Способ ферментации стеблей растений семейства poaceae

Способ ферментации стеблей растений семейства poaceae

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ДАННЫЕ О ПРИОРИТЕТЕ

[0001] Настоящая международная заявка на патент заявляет приоритет по заявке на патент США №15/424843, поданной 4 февраля 2017 г., и заявке на патент США №62/349674, поданной 14 июня 2016 г., каждая из которых настоящим включена посредством ссылки в данный документ.

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0002] Изобретение относится к способам ферментации для синтеза желаемого химического соединения. Более конкретно, настоящее изобретение относится к получению кислородсодержащих органических соединений с помощью нескольких типов микроорганизмов.

ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0003] Наиболее широко культивируемыми сельскохозяйственными культурами семейства Роасеае являются сахарный тростник (Saccharum officinarum), сорго (Sorghum bicolor) и маис (Zea mays). Слово Роасеае происходит от древнегреческого , что означает "фураж". Стебли сельскохозяйственных культур семейства Роасеае применяли в качестве фуража для животных на протяжении тысячелетий. Эти стебли едят жвачные животные, в том числе крупный рогатый скот, овцы и козы, потому что жвачные животные могут переваривать целлюлозу и гемицеллюлозу. Также эти стебли содержат сахара в клетках запасающей паренхимы и иногда содержат меньшее количество гранул крахмала в клетках запасающей паренхимы.

[0004] Сахара из этих стеблей уже давно применяют для производства столового сахара и мелассы и уже давно ферментируют до этанола для получения питьевого этанола (например, рома) и топливного этанола. Также эти стебли часто силосуют путем опрыскивания их молочнокислыми бактериями, и данный способ позволяет сохранять стебли в течение периода до года в качестве корма для животных и делает стебли более легко перевариваемыми для жвачных животных.

[0005] Силосование практикуют в течение приблизительно 200 лет с тех пор, как было обнаружено (в Германии), что при нарезании трав и прессовании нарезанных трав с вытеснением воздуха нарезанные (засилосованные) травы не "портятся" (т.е. не пахнут уксусом). Даже сегодня силосование трав и других сельскохозяйственных культур семейства Роасеае включает вначале нарезание стеблей на мелкие кусочки длиной приблизительно 12-25 мм, затем опрыскивание микроорганизмами (в основном молочнокислыми бактериями), а затем прессование нарезанных стеблей для вытеснения воздуха.

[0006] Это является действенным только потому, что сахара могут диффундировать к поверхностям среза нарезанных стеблей, так что молочнокислые бактерии могут потреблять сахара. Большинство дрожжей и большинство молочнокислых бактерий не являются подвижными (они не могут двигаться сами по себе), поэтому сахар должен диффундировать к ним (эти микроорганизмы не могут плыть туда, где находятся сахара). Поскольку они не являются подвижными, и поскольку микроорганизмы не без труда проникают в стебли растений семейства Роасеае, стебли следует либо нарезать, либо раздробить, чтобы сахара могли диффундировать к микроорганизмам.

[0007] При опрыскивании микроорганизмами и ферментами нарезанных или раздробленных стеблей происходит только осаждение микроорганизмов и ферментов на внешних поверхностях стеблей. Трещины, которые образуются при нарезании или дроблении стеблей, содержат пузырьки воздуха, которые остаются зафиксированными в трещинах, предотвращая осаждение микроорганизмов и ферментов в трещинах при опрыскивании стеблей. Поскольку дрожжи и молочнокислые бактерии не являются подвижными, и поскольку диффузия ферментов и микроорганизмов является чрезвычайно медленной, то проникновение дрожжей, молочнокислых бактерий и ферментов в стебли является слабым.

[0008] В данной области техники существует потребность в решении этой проблемы неполного проникновения дрожжей, молочнокислых бактерий и особенно ферментов в стебли.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0009] Изобретение в некоторых вариациях предусматривает способ ферментации стеблей растений семейства Роасеае, при этом способ включает стадии:

[0010] (а) получения стеблей растений семейства Роасеае, где стебли имеют среднюю длину более 100 мм, и где стебли имеют среднее исходное содержание влаги от 25% до 80%;

[0011] (b) прессования стеблей между роликами, при этом стебли погружены в водный раствор реагентов, где с помощью роликов стебли спрессовывают на от 20% до 90% от их среднего диаметра, и где водный раствор реагентов содержит один или несколько ферментирующих организмов, выбранных из группы, состоящей из дрожжей, молочнокислых бактерий, уксуснокислых бактерий и их комбинаций;

[0012] (с) удаления стеблей из водного раствора реагентов, где в стеблях сохраняется по меньшей мере часть одного или нескольких ферментирующих организмов; и

[0013] (d) ферментации стеблей в течение периода ферментации с получением продуктов ферментации в стеблях.

