Белки, связывающие антиген - лиганд cd30 человека

Белки, связывающие антиген - лиганд cd30 человека

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Предшествующий уровень техники

Лиганд CD30 (CD30L, CD153), встречающийся в природе лиганд CD30, представляет собой мембранный гликопротеин типа II, специфично связывающий CD30, в результате чего запускается передача сигнала CD30 посредством его цитоплазматического домена. CD30 и CD30L представляют собой взаимодействующие гликопротеины клеточной поверхности, являющиеся членами надсемейств рецептора фактора некроза опухоли (TNFR; от англ. "tumor necrosis factor receptor") и фактора некроза опухоли (TNF; от англ. "tumor necrosis factor"), соответственно (Durkop et al., Cell, 68:421, 1992; Smith et al., Cell, 73:1349, 1993; патенты US №: 5480981; 5677430; 6143869 и 6652854). Экспрессия CD30 и CD30L ограничена клетками иммунной системы и строго регулируется. CD30 экспрессируется, прежде всего, на активированных В-клетках и подгруппах Т-клеток с активированным фенотипом/фенотипом памяти (Ellis et al., J. Immun., 151:2380, 1993; Falini et al., Blood, 85:1, 1995). CD30L экспрессируется на высоких уровнях на активированных Т-клетках мыши и человека (Shimozato et al., Biochem. & Biophys. Res. Comm., 256:519, 1999; Armitage, J. Biological Regulators & Homeostatic Agents, 14:142, 2000). Резкие изменения в относительной генной экспрессии CD30L происходят по мере перехода В-клеток через герминативные центры (Klein et al., Proc. Nat. Acad. Sci., USA, 100:2639, 2003). Таким образом, экспрессия CD30L на В-клетках может быть стадиеспецифичной и контекстоспецифичной. CD30L также, по-видимому, является маркером уникальной популяции дендритоподобных антигенпрезентирующих клеток мыши, присутствующих в мальпигиевых тельцах, где Т-клетки взаимодействуют с В-клетками (Kim et al., Immunity, 18:643, 2003).

Взаимодействия между клетками, экспрессирующими CD30/CD30L, по-видимому, важны для генерирования сильных вторичных ответов антител, зависимых от Т-клеток, или ответов антител с переключением изотипа. Данные, свидетельствующие о такой роли, включают данные исследований in vitro (Shanebeck et al., Eur. J. Immunol., 25:2147-53, 1995) и in vivo (Gaspal et al., J. Immunol., 174:3891-6, 2005) на мышиных системах. Кроме того, показано, что обработка мышей in vivo блокирующим, но не истощающим моноклональным антителом (mAb; от англ. "monoclonal antibody") к CD30L мыши ингибирует развитие или прогрессирование заболевания в ряде моделей аутоиммунных заболеваний, зависимых от Τ- и/или В-клеток (патент US №6667039). В модели с сильным гуморальным иммунным компонентом ингибирование заболевания коррелирует с ингибированием ответа антител, обусловленного заболеванием.

Следовательно, было бы полезно иметь композиции, содержащие антитела и/или антигенсвязывающие участки человека, связывающиеся с CD30L, для применения в терапевтических и диагностических областях применения.

Сущность изобретения

Предложены белки, связывающие антиген - лиганд CD30 (CD30L), в частности, CD30L человека. Белки, связывающие антиген CD30L человека, могут уменьшать, ингибировать, нарушать и/или модулировать по меньшей мере один из биологических ответов, относящихся к взаимодействию CD30L/CD30, и как таковые полезны для ослабления действий заболеваний или расстройств, обусловленных CD30L. Белки, связывающие антиген CD30L, можно применять, например, чтобы уменьшать, ингибировать, нарушать и/или модулировать взаимодействия CD30L/CD30.

В одном воплощении изобретения изолированные белки, связывающие антиген, связывают С-концевой участок CD30L, включающий аминокислоты (АА) 201-234. В следующем воплощении изобретения предложен антигенсвязывающий белок, связывающий С-концевой участок CD30L, включающий АА 201-234, и дополнительный участок CD30L, расположенный в N-концевой части внеклеточной области, определенный АА 75-95. В следующих воплощениях изобретения антигенсвязывающий белок обладает по меньшей мере одним свойством, выбранным из группы, состоящей из следующих свойств: а) ингибирования взаимодействия CD30/CD30L; b) ингибирования СD30L-индуцированной индукции интерлейкина (ИЛ)-8; с) перекрестной конкуренции с любым из антител A-F за связывание с CD30L человека; d) константы диссоциации к CD30L человека, составляющей максимум 70 пикомоль (пМ), и е) связывания с CD30L человека по существу с таким же или с более высоким сродством (более низкой константой диссоциации (KD)) по сравнению с любым из антител A-F. Сродство (или KD) может быть определено, как известно специалистам в данной области техники, например, с помощью поверхностного плазмонного резонанса (SPR; от англ. "Surface Plasmon Resonance") или с помощью сортировки флуоресцентно-активированных клеток (FACS; от англ. "Fluorescence Activated Cell Sorting"), как описано в Примере 4 данного изобретения.

