Способы и композиции для высокомультиплексной пцр

Способы и композиции для высокомультиплексной пцр

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Настоящая заявка испрашивает преимущество и приоритет по заявке на выдачу патента США на изобретение с серийным №13/683604, которая была подана 21 ноября 2012 г., и предварительной заявки на выдачу патента США №61/675020, которая была подана 24 июля 2012 г. Заявка на выдачу патента США на изобретение с серийным №13/683604 представляет собой частичное продолжение заявки на выдачу патента США на изобретение с серийным №13/300235, которая была подана 18 ноября 2011 г., представляет собой частичное продолжение заявки на выдачу патента США на изобретение с серийным №13/110685, которая была подана 18 мая 2011 г., и испрашивает приоритет по предварительной заявке на выдачу патента США №61/675020, которая была подана 24 июля 2012 г. Заявка на выдачу патента США на изобретение с серийным №13/110685 испрашивает приоритет по предварительной заявке на выдачу патента США №61/395 850, которая была подана 18 мая 2010 г.; предварительной заявке на выдачу патента США №61/398 159, которая была подана 21 июня 2010 г.; предварительной заявке на выдачу патента США №61/462972, которая была подана 9 февраля 2011 г.; предварительной заявке на выдачу патента США №61/448547, которая была подана 2 марта 2011 г.; и предварительной заявке на выдачу патента США №61/516996, которая была подана 12 апреля 2011 г. Заявка на выдачу патента США на изобретение с серийным №13/300235 испрашивает приоритет по предварительной заявке на выдачу патента США №61/571248, которая была подана 23 июня 2011 г.Содержание всех указанных заявок полностью включено в настоящий документ посредством ссылки.

ЗАЯВЛЕНИЕ О СПОНСИРУЕМЫХ ПРАВИТЕЛЬСТВОМ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИХ РАЗРАБОТКАХ

Настоящая работа была поддержана грантом №5R44HD60423-3, выданным Национальными институтами здоровья (National Institutes of Health). Правительство США может обладать правами по любому выданному на основании настоящей заявки патенту.

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

Настоящее изобретение в целом относится к способам и композициям для одновременной амплификации множественных представляющих интерес областей нуклеиновых кислот в одном реакционном объеме.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Для повышения производительности анализа и обеспечения наиболее эффективного использования образцов нуклеиновых кислот может проводиться одновременная амплификация множества целевых нуклеиновых кислот в представляющем интерес образце путем объединения множества олигонуклеотидных праймеров с образцом и последующего помещения образца в условия полимеразной цепной реакции (ПНР) в ходе процесса, известного в данной области техники как «мультиплексная ПЦР». Применение мультиплексной ПЦР может значительно упростить процедуры тестирования и сократить время, необходимое для анализа и обнаружения нуклеиновых кислот. Однако при добавлении множественных пар в одну ПЦР-реакцию могут образовываться нецелевые продукты амплификации, такие как амплифицированные димеры праймеров. Риск образования таких продуктов возрастает с увеличением числа праймеров. Указанные нецелевые ампликоны значительно ограничивают применение амплифицированных продуктов для дальнейшего анализа и/или испытаний. Соответственно, существует потребность в усовершенствованных способах для уменьшения образования нецелевых ампликонов при мультиплексной ПЦР.

Улучшенные способы мультиплексной ПЦР могут подходить для разнообразных приложений, например, для неинвазивной пренатальной генетической диагностики (NPD). В частности, современные способы пренатальной диагностики могут предупреждать врачей и родителей о патологиях у растущего плода. Без пренатальной диагностики один ребенок из 50 рождается с серьезным физическим или умственным дефектом, а один из 30 будет страдать некоторой формой врожденного порока развития. К сожалению, стандартные способы либо обладают недостаточной точностью, либо предусматривают инвазивную процедуру, которая сопровождается риском самопроизвольного аборта. Способы на основе содержания гормонов в материнской крови или ультразвуковых измерений являются неинвазивными, однако, они также характеризуются низкой точностью. Такие способы, как амниоцентез, биопсия ворсин хориона и забор образцов плодной крови характеризуются высокой точностью, но являются инвазивными и влекут за собой значительный риск. Амниоцентез выполнялся приблизительно при 3% всех беременностей в США, хотя за последние 15 лет частота его применения снизилась.