[0014] В предпочтительных вариантах осуществления стебли выбраны из группы, состоящей из стеблей сахарного тростника, стеблей сорго и стеблей маиса.

[0015] В некоторых вариантах осуществления стебли имеют листья, прикрепленные к стеблям.

[0016] В некоторых вариантах осуществления стебли представлены в виде целого растения.

[0017] В предпочтительных вариантах осуществления ролики имеют тангенциальную скорость от 0,1 м/с до 10 м/с.

[0018] В предпочтительных вариантах осуществления водный раствор реагентов содержит ферменты, выбранные из группы, состоящей из пектинлиазы, амилазы, целлюлазы, глюкозооксидазы, гексозооксидазы, ксиланазы и их комбинаций.

[0019] В некоторых вариантах осуществления водный раствор реагентов содержит кислоты, выбранные из группы, состоящей из муравьиной кислоты, уксусной кислоты, молочной кислоты и их комбинаций.

[0020] В некоторых вариантах осуществления водный раствор реагентов содержит ионы железа, перекись водорода или их комбинацию.

[0021] В предпочтительных вариантах осуществления период ферментации составляет от 1 дня до 7 дней.

[0022] В предпочтительных вариантах осуществления дрожжи представляют собой штамм Saccharomyces cerevisiae.

[0023] В некоторых вариантах осуществления стебли дегидратируют в ходе латентной фазы ферментации на стадии (d).

[0024] В некоторых вариантах осуществления молочнокислые бактерии выбраны из группы, состоящей из Lactobacillus plantarum, Lactobacillus buchneri, Pediococcus pentosaceus, Pediococcus acidilactici, Propionibacterium freudenreichii и их комбинаций.

[0025] В предпочтительных вариантах осуществления способ дополнительно включает перемешивание водного раствора реагентов с применением энергии турбулентности от 0,15 Вт/кг до 5 Вт/кг.

[0026] В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает поддержание стеблей в анаэробной среде в течение периода силосования после завершения периода ферментации.

[0027] В некоторых вариантах осуществления период силосования составляет от одного дня до одного года.

[0028] В предпочтительных вариантах осуществления способ дополнительно включает извлечение продуктов ферментации путем дробления стеблей.

[0029] В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает извлечение продуктов ферментации путем выпаривания продуктов ферментации из стеблей.

[0030] В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает скармливание стеблей жвачным животным после стадии (d).

[0031] В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает применение стеблей в анаэробном сбраживании для получения метана после стадии (d).

[0032] В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает применение стеблей в ферментативном гидролизе для получения этанола из целлюлозы после стадии (d).

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

[0033] Фиг. 1 представляет собой схематический чертеж экспериментального устройства, применяемого в вариантах осуществления и примерах настоящего изобретения.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ВАРИАНТОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0034] Способы, процессы и системы по настоящему изобретению будут подробно описаны посредством ссылки на различные неограничивающие варианты осуществления и фиг. 1.

[0035] Данное описание позволит специалисту в данной области производить и применять настоящее изобретение, и в нем описано несколько вариантов осуществления, адаптации, вариаций, альтернатив и путей применения настоящего изобретения. Эти и другие варианты осуществления, особенности и преимущества настоящего изобретения станут более очевидными для специалистов в данной области при ссылке на следующее подробное описание настоящего изобретения в сочетании с прилагаемыми графическими материалами.

[0036] Применяемые в данном описании и прилагаемой формуле изобретения формы единственного числа включают ссылки на множественное число, если в контексте явно не указано иное. Если не определено иначе, все технические и научные термины, используемые в данном документе, имеют такое же значение, какое обычно понимает специалист в области техники, к которой принадлежит настоящее изобретение.

[0037] Если не указано иное, все числа, выражающие параметры, условия, результаты и т.д., используемые в описании и формуле изобретения, следует понимать как модифицированные во всех случаях термином "приблизительно". Соответственно, если не указано обратное, числа, изложенные в нижеследующем описании и прилагаемой формуле изобретения, являются приблизительными и могут варьировать в зависимости от конкретных алгоритмов и расчетов.

[0038] Термин "включающий", который является синонимом "включающего в себя", "содержащего" или "характеризуемого", является включающим или открытым и не исключает дополнительных, не упомянутых элементов или стадий способа. "Включающий" является термином из уровня техники, применяемым в стиле формулы изобретения, который означает, что названные элементы пункта формулы изобретения являются существенными, но могут быть добавлены другие элементы пункта формулы изобретения, которые по-прежнему образуют конструкцию в пределах объема пункта формулы изобретения.

