Композиция, содержащая два антитела, сконструированных так, чтобы они обладали пониженной и повышенной эффекторной функцией

Композиция, содержащая два антитела, сконструированных так, чтобы они обладали пониженной и повышенной эффекторной функцией

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение в целом относится к иммунотерапии. Более конкретно изобретение относится к направленным против антигенов иммуноконъюгатам и к антителам со сконструированной Fc-областью, предназначенным для совместного применения в качестве иммунотерапевтических агентов. Кроме того, изобретение относится к фармацевтическим композициям, содержащим комбинации указанных иммуноконъюгатов и антител, и к способам их применения для лечения заболевания.

Предпосылки создания изобретения

В различных клинических ситуациях часто требуется деструкция индивидуальной клетки или конкретного типа клеток. Например, основной задачей при терапии рака является специфическое разрушение опухолевых клеток с сохранением при этом в интактном и неповрежденном состоянии здоровых клеток и тканей.

Перспективным путем достижения этой цели является индукция иммунного ответа против опухоли, который принуждает иммунные эффекторные клетки, такие как естественные клетки-киллеры (NK) или цитотоксические Т-лимфоциты (CTL), атаковать и разрушать опухолевые клетки. Эффекторные клетки можно активировать с помощью различных стимулов, включая целый ряд цитокинов, которые индуцируют передачу сигналов посредством связывания с их рецепторами на поверхности иммунных клеток. Например, применение интерлейкина-2 (IL-2), который среди прочего стимулирует пролиферацию и активацию цитотоксических Т-клеток и NK-клеток, разрешено для лечения метастатической почечно-клеточной карциномы и злокачественной меланомы. Однако быстрый клиренс из крови и отсутствие специфичности в отношении опухоли обусловливают необходимость системного введения высоких доз цитокинов для достижения достаточной для активации иммунного ответа или противоопухолевого действия концентрации цитокина в области локализации опухоли. Такие высокие уровни обладающих системным действием цитокинов могут приводить к проявлению серьезной токсичности и нежелательных реакций, что имеет место также в случае IL-2. Таким образом, для применения в противораковой терапии требуется специфическое введение цитокинов в опухоль или микроокружение опухоли. Для этой цели можно конъюгировать цитокин с обеспечивающим направленный перенос фрагментом, например, антителом или фрагментом антитела, специфическим в отношении опухолевого антигена. Дополнительным преимуществом указанных иммуноконъюгатов является их удлиненное время полужизни в сыворотке по сравнению с неконъюгированным цитокином. Их способность повышать до максимума иммуностимулирующую активность в области опухоли, при этом сводя до минимума их системные побочные действия при применении в низкой дозе, делает содержащие цитокины иммуноконъюгаты оптимальными иммунотерапевтическим агентами.