В норме у людей в каждой здоровой диплоидной клетке имеется два набора из 23 хромосом, по одной копии от каждого родителя. Считается, что анеуплоидия, состояние ядерной клетки, при котором клетка содержит слишком много и/или слишком мало хромосом, отвечает за значительный процент неудачных имплантаций, самопроизвольных абортов и генетических заболеваний. Выявление хромосомных аномалий может идентифицировать индивидуумов или эмбрионы с такими состояниями, как синдром Дауна, синдром Клайнфельтера и синдром Тернера, наряду с прочими, помимо повышения шансов на успешную беременность. Важность тестирования на хромосомные аномалии, в частности, возрастает с увеличением возраста матери: подсчитано, что у матерей в возрасте 35-40 лет по меньшей мере 40% эмбрионов являются анормальными, а у матерей в возрасте более 40 лет анормальными являются более половины эмбрионов.

Недавно было обнаружено, что бесклеточная плодная ДНК и интактные плодные клетки могут попадать в кровоток матери. Следовательно, анализ этого генетического материала может обеспечить раннюю неинвазивную пренатальную генетическую диагностику (NPD). Существует потребность в усовершенствованных способах для повышения чувствительности и специфичности, уменьшения временных затрат и стоимости NPD.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Согласно одному аспекту в настоящем изобретении предложены способы амплификации целевых локусов в образце нуклеиновой кислоты. Согласно некоторым вариантам осуществления указанный способ включает (i) приведение указанного образца нуклеиновой кислоты в контакт с библиотекой тестовых праймеров, которые одновременно гибридизуются по меньшей мере с 1000; 2000; 5000; 7500; 10000; 20000; 25000; 30000; 40000; 50000; 75000; или 100000 разных целевых локусов, в результате чего получают реакционную смесь; и (ii) помещение реакционной смеси в условия реакции удлинения праймеров, в результате чего получают амплифицированные продукты, которые включают целевые ампликоны. Согласно некоторым вариантам осуществления указанный способ также включает определение присутствия или отсутствия по меньшей мере одного целевого ампликона (например, по меньшей мере 50, 60, 70, 80, 90, 95, 96, 97, 98, 99 или 99,5% целевых ампликонов). Согласно некоторым вариантам осуществления указанный способ также включает определение последовательности по меньшей мере одного целевого ампликона (например, по меньшей мере 50, 60, 70, 80, 90, 95, 96, 97, 98, 99 или 99,5% целевых ампликонов).

Согласно различным вариантам осуществления любых аспектов настоящего изобретения амплифицируют по меньшей мере 1000; 2000; 5000; 7500; 10000; 20000; 25000; 30000; 40000; 50000; 75000; или 100000 разных целевых локусов. Согласно некоторым вариантам осуществления по меньшей мере 50, 60, 70, 80, 90, 95, 96, 97, 98, 99 или 99,5% амплифицированных продуктов представлено целевыми ампликонами. Согласно некоторым вариантам осуществления амплифицируют по меньшей мере 50, 60, 70, 80, 90, 95, 96, 97, 98, 99 или 99,5% целевых локусов. Согласно различным вариантам осуществления менее чем 60, 50, 40, 30, 20, 10, 5, 4, 3, 2, 1, 0,5, 0,25, 0,1 или 0,05% амплифицированных продуктов представлено димерами праймеров. Согласно некоторым вариантам осуществления библиотека тестовых праймеров включает по меньшей мере 1000; 2000; 5000; 7500; 10000; 20000; 25000; 30000; 40000; 50000; 75000; или 100000 пар тестовых праймеров, при этом каждая пара праймеров включает прямой тестовый праймер и обратный тестовый праймер, которые гибридизуются с одним и тем же целевым локусом. Согласно некоторым вариантам осуществления библиотека тестовых праймеров включает по меньшей мере 1000; 2000; 5000; 7500; 10000; 20000; 25000; 30000; 40000; 50000; 75000; или 100000 индивидуальных тестовых праймеров, которые гибридизуются с разными целевыми локусами, при этом указанные индивидуальные праймеры не входят в состав пар праймеров.