В следующем воплощении изобретения антигенсвязывающий белок связывает CD30L и конкурирует с Fab-фрагментом одного или более из антител А, В, С, D, Ε и F за связывание с CD30L Альтернативно данный антигенсвязывающий белок, характеризующийся как антигенсвязывающий белок, который связывается с CD30L человека (hCD30L), ингибируется связыванием Fab одного или более из антител А, В, С, D, Ε и F. В следующем конкретном воплощении изобретения Fab представляет собой Fab антитела А, включающего каждое из антител А1, А2, A3, A4, А5 и А6.

В одном воплощении изобретения предложен изолированный антигенсвязывающий белок, связывающий CD30L и включающий по меньшей мере одну вариабельную область тяжелой цепи, содержащую участки определения комплементарности (CDR; от англ. "complementarity determining region") Н1, CDRH2 и CDRH3, выбранные из группы, состоящей из следующих участков: a) CDRH1, отличающегося не более чем четырьмя, тремя, двумя или одной аминокислотной заменой, инсерцией или делецией от участка CDRH1, представленного в таблице 3; b) CDRH2, отличающегося не более чем семью, шестью, пятью, четырьмя, тремя, двумя или одной аминокислотной заменой, инсерцией и/или делецией от участка CDRH2, представленного в таблице 3; с) CDRH3, отличающегося не более чем одиннадцатью, десятью, девятью, восемью, семью, шестью, пятью, четырьмя, тремя, двумя или одной аминокислотной заменой, инсерцией и/или делецией от участка CDRH3, представленного в таблице 3; и включающий по меньшей мере одну вариабельную область легкой цепи, содержащую участок CDRL1, CDRL2 и CDRL3, выбранный из группы, состоящей из следующих участков: d) CDRL1, отличающегося не более чем четырьмя, тремя, двумя или одной аминокислотной заменой, инсерцией и/или делецией от участка CDRL1, представленного в таблице 3; е) CDRL2, отличающегося не более чем двумя или одной аминокислотной заменой, инсерцией или делецией от участка CDRL2, представленного в таблице 3; f) CDRL3, отличающегося не более чем двумя или одной аминокислотной заменой, инсерцией или делецией от участка CDRL3, представленного в таблице 3. В родственном воплощении изобретения предложен участок CDRH1, выбранный из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID NO: 14, 15, 16, 17, 18 и 33; участок CDRH2, выбранный из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID NO: 19, 20, 21, 22, 23, 24 и 34; участок CDRH3, выбранный из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID NO: 25, 26, 27, 28, 29 и 35; участок CDRL1, выбранный из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6 и 30; участок CDRL2, выбранный из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID NO: 7, 8, 9, 10 и 31; и участок CDRL3, выбранный из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID NO: 11, 12, 13 и 32.

В другом воплощении изобретения предложен изолированный белок, связывающий антиген, который связывает CD30L человека, содержащий по меньшей мере одну вариабельную область легкой цепи, включающую CDR1, CDR2 и CDR3, где участок CDR1 содержит аминокислотные остатки 23-36, CDR2 содержит аминокислотные остатки 52-58, и CDR3 содержит аминокислотные остатки 91-100 SEQ ID NO: 36, 28, 40, 42 или 44; либо b) вариабельную область легкой цепи, включающую CDR1, CDR2 и CDR3, где участок CDR1 содержит аминокислотные остатки 25-36, CDR2 содержит аминокислотные остатки 52-58, и CDR3 содержит аминокислотные остатки 91-100 SEQ ID NO: 46; и по меньшей мере одну вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1, CDR2 и CDR3, где участок CDR1 содержит аминокислотные остатки 31-35, CDR2 содержит аминокислотные остатки 50-65, и CDR3 содержит аминокислотные остатки 98-113 SEQ ID NO: 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70 или 72. В родственном воплощении изобретения предложен белок, связывающий антиген, содержащий по меньшей мере одну вариабельную область тяжелой цепи и по меньшей мере одну вариабельную область легкой цепи. В другом воплощении изобретения предложен белок, связывающий антиген, включающий по меньшей мере две вариабельные области тяжелой цепи и по меньшей мере две вариабельные области легкой цепи.

