Средство для лечения состояний человеческого организма, связанных с уменьшением уровня экспрессии гена il-11 и/или уменьшением количества белка интерлейкина-11 на основе генно-терапевтических субстанций с геном il-11, способ получения и использования

Средство для лечения состояний человеческого организма, связанных с уменьшением уровня экспрессии гена il-11 и/или уменьшением количества белка интерлейкина-11 на основе генно-терапевтических субстанций с геном il-11, способ получения и использования

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область, к которой относится изобретение

Изобретение относится к молекулярной биологии, биотехнологии, генной инженерии и медицине и может быть использовано для коррекции патологических состояний клеток различных органов и тканей, а также собственно органов и тканей человека, связанных с уменьшением уровня экспрессии гена IL-11 и/или уменьшением количества белка интерлейкина-11, в частности, в терапевтических целях.

Предшествующий уровень.

В организме человека присутствуют низкомолекулярные белки цитокины, которые продуцируются почти всеми эукариотическими клетками. Они осуществляют свое биологическое действие через взаимодействие со специфическими клеточными поверхностными рецепторами, которые экспрессируются в небольших количествах на соответствующих клетках. Они регулируют активацию, дифференцировку и пролиферацию иммунных и неиммунных клеток. Цитокины участвуют в опосредовании как воспалительных, так и иммунных реакций и являются критическими элементами в ответе органов и тканей человека на повреждение или инфекционно-вирусное поражение. К цитокинам относятся такие медиаторы как интерлейкины, хемокины, колониестимулирующие факторы, факторы роста, интерфероны, супрессорные факторы и другие.

Интерлейкины продуцируются различными клетками организма и являются факторами взаимодействия между клетками всех органов и систем. Во многих случаях они проявляют себя как факторы аутокринной регуляции. В настоящее время известны гены и установлены аминокислотные последовательности более двух десятков интерлейкинов, играющих важную роль в формировании противоопухолевой защиты. При любом опухолевом росте имеются нарушения в системе интерлейкинов, которые проявляются дисбалансом продукции и регуляции этих биологически активных веществ, а также изменением экспрессии соответствующих рецепторов.

Белок интерлейкин-11 (ген IL-11) первоначально был выявлен в клетках стромы костного мозга мышей. Затем кДНК человека была клонирована из линии фибробластов и определена в нормальной коже человека. Данный белок стимулирует развитие В-клеток, зависимое от Т-клеток и синергичен с интерлейкином-3 в поддержании формирования колоний мегакариоцитов мыши. Лимфопоэтический и гемопоэтический цитокин интерлейкин-11 стимулирует синтез белков острой фазы воспаления, идентичен с фактором, ингибирующим адипогенез мышей, модулирует функции макрофагов и Т-хелперов типа 1 в клеточной культуре, показывает противовоспалительную активность в моделях на животных (Иммунодерматология, 2008, №1: 41-55).

Интерлейкин-11 - многофункциональный цитокин, вырабатывается преимущественно клетками стромы (фибробластами) костного мозга и лимфоидных органов, стимулирует пролиферацию ранних стволовых клеток и дифференцированных клеток-предшественниц из разных источников, включая кровь и костный мозг. Интерлейкин-11 вызывает выраженную стимуляцию тромбоцитопоэза путем индукции пролиферации, дифференцировки и созревания мегакариоцитов. Действуя на клетки костного мозга и клетки печени эмбрионов, интерлейкин-11 совместно с другими цитокинами может стимулировать различные стадии эритропоэза.

Также интерлейкин-11 является провоспалительным интерлейкином, поскольку регулирует функции Т- и В-лимфоцитов, принимает участие в индукции активности ряда киллерных клеток, является аутокринным фактором для пролиферации мегакариоцитов. Подобно IL-1 и IL-6 принимает участие в индукции синтеза белков острой фазы. Роль IL-11 при опухолевом росте изучена слабо.

У женщин имеется маточный интерлейкин-11, который синтезируется железистым эпителием эндометрия и децидуализированными стромальными клетками преимущественно во время рецептивного периода, когда матка восприимчива к имплантации бластоцисты. У женщин с идиопатическим бесплодием в эндометрии наблюдается снижение взаимодействия эпителиального интерлейкина-11 с его рецепторами по сравнению с контролем. Существует положительная корреляция между уровнем интерлейкина-11 в промывочных водах матки, собранных в период ожидаемой имплантации, и ответной реакцией женщин на стимуляцию яичников при подготовке к ЭКО. Данный факт свидетельствует, что низкий уровень интерлейкина-11 может быть причиной снижения вероятности имплантации эмбриона. Эти исследования показывают, что интерлейкин-11, секретируемый эпителием матки в маточную полость, обеспечивает прикрепление и имплантацию бластоцисты. Таким образом, недостаточная активация рецептора интерлейкина-11 в матке в течение рецептивного периода, связанная с низким количеством этого белка или с невысокой активностью гена IL-11, может блокировать прикрепление и нормальную имплантацию бластоцисты, в результате чего беременность не наступает.(Молекулярный биология, 2011, том 45, №1, с. 44-55).