Другой путь активации эффекторных клеток включает вовлечение активирующих Fc-рецепторов, которые находятся на их поверхности, с помощью Fc-фрагмента иммуноглобулинов или рекомбинантных слитых белков, содержащих Fc-область. Так называемые эффекторные функции антитела, которые опосредуются его Fc-областью, являются важным механизмом действия противораковой иммунотерапии на основе антител. Антитело-обусловленная клеточнозависимая цитотоксичность, т.е. деструкция сенсибилизированных антителом клеток-мишеней (например, опухолевых клеток) с помощью NK-клеток, запускается, когда антитело, связанное с поверхностью клетки, взаимодействует с Fc-рецепторами на NK-клетке. NK-клетки экспрессируют FcγRIIIa (CD16a), который распознает иммуноглобулины IgG₁- или IgG₃-подкласса. Другие эффекторные функции включают антитело-обусловленный клеточнозависмый фагоцитоз (ADCP) и комплементзависимую цитотоксичность (CDC), а варьируют в зависимости от класса и подкласса антитела, поскольку различные типы иммунных клеток несут различные группы Fc-рецепторов, которые распознают различные типы и подтипы константных доменов тяжелых цепей иммуноглобулинов (например, константные домены тяжелых цепей α, δ, γ, ε или μ, соответствующие IgA-, IgD-, IgE-, IgG- или IgM-классу антител соответственно). Для повышения эффекторных функций антител применяли различные стратегии. Например, у Shields и др., J Biol Chem 9(2), 2001, сс. 6591-6604 продемонстрировано, что аминокислотные замены в положениях 298, 333 и/или 334 Fc-области (EU-нумерация остатков) повышает связывание антител с FcγIIIa-рецептором и ADCC. Другие варианты антител, имеющие аминокислотные модификации в Fc-области и обладающие повышенной способностью связываться с Fc-рецептором и эффекторной функцией, описаны например, в US №6737056, WO 2004/063351 и WO 2004/099249. Альтернативно этому, для достижения повышенной способности связываться с Fc-рецептором и эффекторной функции можно изменять гликозилирование антитела. Антитела IgG₁-типа, которые представляют собой антитела, наиболее часто применяемые для противораковой иммунотерапии, имеют консервативный N-связанный сайт гликозилирования на Asn 297 в каждом СН2-домене Fc-области. Два комплексных биантенных олигосахарида, присоединенных к Asn 297, «спрятаны» между СН2-доменами, образуя обширные контакты с полипептидным каркасом, и их присутствие имеет решающее значение для антитела касательно эффекторных функций, включая антитело-обусловленную клеточнозависимую цитотоксичность (ADCC) (Lifely и др., Glycobiology 5, 1995, сс. 813-822; Jefferis и др., Immunol Rev 163, 1998, сс. 59-76; Wright и Morrison, Trends Biotechnol 15, 1997, сс. 26-32). В опытах по конструированию белков установлено, что FcγR взаимодействует с нижней шарнирной областью СН2-домена IgG (Lund и др., J Immunol 157, 1996, сс. 4963-4969)). Однако для связывания FcγR требуется также присутствие олигосахаридов в СН2-области (Lund и др., J Immunol 157, 1996, сс. 4963-4969; Wright и Morrison, Trends Biotech 15, 1997, сс. 26-31), это позволяет предположить, что либо олигосахарид и полипептид оба непосредственно входят в сайт взаимодействия, либо олигосахарид требуется для поддержания активной конформации полипептида СН2. Таким образом, модификацию олигосахаридной структуры можно использовать в качестве средств повышения аффинности взаимодействия между IgG₁ и FcγR и для повышения ADCC-активности антитела IgG₁-подтипа. У Umaña и др., Nat Biotechnol 17, 1999, сс. 176-180 и в US №6602684 (WO 99/54342) (содержание которых полностью включено в настоящее описании в качестве ссылок) продемонстрировано, что сверхэкспрессия β(1,4)-N-ацетилглюкозаминилтрансферазы III (GnTIII), т.е. гликозилтрансферазы, которая катализирует образование бисекционных олигосахаридов в клетках яичника китайского хомячка (СНО), существенно повышает in vitro ADCC-активность антител, продуцируемых в этих клетках. Сверхэкспрессия GnTIII в клеточных линиях-продуцентах приводит к получению антител, обогащенных бисекционными олигосахаридами, которые, как правило, являются также нефукозилированными и относятся к гибридному типу. Если помимо GnTIII в клеточных линиях-продуцентах имеет место сверхэкспрессия маннозидазы II (ManII), то получают антитела, обогащенные бисекционными нефукозилированными олигосахаридами комплексного типа (Ferrara и др., Biotechn Bioeng 93, 2006, сс. 851-861). Для обоих типов антител характерна значительно повышенная ADCC по сравнению с антителами и немодифицированными гликанами, но только антитела, в которых большинство N-гликанов относятся к комплексному типу, обладают способностью индуцировать значительную комплементзависимую цитотоксичность (Ferrara и др., Biotechn Bioeng 93, 2006, сс. 851-861). Имеющим решающим значение фактором для повышения ADCC-активности, по-видимому, является элиминация фукозы из наиболее глубоко лежащего N-ацетилглюкозаминного остатка олигосахаридного ядра, что повышает связывание Fc-домена IgG с FcγRIIIa (Shinkawa и др., J Biol Chem 278, 2003, сс. 3466-3473). Другие методы получения антител со сниженным фукозилированием включают, например, экспрессию в клетках-хозяевах с дефицитом α(1,6)-фукозилтрансферазы (Yamane-Ohnuki и др., Biotech Bioeng 87, 2004, сс. 614-622; Niwa и др., J Immunol Methods 306, 2006, сс. 151-160).

Несмотря на успехи, достигнутые в области противораковой терапии благодаря применению свободных цитокинов, в области противораковой терапии существует постоянная необходимость в иммуноконъюгатах или сконструированных антителах в качестве новых эффективных и безопасных путей лечения.

Краткое изложение сущности изобретения

При создании настоящего изобретения было обнаружено, что комбинация этих двух стратегий, т.е. одновременная стимуляция эффекторных клеток содержащими цитокины иммуноконъюгатами и антителами, сконструированными таким образом, чтобы они обладали повышенными эффекторными функциями, значительно повышает эффективность противораковой иммунотерапии.