В другом воплощении изобретения предложен изолированный белок, связывающий антиген, который связывает CD30L, включающий вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи, где последовательность вариабельной области тяжелой цепи отличается не более чем 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 или 1 аминокислотной заменой, добавлением и/или делецией от последовательности вариабельной области тяжелой цепи, представленной в таблице 2; и где последовательность вариабельной области легкой цепи отличается не более чем 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 или 1 аминокислотной заменой, добавлением и/или делецией от последовательности вариабельной области легкой цепи, представленной в таблице 1.

В другом воплощении изобретения предложен изолированный антигенсвязывающий белок, связывающий CD30L и включающий вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 80% идентичностью последовательности SEQ ID NO: 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70 и 72; и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 88% идентичностью последовательности SEQ ID NO: 36, 38, 40, 42, 44 и 46.

В одном воплощении изобретения предложен изолированный антигенсвязывающий белок, связывающий CD30L, выбранный из группы, состоящей из следующих участков: а) вариабельной области тяжелой цепи, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60 и 62, и вариабельной области легкой цепи SEQ ID NO: 36; b) вариабельной области тяжелой цепи SEQ ID NO: 64 и вариабельной области легкой цепи SEQ ID NO: 38; с) вариабельной области тяжелой цепи SEQ ID NO: 66 и вариабельной области легкой цепи SEQ ID NO: 40; d) вариабельной области тяжелой цепи SEQ ID NO: 68 и вариабельной области легкой цепи SEQ ID NO: 42; е) вариабельной области тяжелой цепи SEQ ID NO: 70 и вариабельной области легкой цепи SEQ ID NO: 44; и f) вариабельной области тяжелой цепи SEQ ID NO: 72 и вариабельной области легкой цепи SEQ ID NO: 46. В родственном воплощении изобретения изолированный антигенсвязывающий белок представляет собой антитело. В другом родственном воплощении изобретения антитело представляет собой моноклональное антитело, рекомбинантное антитело, человеческое антитело, гуманизированное антитело, химерное антитело, мультиспецифическое антитело или его фрагмент антитела. В следующем воплощении изобретения фрагмент антитела представляет собой Fab фрагмент, Fab' фрагмент, F(ab')₂ фрагмент, Fv фрагмент, диатело или одноцепочечную молекулу антитела. В родственном воплощении изобретения антигенсвязывающий белок представляет собой человеческое антитело. В другом родственном воплощении изобретения антигенсвязывающий белок представляет собой моноклональное антитело. В следующем родственном воплощении изобретения антигенсвязывающий белок относится к IgG1-, IgG2- IgG3- или IgG4-типу. В родственном воплощении изобретения антигенсвязывающий белок относится к IgG1- или IgG2-типу.

В другом воплощении изобретения предложены изолированные молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие антигенсвязывающий белок, как раскрыто выше.

В родственном воплощении изобретения по меньшей мере одна вариабельная область тяжелой цепи кодируется изолированной молекулой нуклеиновой кислоты, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71 и 73, и по меньшей мере одна вариабельная область легкой цепи кодируется изолированной молекулой нуклеиновой кислоты, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 37, 39, 41, 43, 45 и 47. В другом родственном воплощении изобретения молекула нуклеиновой кислоты функционально связана с контролирующей последовательностью. В следующих родственных воплощениях изобретения предложены векторы, содержащие нуклеиновую кислоту, раскрытую выше, и клетки-хозяева, содержащие такие векторы. Еще в одном следующем воплощении изобретения предложен изолированный полинуклеотид, достаточный для применения в качестве зонда гибридизации, праймера полимеразной цепной реакции (ПЦР) или секвенирующего праймера, представляющий собой фрагмент молекулы нуклеиновой кислоты, как раскрыто выше, или комплементарной ей молекулы.

В другом воплощении изобретения предложен способ получения антигенсвязывающего белка, как раскрыто выше, включающий стадию получения препарата антигенсвязывающего белка из клетки-хозяина, секретирующей антигенсвязывающий белок.

В другом воплощении изобретения предложен изолированный антигенсвязывающий белок, как раскрыто выше, где антигенсвязывающий белок обладает по меньшей мере одним свойством, выбранным из группы, состоящей из следующих свойств: а) ингибирования взаимодействия CD30/CD30L; b) ингибирования СD30L-индуцированной индукции ИЛ-8; с) перекрестной конкуренции с любым из антител A-F за связывание с CD30L человека; d) константой диссоциации, равной не более 70 пМ, и е) связывания с CD30L человека по существу с такой же Kd, как любого из антител A-F.