Согласно различным вариантам осуществления любых аспектов настоящего изобретения концентрация каждого тестового праймера составляет менее 100, 75, 50, 25, 10, 5, 2 или 1 нМ. Согласно различным вариантам осуществления содержание GC в тестовых праймерах составляет от 30 до 80%, например, от 40 до 70% или от 50 до 60% включительно. Согласно некоторым вариантам осуществления диапазон содержания GC (например, разность максимального содержания GC и минимального содержания GC, например, 80%-60% = диапазон, составляющий 20%) тестовых праймеров составляет менее 30, 20, 10 или 5%. Согласно некоторым вариантам осуществления температура плавления (Т_m) тестовых праймеров составляет от 40 до 80°C, например, от 50 до 70°C, от 55 до 65°C, или от 57 до 60,5°C включительно. Согласно некоторым вариантам осуществления диапазон температур плавления тестовых праймеров составляет менее 20, 15, 10, 5, 3 или 1°C. Согласно некоторым вариантам осуществления длина тестовых праймеров составляет от 15 до 100 нуклеотидов, например, от 15 до 75 нуклеотидов, от 15 до 40 нуклеотидов, от 17 до 35 нуклеотидов, от 18 до 30 нуклеотидов, от 20 до 65 нуклеотидов включительно. Согласно некоторым вариантам осуществления тестовые праймеры содержат маркер, не являющийся специфичным по отношению к цели, например, маркер, образующий внутреннюю петлевую структуру. Согласно некоторым вариантам осуществления указанный маркер расположен между двумя ДНК-связывающими областями. Согласно различным вариантам осуществления тестовые праймеры содержат 5'-область, являющуюся специфической в отношении целевого локуса, внутреннюю область, не являющуюся специфической в отношении целевого локуса и образующую петлевую структуру, и 3'-область, являющуюся специфической в отношении целевого локуса. Согласно различным вариантам осуществления длина 3'-области составляет по меньшей мере 7 нуклеотидов. Согласно некоторым вариантам осуществления длина 3'-области составляет от 7 до 20 нуклеотидов, например, от 7 до 15 нуклеотидов, или от 7 до 10 нуклеотидов включительно. Согласно различным вариантам осуществления тестовые праймеры содержат 5'-область, не являющуюся специфической в отношении целевого локуса (такую как маркер или сайт связывания универсального праймера), за которой следует область, являющаяся специфической в отношении целевого локуса, внутренняя область, не являющаяся специфической в отношении целевого локуса и образующая петлевую структуру, и 3'-область, являющаяся специфической в отношении целевого локуса. Согласно некоторым вариантам осуществления диапазон длин тестовых праймеров составляет менее 50, 40, 30, 20, 10 или 5 нуклеотидов. Согласно некоторым вариантам осуществления длина целевых ампликонов составляет от 50 до 100 нуклеотидов, например, от 60 до 80 нуклеотидов, или от 60 до 75 нуклеотидов включительно. Согласно некоторым вариантам осуществления диапазон длин целевых ампликонов составляет менее 50, 25, 15, 10 или 5 нуклеотидов.

Согласно различным вариантам осуществления любых аспектов настоящего изобретения условия реакции удлинения праймеров представляют собой условия полимеразной цепной реакции (ПЦР). Согласно различным вариантам осуществления продолжительность этапа отжига составляет более 3, 5, 8, 10 или 15 минут. Согласно различным вариантам осуществления продолжительность этапа удлинения составляет более 3, 5, 8, 10 или 15 минут.

Согласно различным вариантам осуществления любых аспектов настоящего изобретения тестовые праймеры применяют для одновременной амплификации по меньшей мере 1000 разных целевых локусов в образце, который содержит материнскую ДНК от беременной матери плода и плодную ДНК, для определения присутствия или отсутствия хромосомных аномалий плода. Согласно различным вариантам осуществления указанный способ включает лигирование сайта связывания универсального праймера с молекулами ДНК в указанном образце; амплификация лигированных молекул ДНК с применением по меньшей мере 1000 специфических праймеров и универсального праймера, в результате чего получают первый набор амплифицированных продуктов; и амплификация первого набора амплифицированных продуктов с применением по меньшей мере 1000 пар специфических праймеров, в результате чего получают второй набор амплифицированных продуктов. Согласно различным вариантам осуществления применяют по меньшей мере 2000; 5000; 7500; 10000; 20000; 25000; 30000; 4 000; 50000; 75000; или 100000 разных пар праймеров.

Согласно различным вариантам осуществления любых аспектов настоящего изобретения тестовые праймеры применяют для одновременной амплификации по меньшей мере 1000 разных целевых локусов в образце, который содержит ДНК от предполагаемого отца плода, и одновременной амплификации целевых локусов в образце, который содержит материнскую ДНК от беременной матери указанного плода и плодную ДНК, для определения, является ли предполагаемый отец биологическим отцом указанного плода.