Таким образом, в настоящем изобретении предложена комбинация (а) иммуноконъюгата, который содержит первое антитело, сконструированное таким образом, чтобы оно обладало пониженной эффекторной функцией, и эффекторный фрагмент, и (б) второе антитело, сконструированное таким образом, чтобы оно обладало повышенной эффекторной функцией, для применения при лечении заболевания у индивидуума, который нуждается в этом. В одном из вариантов осуществления изобретения цитокин выбирают из группы, состоящей из IL-2, GM-CSF, IFN-α и IL-12. В конкретном варианте осуществления изобретения эффекторный фрагмент представляет собой IL-2. В другом варианте осуществления изобретения эффекторный фрагмент представляет собой IL-12. В другом конкретном варианте осуществления изобретения эффекторный фрагмент IL-2 представляет собой мутантный эффекторный фрагмент IL-2, который содержит по меньшей мере одну аминокислотную мутацию, прежде всего аминокислотную замену, которая снижает или элиминирует аффинность мутантного эффекторного фрагмента IL-2 к α-субъединице рецептора IL-2, но сохраняет аффинность мутантного эффекторного фрагмента IL-2 к рецептору IL-2 с промежуточной аффинностью по сравнению с немутантным эффекторным фрагментом IL-2. В конкретном варианте осуществления изобретения мутантный эффекторный фрагмент IL-2 содержит одну, две или три аминокислотные замены в одном, двух или трех положении(ях), выбранном(ых) из положений, которые соответствуют остатку 42, 45 и 72 человеческого IL-2 (SEQ ID NO: 1). В более конкретном варианте осуществления изобретения мутантный эффекторный фрагмент IL-2 содержит три аминокислотные замены, в положениях, которые соответствуют остатку 42, 45 и 72 человеческого IL-2. В еще более конкретном варианте осуществления изобретения мутантный эффекторный фрагмент IL-2 представляет собой человеческий IL-2, содержащий аминокислотные замены F42A, Y45A и L72G. В некоторых вариантах осуществления изобретения мутантный эффекторный фрагмент IL-2 дополнительно содержит аминокислотную мутацию в положении, соответствующем положению 3 человеческого IL-2, которая элиминирует сайт O-гликозилирования IL-2. В конкретном варианте осуществления изобретения мутантный эффекторный фрагмент IL-2 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2. В одном из вариантов осуществления изобретения эффекторный фрагмент представляет собой одноцепочечный эффекторный фрагмент.

В одном из вариантов осуществления изобретения первое антитело представляет собой полноразмерное антитело IgG-класса, прежде всего полноразмерное антитело IgG₁-подкласса. В одном из вариантов осуществления изобретения эффекторный фрагмент объединен амино- или карбоксиконцевой пептидной связью с первым антителом. В одном из вариантов осуществления изобретения эффекторный фрагмент объединен аминоконцевой пептидной связью с первым антителом. В одном из вариантов осуществления изобретения эффекторный фрагмент слит на его N-конце с С-концом одной из тяжелых цепей первого антитела. В конкретном варианте осуществления изобретения иммуноконъюгат содержит не более одного эффекторного фрагмента. В одном из вариантов осуществления изобретения иммуноконъюгат практически состоит из эффекторного фрагмента и первого антитела, которые сцеплены с помощью одной или нескольких пептидных связей. В конкретном варианте осуществления изобретения иммуноконъюгат содержит эффекторный фрагмент, прежде всего одноцепочечный эффекторный фрагмент, и первое антитело, прежде всего полноразмерное антитело IgG-класса, в котором эффекторный фрагмент слит на его аминоконцеовой аминокислоте с карбоксиконцом одной из тяжелых цепей первого антитела, необязательно через пептидный линкер. В некоторых вариантах осуществления изобретения первое антитело содержит в Fc-области модификацию, усиливающую гетеродимеризацию двух неидентичных тяжелых цепей иммуноглобулина. В конкретном варианте осуществления изобретения указанная модификация представляет собой модификацию типа «knob-in-hole» (обеспечение взаимодействия по типу «выступ-во впадину»), которая включает модификацию, приводящую к образованию «выступа» в одной из тяжелых цепей иммуноглобулина, и модификацию, приводящую к образованию «впадины» в другой одной из двух тяжелых цепей иммуноглобулина. В одном из вариантов осуществления изобретения первое антитело содержит модификацию в поверхности раздела между двумя тяжелыми цепями иммуноглобулина в СН3-домене, при этом, I) в СН3-домене одной тяжелой цепи аминокислотный остаток заменяют на аминокислотной остаток, имеющий больший объем боковой цепи, создавая тем самым выпуклость («выступ») на поверхности раздела СН3-домена одной тяжелой цепи, которая может помещаться в полость «впадина» в поверхности раздела СН3-домена другой тяжелой цепи, и II) в СН3-домене другой тяжелой цепи аминокислотный остаток заменяют на аминокислотный остаток, имеющий меньший объем боковой цепи, создавая тем самым полость («впадину») в поверхности раздела второго СН3-домена, в которую может помещаться выпуклость («выступ») на поверхности раздела первого СН3-домена. В одном из вариантов осуществления изобретения первое антитело содержит аминокислотную замену T366W и необязательно аминокислотную замену S354C в одной из тяжелых цепей иммуноглобулина, и аминокислотные замены T366S, L368A, Y407V и необязательно Y349C в другой одной тяжелой цепи иммуноглобулина. В конкретном варианте осуществления изобретения эффекторный фрагмент слит с амино- или карбоксиконцевой аминокислотой тяжелой цепи иммуноглобулина, которая содержит модификацию, приводящую к образованию «выступа».