[0039] Используемая в данном документе фраза "состоящий из" исключает любой элемент, стадию или ингредиент, не указанные в пункте формулы изобретения. Если фраза "состоит из" (или ее вариации) появляется в основной части пункта формулы изобретения, а не сразу после ограничительной части, она ограничивает только элемент, изложенный в этой части; другие элементы не исключаются из пункта формулы изобретения в целом. Используемая в данном документе фраза "состоящий главным образом из" ограничивает объем пункта формулы изобретения определенными элементами или стадиями способа, а также таковыми, которые существенно не влияют на основную(основные) и новую(новые) характеристику(характеристики) заявленного объекта изобретения.

[0040] Что касается терминов "включающий", "состоящий из" и "состоящий главным образом из", если в данном документе используется один из этих трех терминов, то раскрытый в данном документе и заявленный объект изобретения может предусматривать использование любого из двух других терминов. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления, не упомянутых в явном виде в иных случаях, любой пример термина "содержащий" может быть заменен на "состоящий из" или, альтернативно, на "состоящий главным образом из".

[0041] Никакие варианты осуществления, описанные в данном документе, не должны ограничиваться какой-либо теорией или предположениями относительно механизмов реакции, механизмов массообмена или описаниями исходного сырья или продуктов.

[0042] Настоящее изобретение основано на техническом решении проблемы, заключающейся в том, что получение продуктов ферментации из богатой сахаром растительной паренхиматозной ткани является дорогостоящим ввиду большого количества энергии и капитала, необходимых для эффективного дробления стеблей растений семейства Роасеае для экстракции сахаров. Настоящее изобретение также основано на техническом решении проблемы разложения стеблей растений семейства Роасеае после сбора урожая и перед переработкой или потреблением.

[0043] Используемые в данном документе выражения "прессовать", "спрессованный", "осуществление прессования" и "прессование" означают, что средний диаметр стеблей уменьшают на 20%-90%. Используемые в данном документе выражения "дробить", "раздробленный" и "дробление" означают, что средний диаметр стеблей уменьшают более чем на 90%.

[0044] В настоящем изобретении применяют технический подход прессования стеблей на от 20% до 90% от их среднего диаметра, при этом стебли погружены в раствор реагентов, содержащий один или несколько ферментирующих организмов. При таком прессовании стебли разламываются без существенной потери сахаров, и раствор реагентов втягивается в образующиеся трещины в паренхиматозной ткани. Сахара диффундируют из клеток паренхимы, вступают в контакт с ферментирующими организмами, находящимися в трещинах, и в стеблях образуется этанол и/или молочная кислота. Этанол и/или молочная кислота консервируют стебли для последующей экстракции этанола и/или потребления жвачными животными в качестве фуража. В некоторых вариантах ферменты в растворе реагентов разлагают и отделяют стенки клеток паренхимы для низкоэнергетического дробления с экстракцией этанола или сахаров.

[0045] Принципы настоящего изобретения демонстрируются в примерах в данном документе.

[0046] Низкий уровень рН в результате ферментации сахаров в сельскохозяйственных культурах молочнокислыми бактериями предотвращает рост других организмов, вызывающих порчу. Хранение сельскохозяйственных культур в анаэробных условиях предотвращает потребление этанола уксуснокислыми бактериями и выработку уксусной кислоты (уксуса). Поскольку уксуснокислые бактерии обладают высокой подвижностью, они могут потреблять весь этанол в засилосованных стеблях, если среду не поддерживать в анаэробных условиях (без кислорода).

[0047] В настоящее время считается, что низкий уровень рН, обусловленный деятельностью молочнокислых бактерий, также вызывает некоторый тип слабокислотного гидролиза гемицеллюлозы в стеблях, который улучшает перевариваемость стеблей. Обычно слабокислотный гидролиз проходит в течение нескольких часов при рН 2,0 или ниже, но при рН 4,0 в силосе этот слабокислотный гидролиз проходит в течение нескольких недель или месяцев. Данные, подтверждающие слабокислотный гидролиз в силосе, описаны в Henk, Linda L., and James С.Linden, "Solid-state production of ethanol from sorghum". Applied biochemistry and biotechnology 57.1 (1996): 489-501, которая настоящим включена посредством ссылки в данный документ. Henk отмечает (на стр. 491, внутренние цитаты опущены): "Наши данные показывают, что силосование представляет собой форму слабокислотного гидролиза. Силосование улучшало реакционную способность лигноцеллюлозных волокон к ферментативному гидролизу".