В заявке US 20130109583 А1 (Piraye Yurttas Beim, 02.05.2013) описана связь рецептора IL11 с бесплодием. Также проведены исследования, которые выявили уменьшение интерлейкина-11 в маточном смыве у женщин с эндометриозом по сравнению с женщинами без данного заболевания (Известны способы получения рекомбинантной плазмидной ДНК, содержащей IL-11 человека в клетках E.coli или дрожжей Pichia pastoris, которые основаны на изолировании мРНК IL-11 из клеток тканей человека, получении кДНК методом обратно-транскриптазной ПЦР с последующим клонированием в экспрессирующий вектор [Paul S.R. et al. Molecular cloning of a cDNA encoding interleukin 11, a stromal cell-derived lymphopoietic and hematopoietic cytokine. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1990. 87 (19): p.7512-7563; Morris J.C. et al. Molecular cloning and characterization of murine interleukin-11. Exp. Hematol, 1996. 24 (12): p.1369-1376; Wang T.Y. et al. Expression of the Recombinant Human Interleukin-11 in Pichia pastoris. Sheng Wu Hua Xue Yu, Sheng Wu Wu Li Xue Bao (Shanghai), 2001. 33 (6): р.659-664]. Недостатком известных методов является невозможность получения целевого белка, в полной мере сохраняющего биологическую активность.

В патенте США №5215895 (1993) описан способ получения синтетического гена IL-11 для последующей экспрессии в клетках E.coli с использованием для экспрессии отдельных фрагментов полноразмерного гена. Однако полного сохранения биологической активности у рекомбинантного продукта не достигается.

Известен способ получения белка слияния тиоредоксин/интерлейкин-11 с помощью трансформированных штаммов E.coli с последующим расщеплением белка слияния и выходом целевого белка интерлейкина-11 с сохраненной биологической активностью цитокинов (пат. США 6143524, 2000). Также в патенте RU 2426787 описаны рекомбинантная плазмидная ДНК pET32M/mTrx-rh/L-11, созданная на основе модифицированного вектора рЕТ32М и содержащая синтетический ген интерлейкина-11 человека, слитый с геном мутантного тиоредоксина mTrx, способ ее получения и штамм E.coli BL21(DE3)/pET32M/mTrx-rhIL-11, трансформированного рекомбинантной плазмидной и продуцирующий интерлейкин-11 человека в растворимой форме составе слитного белка mTrx-rh/L-11. Изобретение предполагает использование высокоэффективного метода металлохелатной хроматографии для выделения слитного белка и очистки конечного продукта интерлейкина-11. Недостатком данного подхода является высокая стоимость получения чистого рекомбинантного белка.

За прототип авторами была принята заявка WO 1996018372 А2, в которой говорится о применении белка интерлейкина 11 и полинуклеотидов, кодирующих этот белок в терапии инсультов и нейропатии, а также - для выявления соединений-агонистов (лигандов), полезных при терапии. В частности, в заявке говорится о полинуклеотиде, который кодирует белок интерлейкина-11, для изготовления лекарственного средства для лечения инсульта или невропатии, а также - для генной терапии. Такая генная терапия включает введение полинуклеотидной последовательности гена IL-11 в соматические клетки методами генной инженерии для замены дефектного гена IL-11, или для повышения производства белка интерлейкина-11 при таком заболевании, как инсульт. Эти полинуклеотиды содержат нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид, который имеет по меньшей мере 95% идентичности с аминокислотной последовательностью нативного белка интерлейкина-11. В предпочтительном варианте реализации изобретения полинуклеотид включает нативную полинуклеотидную последовательность, кодирующую природный белок гена IL-11. Полинуклеотид может содержать некодирующие 5' и 3' последовательности - транскрибируемые, но нетранслируемые последовательности, сигналы сплайсинга и полиаденилировани, сайты связывания рибосом и последовательности, которые стабилизируют мРНК. Другие варианты осуществления настоящего изобретения включают в себя полинуклеотиды, кодирующие варианты полипептида, в котором аминокислотные остатки замещены, удалены или добавлены, в любой комбинации (например, от 5-го до 10-го, от 1-го до 5-го, от 1-го до 3-го и т.д.).