Еще в одном другом воплощении изобретения предложена фармацевтическая композиция, содержащая по меньшей мере один антигенсвязывающий белок, как раскрыто выше, и фармацевтически приемлемый эксципиент. В родственном воплощении изобретения дополнительно предложены такие фармацевтические композиции, дополнительно содержащие метящую группу или эффекторную группу. В другом родственном воплощении изобретения метящая группа выбрана из группы, состоящей из следующих групп: изотопных меток, магнитных меток, редокс-активных группировок, оптических красителей, биотинилированных групп и предопределенных полипептидных эпитопов, распознаваемых вторичным репортером. В следующем родственном воплощении изобретения эффекторная группа выбрана из группы, состоящей из следующих групп: радиоизотопа, радионуклида, токсина, терапевтической группы и химиотерапевтической группы. В другом родственном воплощении изобретения белок, связывающий антиген, связан с метящей группой.

В другом воплощении изобретения предложен способ лечения или предупреждения состояния, связанного с CD30L, у пациента, включающий введение пациенту, нуждающемуся в этом, эффективного количества по меньшей мере одного изолированного белка, связывающего антиген, как раскрыто выше. В другом родственном воплощении изобретения изолированный антигенсвязывающий белок вводят отдельно или в виде комбинированной терапии.

В другом воплощении изобретения предложен способ снижения активности CD30L у пациента, включающий введение эффективного количества по меньшей мере одного белка, связывающего антиген, как раскрыто выше.

Еще в одном другом воплощении изобретения предложены белки, связывающие антиген, конкурирующие по меньшей мере с одним белком, связывающим антиген, как раскрыто выше.

В другом воплощении изобретения предложен белок, связывающий антиген, как раскрыто выше, полностью или частично афукозилированный.

Описание графических материалов

Фиг.1А. Клетки Ramos и эффекторы, представляющие собой естественные киллерные клетки (NK; от англ. "natural killers"), Пустые квадраты: Ритуксан (IgG1), Сплошные ромбы: Антитело (Аb; от англ. Antibody) А1 IgG1f, Сплошные квадраты: Антитело А1 IgG1, Пустые круги: Антитело А1 IgG2.

Фиг.1В: Клетки JD38 и эффекторы NK, Пустые квадраты: Ритуксан (IgG1), Сплошные ромбы: Антитело А1 IgG1f, Сплошные квадраты: Антитело А1 IgG1, Пустые круги: Антитело А1 IgG2.

Фиг.1С. Клетки DS179 и эффекторы NK, Пустые квадраты: Ритуксан (IgG1), Сплошные ромбы: Антитело А1 IgG1f, Сплошные квадраты: Антитело А1 IgG1, Пустые круги: Антитело А1 IgG2.

Фиг.1D: Клетки EW36 и эффекторы NK, Пустые квадраты: Ритуксан (IgG1), Сплошные ромбы: Антитело А1 IgG1f, Сплошные квадраты: Антитело А1 IgG1, Пустые круги: Антитело А1 IgG2.

Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения

В настоящем изобретении предложены композиции, наборы и способы, относящиеся к белкам, связывающим антиген CD30L, включающим антигенсвязывающие белки, которые блокируют взаимодействие между CD30L и CD30, такие как антитела против CD30L, фрагменты антител и производные антител, например, нейтрализующие антитела против CD30L, фрагменты антител или производные антител. Также предложены полинуклеотиды и их производные и фрагменты, содержащие последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие весь полипептид или участок полипептида, связывающийся с CD30L, например, полинуклеотид, кодирующий все антитело или участок антитела против CD30L, фрагмент антитела или производное антитела, плазмиды и векторы, содержащие такие нуклеиновые кислоты, и клетки или линии клеток, содержащие такие полинуклеотиды и/или векторы или плазмиды. Предложенные способы включают, например, способы получения, идентификации или выделения белков, связывающих антиген CD30L, таких как антитела против CD30L, способы определения блокирования молекулой взаимодействия между CD30L и CD30, способы определения антагонизма молекулы CD30L, способы получения композиций, таких как фармацевтические композиции, содержащие белок, связывающий антиген CD30L, и способы введения белка, связывающего антиген CD30L, субъекту, например, способы лечения состояния, опосредованного CD30L, и блокирования взаимодействия между CD30L и CD30, in vivo или in vitro.