[0048] Специалисты в данной области поймут, что для силосования сельскохозяйственных культур обычно применяют многие микроорганизмы и ферменты, в том числе дрожжи, молочнокислые бактерии, гемицеллюлазу, целлюлазу и глюкозооксидазу. Это описано в Kung, L, "Silage fermentation and additives", Proceedings of Alltech's Seventeenth Annual Symposium. 2001, которая настоящим включена посредством ссылки в данный документ.Также это описано в Charley, Robert С., РСТ-заявка на патент № РСТ/СА 2010/001729, которая настоящим включена посредством ссылки в данный документ.

[0049] Специалисты в данной области и те, кто хорошо знаком со свежесобранным сахарным тростником, сорго и маисом, признают, что свежесобранные стебли этих сельскохозяйственных культур являются довольно хрупкими. Если обычный человек наступает пяткой на стебель, лежащий на земле, он почувствует его треск, и, глядя на спрессованный стебель, он увидит большую трещину, несколько меньших трещин и большое количество еще более мелких трещин, все из каковых трещин проходят в осевом направлении. Он также увидит, что после простого наступания на стебель пяткой из стебля выжимается немного сока. Он также признает, что согнутый стебель внезапно сломается с щелчком (хрупким разрушением) - как при известном дефекте "обламывания стеблей" в сельскохозяйственных культурах кукурузы. В настоящем изобретении используется преимущество хрупкой природы свежесобранных стеблей для распространения трещин в стеблях при очень малой энергии.

[0050] Клетки запасающей паренхимы в стеблях растений семейства Роасеае представляют собой тонкостенные полиэдральные клетки размером примерно 360 микронов в длину и 60 микронов в диаметре с толщиной стенки приблизительно 2 микрона. Это описано более подробно в Dong, "A nitrogen-fixing endophyte of sugarcane stems (a new role for the apoplast)", Plant Physiology 105.4 (1994): 1139-1147, которая настоящим включена посредством ссылки в данный документ.

[0051] В частности, Dong демонстрирует на фиг. 2, изображениях С и G, что клетки паренхимы сахарного тростника выровнены в осевом направлении, но не выровнены в радиальном направлении. Именно поэтому вода течет по апопласту в осевом направлении (ограниченном длиной междоузлия), но не течет по апопласту в радиальном или в боковом направлениях. Аналогично выровнены клетки паренхимы стеблей других растений семейства Роасеае. Стебли сахарного тростника и других растений семейства Роасеае легко разламываются в осевом направлении, потому что стенки клеток паренхимы образуют плоскости разлома в осевом направлении. Стебли растений семейства Роасеае трудно разрезать в радиальном направлении, потому что клеточные стенки не выровнены в радиальном направлении, что вынуждает проводить разрезание через клеточные стенки. Напротив, стебли растений семейства Роасеае не требуют большого количества энергии для разделения или раскалывания в осевом направлении.

[0052] Стебли растений семейства Роасеае легко раскалываются при прессовании в радиальном направлении. Результаты раскалывания стеблей сахарного тростника, а также конечно-элементная модель раскалывания содержатся в Skantz, J., and S.A. Domanti, "Experiments into the constitutive behaviour of sugarcane billets". PROCEEDINGS-AUSTRALIAN SOCIETY OF SUGAR CANE TECHNOLOGISTS. WATSON FERGUSON AND COMPANY, 1998, которая настоящим включена посредством ссылки в данный документ. Не желая быть связанными какой-либо конкретной теорией, полагают, что начальное радиальное прессование приводит к образованию одной большой трещины, последующее прессование приводит к образованию двух меньших трещин, последующее прессование дает четыре еще более мелкие трещины и т.д.

[0053] Стебли растений семейства Роасеае, которые раскалываются при прессовании, быстро возвращаются к округлой форме при устранении усилия в отношении стебля. Волокна стеблей обладают высокой прочностью на растяжение и служат для восстановления округлой формы стебля при устранении усилия в отношении стебля, хоть и с трещинами в паренхиматозной ткани стебля.

[0054] Сок в клетках паренхимы стеблей растений семейства Роасеае обычно содержит от 2% до 20% гексозных сахаров, состоящих в основном из сахарозы, глюкозы и фруктозы. Паренхиматозная ткань также часто содержит гранулы крахмала. Сухое вещество этих стеблей после выжимания сока часто называют багассой. Багасса обычно содержит примерно 35% целлюлозы, 25% гемицеллюлозы и 22% лигнина. Гемицеллюлоза обычно состоит из приблизительно 85% ксилозы, 13% глюкозы и 2% арабинозы. Целлюлоза, гемицеллюлоза и лигнин часто прочно связаны друг с другом, что предотвращает доступ ферментов для гидролиза целлюлозы и гемицеллюлозы. Силосование (превращение свободных сахаров в молочную кислоту) представляет собой форму слабокислотного гидролиза, при котором гемицеллюлоза подвергается гидролизу, что делает целлюлозу более доступной для ферментов при переваривании жвачным животным, анаэробном сбраживании или ферментативном гидролизе.

