содержащие варианты альбумина или их фрагменты, причем данные варианты альбумина, их фрагменты, слитые полипептиды, содержащие варианты альбумина или их фрагменты, либо конъюгаты, содержащие варианты альбумина или их фрагменты, либо ассоциаты вариантов альбумина или их фрагментов обладают измененным сродством связывания с FcRn и/или измененным временем полужизни в плазме по сравнению с соответствующим сродством связывания и/или временем полужизни в плазме у HSA или его фрагмента, слитого полипептида, содержащего HSA или его фрагмент, либо конъюгатов или ассоциатов HSA или его фрагмента, содержащих HSA или его фрагмент.

Краткое описание фигур

Фиг.1. Множественное выравнивание аминокислотных последовательностей (i) полноразмерного зрелого HSA (Hu_1_2_3), (ii) варианта альбумина, содержащего домен I и домен III HSA (Hu_1_3), (iii) варианта альбумина, содержащего домен II и домен III HSA (Hu_2_3), (iv) полноразмерного альбумина Macaca mulatta (Mac_mul), (v) полноразмерного альбумина Rattus norvegicus (Rat) и (vi) полноразмерного альбумина Mus musculus (Mouse). Стрелками указаны позиции 500, 550 и 573 (относительно полноразмерного HSA). На фиг.4 домены I, II и III приводятся как 1, 2 и 3 (соответственно).

Фиг.2. Множественное выравнивание аминокислотных последовательностей зрелого альбумина от человека, овцы, мыши, кролика и козы и незрелых альбуминов от шимпанзе ("Chimp"), макаки, хомяка, морской свинки, крысы, коровы, лошади, осла, собаки, курицы и свиньи. Указаны начальные и концевые аминокислоты доменов 1, 2 и 3 (как это определено Dockal et al. (Journal of Biological Chemistry, 1999, Vol. 274(41): 29303-29310)) относительно зрелого альбумина человека.

Фиг.3. Консервативные группы аминокислот на основании их свойств.

Фиг.4. Доменная архитектура HSA и свойства связывания с shFcRn у гибридных молекул HSA. (А) Общая структура shFcRn, показывающая расположение рН-зависимой гибкой петли (оранжевая полоска непосредственно под меткой 'His 166') и His-166 относительно IgG-связывающего сайта (красные остатки в виде шариков и палочек (остатки типа шариков на палочках ниже метки 'α2' и слева от меток 'Glu115', 'Glu116' и 'IgG') (23). (В) Кристаллическая структура полноразмерного HSA состоит из трех α-спиральных доменов: DI (розовый), DII (оранжевый) и DIII (голубой/синий) (19). DIII разделен на субдомены DIIIa (голубой) и DIIIb (синий). (С) Доменная организация сконструированных гибридных молекул HSA (DI-DII, DI-DIII, DII-DIII, DIII; домены закрашены по той же схеме, что и на фиг.4А и 4В). (D) Миграция в геле SDS-PAGE вариантов доменов HSA. (E) SPR-сенсограммы HSA дикого типа и комбинаций доменов, которые пропускали над иммобилизованным shFcRn при рН 6,0. (F) Данные ELISA, показывающие рН-зависимое связывание HSA дикого типа, DIIIa HSA и HSA Bartin с shFcRn при рН 7,4 и рН 6,0.