Согласно различным вариантам осуществления любых аспектов настоящего изобретения тестовые праймеры применяют для одновременной амплификации по меньшей мере 1000 разных целевых локусов в одной клетке или множестве клеток эмбриона для определения присутствия или отсутствия хромосомных аномалий. Согласно различным вариантам осуществления исследуют клетки из группы, включающей два или более эмбрионов, и один эмбрион отбирают для оплодотворения in vitro.

Согласно различным вариантам осуществления любых аспектов настоящего изобретения тестовые праймеры применяют для одновременной амплификации по меньшей мере 1000 разных целевых локусов в образце нуклеиновой кислоты для судебно-технической экспертизы. Согласно различным вариантам осуществления продолжительность этапа отжига составляет более 3, 5, 8, 10 или 15 минут.

Согласно различным вариантам осуществления любых аспектов настоящего изобретения способ включает применение тестовых праймеров для одновременной амплификации по меньшей мере 1000 разных целевых локусов в контрольном образце нуклеиновой кислоты, в результате чего получают первый набор целевых ампликонов, и для одновременной амплификации указанных целевых локусов в тестируемом образце нуклеиновой кислоты, в результате чего получают второй набор целевых ампликонов; и сравнение первого и второго наборов целевых ампликонов для определения того, присутствует ли целевой локус в одном образце, отсутствуя при этом в другом, или того, присутствует ли целевой локус с разными титрами в контрольном образце и в тестируемом образце. Согласно различным вариантам осуществления указанный тестируемый образец получен от индивидуума, у которого предположительно имеется представляющее интерес заболевание или фенотип (например, раковое заболевание) или повышенный риск представляющего интерес заболевания или фенотипа; и при этом один или большее число целевых локусов содержат последовательность (например, полиморфизм или другую мутацию), связанную с повышенным риском представляющего интерес заболевания или фенотипа, или связанную с представляющим интерес заболеванием или фенотипом. Согласно различным вариантам осуществления указанный способ включает применение тестовых праймеров для одновременной амплификации 1000 разных целевых локусов в контрольном образце, который содержит РНК, в результате чего получают первый набор целевых ампликонов, и для одновременной амплификации указанных целевых локусов в тестируемом образце, который содержит РНК, в результате чего получают второй набор целевых ампликонов; и сравнение первого и второго наборов целевых ампликонов для определения присутствия или отсутствия разницы в уровнях экспрессии РНК между контрольным образцом и тестируемым образцом. Согласно различным вариантам осуществления указанная РНК представляет собой мРНК. Согласно различным вариантам осуществления тестируемый образец получен от индивидуума, у которого предположительно имеется представляющее интерес заболевание или фенотип (например, раковое заболевание) или повышенный риск представляющего интерес заболевания или фенотипа (например, ракового заболевания); и при этом один или большее число целевых локусов содержат последовательность (например, полиморфизм или другую мутацию), связанную с повышенным риском представляющего интерес заболевания или фенотипа, или связанную с представляющим интерес заболеванием или фенотипом. Согласно некоторым вариантам осуществления тестируемый образец получен от индивидуума, у которого диагностировано представляющее интерес заболевание или фенотип (например, раковое заболевание); и при этом различие уровня экспрессии РНК между контрольным образцом и тестируемым образцом указывает на то, что целевой локус содержит последовательность (например, полиморфизм или другую мутацию), связанную с повышенным или пониженным риском представляющего интерес заболевания или фенотипа.

Согласно некоторым вариантам осуществления любых аспектов настоящего изобретения тестовые праймеры выбирают из библиотеки кандидатных праймеров на основании одного или нескольких параметров, например, проводят отбор праймеров с применением любых способов согласно настоящему изобретению. Согласно некоторым вариантам осуществления тестовые праймеры выбирают из библиотеки кандидатных праймеров по меньшей мере отчасти на основании способности указанных кандидатных праймеров образовывать димеры праймеров.