[0055] Содержание крахмала в стеблях сахарного сорго описано в Zhao, Ya Li et al. "Changes in stem composition and harvested produce of sweet sorghum during the period from maturity to a sequence of delayed harvest dates", Biomass and Bioenergy 39 (2012): 261-273, которая настоящим включена посредством ссылки в данный документ. Zhao демонстрирует в таблице 2, что приблизительно 10,1% от веса стеблей составляют сахара и 3,6% от их веса - крахмал. Если бы крахмал выдавливался в соке, то приблизительно 4,3% от веса сока составлял бы крахмал, но исследования демонстрируют, что крахмал составляет только приблизительно 0,1% от веса сока (1000 мг/л). Не желая быть связанными какой-либо конкретной теорией, полагают, что при выжимании сока большая часть крахмала остается в стеблях вследствие фильтрации гранул крахмала, происходящей, когда стебли находятся под сверхвысоким давлением.

[0056] Содержание крахмала в соке сахарного тростника и сахарного сорго описано в Alves, Fernanda Viginotti et al. "Structural and physicochemical characteristics of starch from sugar cane and sweet sorghum stalks", Carbohydrate polymers 111 (2014): 592-597, которая настоящим включена посредством ссылки в данный документ. Alves демонстрирует, что сок сахарного тростника содержит приблизительно 356 мг/л крахмала, а сок сахарного сорго содержит приблизительно 1147 мг/л крахмала. Это означает, что стебли сахарного тростника содержат приблизительно одну треть от количества крахмала, содержащегося в стеблях сахарного сорго, и поэтому приблизительно 1% от веса стебля сахарного тростника составляет крахмал.

[0057] Содержание сахара в тропических гибридах маиса описано в White, Wendy G. et al. "The sugar, biomass and biofuel potential of temperate by tropical maize hybrids", GCB Bioenergy 4.5 (2012): 496-508, которая настоящим включена посредством ссылки в данный документ. White демонстрирует, что из среднеширотных и тропических гибридов маиса (Zea mays) получают как зерно, так и ферментируемые сахара стеблей.

[0058] Многие ферментирующие организмы могут напрямую превращать глюкозу, фруктозу, мальтозу (димер глюкозы) и сахарозу (димер глюкозы и фруктозы) в этанол и молочную кислоту. В данном документе мономеры и димеры глюкозы и фруктозы будут называться сахарами, ферментирующие организмы, которые превращают сахара в этанол, будут называться дрожжами, а ферментирующие организмы, которые превращают сахара в молочную кислоту, будут называться молочнокислыми бактериями. Ферментирующие организмы, которые превращают сахара в этанол, могут быть эукариотическими, одноклеточными организмами или могут быть бактериями. Ферментирующие организмы, которые превращают сахара в молочную кислоту, могут быть эукариотическими, одноклеточными организмами или могут быть бактериями.

[0059] Многие ферментирующие организмы превращают сахара в этанол. Наиболее широко применяемыми ферментирующими организмами, вырабатывающими этанол, являются штаммы пивоваренных дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Этанол имеет значительную экономическую ценность в напитках, транспортном топливе и в качестве предшественника для других органических соединений.

[0060] Другие ферментирующие организмы превращают сахара в молочную кислоту. Они известны как молочнокислые бактерии, и наиболее распространенным штаммом является Lactobacillus plantarum. Молочная кислота снижает рН ферментируемого материала до приблизительно 4,2, при котором ингибируется рост большинства других бактерий и грибов. Это обычно применяют, чтобы сохранить продукты, такие как йогурт и квашеная капуста. Также это обычно применяют для сохранения сельскохозяйственных культур для последующего применения в качестве корма для животных (фуража), что известно как "силосование".

[0061] Некоторые организмы превращают этанол в уксусную кислоту (уксус) в присутствии кислорода (в аэробной среде). Наиболее распространенным штаммом является Acetobacter aceti.

[0062] 0,5% раствор муравьиной кислоты является селективным ингибитором молочнокислых бактерий, а также других загрязняющих бактерий, но не ингибирует дрожжи. Это описано в Schmidt, J. et al. "Preservation of sugar content in ensiled sweet sorghum", Bioresource Technology 60.1 (1997): 9-13, которая настоящим включена посредством ссылки в данный документ. Значительную процентную долю муравьиной кислоты, производимой во всем мире, применяют для силосования корма для животных.