Полинуклеотиды по настоящему изобретению могут быть получены с использованием стандартных методов клонирования, используя библиотеки кДНК, геномные библиотеки ДНК, или могут быть синтезированы с использованием хорошо известных технологий. В частности, описано, что полинуклеотид с кодирующей последовательностью белка интерлейкина-11 может быть встроен для экспрессии в реплицирующемся дефектном ретровирусном векторе. Полученная конструкция может быть введена в клетку, трансдуцированную ретровирусным плазмидным вектором, содержащим РНК, которая кодирует полипептид по настоящему изобретению, таким образом, что клетка продуцирует инфекционные вирусные частицы, содержащие интересующий ген. Эти клетки-продуценты могут быть введены пациенту для экспрессии гена и получения полипептида in vivo.

Недостатком данного подхода является то, что при создании генно-терапевтического средства в этом изобретении применены методы, которые приводят к делециям, заменам, вставкам аминокислот целевого белка интерлейкина-11, что может приводить к изменению его структуры и свойств, а также не учитываются индивидуальные характеристики пациента, в связи с которыми может понадобиться группа вариаций для данного средства.

Раскрытие изобретения

Задачей данного изобретения является создание высокоэффективного средства для лечения состояний человеческого организма, связанных с уменьшением уровня экспрессии гена IL-11 и/или уменьшением количества белка интерлейкина-11 на основе генно-терапевтических субстанций с геном IL-11, представляющего собой группу генно-терапевтических субстанций, при использовании которых с учетом индивидуальных особенностей пациента, происходит повышение уровня экспрессии гена IL-11 и/или повышение количества белка интерлейкина-11, в клетках органов и тканей и/или органах и тканях организма.

Указанная задача решается за счет того, что создано средство для лечения состояний человеческого организма, связанных с уменьшением экспрессии гена IL-11 и/или уменьшением количества белка интерлейкина-11 на основе генно-терапевтических субстанций с геном IL-11, представляющее собой, по крайней мере, одну генно-терапевтическую субстанцию, выбранную из группы генно-терапевтических субстанций, каждая из которых представляет генетическую конструкцию на основе векторной плазмиды, включающей кДНК гена IL-11, с кодирующей последовательностью белка интерлейкина-11, с делециями 5' и 3'- нетранслируемых областей, а именно, полученной на основе участка нативной немодифицированной кДНК гена IL-11 SEQ ID No:1 или участка нативной немодифицированной кДНК гена IL-11 SEQ ID No:2, или модифицированной кДНК гена IL-11, при этом в качестве модифицированной кДНК гена IL-11 используют SEQ ID No:3, или SEQ ID No:4, или SEQ ID No:5, или SEQ ID No:6, или SEQ ID No:7, или сочетание этих генетических конструкций, каждая из которых содержит также регуляторные элементы, обеспечивающие высокий уровень экспрессии гена IL-11 в эукариотических клетках, в частности в клетках органов и тканей человека, и способную увеличить количество белка интерлейкина-11 в клетках органов и тканей и/или органах и тканях человека, в частности в головном мозге, спинном мозге, тимусе, гипоталамусе, мозжечке, гипофизе, коре почек, почках, легких, кишечнике, желудке, аппендиксе, семенниках, матке, коже, костях, костном мозге, суставах, пуповине, митральном клапане, плаценте, в костной, мышечной, хрящевой, соединительной, эндометриальной ткани, синовиальном эндотелии, в нейронах ЦНС, в клетках трофобласта, в фибробластах матки, сперматогониях, сперматоцитах, сперматидах, в клетках эндометрия матки, в эндотелиальных клетках вен, в синовиоцитах, хондроцитах, в кератоцитах кожи, фибробластах и остеобластах костной ткани, в фибробластах, эпителиальных и мышечных клетках в сочетании с транспортной молекулой или без нее при введении этих генно-терапевтических субстанций в органы и ткани человека. При этом каждая генетическая конструкция с модифицированной кДНК гена IL-11 содержит последовательность нуклеотидов, включающую в себя белок-кодирующую область кДНК гена IL-11, которая несет модификации, не затрагивающие структуру белка интерлейкина-11, а именно: нуклеотидные замены, не приводящие к аминокислотным заменам или обрыву аминокислотной цепи, или комбинации вышеперечисленных модификаций и, не влияющие на кодируемую этой последовательностью аминокислотную последовательность. В качестве транспортной молекулы используют липосомы, или дендримеры 5-го и выше поколений, или амфифильные блоксополимеры.