Согласно одному аспекту в настоящем изобретении предложены способы отбора тестовых праймеров из библиотеки кандидатных праймеров. Согласно различным вариантам осуществления указанный отбор включает (i) вычисление на компьютере балла нежелательности для большей части или для всех возможных комбинаций двух кандидатных праймеров из библиотеки, при этом каждый балл нежелательности основан по меньшей мере отчасти на вероятности образования димеров между двумя кандидатными праймерами; (ii) удаление кандидатного праймера с максимальным баллом нежелательности из библиотеки кандидатных праймеров; и (iii), в том случае, если кандидатный праймер, удаленный на этапе (ii), представляет собой член пары праймеров, удаление другого члена указанной пары праймеров из библиотеки кандидатных праймеров; и (iv) необязательно повторение этапов (ii) и (iii), что обеспечивает отбор библиотеки тестовых праймеров. Согласно некоторым вариантам осуществления указанный способ отбора используют до тех пор, пока все баллы нежелательности для комбинаций кандидатных праймеров, остающихся в библиотеке, не сравняются с минимальным порогом или не опустятся ниже минимального порога. Согласно некоторым вариантам осуществления указанный способ отбора используют до тех пор, пока количество кандидатных праймеров, остающихся в библиотеке, не снизится до требуемого количества. Согласно различным вариантам осуществления балл нежелательности рассчитывают по меньшей мере для 80, 90, 95, 98, 99 или 99,5% возможных комбинаций кандидатных праймеров в библиотеке. Согласно различным вариантам осуществления кандидатные праймеры, остающиеся в библиотеке, способны одновременно амплифицировать по меньшей мере 1000; 2000; 5000; 7500; 10000; 20000; 25000; 30000; 4000; 50000; 75000; или 100000 разных целевых локусов. Согласно различным вариантам осуществления указанный способ также включает (v) приведение образца нуклеиновой кислоты, который содержит целевые локусы, в контакт с кандидатными праймерами, остающимися в библиотеке, в результате чего получают реакционную смесь; и (vi) помещение реакционной смеси в условия реакции удлинения праймеров, в результате чего получают амплифицированные продукты, которые включают целевые ампликоны.

Согласно одному аспекту в настоящем изобретении предложены способы отбора тестовых праймеров из библиотеки кандидатных праймеров. Согласно различным вариантам осуществления указанный выбор тестовых праймеров из библиотеки кандидатных праймеров включает (i) вычисление на компьютере балла нежелательности для большей части или для всех возможных комбинаций двух кандидатных праймеров из библиотеки, при этом каждый балл нежелательности основан по меньшей мере отчасти на вероятности образования димеров между двумя кандидатными праймерами; (ii) удаление из библиотеки кандидатных праймеров кандидатного праймера, который входит в состав наибольшего числа комбинаций двух кандидатных праймеров с баллом нежелательности выше первого минимального порога; (iii) в том случае, если кандидатный праймер, удаленный на этапе (ii), представляет собой член пары праймеров, удаление другого члена указанной пары праймеров из библиотеки кандидатных праймеров; и (iv) необязательно повторение этапов (ii) и (iii), что обеспечивает отбор библиотеки тестовых праймеров. Согласно некоторым вариантам осуществления указанный способ отбора используют до тех пор, пока все баллы нежелательности для комбинаций кандидатных праймеров, остающихся в библиотеке, не сравняются с первым минимальным порогом или не опустятся ниже первого минимального порога. Согласно некоторым вариантам осуществления указанный способ отбора используют до тех пор, пока количество кандидатных праймеров, остающихся в библиотеке, не снизится до требуемого количества. Согласно различным вариантам осуществления балл нежелательности рассчитывают по меньшей мере для 80, 90, 95, 98, 99 или 99,5% возможных комбинаций кандидатных праймеров в библиотеке. Согласно различным вариантам осуществления кандидатные праймеры, остающиеся в библиотеке, способны одновременно амплифицировать по меньшей мере 1000; 2000; 5000; 7500; 10000; 20000; 25000; 30000; 4000; 50000; 75000; или 100000 разных целевых локусов. Согласно различным вариантам осуществления указанный способ также включает (v) приведение образца нуклеиновой кислоты, который содержит целевые локусы, в контакт с кандидатными праймерами, остающимися в библиотеке, в результате чего получают реакционную смесь; и (vi) помещение реакционной смеси в условия реакции удлинения праймеров, в результате чего получают амплифицированные продукты, которые включают целевые ампликоны.