Если в данном изобретении не определено иное, научные и технические термины, используемые в связи с настоящим изобретением, имеют значение, обычно понимаемое обычными специалистами в данной области техники. Кроме того, если контекст не требует иного, термины в единственном числе включают термины во множественном числе, а термины множественного числа включают термины в единственном числе. Как правило, методы культивирования клеток и тканей, молекулярной биологии, иммунологии, микробиологии, генетики и химии белков и нуклеиновых кислот и гибридизации, описанные в данном изобретении, и номенклатуры, используемые в связи с ними, хорошо известны и общеприняты в данной области техники. Способы и методы по настоящему изобретению, как правило, выполняют в соответствии с традиционными способами, хорошо известными в данной области техники и описанными в различных общих и более конкретных ссылках, цитируемых и обсуждаемых на протяжении всего настоящего описания, если не указано иное. См., например, следующие ссылки: Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2001) и Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates (1992), а также Harlow and Lane Antibodies: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1990). Методы ферментативных реакций и очистки выполняют в соответствии со спецификациями изготовителя, которые обычно выполняют в данной области техники, или как раскрыто в данном изобретении. Лабораторные работы и методы аналитической химии, химии органического синтеза и медицинской и фармацевтической химии, раскрытые в данном изобретении, а также терминология, используемая в связи с ними, хорошо известны и общеприняты в данной области техники. Для химических синтезов, химических анализов, получения, приготовления, и доставки фармацевтических препаратов и лечения пациентов можно использовать стандартные способы.

Все документы или части документов, цитируемые в данном изобретении, включающие, но не ограниченные ими, патенты, заявки на патенты, статьи, книги и монографии, явным образом полностью включены в данное изобретение посредством ссылки в целях описания и раскрытия, например, методологии, описанные в таких публикациях, которые могут быть использованы в сочетании с информацией, раскрытой в данном изобретении.

Термин "СD30-лиганд" (CD30L) относится к роду полипептидов, способных к связыванию с CD30, как раскрыто в статье Smith et al., Cell 73:1349-1360, 1993 и в патенте US №5480981, включая его СD30-связывающие мутеины; такие полипептиды включают мембраносвязанные белки (содержащие цитоплазматический домен, трансмембранную область и внеклеточный домен), а также укороченные белки, сохраняющие СD30-связывающее свойство. Такие укороченные белки включают, например, растворимый CD30L, содержащий только внеклеточный (рецептор-связывающий) домен. Включены также фрагменты CD30L, включающие участки полноразмерного полипептида CD30L, сохраняющие способность к связыванию с CD30, или способные вызывать антитело, специфично связывающееся с полипептидом CD30 или с участком полноразмерного CD30, способным передавать биологический сигнал, такой как активация фактора транскрипции каппа В (NF-κB).

Термин "CD30" относится к рецептору, являющемуся членом надсемейства рецепторов фактора некроза опухоли (TNF; от англ. "tumor necrosis factor")/фактора роста нервной ткани (NGF; от англ. "nerve growth factor"), клонирование которого раскрыто в статье Durkop et al. (Cell 68:421, 1992). Выражение "растворимый CD30" (sCD30) относится к растворимым молекулам, включающим весь внеклеточный домен или часть внеклеточного домена белка CD30, и сохраняющим способность к специфичному связыванию с CD30L. Растворимые полипептиды CD30 охватывают рекомбинантные SCD30 и встречающиеся в природе белки sCD30 в высокоочищенной форме.

Как используют в настоящем изобретении, выражение "фрагмент CD30" относится к участку полноразмерного полипептида CD30, сохраняющему способность к связыванию с CD30L, или способному вызывать антитело, специфично связывающееся с полипептидом CD30 или с участком полноразмерного CD30, способным передавать биологический сигнал, такой как активация NF-κB.

Выражение "взаимодействие CD30/CD30L", как используют в настоящем изобретении, относится к специфичному связыванию CD30 с CD30L, приводящему в результате к преобразованию сигнала CD30. Это связывание включает случаи, в которых по меньшей мере один партнер связывания представляет собой фрагмент либо CD30, либо CD30L, то есть этот термин может относиться к связывающему взаимодействию фрагмента CD30 с CD30L, CD30 с фрагментом CD30L или фрагмента CD30 с фрагментом CD30L. Кроме того, во взаимодействие CD30/CD30L может быть вовлечен аналог CD30 (такой как аллельный вариант или мутеин), способный к специфичному связыванию с CD30L, либо в это взаимодействие может быть вовлечен аналог CD30L (такой как аллельный вариант или мутеин), специфично связывающийся с CD30. Кроме того, во взаимодействие CD30/CD30L могут быть вовлечены либо эндогенные белки CD30 или CD30L, либо рекомбинантные белки CD30 или CD30L, экспрессируемые клеткой, трансфицированной нуклеиновой кислотой, кодирующей рекомбинантный белок.