Способ получения средства для лечения состояний человеческого организма, связанных с уменьшением экспрессии гена IL-11 и/или уменьшением количества белка интерлейкина-11 по п. 1, заключается в получении каждой генно-терапевтической субстанции из группы генно-терапевтических субстанций по п. 1, при этом получают кДНК гена IL-11, затем помещают кДНК в векторную плазмиду, способную обеспечить высокий уровень экспрессии этой кДНК в клетках различных органов и тканей человека, наращивают и выделяют необходимое количество генетической конструкции, затем комбинируют генетическую конструкцию с транспортной молекулой для трансфекции полученной генно-терапевтической субстанцией клеток органов и тканей и/или введения полученной генно-терапевтической субстанции в органы и ткани человека, при этом используют кДНК гена IL-11 с кодирующей последовательностью белка интерлейкина-11, с делециями 5'- и 3-нетранслируемых областей, а именно, полученной на основе участка нативной немодифицированной кДНК гена IL-11 SEQ ID No:1 или участка нативной немодифицированной кДНК гена IL-11 SEQ ID No:2, или модифицированной кДНК гена IL-11, при этом в качестве модифицированной кДНК гена IL-11 используют, или SEQ ID No:3, или SEQ ID No:4, или SEQ ID No:5, или SEQ ID No:6, или SEQ ID No:7, или сочетание этих генетических конструкций.

Способ использования средства для лечения состояний человеческого организма, связанных с уменьшением экспрессии гена IL-11 и/или уменьшением количества белка интерлейкина-11, в том числе женского бесплодия, заключается в трансфекции генно-терапевтической субстанцией, выбранной из группы созданных генно-терапевтических субстанций по п. 1. клеток органов и тканей пациента и/или во введении в органы и ткани пациента аутологичных клеток пациента, трансфицированных генно-терапевтической субстанцией, выбранной из группы созданных генно-терапевтических субстанций по п. 1, и/или во введении в органы и ткани пациента генно-терапевтической субстанции или нескольких субстанций, выбранной/ выбранных из группы созданных генно-терапевтических субстанций по п. 1, или сочетанием обозначенных способов.

Перечень фигур

На фиг. 1

Представлена нуклеотидная последовательность немодифицированной кДНК гена IL-11 длиной 600 н.п. SEQ ID No:1, которая имеет высокую гомологию с приводимой в базе данных GenBank под номером NM_000641 и кодирует изоформу Large белка интерлейкина-11 (GenBank NP_000632.1).

На фиг. 2

Представлена нуклеотидная последовательность немодифицированной кДНК гена IL-11 длиной 383 н.п. SEQ ID No:2, которая имеет высокую гомологию с приводимой в базе данных GenBank под номером NM_000641 и кодирует изоформу Small белка интерлейкина-11 (GenBank NP_001254647.1.).

На фиг. 3

Представлена нуклеотидная последовательность модифицированной кДНК гена IL-11, SEQ ID No:3, которая

содержит 6 нуклеотидных замен G→C в позициях 615, 633, 639, 621, 624, 627, не приводящих к изменениям в аминокислотной последовательности белка интерлейкина-11 (изоформа Small).

На фиг. 4

Представлена нуклеотидная последовательность модифицированной кДНК гена IL-11, SEQ ID No:4, которая

содержит 7 нуклеотидных замен G→C в позициях 450, 615, 633, 639, 621, 624, 627 и три нуклеотидных замены A→G в позициях 447, 456, 549, не приводящие к изменениям в аминокислотной последовательности белка интерлейкина-11 (изоформа Small).

На фиг. 5

Представлена нуклеотидная последовательность модифицированной кДНК гена IL-11, SEQ ID No:5, которая

содержит 8 нуклеотидных замен G→C в позициях 399, 450, 615, 633, 639, 621, 624, 627 и 4 нуклеотидных замены A→G в позициях 417, 447, 456, 549, не приводящие к изменениям в аминокислотной последовательности белка интерлейкина-11 (изоформа Small).

На фиг. 6

Представлена нуклеотидная последовательность модифицированной кДНК гена IL-11, SEQ ID No:6, которая

содержит 7 нуклеотидных замен G→C в позициях 450, 615, 633, 639, 621, 624, 627 и 3 нуклеотидных замены A→G в позициях 447, 456, 549, не приводящие к изменениям в аминокислотной последовательности белка интерлейкина-11 (изоформа Large).

На фиг. 7

Представлена нуклеотидная последовательность модифицированной кДНК гена IL-11, SEQ ID No:7, которая

содержит 10 нуклеотидных замен G→C в позициях 306, 312, 399, 450, 615, 633, 639, 621, 624, 627 и 5 нуклеотидных замен A→G в позициях 243, 417, 447, 456, 549, не приводящие к изменениям в аминокислотной последовательности белка интерлейкина-11 (изоформа Large).

На фиг. 8

С целью последующего корректного определения генно-терапевтического эффекта после трансфекции фибробластов генно-терапевтической субстанцей с кДНК гена IL-11 проводили анализ эндогенной экспрессии гена IL-11 в культуре первичных фибробластов. На фигуре представлены графики накопления продуктов полимеразной цепной реакции (ПЦР), соответствующих:

1 - кДНК гена IL-11, фибробласты со сниженной экспрессией гена IL-11

2 - кДНК гена IL-11, фибробласты с нормальной экспрессией гена IL-11

3 - кДНК гена В2М, фибробласты со сниженной экспрессией гена IL-11

4 - кДНК гена В2М, фибробласты с нормальной экспрессией гена IL-11

В качестве референтного гена использовали ген В2М (Бета-2-микроглобулин) приведенного в базе данных GenBank под номером NM 004048.2.