В одном из вариантов осуществления изобретения пониженную эффекторную функцию первого антитела выбирают из группы, включающей пониженную способность связываться с активирующим Fc-рецептором, пониженную ADCC, пониженный ADCP, пониженную CDC и пониженную секрецию цитокинов. В одном из вариантов осуществления изобретения пониженная эффекторная функция представляет собой пониженную способность связываться с активирующим Fc-рецептором. В одном из вариантов осуществления изобретения активирующий Fc-рецептор представляет собой человеческий рецептор. В одном из вариантов осуществления изобретения активирующий Fc-рецептор представляет собой Fcγ-рецептор. В конкретном варианте осуществления изобретения активирующий Fc-рецептор выбирают из группы, включающей FcγRIIIa, FcγRI и FcRγIIa. В одном из вариантов осуществления изобретения активирующий Fc-рецептор представляет собой FcγRIIIa, прежде всего человеческий FcγRIIIa. В одном из вариантов осуществления изобретения пониженная эффекторная функция представляет собой пониженную ADCC. В одном из вариантов осуществления изобретения пониженная эффекторная функция представляет собой пониженную способность связываться с активирующим Fc-рецептором и пониженную ADCC.

В одном из вариантов осуществления изобретения первое антитело конструируют путем интродукции одной или нескольких аминокислотных мутаций в Fc-область. В конкретном варианте осуществления изобретения аминокислотные мутации представляют собой аминокислотные замены. В конкретном варианте осуществления изобретения первое антитело, прежде всего человеческое полноразмерное антитело IgG₁-подкласса, содержит аминокислотную замену в положении Р329 тяжелых цепей иммуноглобулина (EU нумерация). В более конкретном варианте осуществления изобретения аминокислотная замена представляет собой Р329А или P329G, прежде всего P329G. В одном из вариантов осуществления изобретения антитело содержит дополнительную аминокислотную замену в положении, выбранном из S228,

Е233, L234, L235, N297 и Р331 тяжелых цепей иммуноглобулина. В более конкретном варианте осуществления изобретения дополнительная аминокислотная замена представляет собой S228P, Е233Р, L234A, L235A, L235E, N297A, N297D или P331S. В конкретном варианте осуществления изобретения антитело содержит аминокислотные замены в положениях Р329, L234 и L235 тяжелых цепей иммуноглобулина (EU нумерация). В более конкретном варианте осуществления изобретения антитело содержит аминокислотные замены L234A, L235A и P329G (LALA P329G) в тяжелых цепях иммуноглобулина.

В некоторых вариантах осуществления изобретения первое антитело направлено против антигена, присутствующего на опухолевой клетке или в окружении опухолевой клетки. В конкретном варианте осуществления изобретения первое антитело направлено против антигена, выбранного из группы, включающей фибробласт-активирующий белок (FAP), А1-домен тенасцина-С (TNC A1), А2-домен тенасцина-С (TNC А2), экстра-домен В фибронектина (EDB), карциноэмбриональный антиген (СЕА) и ассоциированный с меланомой хондроитинсульфат-протеогликан (MCSP). В конкретном варианте осуществления изобретения первое антитело направлено против СЕА. В другом конкретном варианте осуществления изобретения первое антитело направлено против FAP.

В одном из вариантов осуществления изобретения повышенную эффекторную функцию второго антитела выбирают из группы, включающей повышенную способность связываться с активирующим Fc-рецептором, повышенную ADCC, повышенный ADCP, повышенную CDC и повышенную секрецию цитокинов. В одном из вариантов осуществления изобретения повышенная эффекторная функция представляет собой повышенную способность связываться с активирующим Fc-рецептором. В конкретном варианте осуществления изобретения активирующий Fc-рецептор выбирают из группы, включающей FcγRIIIa, FcγRI и FcRγIIa. В одном из вариантов осуществления изобретения активирующий Fc-рецептор представляет собой FcγRIIIa. В одном из вариантов осуществления изобретения повышенная эффекторная функция представляет собой повышенную ADCC. В одном из вариантов осуществления изобретения повышенная эффекторная функция представляет собой повышенную способность связываться с активирующим Fc-рецептором и повышенную ADCC.