Фиг.5. Структурные последствия HSA Casebrook на связывание с shFcRn. (А) Сеть взаимодействий вокруг Asp-494 в HSA крупным планом. Asp-494 располагается в петле, соединяющей субдомены DIIIa (голубой) и DIIIb (синий). Asp-494 образует ионное взаимодействие с Arg-472 и водородную связь с Gln417, которые оба локализованы в субдомене DIIIa. Asp-494 также образует водородную связь с Thr-496, тем самым стабилизируя петлю, соединяющую DIIIa и DIIIb. (В) Миграция в геле SDS-PAGE мутантов D494N, D494A, D494Q, E495Q, Е495А, Т496А и D494N/T496A. SPR-сенсограммы, показывающие связывание shFcRn с HSA дикого типа и (С) с полученными рекомбинантным способом мутантами Casebrook (D494N), D494A и D494Q. (D) E495Q и Е495А и (Е) Т496А и D494N/T496A при рН 6,0. (F) SPR-сенсограммы связывания shFcRn с HSA дикого типа и Casebrook, выделенным из гетерозиготного пациента. (G) Конкурентное связывание HSA дикого типа и Casebrook с shFcRn при рН 6,0. Рецептор в присутствии оттитрованных количеств HSA дикого типа или Casebrook пропускали над иммобилизованным HSA. (H) SPR-сенсограммы, показывающие связывание shFcRn с HSA дикого типа и Q417A при рН 6,0.

Фиг.6. Консервативные гистидины являются существенными для связывания с shFcRn. (А) Расположение отдельных остатков в DIII HSA. Остатки в петле, соединяющей субдомены DIIIa и DIIIb, отобранные для мутагенеза (Asp-494, Glu-495, Lys-500 и Glu-501), а также дополнительные остатки, расположенные возле соединительной петли, при этом консервативные гистидины (His-464, His-510 и His-536) и Lys-536 и Pro-537 представлены в виде шариков и палочек (бордовые). Неконсервативный His-440 располагается дистально. Последняя С-концевая α-спираль выделена желтым (помечена как 'С-концевая α-спираль'). SPR-сенсограммы связывания shFcRn с HSA дикого типа и (В) Р499А, К500А и Е501А, и (С) H440Q, H464Q, H510Q и H535Q, а также (С) К536А, Р537А и К538А при кислом рН (6,0).

Фиг.7. His-166 стабилизирует гибкую петлю рН-зависимым образом. Область петли НС FcRn при различных значениях рН крупным планом. (А) При низком рН (4,2), положительно заряженный His-166 формирует стабилизированную зарядом водородную связь с Glu-54 и Tyr-60 в пределах выходящей на поверхность петли в shFcRn (23). (В) При высоком рН (8,2) ослабляется взаимодействие незаряженного His-166 с Glu-54 и Tyr-60, а петля между остатками Trp-51 и Tyr-60 становится гибкой и структурно разупорядоченной (представлено пунктирной линией) (8). (С) Связывание shFcRn дикого типа и мутантов (E54Q, Q56A и Н166А) с оттитрованным количеством HSA, фиксированного в лунках ELISA при рН 6,0.

Фиг.8. Предложенная модель стыковки shFcRn-HSA.

(A) Схема стыковки молекул в двух ориентациях, на которой показаны НС FcRn (зеленый, помечен как 'FcRnα1', 'FcRnα2' и 'FcRnα3'), β2m (серый) и три α-спиральные домены HSA: DI (розовый), DII (оранжевый) и DIII (голубой/синий). DIII делится на субдомены DIIIa (голубой) и DIIIb (синий).

(B) Поверхность раздела при взаимодействии между shFcRn (зеленый контур) и HSA (синяя поверхность на пространственной диаграмме, темно-серая по серой шкале) на модели стыковки крупным планом. С-терминальный конец HSA (темно-синий, темно-серый по серой шкале) и петля, соответствующая остаткам 490-510 между субдоменами DIIIa и DIIIb, образуют щель на поверхности HSA, в которую может входить рН-зависимая и гибкая петля из shFcRn (остатки 51-59). His-166 shFcRn может образовывать сильные, стабилизированные зарядами взаимодействия с остатками Glu-54 и Glu-505 из HSA. К тому же Glu-505 из HSA может взаимодействовать с Arg-162 из shFcRn. Могут образовываться солевые мостики между Lys-150 и Glu-151 из shFcRn и Glu-501 и Lys-500 из HSA. На поверхности HSA образуется щель между петлей, соединяющей DIIIa и DIIIb, и α-спиралью, охватывающей остатки 520-535. При низком рН His-161 из shFcRn может взаимодействовать с Glu-531 из HSA, и комплекс может быть усилен солевым мостиком между Glu-168 из shFcRn и Lys-524 из HSA.