[0063] Ингибирование Saccharomyces cerevisiae молочной кислотой и уксусной кислотой описано в Narendranath, N.V., К.С. Thomas, and W.М. Ingledew, "Effects of acetic acid and lactic acid on the growth of Saccharomyces cerevisiae in a minimal medium". Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology 26.3 (2001): 171-177, которая настоящим включена посредством ссылки в данный документ. Narendranath отмечает: "В тех случаях, когда в среде присутствовала молочная кислота в концентрации 0,5% вес/объем, присутствие уксусной кислоты (которая не вызывала значительного изменения скорости роста дрожжей в случаях, когда она присутствовала в отдельности) в концентрации даже 0,04% вес/объем вызывало значительное снижение скорости роста S. cerevisiae".

[0064] Точка кипения этанола составляет 78°С, точка кипения молочной кислоты составляет 122°С, и точка кипения уксусной кислоты составляет 118°С. Это делает возможным недорогостоящее отделение этанола от растворов, содержащих молочную кислоту и уксусную кислоту, путем применения перегонного куба (иногда называемого аламбиком). Однако точка кипения муравьиной кислоты составляет 100,8°С, что затрудняет разделение смеси этанола и муравьиной кислоты с применением перегонного куба. Также с помощью ферментирующих организмов и некоторых ферментов в ограниченных количествах получают метанол, и он имеет точку кипения 65°С. Так как он кипит при более низкой температуре, чем этанол, его можно удалить с применением перегонного куба, слив первоначальные несколько процентов дистиллята (называемые головной фракцией). Как муравьиная кислота, так и метанол являются токсичными для человека, поэтому, если спирт для алкогольных напитков получают из ферментированных стеблей, муравьиную кислоту не следует применять для силосования стеблей.

[0065] Существуют хорошо известные методики ферментации сахаров в стеблях растений семейства Роасеае до этанола. Стебли обычно дробят между рядом роликов для экстракции сока в результате разрыва клеток паренхимы, а затем сок отделяют от остаточных твердых веществ и ферментируют. Поскольку клетки паренхимы довольно малы, требуется много энергии, чтобы их раздробить. Почти 35% капитальных и эксплуатационных расходов в производстве сахара из стеблей обусловлены расходами на дробление. Экономическая составляющая дробления сахарного тростника описана более подробно в Gbaboa, "Comparative study on cane cutter/juice expeller and roller model Sugarcane juice extraction systems", INT J CURR SCI 2013, 7: E 55-60, которая настоящим включена посредством ссылки в данный документ.

[0066] Иногда применяют твердофазную ферментацию для ферментации стеблей растений семейства Роасеае, разрезая стебли на мелкие кусочки (или измельчая стебли), опрыскивая их дрожжами и оставляя их для ферментации. Дрожжи прилипают к свежеобнаженной паренхиматозной ткани, а сахара изнутри нарезанных кусочков (или измельченных стеблей) диффундируют к дрожжам, которые ферментируют сахара до этанола. В этом случае механизм такой же, как и при силосовании, но вместо молочнокислых бактерий применяют дрожжи. Недостаток этого типа твердофазной ферментации заключается в том, что для пастеризации стеблей перед ферментацией требуется много энергии. Другим недостатком этой методики является большое количество энергии, необходимой для разрезания или измельчения стеблей. Другим недостатком этой методики является то, что он не позволяет осуществлять реакцию содержимого внутренней части стеблей с ферментами вследствие очень медленной диффузии ферментов. Другим недостатком является то, что нарезанные или измельченные стебли имеют значительно меньшую объемную плотность, чем целые стебли или заготовки.

[0067] Одним из примеров этого является способ EX-FERM, описанный в патенте США №4560659, выданном Asturias 24 декабря 1985 г., который настоящим включен посредством ссылки в данный документ. Способ EX-FERM предусматривает нарезание сахарного тростника на кусочки со средним размером частиц в диаметре от 0,25 см до 4,0 см, смешивание с дрожжами и водой и ферментацию. Ферментированный раствор затем повторно применяют в последующих процессах ферментации для увеличения концентрации этанола перед дистилляцией.

[0068] Другой тип твердофазной ферментации описан в Bryan, William L., "Solid-state fermentation of sugars in sweet sorghum", Enzyme and Microbial Technology 12.6 (1990): 437-442, которая настоящим включена посредством ссылки в данный документ.В этой методике стебли разрезают до длины 0,6 см или измельчают стебли. Почти 80% сахара в стеблях ферментируют до этанола. Однако получают большие количества молочной кислоты и уксусной кислоты, поскольку стебли перед ферментацией не пастеризовали.

