Набор реактивов для выделения днк

Набор реактивов для выделения днк

Реферат

Изобретение относится к биохимии. Известен наиболее близкий набор реактивов для выделения ДНК [RU 2485178, С2, 20.06.2013], способ выделения ДНК из биологических объектов, заключающийся в том, что биологический объект измельчают и помещают в пробирку с лизирующим буферным раствором состава: 0,1 М Трис-HCl, 0,1 М ЭДТА, 0,1 М NaCl, 0,5% N-лаурилсаркозил Na и протеиназы K, рН 6-7, получают клеточный лизат, к лизату добавляют сорбент магнитных наночастиц, модифицированных хитозаном, перемешивают и инкубируют в течение 25-35 мин, пробирку помещают на магнитный штатив, разделяют смесь на фракции - сорбент, связанный с ДНК, и надосадочную жидкость, надосадок удаляют, а к осадку приливают элюирующий буферный раствор состава: 10 мМ Трис-HCl, рН 7,4; 100 мМ NaCl; 1 мМ ЭДТА, инкубируют, пробирки помещают на магнитный штатив, разделяют смесь на фракции - сорбент - осадок и надосадок - ДНК, растворенная в элюирующем буферном растворе, осадок удаляют, в надосадке остается ДНК-конечный продукт.

Известный набор реактивов для выделения ДНК имеет недостаток: маленький выход ДНК.

Задачей заявляемого набора для выделения ДНК является увеличение выхода ДНК.

В результате использования данного изобретения достигнут технический результат: увеличился выход ДНК до 5 раз, а именно от 200 до 500-1000 нг из 5 г исходного материала.

Технический результат достигается тем, что в качестве лизирующего буферного раствора набор содержит буфер для лизиса и связывания гуанидин тиоцианат формулы C₂H₆N₄S-CH₅N₃·HSCN концентрацией 5 М, трис гидрохлорид формулы C₄H₁₁NO₃·HCl концентрацией 20 мМ, тритон концентрацией 15%, в качестве промывочных растворов: промывочный буфер №1, содержащий гуанидин тиоцианат концентрацией 4 М, трис гидрохлорид концентрацией 25 мМ, этиловый спирт концентрацией 34%, в качестве сорбента - суспензию из магнитных микросфер со средним размером 1,26 мкм в солевом растворе 1 М NaCl и 0,05% NaN₃, промывочный буфер №2, содержащий трис гидрохлорид концентрацией 5 мМ, натрия хлорид концентрацией 15 мМ и этиловый спирт концентрацией 80%, в качестве элюирующего раствора берут деионизированную воду.

Объясняется технический результат тем, найденные в результате экспериментов реактивы и их концентрации оказались оптимальными для максимального выхода ДНК. Кроме того, эти реактивы более доступны и дешевле, чем набор реактивов, использованный в прототипе.

Пример использования заявляемого набора реактивов.

Выделение ДНК проводится из 100 мкл контрольного образца.

1. Внести по 100 мкл образца в 1,5 или 2 мл пробирки.

2. Внести в эти же пробирки по 500 мкл буфера для лизиса и связывания ДНК, перемешать на вортексе.

3. Инкубировать пробирки при 60°С в течение 15 минут.

4. Внести по 10 мкл суспензии магнитных частиц. Перемешать пипетированием.

5. Инкубировать при комнатной температуре в течение 5 минут, перемешивать во время инкубирования 2-3 раза на вортексе.

6. Поместить пробирки в магнитный штатив, подождать, пока частицы полностью соберутся на стенке пробирок (2 минуты) и удалить супернатант.

7. Внести в пробирки по 350 мкл промывочного буфера №1, ресуспендировать магнитные частицы в растворе.

8. Поместить пробирки в магнитный штатив, подождать, пока частицы полностью соберутся на стенках пробирок и удалить супернатант.

9. Внести в пробирки по 350 мкл хорошо перемешанного промывочного буфера №2, перемешать на вортексе.

10. Поместить пробирки в магнитный штатив, подождать, пока частицы полностью соберутся на стенках пробирок и удалить супернатант.

11. Повторить пункты 9 и 10.

12. Поместить пробирки с приоткрытыми крышками в термостат и инкубировать при 60°С в течение 10 минут для просушки и удаления остаточного этанола.

13. Внести в пробирки по 50 мкл элюирующего буфера. Ресуспендировать частицы на вортексе.

14. Инкубировать при 60°С в течение 10 минут, во время инкубирования перемешать 2-3 раза на вортексе.

15. Поместить пробирки в магнитный штатив, подождать, пока частицы полностью соберутся на стенках пробирок.

16. Перенести супернатант, содержащий выделенную ДНК, в новую пробирку.

Таким образом, предлагаемый набор реактивов пригоден для эффективного выделения ДНК из исходного биологического материала.

Набор реактивов для выделения ДНК из биологических объектов, включающий лизирующий буферный раствор, промывочные буферные растворы №1 и №2, сорбент - магнитные частицы, элюирующий буферный раствор, отличающийся тем, что в качестве лизирующего буферного раствора используют раствор, содержащий гуанидин тиоцианат формулы C₂H₆N₄S-CH₅N₃·HSCN концентрацией 5 М, трис гидрохлорид формулы C₄H₁₁NO₃·HCl концентрацией 20 мМ, тритон концентрацией 15%, в качестве сорбента - суспензию из магнитных микросфер со средним размером 1,26 мкм в солевом растворе 1 М NaCl и 0,05% NaN₃, в качестве промывочных растворов - промывочный буфер №1, содержащий гуанидин тиоцианат концентрацией 4 М, трис гидрохлорид концентрацией 25 мМ, этиловый спирт концентрацией 34%, промывочный буфер №2, содержащий трис гидрохлорид концентрацией 5 мМ, хлорид натрия концентрацией 15 мМ и этиловый спирт концентрацией 80%, а в качестве элюирующего раствора берут деионизированную воду.