На фиг. 9

С целью подтверждения увеличения экспрессии гена IL-11 в клеточной культуре фибробластов со сниженной экспрессией гена IL-11 при трансфекции данных клеток генно-терапевтической субстанцией с кДНК гена IL-11 с генетической конструкцией pCMV6- IL-11 SEQ ID No:1 представлены графики накопления ПЦР-продуктов, соответствующих:

1 - кДНК гена IL-11 в фибробластах с нормальной экспрессией гена IL-11,

2 - кДНК гена IL-11 в фибробластах со сниженной экспрессией гена IL-11 до трансфекции ГТС с кДНК гена IL-11

3 - кДНК гена IL-11 в фибробластах со сниженной экспрессией гена IL-11 после трансфекции ГТС с кДНК гена IL-11

4 - кДНК гена IL-11 в фибробластах со сниженной экспрессией гена IL-11 после трансфекции вектором без кДНК гена IL-11

5 - кДНК гена В2М в фибробластах с нормальной экспрессией гена IL-11

6 - кДНК гена В2М в фибробластах со сниженной экспрессией гена IL-11 до трансфекции ГТС с кДНК гена IL-11

7 - кДНК гена В2М в фибробластах со сниженной экспрессией гена IL-11 после трансфекции ГТС с кДНК гена IL-11

8 - кДНК гена В2М в фибробластах со сниженной экспрессией гена IL-11 после трансфекции вектором без кДНК гена IL-11

Из графиков следует, что в случае трансфекции вектором без вставки кДНК гена IL-11 уровень кДНК гена IL-11 в фибробластах не изменился, а в случае трансфекции вектором с кДНК гена IL-11 - уровень кДНК фибробластов со сниженной экспрессией гена IL-11 многократно увеличился (до уровня выше, чем уровень кДНК гена IL-11 в нормальных фибробластах).

На фиг. 10

С целью подтверждения увеличения количества белка интерлейкина-11 в клеточной культуре фибробластов с нормальной экспрессией гена IL-11 при трансфекции данных клеток генно-терапевтической субстанцией содержащей кДНК гена IL-11 представлен график изменения количества белка интерлейкина-11 нетрансфицированных фибробластов (культура А), трансфицированных вектором pCDNA 3.1 (+) не содержащим кДНК гена IL-11 (культура В) и трансфицированных генно-терапевтической субстанцией с генетической конструкцией pCDNA 3.1-IL-11 SEQ ID No:1 (культура С). Из графика следует, что при трансфекции фибробластов генно-терапевтической субстанцией с кДНК гена IL-11 происходит увеличение количества белка интерлейкина-11 в клеточном лизате.

На фиг. 11

С целью подтверждения увеличения количества белка интерлейкина-11 в коже человека при введении в кожу клеточной культуры фибробластов, трансфицированной генно-терапевтической субстанцией представлен анализ изменения количества белка интерлейкина-11 в коже пациентов. При этом пациентам вводили три варианта культуры аутологичных фибробластов - нетрансфицированные (А), трансфицированные вектором pCMV6-XL5 (Б) и трансфицированные генно-терапевтической субстанцией с генетической конструкцией pCMV6- IL-11 SEQ ID No:7 (С) - в кожу предплечья. Также анализировали количественный уровень белка интерлейкина-11 в интактной коже. Показано повышение количества белка интерлейкина-11 в коже пациента в области введения фибробластов, трансфицированных генно-терапевтической субстанцией кДНК гена IL-11 (С).

На фиг. 12

С целью подтверждения увеличения количества белка интерлейкина-11 до различного индивидуального уровня в клеточных культурах фибробластов пациентов при трансфекции данных клеток генно-терапевтическими субстанциями с участками нативных немодифицированных кДНК гена IL-11 и модифицированных кДНК гена IL-11, представлен анализ изменения количественного уровня белка интерлейкина-11 в культурах фибробластов кожи человека в зависимости от наличия и типа модификаций в кДНК гена IL-11, используемой для трансфекции фибробластов.

Культуры фибробластов 19 пациентов делили на 8 частей каждую с (А) по (Н); первые части (А) клеточных культур пациентов трансфицировали генно-терапевтической субстанцией pCMV6-IL-11 SEQ ID No:1, части (В) трансфицировали генно-терапевтической субстанцией pCMV6-IL-11 SEQ ID No:2, части (С) трансфицировали генно-терапевтической субстанцией pCMV6-IL-11 SEQ ID No:3, части (D) трансфицировали генно-терапевтической субстанцией pCMV6-IL-11 SEQ ID No:4, части (E) трансфицировали генно-терапевтической субстанцией pCMV6-IL-11 SEQ ID No:5, части (F) трансфицировали генно-терапевтической субстанцией pCMV6-IL-11 SEQ ID No:6, части (G) трансфицировали генно-терапевтической субстанцией pCMV6-IL-11 SEQ ID No:7, части (H) трансфицировали векторной плазмидой, не содержащей кДНК гена IL-11.