(C) Поверхность раздела при взаимодействии между shFcRn (зеленая поверхность на пространственной диаграмме в левом нижнем углу) и HSA (розовый, синий и голубой контуры на ленточной диаграмме) на модели стыковки. Петля β-шпильки из shFcRn вклинивается между доменами DI (розовый, включая метки 'Lys190', 'Asp108' и 'Arg197') и DIIIa (голубой, включая метки 'Glu425' и 'His464') из HSA. Asp110 из shFcRn может быть партнером для Lys190 или Arg197 из HSA после некоторых структурных перестроек в этой интерфазе. Консервативный His464 располагается в α-спирали DIIIa, контактирующей с петлей β-шпильки.

Фиг.9. Представление модели стыковки shFcRn-HSA. (A-B) Представлены две ориентации комплекса. Альбумин представлен пространственной диаграммой, а FcRn - в виде ленточной диаграммы. Основная часть интерфазы связывания HSA выделена розовым (по серой шкале - в виде самого темного, почти черного участка, DI (CBI)), тогда как зона, расположенная дистально от интерфазы, представлена как DII (оранжевая), а DIII разделен на субдомены DIIIa (голубой) и DIIIb (синий).

Фиг.10. Связывание shFcRn-GST с серией мутаций HSA Casebrook (100-0,045 мкг/мл) при рН 6,0 и рН 7,4. Значения ELISA представляют среднее из двух повторов.

Фиг.11. Связывание варианта HSA Casebrook, выделенного из гетерозиготного индивида, и HSA дикого типа (200-1,625 мкг/мл) с shFcRn-GST при рН 6,0.

Фиг.12. Спектры CD HSA дикого типа и вариантов Casebrook при рН 6,0. Исследовали по 5 мкМ каждого варианта, а представленные спектры представляют среднее из 5 запусков.

Фиг.13. Анализ методом восстановительного SDS-PAGE гистидиновых вариантов HSA. Дорожка 1, SeeBlue^® Plus2 (6 мкл) и по 1 мкг на дорожку (2) H440Q, (3) H464Q, (4) H510Q и (5) H535Q.

Фиг.14. Связывание усеченных вариантов HSA дикого типа и варианта HSA 568stop (усеченный вариант, у которого отсутствуют последние 17 аминокислот). Связывание усеченного по С-концу варианта HSA с shFcRn. По 10 мкМ каждого пропускали над иммобилизованным shFcRn (2000 RU) при рН 6,0.

Фиг.15. Связывание shFcRn-GST с HSA дикого типа и HSA E168A (200-0,045 мкг/мл) при рН 6,0 и рН 7,4. Значения ELISA представляют среднее из двух повторов.

Фиг.16. Предложенная модель стыковки shFcRn-HSA, показывающая, в двух ориентациях, одновременное связывание двух лигандов (IgG и HSA) с FcRn.

Фиг.17. Сравнение связанного с жирными кислотами и свободного HSA не показывает никаких существенных перестроек внутри субдомена DIII HSA при связывании, но значительный сдвиг ориентации DI HSA относительно DIII HSA. Myr: миристат; β2m: β2-микроглобулин.

Фиг.18. Выборка альфа-углеродов из файла PDB по HSA (SEQ ID No. 2) из модели стыковки HSA и FcRn, описанной в примере 1.

Фиг.19. Выборка альфа-углеродов из файла PDB по FcRn (SEQ ID No. FcRn) из модели стыковки HSA и FcRn, описанной в примере 1.

Фиг.20. Связывание укороченных по С-концу вариантов HSA с shFcRn. По 10 мкМ каждого варианта пропускали над иммобилизованным shFcRn-GST (2000 RU) при рН 6,0.