[0069] Аналогичный тип твердофазной ферментации описан в Henk, Linda L., and James С. Linden, "Solid-state production of ethanol from sorghum", Applied biochemistry and biotechnology 57.1 (1996): 489-501, которая настоящим включена посредством ссылки в данный документ. В этой методике применяют косилку-измельчитель для нарезания как стеблей, так и листьев в поле, опрыскивают нарезанные кормовые растения дрожжами и ферментами, а затем оставляют для ферментации. Недостатком является то, что для экстракции этанола необходима противоточная экстракция, которая является более капиталоемким способом, чем дробление стеблей. Henk отмечает (на стр. 500): "Этанолсодержащий сорговый силос стабилен в течение периода по меньшей мере 230 дней, что потенциально позволяет получать недорогостоящее исходное сырье для непрерывного получения этанола на годовой основе".

[0070] Другая методика ферментации сахаров в стеблях растений семейства Роасеае до этанола описана в патенте США №9499839, выданном Hamrick 22 ноября 2016 г., который настоящим включен посредством ссылки в данный документ и который имеет того же заявителя, что и настоящая заявка. В этой методике применяют вакуум для введения дрожжей и ферментов в апопласт богатых углеводами сельскохозяйственных культур, в том числе сахарного тростника и сахарного сорго; отведение жидкости от сельскохозяйственных культур со всех сторон, а затем ферментацию в апопласте.

[0071] Стебли растений семейства Роасеае могут перевариваться жвачными животными после силосования. Henk утверждает, что эта улучшенная перевариваемость обусловлена слабокислотным гидролизом гемицеллюлозы. Перевариваемость сахарного сорго описана в Di Marco, О.N. et al. "Digestibility of forage silages from grain, sweet and bmr sorghum types: Comparison of in vivo, in situ and in vitro data", Animal Feed Science and Technology 153.3 (2009): 161-168, которая настоящим включена посредством ссылки в данный документ.Перевариваемость сахарного тростника описана в Kawashima, Т. et al. "Feeding value of sugarcane stalk for cattle", ASIAN AUSTRALASIAN JOURNAL OF ANIMAL SCIENCES 15.1 (2002): 55-60, которая настоящим включена посредством ссылки в данный документ.

Перевариваемость стеблей кукурузной соломы описана в Tolera, Adugna, and Frik Sundst∅l, "Morphological fractions of maize stover harvested at different stages of grain maturity and nutritive value of different fractions of the stover", Animal Feed Science and Technology 81.1 (1999): 1-16, которая настоящим включена посредством ссылки в данный документ.

[0072] Перевариваемость и питательная ценность засилосованных трав описаны в Jaakkola, Seija, Pekka Huhtanen, and К. Hissa, "The effect of cell wall degrading enzymes or formic acid on fermentation quality and on digestion of grass silage by cattle", Grass and Forage Science 46.1 (1991): 75-87, которая настоящим включена посредством ссылки в данный документ. Jaakkola делает вывод, что в случае, если тимофеевка луговая (Phleum pretense, растение семейства Роасеае) содержит недостаточно сахаров для силосования с помощью молочнокислых бактерий, то силосование с помощью муравьиной кислоты является более действенным, чем силосование с помощью ферментов целлюлазы и гемицеллюлазы.

[0073] Большинство ферментирующих организмов окисляют сахара до диоксида углерода и воды в аэробной среде (в присутствии кислорода). Один моль глюкозы или фруктозы (С₆Н₁₂О₆) (или 0,5 моля сахарозы или мальтозы) и шесть молей кислорода (О₂) окисляются до шести молей диоксида углерода (СО₂) и шести молей воды (Н₂О). Этот механизм обеспечивает быстрое удаление кислорода из среды при ферментации.

[0074] Дрожжи ферментируют сахара до этанола в анаэробной среде (без кислорода). Один моль глюкозы или фруктозы (или 0,5 моля сахарозы или мальтозы) ферментируется до 2 молей этанола и 2 молей диоксида углерода с выделением 118 кДж тепла. Это означает, что ферментация 18% раствора сахара приведет к повышению температуры до 34°С, что означает необходимость охлаждения ферментационной среды. При ферментации 1 литра 18% раствора сахара (1 моль глюкозы) также будут получать 2 моля диоксида углерода, который имеет объем приблизительно 48 литров при 20°С и атмосферном давлении. Типичные дрожжи осуществляют ферментацию наиболее эффективно при от 20°С до 40°С, однако обладают значительной ферментативной активностью вплоть до 5°С (белое вино ферментируется при от 7°С до 15°С). Дрожжевые клетки постепенно погибают при температурах выше 42°С. Saccharomyces cerevisiae относительно нечувствителен к рН и будет осуществлять ферментацию в диапазоне рН от 2,9 до 7,2. Это описано более подробно в , "Effects of temperature, рН and sugar concentration on the growth parameters of Saccharomyces cerevisiae, S. kudriavzevii and their interspecific hybrid", International journal offood microbiology 131.2 (2009): 120-127, которая настоящим включена посредством ссылки в данный документ.