По итогам анализа количественного уровня белка интерлейкина-11 выбрали показатели, касательно каждой части клеточной культуры от каждого пациента, продемонстрировавшие максимальное количество белка интерлейкина-11 и объединили их в семь групп, исходя из следующего критерия:

В группе 1 максимальное количество белка интерлейкина-11 наблюдалось при трансфекции pCMV6-IL-11 SEQ ID No:1,

в группе 2 максимальное количество белка интерлейкина-11 наблюдалось при трансфекции pCMV6-IL-11 SEQ ID No:2,

в группе 3 максимальное количество белка интерлейкина-11 наблюдалось при трансфекции pCMV6-IL-11 SEQ ID No:3,

в группе 4 максимальное количество белка интерлейкина-11 наблюдалось при трансфекции pCMV6-IL-11 SEQ ID No:4,

в группе 5 максимальное количество белка интерлейкина-11 наблюдалось при трансфекции pCMV6-IL-11 SEQ ID No:5,

в группе 6 максимальное количество белка интерлейкина-11 наблюдалось при трансфекции pCMV6-IL-11 SEQ ID No:6,

в группе 7 максимальное количество белка интерлейкина-11 наблюдалось при трансфекции pCMV6-IL-11 SEQ ID No:7.

Ни в одной из клеточных культур не наблюдалось того, что максимальное количество белка интерлейкина-11 присутствует при трансфекции вектором без вставки кДНК гена IL-11.

На фигуре 12 для каждой группы клеточных культур приведены диаграммы показателей концентрации белка интерлейкина-11 (усредненных в рамках группы, в случае, если в группу входит более одной клеточной культуры) применительно ко всем, участвующим в эксперименте генно-терапевтическим субстанциям, после трансфекции этих клеточных культур активными генно-терапевтическими субстанциями, содержащими модифицированные и нативную кДНК гена IL-11.

Из фигуры следует, что достижение максимального количества белка интерлейкина-11 в культурах фибробластов кожи различных пациентов при их трансфекции генно-терапевтическими субстанциями, связано с индивидуальными особенностями пациентов и зависит от наличия и типа модификаций в кДНК гена IL-11, входящих в генно-терапевтические субстанции.

Каждая генно-терапевтическая субстанция из группы генно-терапевтических субстанций является эффективной в некоторой значительной группе пациентов. Следовательно, для выбора наиболее эффективной генно-терапевтической субстанции из группы генно-терапевтических субстанций для терапевтических целей необходимо предварительное персонализированное исследование пациента.

Обозначения:

части клеточных культур, трансфицированных ГТС IL-11 SEQ ID No:1 (А)

части клеточных культур, трансфицированных ГТС IL-11 SEQ ID No:2 (В)

части клеточных культур, трансфицированных ГТС IL-11 SEQ ID No:3 (С)

части клеточных культур, трансфицированных ГТС IL-11 SEQ ID No:4 (D)

части клеточных культур, трансфицированных ГТС IL-11 SEQ ID No:5 (Е)

части клеточных культур, трансфицированных ГТС IL-11 SEQ ID No:6 (F)

части клеточных культур, трансфицированных ГТС IL-11 SEQ ID No:7 (G)

части клеточных культур, трансфицированных плацебо (Н)

На фиг. 13

С целью подтверждения увеличения экспрессии гена IL-11 в клеточной культуре эндометрия матки человека при трансфекции данных клеток генно-терапевтической субстанцией с кДНК гена IL-11 в генетической конструкции pCMV6-Kan/Neo IL-11 SEQ ID No:2 приведены графики накопления ПЦР-продуктов, соответствующих:

1 - кДНК гена IL-11, клетки эндометрия до трансфекции

2 - кДНК гена IL-11, клетки эндометрия после трансфекции

3 - кДНК гена В2М, клетки эндометрия до трансфекции

4 - кДНК гена В2М, клетки эндометрия после трансфекции

Ген В2М использовали в качестве референтного.

Из фигуры следует, что в результате трансфекции уровень специфической кДНК гена IL-11 в культуре клеток эндометрия человека многократно вырос.

На фиг. 14

С целью подтверждения увеличения экспрессии гена IL-11 в клеточной культуре хондроцитов при трансфекции данных клеток генно-терапевтической субстанцией с кДНК гена IL-11 приведены графики накопления ПЦР-продуктов, соответствующих:

1 - кДНК гена IL-11, до трансфекции

2 - кДНК гена IL-11, после трансфекции

3 - кДНК гена В2М, до трансфекции

4 - кДНК гена В2М, после трансфекции

Ген В2М использовали в качестве референтного.