Фиг.21. Конкурентное связывание укороченных по С-концу вариантов HSA. Конкурентное связывание оценивали путем пропускания shFcRn-GST (100 нМ), одного или вместе с серийными разведениями вариантов HSA, над иммобилизованным HSA (~2200 RU) при рН 6,0.

Фиг.22. Точечные мутации в С-концевой части HSA модулируют связывание с shFcRn. По 10 мкМ HSA дикого типа и (A) HSA Q580A, (В) HSA K574A и (С) HSA K573P/Q580A пропускали над иммобилизованным shFcRn-GST (~2000 RU) при рН 6,0.

Фиг.23. Связывание с shFcRn HSA дикого типа, HSA K573P и HSA N111Q/K573P при рН 5,5. Образцы пропускали над иммобилизованным shFcRn-HIS (~1500-2500 RU) при рН 5,5.

Фиг.24. Предложенная модель стыковки shFcRn-HSA, показывающая пространственные взаимоотношения между shFcRn (пространственная диаграмма) и DI, DII и DIII HSA (ленточная диаграмма), включая петли HSA, содержащие позиции 78-88 и 108-112.

Раскрытие сущности изобретения

Изобретение касается выделенных вариантов альбумина либо их фрагментов или слитых полипептидов, содержащих варианты альбумина или их фрагменты, из исходного или контрольного альбумина, содержащих изменения в одном или нескольких положениях, которые влияют и/или участвуют во взаимодействии между альбумином и FcRn, предпочтительно изменения в одном или нескольких положениях, соответствующих позициям 30-41, 75-91, 104-120, 144-150, 186-201, 414-426, 457-472, 492-538, 550-585, 276, 410 и/или 411 зрелого полипептида по SEQ ID NO: 2, при этом предпочтительно, если вариант, его фрагмент или слитый белок содержит одну или несколько замен в положениях, выбранных из (i) группы, состоящей из позиций 417, 464, 492, 493, 494, 495, 496, 499, 500, 501, 503, 504, 505, 506, 510, 535, 536, 537, 538, 540, 550, 573, 574, 575, 577, 578, 579, 580, 581, 582 и 584, и/или (ii) группы, состоящей из позиций 34, 38, 40, 75, 76, 80, 82, 83, 86, 90, 91, 104, 113, 115, 116, 200, 461, 471, 496, 498, 501, 503, 504, 505, 506, 512, 514, 538, 550, 558, 559, 560, 562, 564, 565, 567, 573, 574, 577, 578, 579, 580, 581, 582, 584, 585 (в особенности замены по одной или нескольким из позиций 34, 38, 40, 76, 80, 82, 83, 86, 104, 113, 115, 116, 471, 496, 498, 501, 503, 504, 505, 506, 512, 538, 550, 560, 562, 564, 565, 573, 574, 577, 578, 579, 580, 581, 582, 584, 585 из природного остатка (например, остатка не Cys) на Cys и/или делеции или замены по одной или нескольким из позиций 91, 200, 461, 514, 558, 559, 567 из Cys на остаток не Cys), то вариант, его фрагмент или слитый белок также содержит одно или несколько изменений в положениях, выбранных из группы, состоящей из позиций 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 276, 410, 411, 414, 415, 416, 418, 419, 420, 421, 422, 423, 424, 425, 426, 457, 458, 459, 460, 461, 462, 463, 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471, 472, 497, 498, 502, 507, 508, 509, 511, 512, 513, 514, 515, 516, 517, 518, 519, 520, 521, 522, 523, 524, 525, 526, 527, 528, 529, 530, 531, 532, 533, 534, 551, 552, 553, 554, 555, 556, 557, 558, 559, 560, 561, 562, 563, 564, 565, 567, 568, 569, 570, 571, 572, 576, 583, 585.