Термин "полинуклеотид" включает как однонитевые, так и двунитевые нуклеиновые кислоты, и включает ДНК, РНК, мРНК, кДНК геномного или синтетического происхождения или некоторые их комбинации, не связанные с последовательностями, в норме обнаруживаемыми в природе. Изолированные полинуклеотиды, содержащие указанные последовательности, могут содержать, кроме указанных последовательностей, последовательности, кодирующие вплоть до десяти или даже вплоть до двенадцати других белков или их участков, либо могут включать функционально связанные регуляторные последовательности, контролирующие экспрессию кодирующей области указанных нуклеиново-кислотных последовательностей, и/или могут включать векторные последовательности. Нуклеотиды, составляющие полинуклеотид, могут представлять собой рибонуклеотиды или дезоксирибонуклеотиды, либо модифицированную форму любого из типов нуклеотидов. Модификации включают модификации оснований, такие как производные, представляющие собой бромуридин и инозин, модификации рибозы, такие как 2',3'-дидезоксирибоза, и модификации межнуклеотидной связи, такие как фосфоротиоат, фосфородитиоат, фосфороселеноат, фосфородиселеноат, фосфороанилотиоат, фосфоранилидат и фосфороамидат.

Термин "олигонуклеотид" означает полинуклеотид, содержащий 100 или менее нуклеотидов. В некоторых воплощениях изобретения олигонуклеотиды составляют от 10 до 60 оснований в длину. В других воплощениях изобретения олигонуклеотиды составляют 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или от 20 до 40 нуклеотидов в длину. Олигонуклеотиды могут быть однонитевыми или двунитевыми, например, для применения при конструировании мутантного гена. Олигонуклеотиды могут представлять собой смысловые или антисмысловые олигонуклеотиды. Олигонуклеотид может включать обнаружимую метку, такую как радиоактивная метка, флуоресцентная метка, гаптен или антигенная метка, для анализов определения. Олигонуклеотиды можно применять, например, в качестве праймеров ПЦР, праймеров клонирования или зондов гибридизации.

Термины "полипептид" или "белок" означает макромолекулу, имеющую аминокислотную последовательность нативного белка, то есть белка, продуцируемого встречающейся в природе и нерекомбинантной клеткой; либо продуцируемого клеткой, сконструированной генно-инженерными методами, или рекомбинантной клеткой, и включает молекулы, имеющие аминокислотную последовательность нативного белка, или молекулы, имеющие одну или более делеций, инсерций и/или замен аминокислотных остатков нативной последовательности. Данный термин также включает полимеры аминокислот, в которых одна или более аминокислот представляют собой химические аналоги соответствующих встречающихся в природе аминокислот и полимеров. Термины "полипептид" и "белок" охватывают белки, связывающие антиген CD30L (такие как антитела), и последовательности, имеющие одну или более делеций, добавлений и/или замен аминокислотных остатков последовательности белка, связывающего антиген. Термин "полипептидный фрагмент" относится к полипептиду, имеющему амино-концевую делецию, карбокси-концевую делецию и/или внутреннюю делецию по сравнению с полноразмерным нативным белком. Такие фрагменты могут также содержать модифицированные аминокислоты по сравнению с нативным белком. В определенных воплощениях изобретения фрагменты имеют длину от примерно пяти до 500 аминокислот. Например, длина фрагментов может составлять по меньшей мере 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 50, 70, 100, 110, 150, 200, 250, 300, 350, 400 или 450 аминокислот. Полезные полипептидные фрагменты включают иммунологически функциональные фрагменты антител, включая связывающие домены. В случае белка, связывающего антиген CD30L, такого как антитело, полезные фрагменты включают, но не ограничены ими, один или более участков CDR, вариабельный домен тяжелой или легкой цепи, участок цепи антитела, участок вариабельной области, включающий менее трех CDR, и тому подобное.