В одном из вариантов осуществления изобретения второе антитело конструируют путем интродукции одной или нескольких аминокислотных мутаций в Fc-область. В конкретном варианте осуществления изобретения аминокислотные мутации представляют собой аминокислотные замены. В одном из вариантов осуществления изобретения второе антитело конструируют путем модификации гликозилирования в Fc-области. В конкретном варианте осуществления изобретения модификация гликозилирования в Fc-области представляет собой повышенное относительное содержание нефукозилированных олигосахаридов в Fc-области по сравнению с не подвергнутым инженерии антителом. В еще более конкретном варианте осуществления изобретения повышенное относительное содержание нефукозилированных олигосахаридов в Fc-области составляет по меньшей мере 20%, предпочтительно по меньшей мере 50%, наиболее предпочтительно по меньшей мере 70% нефукозилированных олигосахаридов в Fc-области. В другом конкретном варианте осуществления изобретения модификация гликозилирования в Fc-области представляет собой повышенное относительное содержание бисекционнных олигосахаридов в Fc-области по сравнению с не подвергнутым инженерии антителом. В еще более конкретном варианте осуществления изобретения повышенное относительное содержание бисекционных олигосахаридов в Fc-области составляет по меньшей мере 20%, предпочтительно по меньшей мере 50%, наиболее предпочтительно по меньшей мере 70% бисекционных олигосахаридов в Fc-области. В еще более конкретном варианте осуществления изобретения модификация гликозилирования в Fc-области представляет собой повышенное относительное содержание бисекционных нефукозилированных олигосахаридов в Fc-области по сравнению с не подвергнутым инженерии антителом. Предпочтительно второе антитело содержит по меньшей мере примерно 25%, по меньшей мере примерно 35% или по меньшей мере примерно 50% бисекционных нефукозилированных олигосахаридов в Fc-области. В конкретном варианте осуществления изобретения второе антитело конструируют таким образом, чтобы оно имело повышенное относительное содержание нефукозилированных олигосахаридов в Fc-области по сравнению с не подвергнутым инженерии антителом. Повышенное относительное содержание нефукозилированных олигосахаридов в Fc-области антитела приводит к получению антитела, обладающего повышенной эффекторной функцией, прежде всего повышенной ADCC. В конкретном варианте осуществления изобретения нефукозилированные олигосахариды представляет собой бисекционные нефукозилированные олигосахариды.

В одном из вариантов осуществления изобретения второе антитело представляет собой полноразмерное антитело IgG-класса, прежде всего полноразмерное антитело IgG₁-подкласса. В некоторых вариантах осуществления изобретения второе антитело направлено против антигена, присутствующего на опухолевой клетке. В конкретном варианте осуществления изобретения второе антитело направлено против антигена, выбранного из группы, включающей CD20, рецептор эпидермального фактора роста (EGFR), HER2, HER3, рецептор инсулиноподобного фактора роста 1 (IGF-1R), c-Met, содержащий CUB-домен белок-1 (CDCP1), карциноэмбриональный антиген (СЕА) и ассоциированный с меланомой хондроитинсульфат-протеогликан (MCSP).