Предпочтительными изменениями являются те, что производятся в положениях, эквивалентных позициям 534, 505, 111, 527, 510 и/или 108 (согласно SEQ ID No: 2). Более предпочтительны замены K534V, E505Q, N111D, T527M, H510D и D108A или такие же замены в положениях, эквивалентных им. Также предпочтительны замены K534I, K534L, D108E и N111E или такие же замены в положениях, эквивалентных им, так как они представляют очень консервативные замены для K534V, D108A и N111D. Предпочтительными являются изменения в положениях, эквивалентных петле, включающей позиции 105-120 (согласно SEQ ID No: 2), более предпочтительно в положениях, эквивалентных позициям 106-115, и еще более предпочтительно в положениях, эквивалентных позициям 108, 109, 110, 111 и 112. Специалисты смогут идентифицировать позиции, эквивалентные позициям SEQ ID No: 2, как описано здесь.

Изобретением предусмотрены варианты альбумина или их фрагменты с измененным сродством связывания с FcRn по сравнению с исходным или контрольным альбумином, которые содержат изменения (как-то замены, делеции или вставки) в:

(a) одному или нескольким положениям, соответствующим позициям в SEQ ID No: 2 из числа позиций 30, 31, 32, 33, 35, 36, 37, 39, 41, 77, 78, 79, 81, 84, 85, 87, 88, 89, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 117, 118, 120, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197; и/или

(b) одному или нескольким положениям, соответствующим позициям в SEQ ID No: 2 из числа позиций 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 276; и/или

(c) одному или нескольким положениям, соответствующим позициям в SEQ ID No: 2 из числа позиций 410, 411, 414, 415, 416, 418, 419, 420, 421, 422, 423, 424, 425, 426, 457, 458, 459, 460, 462, 463, 465, 466, 467, 468, 469, 470, 472, 497, 498, 502, 507, 508, 509, 511, 515, 516, 517, 518, 519, 520, 521, 522, 523, 524, 525, 526, 527, 528, 529, 530, 531, 532, 534, 551, 552, 553, 554, 555, 556, 557, 561, 566, 568, 569, 570, 571, 572, 576, 583;

причем измененное сродство связывания у варианта или его фрагмента будет относительно сродства связывания у контрольного типа исходного альбумина или его фрагмента, не содержащего изменений.

Положения, приведенные в (а) (выше), могут находиться в первом домене (например, домене I) полипептида типа альбумина, например, HSA. Положения, приведенные в (b) (выше), могут находиться во втором домене (например, домене II) полипептида типа альбумина, например, HSA. Положения, приведенные в (с) (выше), могут находиться в третьем домене (например, домене III) полипептида типа альбумина, например, HSA.

Вариант альбумина или его фрагмент может дополнительно включать изменения (как-то замены или вставки) по одному или нескольким положениям, соответствующим следующим позициям в SEQ ID No: 2:

(i) из числа позиций 417, 464, 492, 493, 494, 495, 496, 499, 500, 501, 503, 504, 505, 506, 510, 535, 536, 537, 538, 540, 550, 573, 574, 575, 577, 578, 579, 580, 581, 582, 584,

(ii) из числа позиций 34, 38, 40, 75, 76, 80, 82, 83, 86, 90, 91, 104, 113, 115, 116, 200, 461, 471, 496, 498, 501, 503, 504, 505, 506, 512, 514, 538, 550, 558, 559, 560, 562, 564, 565, 567, 573, 574, 577, 578, 579, 580, 581, 582, 584, 585 (в особенности замены по одной или нескольким из позиций 34, 38, 40, 76, 80, 82, 83, 86, 104, 113, 115, 116, 471, 496, 498, 501, 503, 504, 505, 506, 512, 538, 550, 560, 562, 564, 565, 573, 574, 577, 578, 579, 580, 581, 582, 584, 585 из природного остатка (например, не остатка Cys) на Cys и/или делеции или замены по одной или нескольким из позиций 91, 200, 461, 514, 558, 559, 567 из Cys на остаток не Cys), и/или