Согласно различным вариантам осуществления любых аспектов настоящего изобретения указанный способ отбора включает дополнительное снижение числа кандидатных праймеров, остающихся в библиотеке, путем снижения первого минимального порога, используемого на этапе (ii), до более низкого второго минимального порога и, необязательно, повторение этапов (ii) и (iii). Согласно некоторым вариантам осуществления указанный способ отбора включает повышение первого минимального порога, используемого на этапе (ii), до более высокого второго минимального порога и, необязательно, повторение этапов (ii) и (iii). Согласно некоторым вариантам осуществления указанный способ отбора используют до тех пор, пока все баллы нежелательности для комбинаций кандидатных праймеров, остающихся в библиотеке, не сравняются со вторым минимальным порогом или не опустятся ниже второго минимального порога, или до тех пор, пока количество кандидатных праймеров, остающихся в библиотеке, не снизится до требуемого количества.

Согласно различным вариантам осуществления любых аспектов настоящего изобретения указанный способ включает, до этапа (i), идентификацию или отбор праймеров, которые гибридизуются с целевыми локусами. Согласно некоторым вариантам осуществления множество праймеров (или пар праймеров) гибридизуются с одним и тем же целевым локусом, и указанный способ отбора используют для выбора одного праймера (или одной пары праймеров) для указанного целевого локуса на основании одного или нескольких параметров. Согласно различным вариантам осуществления указанный способ включает, до этапа (ii), удаление из библиотеки пары праймеров, дающей целевой ампликон, который перекрывается с целевым ампликоном, получаемым с помощью другой пары праймеров. Согласно различным вариантам осуществления кандидатный праймер выбирают из группы двух или более кандидатных праймеров с равными баллами нежелательности для удаления из библиотеки кандидатных праймеров на основании одного или нескольких других параметров. Согласно некоторым вариантам осуществления кандидатные праймеры, остающиеся в библиотеке, используют в качестве библиотеки тестовых праймеров в любых способах согласно настоящему изобретению. Согласно некоторым вариантам осуществления полученная библиотека тестовых праймеров включает любые из библиотек праймеров согласно настоящему изобретению.

Согласно различным вариантам осуществления любых аспектов настоящего изобретения баллы нежелательности основаны по меньшей мере отчасти на одном или нескольких параметрах, выбранных из группы, состоящей из степени гетерозиготности целевого локуса, распространенности заболевания, связанной с последовательностью (например, полиморфизмом) в целевом локусе, пенетрантности заболевания, связанной с последовательностью (например, полиморфизмом) в целевом локусе, специфичности кандидатного праймера в отношении целевого локуса, размера кандидатного праймера, температуры плавления целевого ампликона, содержания GC в целевом ампликоне, эффективности амплификации целевого ампликона и размера целевого ампликона.

Согласно различным вариантам осуществления любых аспектов настоящего изобретения баллы нежелательности основаны по меньшей мере отчасти на одном или нескольких параметрах, выбранных из группы, состоящей из степени гетерозиготности целевого локуса, специфичности кандидатного праймера в отношении целевого локуса; размера кандидатного праймера, температуры плавления целевого ампликона, содержания GC в целевом ампликоне, эффективности амплификации целевого ампликона и размера целевого ампликона; и тестовые праймеры применяют для одновременной амплификации по меньшей мере 1000 разных целевых локусов в образце, который содержит материнскую ДНК от беременной матери плода и плодную ДНК, для определения присутствия или отсутствия хромосомных аномалий плода. Согласно различным вариантам осуществления указанный способ включает лигирование сайта связывания универсального праймера с молекулами ДНК в указанном образце; амплификацию лигированных молекул ДНК с применением по меньшей мере 1000 специфических праймеров и универсального праймера, в результате чего получают первый набор амплифицированных продуктов; и амплификацию первого набора амплифицированных продуктов с применением по меньшей мере 1000 пар специфических праймеров, в результате чего получают второй набор амплифицированных продуктов. Согласно различным вариантам осуществления применяют по меньшей мере 2000; 5000; 7500; 10000; 20000; 25000; 30000; 4000; 50000; 75000; или 100000 разных пар праймеров. Согласно различным вариантам осуществления амплифицируют по меньшей мере 2000; 5000; 7500; 10000; 20000; 25000; 30000; 4 000; 50000; 75000; или 100000 разных целевых локусов.