[0075] Молочнокислые бактерии ферментируют сахара до молочной кислоты как в аэробной, так и в анаэробной среде в зависимости от типа молочнокислых бактерий. При гомоферментативной молочнокислой ферментации один моль глюкозы или фруктозы (С₆Н₁₂О₆) (или 0,5 моля сахарозы или мальтозы) ферментируется до двух молей молочной кислоты (С₃Н₆О₃). При гетероферментативной молочнокислой ферментации один моль глюкозы или фруктозы (С₆Н₁₂О₆) (или 0,5 моль сахарозы или мальтозы) ферментируется до одного моля молочной кислоты (С₃Н₆О₃), одного моля этанола (С₂Н₆О) и одного моля диоксида углерода (СО₂). Lactobacillus plantarum растет при от 15°С до 40°С как в аэробных, так и в анаэробных средах. В аэробных средах Lactobacillus plantarum использует в процессе дыхания кислород, и этот потребляемый кислород приводит к образованию перекиси водорода (Н₂О₂), которая ингибирует рост других организмов.

[0076] Большинство штаммов Saccharomyces cerevisiae имеют диаметр примерно 10 микронов. Штамм Saccharomyces cerevisiae с размером клетки примерно 5 микронов представляет собой Thermosacc^® Dry, доступный от Lallemand Biofuels & Distilled Spirits, Дулут, Джорджия, США. Он вырабатывает этанол в концентрациях до 20% по объему (16% по весу), поэтому богатые сахаром сельскохозяйственные культуры с содержанием сахара до 32% по весу можно ферментировать с помощью этих дрожжей. Это означает, что сельскохозяйственная культура или экстрагированный сок можно дегидратировать перед ферментацией, чтобы в результате получить более высокую концентрацию этанола. Дрожжевая ферментация может занимать от 1 часа до 8 часов до получения значительного количества этанола и диоксида углерода. Этот период обычно называют латентной фазой ферментации. Путем дегидратации в ходе латентной фазы ферментации можно увеличить конечную концентрацию этанола.

[0077] Большинство штаммов Lactobacillus plantarum являются палочковидными с диаметром приблизительно 0,5-1,2 микрона и длиной 1-10 микронов. Одним из источников Lactobacillus plantarum является инокулянт для силоса BIOTAL^® II, доступный от Lallemand Animal Nutrition, Милуоки, Висконсин, США. Lactobacillus plantarum часто применяют с другими бактериями и ферментами для обработки силоса. Это описано в патенте США №5433074, выданном Evans et al. 11 июля 1995 г., который настоящим включен посредством ссылки в данный документ. Доступные в настоящее время составы для силосования от Lallemand Animal Nutrition содержат смеси Lactobacillus plantarum с Lactobacillus buchneri, Pediococcus pentosaceus, Pediococcus acidilactici и Propionibacterium freudenreichii.

[0078] Ферментирующие организмы являются настолько крупными, что они не перемещаются путем диффузии в течение своей жизни. Однако, газы и сахара диффундируют легко и легко диффундируют через стенки клеток паренхимы, а ферменты диффундируют через жидкости снаружи клеток паренхимы. Коэффициент диффузии диоксида углерода составляет 2,5×10^-9 м²/с, что означает, что он диффундирует на 1 мм приблизительно за 7 минут и на 10 мм приблизительно за 11 часов. Коэффициент диффузии сахарозы составляет 7,1×10^-10 м²/с, что означает, что она диффундирует на 1 мм приблизительно за 17 минут и на 10 мм приблизительно за 39 часов. Коэффициент диффузии пектинлиазы составляет 8,0×10^-11 м²/с, что означает, что она диффундирует на 1 мм приблизительно за 3,5 часа и на 10 мм приблизительно за 14 дней.

[0079] Дрожжевые клетки прилипают к поверхностям (таким как клетки паренхимы) в присутствии сахаров. Это описано в Verstrepen and Klis, "Flocculation, adhesion and biofilm formation in yeasts", Molecular microbiology 60.1 (2006): 5-15, которая настоящим включена посредством ссылки в данный документ. Аналогично, молочнокислые бактерии также прилипают к поверхн