В конкретном варианте осуществления изобретения второе антитело представляет собой антитело к CD20, сконструированное таким образом, чтобы оно имело повышенное относительное содержание нефукозилированных олигосахаридов в Fc-области по сравнению с не подвергнутым инженерии антителом. Пригодные антитела к CD20 описаны в WO 2005/044859, которая полностью включена в настоящее описание в качестве ссылки. В другом конкретном варианте осуществления изобретения второе антитело представляет собой антитело к EGFR, сконструированное таким образом, чтобы оно имело повышенное относительное содержание нефукозилированных олигосахаридов в Fc-области по сравнению с не подвергнутым инженерии антителом. Пригодные антитела к EGFR описаны в WO 2006/082515 и WO 2008/017963, каждая из которых полностью включена в настоящее описание в качестве ссылки. В другом конкретном варианте осуществления изобретения второе антитело представляет собой антитело к IGF-1R, сконструированное таким образом, чтобы оно имело повышенное относительное содержание нефукозилированных олигосахаридов в Fc-области по сравнению с не подвергнутым инженерии антителом. Пригодные антитела к IGF-1R описаны в WO 2008/077546, которая полностью включена в настоящее описание в качестве ссылки. В другом конкретном варианте осуществления изобретения второе антитело представляет собой антитело к СЕА, сконструированное таким образом, чтобы оно имело повышенное относительное содержание нефукозилированных олигосахаридов в Fc-области по сравнению с не подвергнутым инженерии антителом. Пригодные антитела к СЕА описаны в публикации РСТ WO 2011/023787, которая полностью включена в настоящее описание в качестве ссылки. В еще одном конкретном варианте осуществления изобретения второе антитело представляет собой антитело к HER3, сконструированное таким образом, чтобы оно имело повышенное относительное содержание нефукозилированных олигосахаридов в Fc-области по сравнению с не подвергнутым инженерии антителом. Пригодные антитела к HER3 описаны в публикации РСТ WO 2011/076683, которая полностью включена в настоящее описание в качестве ссылки. В еще одном конкретном варианте осуществления изобретения второе антитело представляет собой антитело к CDCP1, сконструированное таким образом, чтобы оно имело повышенное относительное содержание нефукозилированных олигосахаридов в Fc-области по сравнению с не подвергнутым инженерии антителом. Пригодные антитела к CDCP1 описаны в публикации РСТ WO 2011/023389, которая полностью включена в настоящее описание в качестве ссылки. В одном из вариантов осуществления изобретения второе антитело конструируют так, чтобы оно имело модифицированное гликозилирование в Fc-области по сравнению с не подвергнутым инженерии антителом, путем получения антитела в клетке-хозяине, обладающей измененной активностью одной или нескольких гликозилтрансфераз.

В одном из вариантов осуществления изобретения второе антитело конструируют таким образом, чтобы оно имело повышенное относительное содержание нефукозилированных олигосахаридов в Fc-области по сравнению с не подвергнутым инженерии антителом, путем получения антитела в клетке-хозяине, обладающей повышенной активностью β(1,4)-N-ацетилглюкозамилтрансферазы III (GnTIII). В конкретном варианте осуществления изобретения клетка-хозяин дополнительно обладает повышенной активностью α-маннозидазы II (ManII). В другом варианте осуществления изобретения второе антитело конструируют таким образом, чтобы оно имело повышенное относительное содержание нефукозилированных олигосахаридов в Fc-области по сравнению с не подвергнутым инженерии антителом, путем получения антитела в клетке-хозяине, обладающей пониженной активностью α(1,6)-фукозилтрансферазы.

В одном из вариантов осуществления изобретения заболевание представляет собой нарушение, которое можно лечить путем стимуляции функции эффекторных клеток. В одном из вариантов осуществления изобретения заболевание представляет собой нарушение пролиферации клеток. В конкретном варианте осуществления изобретения заболевание представляет собой рак. В конкретном варианте осуществления изобретения рак выбирают из группы, включающей рак легкого, колоректальный рак, рак почки, рак предстательной железы, рак молочной железы, рак головы и шеи, рак яичника, рак головного мозга, лимфому, лейкоз и рак кожи. В одном из вариантов осуществления изобретения индивидуум представляет собой млекопитающее. В конкретном варианте осуществления изобретения индивидуум представляет собой человека.

Конкретным вариантом осуществления изобретения является комбинация

(а) иммуноконъюгата, содержащего первое полноразмерное антитело IgG-класса, сконструированное таким образом, чтобы оно обладало пониженной эффекторной функцией, путем интродукции одной или нескольких аминокислотных мутаций в Fc-область, и цитокин, в котором эффекторный фрагмент слит на его аминоконцевой аминокислоте с карбоксиконцом одной из тяжелых цепей первого антитела, необязательно через пептидный линкер, и

(б) второго полноразмерного антитела IgG-класса, сконструированного таким образом, чтобы оно обладало повышенной эффекторной функцией, путем модификации гликозилирования в Fc-области, предназначенная для применения при лечении заболевания у индивидуума, который нуждается в этом. Другим объектом изобретения является фармацевтическая композиция, содержащая (а) иммуноконъюгат, который содержит первое антитело, сконструированное таким образом, чтобы оно обладало пониженной эффекторной функцией, и эффекторный фрагмент, и (б) второе антитело, сконструированное таким образом, чтобы оно обладало повышенной эффекторной функцией, в фармацевтически приемлемом носителе.

Изобретение относится также к применению (а) иммуноконъюгата, который содержит первое антитело, сконструированное таким образом, чтобы оно обладало пониженной эффекторной функцией, и эффекторный фрагмент, и (б) второго антитела, сконструированного таким образом, чтобы оно обладало повышенной эффекторной функцией, для приготовления лекарственного средства, предназначенного для лечения заболевания у индивидуума.