Согласно различным вариантам осуществления любых аспектов настоящего изобретения баллы нежелательности основаны по меньшей мере отчасти на одном или нескольких параметрах, выбранных из группы, состоящей из степени гетерозиготности целевого локуса, специфичности кандидатного праймера в отношении целевого локуса; размера кандидатного праймера, температуры плавления целевого ампликона, содержания GC в целевом ампликоне, эффективности амплификации целевого ампликона и размера целевого ампликона; и тестовые праймеры применяют для одновременной амплификации по меньшей мере 1000 разных целевых локусов в образце, который содержит ДНК от предполагаемого отца плода, и для одновременной амплификации указанных целевых локусов в образце, который содержит материнскую ДНК от беременной матери плода и плодную ДНК, для определения, является ли предполагаемый отец биологическим отцом указанного плода. Согласно различным вариантам осуществления амплифицируют по меньшей мере 2000; 5000; 7500; 10000; 20000; 25000; 30000; 4000; 50000; 75000; или 100000 разных целевых локусов.

Согласно различным вариантам осуществления любых аспектов настоящего изобретения баллы нежелательности основаны по меньшей мере отчасти на одном или нескольких параметрах, выбранных из группы, состоящей из степени гетерозиготности целевого локуса, специфичности кандидатного праймера в отношении целевого локуса; размера кандидатного праймера, температуры плавления целевого ампликона, содержания GC в целевом ампликоне, эффективности амплификации целевого ампликона и размера целевого ампликона; и тестовые праймеры применяют для одновременной амплификации по меньшей мере 1000 разных целевых локусов в одной клетке или множестве клеток эмбриона для определения присутствия или отсутствия хромосомных аномалий. Согласно различным вариантам осуществления исследуют клетки из группы, включающей два или более эмбриона, и один эмбрион отбирают для оплодотворения in vitro. Согласно различным вариантам осуществления амплифицируют по меньшей мере 2000; 5000; 7500; 10000; 20000; 25000; 30000; 4000; 50000; 75000; или 100000 разных целевых локусов.

Согласно различным вариантам осуществления любых аспектов настоящего изобретения баллы нежелательности основаны по меньшей мере отчасти на одном или нескольких параметрах, выбранных из группы, состоящей из степени гетерозиготности целевого локуса, специфичности кандидатного праймера в отношении целевого локуса; размера кандидатного праймера, температуры плавления целевого ампликона, содержания GC в целевом ампликоне, эффективности амплификации целевого ампликона и размера целевого ампликона; и тестовые праймеры применяют для одновременной амплификации по меньшей мере 1000 разных целевых локусов в образце нуклеиновой кислоты для судебно-технической экспертизы. Согласно различным вариантам осуществления продолжительность этапа отжига составляет более 3, 5, 8, 10 или 15 минут. Согласно различным вариантам осуществления амплифицируют по меньшей мере 2000; 5000; 7500; 10000; 20000; 25000; 30000; 40000; 50000; 75000; или 100000 разных целевых локусов.

Согласно различным вариантам осуществления любых аспектов настоящего изобретения баллы нежелательности основаны по меньшей мере отчасти на одном или нескольких параметрах, выбранных из группы, состоящей из степени гетерозиготности целевого локуса, распространенности заболевания, связанной с последовательностью (например, полиморфизмом) в целевом локусе, пенетрантности заболевания, связанной с последовательностью (например, полиморфизмом) в целевом локусе, специфичностью кандидатного праймера в отношении целевого локуса, размера кандидатного праймера, температуры плавления целевого ампликона, содержания GC в целевом ампликоне, эффективности амплификации целевого ампликона и размера целевого ампликона; и указанный способ включает применение тестовых праймеров для одновременной амплификации по меньшей мере 1000 разных целевых локусов в контрольном образце нуклеиновой кислоты, в результате чего получают первый набор целевых ампликонов, и для одновременной амплификации указанных целевых локусов в тестируемом образце нуклеиновой кислоты, в результате чего получают второй набор целевых ампликонов; и сравнение первого и второго наборов целевых ампликонов для определения того, присутствует ли целевой локус в одном образце, отсутствуя при этом в другом, или того, присутствует ли целевой локус в контрольном образце и в тестируемом образце с разными титрами. Согласно различным вариантам осуществления указанный тестируемый образец получен от индивидуума, у которого предположительно имеется представляющее интерес заболевание или фенотип, или повышенный риск представляющего интерес заболевания или фенотипа; и при этом один или большее число целевых локусов содержат последовательность (например, полиморфизм) в целевом локусе, связанную с повышенным риском представляющего интерес заболевания или фенотипа, или связанную с представляющим интерес заболеванием или фенотипом. Согласно различным вариантам осуществления амплифицируют по меньшей мере 2000; 5000; 7500; 10000; 20000; 25000; 30000; 4000; 50000; 75000; или 100000 разных целевых локусов.