"Аминокислота" включает ее обычное значение в данной области техники. Двадцать встречающихся в природе аминокислот и их сокращения следуют стандартному использованию. См.: Immunology-Α Synthesis, 2nd Edition, (Ε.S. Golub and D.R. Gren, eds.), Sinauer Associates: Sunderland, Mass. (1991). Стереоизомеры (например, D-аминокислоты) двадцати стандартных аминокислот, неприродные аминокислоты, такие как [альфа]-,[альфа]-двузамещенные аминокислоты, N-алкиламинокислоты и другие нестандартные аминокислоты могут также быть подходящими компонентами для полипептидов. Примеры нестандартных аминокислот включают следующие аминокислоты: 4-гидроксипролин, [гамма]-карбоксиглутамат, [эпсилон]-N,N,N-триметиллизин, [эпсилон]-N-ацетиллизин, О-фосфосерин, N-ацетилсерин, N-формилметионин, 3-метилгистидин, 5-гидроксилизин, [сигма]-1Ч-метиларгинин и другие подобные аминокислоты и иминокислоты (например, 4-гидроксипролин). В обозначении полипептидов, используемом в данном изобретении, направление влево представляет собой амино-концевое направление, а направление вправо представляет собой карбокси-концевое направление в соответствии со стандартным использованием и правилом.

Термин "изолированный белок" относится к белку, такому как белок, связывающий антиген (примером которого может быть антитело), очищенный от белков или полипептидов, либо от других загрязняющих веществ, которые препятствовали бы его терапевтическому, диагностическому, профилактическому, исследовательскому или другому применению. Как используют в настоящем изобретении, "по существу чистый" означает, что молекула описываемого соединения является преобладающей из присутствующих соединений, то есть на молярной основе она является более многочисленной, чем любое другое индивидуальное соединение в той же смеси. В определенных воплощениях изобретения по существу чистая молекула представляет собой композицию, где молекула-объект составляет по меньшей мере 50% (на молярной основе) всех присутствующих макромолекулярных соединений. В других воплощениях изобретения по существу чистая композиция содержит по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95% или 99% всех макромолекулярных соединений, присутствующих в композиции. В определенных воплощениях изобретения по существу гомогенное вещество очищено до такой степени, что загрязняющие соединения не могут быть обнаружены в композиции традиционными способами обнаружения, и, следовательно, композиция состоит из единственного обнаружимого макромолекулярного соединения.

"Вариант" полипептида (например, белок, связывающий антиген, такой как антитело) содержит аминокислотную последовательность, где один или более аминокислотных остатков вставлено, делетировано и/или заменено в пределах аминокислотной последовательности относительно другой полипептидной последовательности. Варианты включают слитые белки. "Производное" полипептида представляет собой полипептид, который был химически модифицирован определенным образом, отличающимся от вариантов инсерции, делеции или замены, например, посредством конъюгации с другой химической группировкой.

Термины "встречающийся в природе" или "нативный", как используют на протяжении всего описания в сочетании с биологическими материалами, такими как полипептиды, нуклеиновые кислоты, клетки-хозяева и тому подобное, относятся к веществам, обнаруживаемым в природе. В данном контексте "рекомбинантный белок" представляет собой белок, полученный с использованием рекомбинантных методов, то есть посредством экспрессии рекомбинантной нуклеиновой кислоты, как раскрыто в данном изобретении. Способы и методы получения рекомбинантных белков хорошо известны в данной области техники.

Термин "антитело" относится к интактному иммуноглобулину любого изотипа или к его фрагменту, который может конкурировать с интактным антителом за специфичное связывание с антигеном-мишенью, и включает, например, химерные, гуманизированные, полностью человеческие и биспецифические антитела. Антитело как таковое представляет собой вид белка, связывающего антиген. Если не указано иное, термин "антитело" включает, кроме антител, содержащих две полноразмерных тяжелых цепи и две полноразмерных легких цепи, его производные, варианты, фрагменты и мутеины, примеры которых раскрыты ниже. Интактное антитело, как правило, содержит по меньшей мере две полноразмерных тяжелых цепи и две полноразмерных легких цепи, но в некоторых случаях может содержать меньшее количество цепей, как, например, антитела, в природе встречающиеся у верблюдовых, которые могут содержать только тяжелые цепи. Антитела могут иметь происхождение только из одного источника или могут быть "химерными", то есть различные участки антитела могут иметь происхождение от двух различных антител, как дополнительно описано ниже. Белки, связывающие антиген, антитела или связывающие фрагменты могут быть получены в гибридомах, методами рекомбинантных ДНК или путем ферментативного или химического расщепления интактных антител.