В изобретении предложен также способ лечения заболевания у индивидуума, заключающийся в том, что вводят индивидууму комбинацию (а) иммуноконъюгата, который содержит первое антитело, сконструированное таким образом, чтобы оно обладало пониженной эффекторной функцией, и эффекторный фрагмент, и (б) второго антитела, сконструированного таким образом, чтобы оно обладало повышенной эффекторной функцией, в терапевтически эффективном количестве.

В изобретении предложен также способ стимуляции функции эффекторных клеток у индивидуума, заключающийся в том, что вводят индивидууму комбинацию (а) иммуноконъюгата, который содержит первое антитело, сконструированное таким образом, чтобы оно обладало пониженной эффекторной функцией, и эффекторный фрагмент, и (б) второго антитела, сконструированного таким образом, чтобы оно обладало повышенной эффекторной функцией, в количестве, эффективном в отношении стимуляции функции эффекторных клеток.

Следующим объектом изобретения является набор, предназначенный для лечения заболевания, который содержит в одном и том же или в различных контейнерах (а) иммуноконъюгат, который содержит первое антитело, сконструированное таким образом, чтобы оно обладало пониженной эффекторной функцией, и эффекторный фрагмент, и (б) второе антитело, сконструированное таким образом, чтобы оно обладало повышенной эффекторной функцией, и (в) необязательно листовку-вкладыш в упаковку с напечатанными инструкциями по применению комбинированного лечения в качестве способа лечения заболевания.

Должно быть очевидно, что иммуноконъюгат и второе антитело, используемые в фармацевтической композиции, применении, способах и наборе, предлагаемых в изобретении, могут обладать любой из особенностей, индивидуально или в сочетании, описанной в предыдущих параграфах касательно вторых антител и иммуноконъюгатов, предлагаемых в изобретении.

Краткое описание чертежей

На чертежах показано:

на фиг. 1 - данные, полученные для иммуноконъюгата 28Н1 IgG-IL-2, мишенью которого является FAP (А), или не имеющего специфической мишени («ненаправленного») иммуноконъюгата DP47GS IgG-IL-2 (Б), содержащих четырехмутантный (qm) IL-2, у которого отсутствует способность связываться с CD25, и анти-EGFR GlycoMab (созданное с использованием гликоинженерии МАт), при тестировании в отношении SCID-мышей, которым инъецировали интралингвально клетки человеческой карциномы головы и шеи линии FaDu. Из представленных данных следует, что комбинация, включающая иммуноконъюгат 28Н1 IgG-IL2 qm, но не иммуноконъюгат DP47GS IgG-IL2, и анти-EGFR GlycoMab, опосредовала повышенную эффективность в понятиях удлиненной медианы выживаемости по сравнению с индивидуальным применением соответствующего иммуноконъюгата или анти-EGFR GlycoMab (см. пример 1);

на фиг. 2 - данные о полном уничтожении опухолевых клеток линии А549 с использованием РВМС (Е : Т = 10:1, 4 ч), которые предварительно обрабатывали 0,57 нМ (А) или 5,7 нМ (Б) иммуноконъюгатом 28Н1 IgG-IL2 qm, мишенью которого является FAP или IL-2 (пролейкин) или не обрабатывали указанными субстанциями, в присутствии применяемого в различных концентрациях анти-EGFR GlycoMab (см. пример 2);

на фиг. 3 - данные, полученные для иммуноконъюгата СН1А1А IgG-IL-2, мишенью которого является СЕА, содержащего четырехмутантный (qm) IL-2, у которого отсутствует способность связываться с CD25, и анти-EGFR GlycoMab (А) или цетуксимаба (Б), при тестировании в отношении трансгенных по FcγRIII SCID-мышей, которым инъецировали внутрь селезенки клетки человеческой колоректальной карциномы линии LS174T. Из представленных данных следует, что комбинация иммуноконъюгата СН1А1А IgG-IL2 qm и анти-EGFR GlycoMab опосредовала повышенную эффективность в понятиях удлиненной медианы выживаемости и общей выживаемости по сравнению с индивидуальным применением соответствующего иммуноконъюгата, анти-EGFR GlycoMab или цетуксимаба, а также комбинации иммуноконъюгата СН1А1А IgG-IL2 qm и цетуксимаба (см. пример 3);

на фиг. 4 - данные, полученные для иммуноконъюгата СН1А1А IgG-IL-2, мишенью которого является СЕА, содержащего четырехмутантный (qm) IL-2, у которого отсутствует способность связываться с CD25, и анти-EGFR GlycoMab (А) или цетуксимаба (Б), при тестировании в отношении трансгенных по FcγRIII SCID-мышей, которым инъецировали внутривенно клетки человеческой карциномы легкого линии А549. Из представленных данных следует, что комбинация иммуноконъюгата СН1А1А IgG-IL2 qm и анти-EGFR GlycoMab опосредовала повышенную эффективность в понятиях удлиненной медианы выживаемости и общей выживаемости по сравнению с индивидуальным применением соответствующего иммуноконъюгата или анти-EGFR GlycoMab, a также комбинации иммуноконъюгата СН1А1А IgG-IL2 qm и цетуксимаба (см. пример 4);