Согласно различным вариантам осуществления любых аспектов настоящего изобретения баллы нежелательности основаны по меньшей мере отчасти на одном или нескольких параметрах, выбранных из группы, состоящей из степени гетерозиготности целевого локуса, распространенности заболевания, связанной с последовательностью (например, полиморфизмом) в целевом локусе, пенетрантности заболевания, связанной с последовательностью (например, полиморфизмом) в целевом локусе, специфичности кандидатного праймера в отношении целевого локуса, размера кандидатного праймера, температуры плавления целевого ампликона, содержания GC в целевом ампликоне, эффективности амплификации целевого ампликона и размера целевого ампликона; и указанный способ включает применение тестовых праймеров для одновременной амплификации 1000 разных целевых локусов в контрольном образце, который содержит РНК, в результате чего получают первый набор целевых ампликонов, и для одновременной амплификации указанных целевых локусов в тестируемом образце, который содержит РНК, в результате чего получают второй набор целевых ампликонов; и сравнение первого и второго наборов целевых ампликонов для определения присутствия или отсутствия разницы в уровнях экспрессии РНК между контрольным образцом и тестируемым образцом. Согласно различным вариантам осуществления указанная РНК представляет собой мРНК. Согласно различным вариантам осуществления указанный тестируемый образец получен от индивидуума, у которого предположительно имеется представляющее интерес заболевание или фенотип (например, раковое заболевание) или повышенный риск представляющего интерес заболевания или фенотипа (например, ракового заболевания); и при этом один или большее число целевых локусов содержат последовательность (например, полиморфизм или другую мутацию), связанную с повышенным риском представляющего интерес заболевания или фенотипа, или связанную с представляющим интерес заболеванием или фенотипом. Согласно некоторым вариантам осуществления указанный тестируемый образец получен от индивидуума, у которого диагностировано представляющее интерес заболевание или фенотип (например, раковое заболевание); и при этом различие уровня экспрессии РНК между контрольным образцом и тестируемым образцом указывает на то, что целевой локус включает последовательность (например, полиморфизм или другую мутацию), связанную с повышенным или пониженным риском представляющего интерес заболевания или фенотипа. Согласно различным вариантам осуществления амплифицируют по меньшей мере 2000; 5000; 7500; 10000; 20000; 25000; 30000; 4000; 50000; 75000; или 100000 разных целевых локусов.

Согласно одному аспекту в настоящем изобретении предложены библиотеки праймеров. Согласно некоторым вариантам осуществления указанные праймеры выбирают из библиотеки кандидатных праймеров с применением любых способов согласно настоящему изобретению. Согласно некоторым вариантам осуществления библиотека содержит праймеры, которые одновременно гибридизуются по меньшей мере с 1000; 2000; 5000; 7500; 10000; 20000; 25000; 30000; 4000; 50000; 75000; или 100000 разных целевых локусов. Согласно некоторым вариантам осуществления библиотека содержит праймеры, которые одновременно амплифицируют по меньшей мере 1000; 2000; 5000; 7500; 10000; 20000; 25000; 30000; 4000; 50000; 75000; или 100000 разных целевых локусов. Согласно некоторым вариантам осуществления библиотека содержит праймеры, которые одновременно амплифицируют по меньшей мере 1000; 2000; 5000; 7500; 10000; 20000; 25000; 30000; 4000; 50000; 75000; или 100000 разных целевых локусов таким образом, что менее чем 60; 40; 30; 20; 10; 5; 4; 3; 2; 1; 0,5; 0,25; 0,1; или 0,05% амплифицированных продуктов представлено димерами праймеров. Согласно некоторым вариантам осуществления библиотека содержит праймеры, которые одновременно амплифицируют 1000; 2000; 5000; 7500; 10000; 20000; 25000; 30000; 4000; 50000; 75000; или 100000 разных целевых локусов таким образом, что по меньшей мере 50, 60, 70, 80, 90, 95, 96, 97, 98, 99 или 99,5% амплифицированных продуктов представлено целевыми ампликонами. Согласно некоторым вариантам осуществления библиотека содержит праймеры, которые одновременно амплифицируют целевые локусы таким образом, что амплифицируется по меньшей мере 50, 60, 70, 80, 90, 95, 96, 97, 98, 99 или 99,5% целевых локусов из 1000; 2000; 5000; 7500; 10000; 20000; 25000; 30000; 4000; 50000; 75000; или 10000