Из фигуры следует, что в результате трансфекции уровень специфической кДНК гена IL-11 вырос многократно.

На фиг. 15

С целью подтверждения увеличения количества белка интерлейкина-11 в коже человека при введении в кожу генно-терапевтической субстанции представлен анализ изменения количественного уровня белка интерлейкина-11 в коже. При этом пациенту вводили генно-терапевтическую субстанцию, содержащую векторную плазмиду с кДНК гена IL-11 pCMV6-IL-11 SEQ ID No:4 (В) и параллельно вводили плацебо, представляющее собой комбинацию векторной плазмиды pCMV-XL5 не содержащей кДНК гена IL-11 с транспортной молекулой (А) - в кожу предплечья. Показано увеличение количества белка интерлейкина-11 в биоптате кожи пациента 1В, которому вводились генно-терапевтическая субстанция, содержащая генетическую конструкцию с кДНК гена IL-11, что говорит об эффективности генно-терапевтической субстанции.

Обозначения:

пациент 1А

пациент 1В

пациент 1В до введения ГТС

На фиг. 16

С целью подтверждения увеличения количества белка интерлейкина-11 в хрящевой ткани человека при введении в хрящевую ткань генно-терапевтической субстанции представлен анализ изменения количественного уровня белка интерлейкина-11 в хрящевой ткани. При этом пациенту вводили генно-терапевтическую субстанцию, содержащую векторную плазмиду с кДНК гена IL-11 pCDNA 3.1 IL-11 SEQ ID No:5 (В) и параллельно вводили плацебо pCDNA 3.1(+), представляющее собой комбинацию векторной плазмиды не содержащей кДНК гена IL-11 с транспортной молекулой (А) - в хрящевую ткань.

Показано увеличение количественного уровня белка интерлейкина-11 в лизате биоптата хрящевой ткани пациента 1В, которому вводились генно-терапевтическая субстанция, содержащая генетическую конструкцию с кДНК гена IL-11, что говорит об эффективности генно-терапевтической субстанции.

Обозначения:

пациент 1А

пациент 1В

пациент 1В до введения ГТС

На фиг. 17

С целью подтверждения увеличения количества белка интерлейкина-11 в мышечной ткани человека при введении в мышечную ткань генно-терапевтической субстанции представлен анализ изменения количества белка интерлейкина-11 в мышечной ткани. При этом пациенту вводили генно-терапевтическую субстанцию, содержащую векторную плазмиду с кДНК гена IL-11 - pCMV6-Kan/Neo IL-11 SEQ ID No:6 (В) и параллельно вводили плацебо pCMV6-Kan/Neo, представляющее собой комбинацию векторной плазмиды не содержащей кДНК гена IL-11 с транспортной молекулой (А) - в мышечную ткань в зоне предплечья. Показано увеличение количества белка интерлейкина-11 в биоптате мышечной ткани пациента 1В, которому вводились генно-терапевтическая субстанция, содержащая генетическую конструкцию с кДНК гена IL-11, что говорит об эффективности генно-терапевтической субстанции.

Обозначения:

пациент1А

пациент 1В

пациент 1В до введения ГТС

На фиг. 18

С целью подтверждения увеличения количества белка интерлейкина-11 до различного индивидуального уровня при введении в кожу пациентов генно-терапевтических субстанций с модифицированными и участками нативных немодифицированных кДНК гена IL-11 анализировали количественный уровень белка интерлейкина-11 в коже человека в зависимости от наличия и типа модификаций в кДНК гена IL-11.

Каждому из 20-ти пациентов, отобранных в случайном порядке, вводили в кожу предплечья 7 генно-терапевтических субстанций pCMV6- SEQ ID No:1, pCMV6- SEQ ID No:2, pCMV6- SEQ ID No:3, pCMV6-SEQ ID No:4, pCMV6- SEQ ID No:5, pCMV6- SEQ ID No:6, pCMV6- SEQ ID No:7 и плацебо pCMV6- XL5.

По итогам анализа количества белка интерлейкина-11 в биоптатах выбрали показатели, касательно каждого биоптата от каждого пациента, продемонстрировавшие максимальные количественные уровни белка интерлейкина-11 и объединили их в семь групп, исходя из следующего критерия:

В группе 1 максимальное количество белка интерлейкина-11 наблюдалось при введении pCMV6-IL-11 SEQ ID No:1,

в группе 2 максимальное количество белка интерлейкина-11 наблюдалось при введении pCMV6-IL-11 SEQ ID No:2,

в группе 3 максимальное количество белка интерлейкина-11 наблюдалось при введении pCMV6-IL-11 SEQ ID No:3,

в группе 4 максимальное количество белка интерлейкина-11 наблюдалось при введении pCMV6-IL-11 SEQ ID No:4,

в группе 5 максимальное количество белка интерлейкина-11 наблюдалось при введении pCMV6-IL-11 SEQ ID No:5,

в группе 6 максимальное количество белка интерлейкина-11 наблюдалось при введении pCMV6-IL-11 SEQ ID No:6,

в группе 7 максимальное количество белка интерлейкина-11. наблюдалось при введении pCMV6-IL-11 SEQ ID No:7.