на фиг. 5 - данные, полученные для иммуноконъюгата СН1А1А IgG-IL-2, содержащего четырехмутантный (qm) IL-2, мишенью которого является СЕА, у которого отсутствует способность связываться с CD25, и анти-Her3 GlycoMab при тестировании в отношении трансгенных по FcγRIII SCID-мышей, которым инъецировали внутрь селезенки клетки человеческой колоректальной карциномы линии LS174Т. Из представленных данных следует, что комбинация иммуноконъюгата СН1А1А IgG-IL2 qm и анти-Her3 GlycoMab опосредовала повышенную эффективность в понятиях удлиненной медианы выживаемости по сравнению с индивидуальным применением соответствующего иммуноконъюгата или анти-Her3 GlycoMab (см. пример 5);

на фиг. 6 - данные, полученные для иммуноконъюгата 28Н1 IgG-IL-2, мишенью которого является FAP, содержащего четырехмутантный (qm) IL-2, у которого отсутствует способность связываться с CD25, и анти-EGFR GlycoMab, при тестировании в отношении трансгенных по FcγRIII SCID-мышей, которым инъецировали внутрь почки клетки человеческой почечной карциномы линии ACHN. Из представленных данных следует, что комбинация иммуноконъюгата СН1А1А IgG-IL2 qm и анти-EGFR GlycoMab опосредовала повышенную эффективность в понятиях удлиненной медианы выживаемости и общей выживаемости по сравнению с индивидуальным применением анти-EGFR GlycoMab или анти-EGFR GlycoMab в комбинации с Proleukin^® (см. пример 6);

на фиг. 7 - обобщенные данные об уничтожении LS174Т-клеток с использованием РВМС после обработки только анти-Her3 GlycoMab (левая панель), только иммуноконъюгатом СН1А1А IgG-IL-2 qm (правая панель) или комбинацией иммуноконъюгата СН1А1А IgG-IL-2 qm с анти-Her3 GlycoMab (правая панель);

на фиг. 8 - данные об экспрессии CD25 (А) или CD69 (Б) на NK-клетках после обработки только анти-Her3 GlycoMab (левая панель), только иммуноконъюгатом СН1А1А IgG-IL-2 qm (правая панель) или комбинацией иммуноконъюгата СН1А1А IgG-IL-2 qm с анти-Her3 GlycoMab (правая панель).

Подробное описание изобретения

Первым объектом настоящего изобретения является комбинация (а) иммуноконъюгата, который содержит первое антитело, сконструированное таким образом, чтобы оно обладало пониженной эффекторной функцией, и эффекторный фрагмент, и (б) второго антитела, сконструированного таким образом, чтобы оно обладало повышенной эффекторной функцией, предназначенная для применения при лечении заболевания у индивидуума, который нуждается в этом.

В изобретении предложен также способ лечения заболевания у индивидуума, заключающийся в том, что вводят индивидууму комбинацию (а) иммуноконъюгата, который содержит первое антитело, сконструированное таким образом, чтобы оно обладало пониженной эффекторной функцией, и эффекторный фрагмент, и (б) второго антитела, сконструированного таким образом, чтобы оно обладало повышенной эффекторной функцией, в терапевтически эффективном количестве.

В изобретении предложен также способ стимуляции функции эффекторных клеток у индивидуума, заключающийся в том, что вводят индивидууму комбинацию (а) иммуноконъюгата, который содержит первое антитело, сконструированное таким образом, чтобы оно обладало пониженной эффекторной функцией, и эффекторный фрагмент, и (б) второго антитела, сконструированного таким образом, чтобы оно обладало повышенной эффекторной функцией, в количестве, эффективном в отношении стимуляции функции эффекторных клеток.

Определения

Понятия, применяемые в настоящем описании, имеют значения, общепринятые в данной области, если ниже специально не указано иное.

В контексте настоящего описания понятие «иммуноконъюгат» относится к молекуле полипептида, которая включает по меньшей один эффекторный фрагмент и антитело. В некоторых вариантах осуществления изобретения иммуноконъюгат содержит не более одного эффекторного фрагмента. В частности, иммуноконъюгаты, предлагаемые в изобретении, практически состоят из одного эффекторного фрагмента и антитела, сцепленных с помощью одного или неско