Термин "функциональный фрагмент" (или просто "фрагмент") антитела или цепи иммуноглобулина (тяжелой или легкой цепи), как используют в настоящем изобретении, представляет собой белок, связывающий антиген, содержащий участок (независимо от того, каким образом получен или синтезирован этот участок) антитела, в котором отсутствуют по меньшей мере некоторые из аминокислот, присутствующие в полноразмерной цепи, но способный к специфичному связыванию с антигеном. Такие фрагменты биологически активны в том, что они специфично связываются с антигеном-мишенью и могут конкурировать с другими белками, связывающими антиген, включая интактные антитела, за специфичное связывание с данным эпитопом. В одном аспекте такой фрагмент сохраняет по меньшей мере один CDR, присутствующий в полноразмерной легкой или тяжелой цепи, и в некоторых воплощениях изобретения содержит одну тяжелую цепь и/или легкую цепь, либо ее участок. Эти биологически активные фрагменты могут быть получены методами рекомбинантных ДНК, либо могут быть получены путем ферментативного или химического расщепления белков, связывающих антиген, включая интактные антитела. Фрагменты включают, но не ограничены ими, иммунологически функциональные фрагменты, такие как Fab, Fab', F(ab')2, Fv, доменные антитела и одноцепочечные антитела, и могут иметь происхождение из любого источника млекопитающего, включающего, но не ограниченного ими, человека, мышь, крысу, верблюда или кролика. Кроме того, рассматривают, что функциональный участок белков, связывающих антиген, раскрытых в данном изобретении, например, один или более CDR, может быть ковалентно связан со вторым белком или с малой молекулой для создания терапевтического агента, направленного на определенную мишень в организме, обладающего бифункциональными терапевтическими свойствами или обладающего пролонгированным периодом полувыведения в сыворотке.

Термин "конкурировать" при использовании в контексте белков, связывающих антиген (например, нейтрализующих белков, связывающих антиген, или нейтрализующих антител), означает конкуренцию между белками, связывающими антиген, которую определяют с помощью анализа, в котором белок, связывающий антиген (например, антитело или его иммунологически функциональный фрагмент), в условиях теста предотвращает или ингибирует специфичное связывание референсного белка, связывающего антиген (например, лиганда или референсного антитела) с общим антигеном (например, с белком CD30L или его фрагментом). Можно использовать многочисленные типы анализов конкурентного связывания, например, следующие анализы: твердофазный прямой или непрямой радиоиммунологический анализ (РИА), твердофазный прямой или непрямой иммуноферментный анализ (ИФА), конкурентный сэндвич-анализ (см., например, Stahli et al., 1983, Methods in Enzymology 92:242-253); твердофазный прямой ИФА с биотином-авидином (см., например, Kirkland et al., 1986, J. Immunol. 137:3614-3619) твердофазный анализ с прямым мечением, твердофазный сэндвич-анализ с прямым мечением (см., например, Harlow and Lane, 1988, Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press); твердофазный РИА с прямым мечением с использованием метки 1-125 (см., например, Morel et al., 1988, Molec. Immunol. 25:7-15); твердофазный прямой ИФА с биотином-авидином (см., например, Cheung, et al., 1990, Virology 176:546-552); и РИА с прямым мечением (Moldenhauer et al., 1990, Scand. J. Immunol. 32:77-82). В характерном случае такой анализ включает использование очищенного антигена, связанного с твердой поверхностью, или клеток, несущих любой из них, немеченый тестируемый белок, связывающий антиген, и меченый референсный белок, связывающий антиген. Могут быть предприняты различные подходы, известные специалистам в данной области техники. Альтернативная возможность включает получение референсного белка, связывающего антиген, связанного с планшетом, необязательно посредством гибкого матрикса. Дополнительные варианты могут быть основаны на порядке добавления, то есть, смешивают ли с референсным белком, связывающим антиген, связанным с планшетом, сначала антиген или тестируемый белок, связывающий антиген. Во всех случаях необходимо насыщение антигена белком, связывающим антиген, чтобы избежать ложного неконкурентного результата.

Конкурентное ингибирование измеряют путем определения количества метки, связанной с твердой поверхностью или с клетками, в присутствии тестируемого белка, связывающего антиген. Обычно тестируемый белок, связывающий антиген, присутствует в избытке. Белки, связывающие антиген, идентифицированные с помощью конкурентного анализа (конкурирующие белки, связывающие антиген), включают антигенсвязывающие белки, связывающиеся с тем же эпитопом, что и референсные антигенсвязывающие белки, а также антигенсвязывающие белки, связывающиеся с примыкающим эпитопом, достаточно приближенным к эпитопу, связанному референсным антигенсвязывающим белком, в результате чего происходит стерическое затруднение. Обычно, когда конкурирующий белок, связывающий антиген, присутствует в избытке, он ингибирует специфичное связывание референсного белка, связывающего антиге