Ни в одном из биоптатов не наблюдалось того, что максимальное количество белка интерлейкина-11 присутствует в случае введения плацебо.

На фигуре 18 для каждой группы биоптатов приведены диаграммы показателей концентрации белка интерлейкина-11 (усредненных в рамках группы, в случае, если в группу входит более одного биоптата) применительно ко всем, участвующим в эксперименте генно-терапевтическим субстанциям, после введения пациентам этих генно-терапевтических субстанций, содержащих модифицированные и участки нативных немодифицированных кДНК гена IL-11.

Из данного примера следует, что достижение максимального количества белка интерлейкина-11 в биоптатах кожи различных пациентов при введении им в кожу генно-терапевтических субстанций, связано с индивидуальными особенностями пациентов и зависит от наличия и типа модификаций в кДНК гена IL-11, входящих в генно-терапевтические субстанции.

Каждая генно-терапевтическая субстанция из группы генно-терапевтических субстанций является эффективной в некоторой значительной группе пациентов. Следовательно, для выбора наиболее эффективной генно-терапевтической субстанции из группы генно-терапевтических субстанций для терапевтических целей, необходимо предварительное персонализированное исследование пациента. Обозначения:

биоптаты пациентов после введения ГТС IL-11 SEQ ID No:1 (А)

биоптаты пациентов после введения ГТС IL-11 SEQ ID No:2 (В)

биоптаты пациентов после введения ГТС IL-11 SEQ ID No:3 (С)

биоптаты пациентов после введения ГТС IL-11 SEQ ID No:4 (D)

биоптаты пациентов после введения ГТС IL-11 SEQ ID No:5 (Е)

биоптаты пациентов после введения ГТС IL-11 SEQ ID No:6 (F)

биоптаты пациентов после введения ГТС IL-11 SEQ ID No:7 (G)

биоптаты пациентов после введения плацебо (Н)

На фиг. 19

С целью определения наиболее эффективной применительно к конкретному пациенту генно-терапевтической субстанции анализировали количественный уровень белка интерлейкина-11 в клеточных лизатах фибробластов этого пациента, трансфицированных разными генетическими конструкциями, содержащими участки нативных немодифицированных кДНК гена IL-11 или модифицированных кДНК гена IL-11.

По итогам анализа количества белка интерлейкина-11 в культуре фибробластов пациента выделили вариант генно-терапевтической субстанции, при трансфекции которой выявляется максимальная концентрация белка интерлейкина-11 в лизате клеточной культуры. В данном эксперименте максимальная концентрация белка интерлейкина-11 в лизате наблюдается при трансфекции генно-терапевтической субстанцией на базе pCMV6 IL-11 SEQ ID No:1, содержащей модифицированную кДНК гена IL-11 изоформы Large белка интерлейкина-11, что показано на фигуре 19.

Таким образом, выбрана наиболее эффективная применительно к данному пациенту генно-терапевтическая субстанция для последующей трансфекции клеток пациента в рамках терапевтической процедуры.

Обозначения:

1 - клеточный лизат после трансфекции ГТС IL-11 SEQ ID No:1 (А)

2 - клеточный лизат после трансфекции ГТС IL-11 SEQ ID No:2 (В)

3 - клеточный лизат после трансфекции ГТС IL-11 SEQ ID No:3 (С)

4 - клеточный лизат после трансфекции ГТС IL-11 SEQ ID No:4 (D)

5 - клеточный лизат после трансфекции ГТС IL-11 SEQ ID No:5 (Е)

6 - клеточный лизат после трансфекции ГТС IL-11 SEQ ID No:6 (F)

7 - клеточный лизат после трансфекции ГТС IL-11 SEQ ID No:7 (G)

8 - клеточный лизат после трансфекции плацебо (Н)

На фиг. 20

С целью определения наиболее эффективной применительно к конкретному пациенту генно-терапевтической субстанции анализировали количество белка интерлейкина-11 в лизатах биоптатов кожи этого пациента, после введения ему генно-терапевтических субстанций, содержащих участки нативных немодифицированных кДНК гена IL-11 или модифицированных кДНК гена IL-11.

По итогам анализа количества белка интерлейкина-11 в лизате биоптатов кожи пациента выделили вариант генно-терапевтической субстанции, при введен