(iii) из числа позиций 63, 82, 84, 87, 90, 106, 114, 119, 146, 464, 201, 494, 501, 503, 505, 510, 513, 518, 525, 529, 533, 535, 536, 537, 550, 550, 557, 560, 563, 565, 570, 573, 574, 574, 584 (в особенности одной или нескольких из D63N, Е82К, Е84К, D87N, L90P, К106Е, R114G, Е119К, V146E, Н464А, H464N, C201F, D494N, Е501К, Е503К, Е505К, Н510А, I513N, D518N, К525Е, Е529К, V533M, Н535А, К536Е, I537N, D550G, D550A, V557M, К560Е, D563N, Е565К, Е570К, К573Е, K574N, К574Е, К584Е).

Предпочтительно исходный альбумин и/или вариант альбумина содержит или состоит из:

(a) полипептида, по меньшей мере на 60% идентичного по последовательности зрелому полипептиду по SEQ ID NO: 2;

(b) полипептида, кодируемого таким полинуклеотидом, который гибридизуется в условиях низкой жесткости с (i) кодирующей последовательностью зрелого полипептида по SEQ ID NO: 1 или (ii) полноразмерной последовательностью, комплементарной к (i);

с) полипептида, кодируемого таким полинуклеотидом, который по меньшей мере на 60% идентичен кодирующей последовательности зрелого полипептида по SEQ ID NO: 1; и/или

(d) фрагмента зрелого полипептида по SEQ ID NO: 2.

Изменения по одному или нескольким положениям могут быть независимо выбраны из замен, вставок и делеций, причем предпочтительны замены.

Изобретение также включает введение стоп-кодона в положение от остатка 497 до 585 (или эквивалентное положение согласно SEQ ID NO: 2) либо от остатка 497 (или эквивалентного положения согласно SEQ ID NO: 2) до последнего остатка последовательности зрелого альбумина. Введение стоп-кодона может осуществляться вместо или вместе с одним или несколькими из приведенных здесь изменений.

Изобретение также позволяет адаптировать сродство связывания (а тем самым и период полужизни) молекулы альбумина с рецептором FcRn к требованиям конкретного клиента или применения. Такая подгонка может варьировать от сильного увеличения времени полужизни до небольшого увеличения времени полужизни, от небольшого уменьшения времени полужизни до сильного уменьшения времени полужизни. Таким образом, молекулы альбумина можно использовать для подгонки времени полужизни слитых полипептидов, конъюгатов, ассоциатов, наночастиц и композиций, содержащих молекулы альбумина. Изобретение особенно подходит для фармацевтических препаратов. Некоторые фармацевтические препараты получают преимущество от увеличения времени полужизни, например, для увеличения интервала между дозами. Некоторые фармацевтические препараты получают преимущество от сокращения времени полужизни, например, для ускорения выведения из организма пациента. Таким образом, применение молекул альбумина по изобретению в фармацевтических препаратах позволяет адаптировать время полужизни препарата по желанию.

Определения

Вариант. Термин "вариант" означает полипептид, полученный из исходного альбумина посредством одного или нескольких изменений, т.е. замен, вставок и/или делеций, по одному или нескольким положениям. Замена означает замену аминокислоты, занимающей положение, на другую аминокислоту; делеция означает удаление аминокислоты, занимающей положение; а вставка означает добавление 1 или нескольких, например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10, предпочтительно 1-3 аминокислот, непосредственно примыкающих к аминокислоте, занимающей позицию. В отношении замен 'в непосредственной близости' может означать с N-стороны (выше) или С-стороны ('ниже) от аминокислоты, занимающей позицию ('названной аминокислоты'). Таким образом, для аминокислоты, названной/пронумерованной 'X', вставка может быть в положении 'Х+1' ('выше') или в положении 'Х-1' ('ниже).

Мутант. Термин "мутант" означает полинуклеотид, кодирующий вариант.

Альбумин дикого типа. Термин альбумин "дикого типа" (WT) означает альбумин с такой же аминокислотной последовательностью, что встречается в природе у животных