Молекулы искусственной нуклеиновой кислоты

Молекулы искусственной нуклеиновой кислоты

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Изобретение относится к молекулам искусственной нуклеиновой кислоты, включающим открытую рамку считывания, элемент 3'-UTR и необязательно поли(А)-последовательность и/или сигнал полиаденилирования. Изобретение дополнительно относится к вектору, включающему элемент 3'-UTR, к фармацевтической композиции, включающей молекулу искусственной нуклеиновой кислоты, и к набору, включающему молекулу искусственной нуклеиновой кислоты, причем вектор и/или фармацевтическая композиция, включающие молекулу искусственной нуклеиновой кислоты, предпочтительно применяются в области генной терапии и/или генетической вакцинации.

Генная терапия и генетическая вакцинация принадлежат к наиболее многообещающим и быстро развивающимся методам современной медицины. С их помощью можно разработать высокоспецифичные и индивидуальные варианты лечения широкого спектра заболеваний. В частности, наследственные генетические заболевания, а также аутоиммунные заболевания, раковые или связанные с опухолями заболевания, а также воспалительные заболевания могут представлять собой объект для таких подходов к лечению. Предусматривается также предотвращение (раннего) проявления таких заболеваний с помощью этих подходов.

Главная рациональная концепция относительно генной терапии заключается в соответствующей модуляции нарушенной экспрессии генов, связанных с патологическими состояниями при конкретных заболеваниях. Патологически измененная экспрессия генов может привести к отсутствию или гиперпродукции важных продуктов генов, например, факторов сигнализации, таких как гормоны, факторы домашнего хозяйства, ферменты метаболизма, структурные белки или тому подобное. Измененная экспрессия генов может быть обусловлена не только неверной регуляцией транскрипции и/или трансляции, но также возникать в результате мутаций в пределах ORF, кодирующей конкретный белок. Патологические мутации могут быть вызваны, например, хромосомной аберрацией или более конкретными мутациями, такими как точечные мутации или мутации со сдвигом рамки считывания, причем все они приводят к ограниченному функционированию и потенциально к полной потере функции продукта гена. Однако нарушение регуляции транскрипции или трансляции может также возникать, если мутации возникают в генах, кодирующих белки, которые вовлечены в механизм транскрипции или трансляции в клетке. Такие мутации могут приводить к патологической позитивной или негативной регуляции генов, которые по существу являются функциональными. Гены, кодирующие генные продукты, которые имеют такие регуляторные функции, могут представлять собой, например, транскрипционные факторы, рецепторы сигнальных соединений, белки-посредники или тому подобное. Однако потеря функции таких генов, кодирующих регуляторные белки, может при определенных условиях быть возвращена искусственным введением других факторов, действующих далее по нижележащему пути относительно поврежденного генного продукта. Такие генные дефекты могут также компенсироваться генной терапией путем замены самого поврежденного гена.

Генетическая вакцинация позволяет вызвать желаемый иммунный ответ на выбранные антигены, такие как характерные компоненты поверхности бактерий, вирусных частиц, опухолевые антигены или тому подобное. В целом вакцинация является одним из главных достижений современной медицины. Однако эффективные вакцины в настоящее время доступны только для небольшого количества заболеваний. Соответственно, инфекции, которые не могут быть предотвращены вакцинацией, все еще поражают миллионы людей каждый год.

В целом вакцины могут быть подразделены на вакцины «первого», «второго» и «третьего» поколения. Вакцины «первого поколения» обычно представляют собой вакцины на основе целого организма. Они основаны либо на живых и ослабленных, либо на убитых патогенах, например, вирусах, бактериях или тому подобном. Главным недостатком живых и ослабленных вакцин является риск возвращения к вариантам, опасным для жизни. Таким образом, хотя и ослабленные, такие патогены могут все еще в действительности нести непредсказуемые риски. Убитые патогены могут быть не настолько эффективными, насколько это желательно для выработки специфического иммунного ответа. Для того чтобы минимизировать эти риски, были разработаны вакцины «второго поколения». Они обычно представляют собой субъединичные вакцины, состоящие из определенных антигенов или рекомбинантных белковых компонентов, которые происходят от патогенов.

Генетические вакцины, т.е. вакцины для генетической вакцинации, обычно обозначаются как вакцины «третьего поколения». Они обычно состоят из молекул нуклеиновой кислоты, созданных генно-инженерным способом, которые дают возможность экспрессироваться in vivo фрагментам пептида или белка (антигена), характерным для патогена или опухолевого антигена. Генетические вакцины экспрессируются при введении больному и захватываются компетентными клетками. Экспрессия введенных нуклеиновых кислот приводит к продукции кодируемых белков. В случае если эти белки узнаются иммунной системой больного как чужеродные, запускается иммунный ответ.

Как видно из представленного выше, оба метода, генная терапия и генетическая вакцинация, по существу основаны на введении молекул нуклеиновой кислоты больному и последующей транскрипции и/или трансляции кодируемой генетической информации. Альтернативно генетическая вакцинация или генная терапия может также включать методы, включающие выделение конкретных клеток из организма больного, подлежащего лечению, последующую трансфекцию in vitro таких клеток и повторное введение обработанных клеток больному.

В контексте генной терапии или генетической вакцинации в качестве молекул нуклеиновой кислоты для введения может быть использована ДНК, а также РНК. ДНК, как известно, является относительно стабильной и легкой для обработки. Однако использование ДНК несет риск нежелательной вставки введенных фрагментов ДНК в геном больного, потенциально ведущей к потере функции поврежденных генов. Дополнительным риском является нежелательная выработка антител против ДНК. Другим недостатком является ограниченный уровень экспрессии кодируемого пептида или белка, который может быть достигнут при введении ДНК и ее транскрипции/трансляции. Среди других причин, уровень экспрессии вводимой ДНК будет зависеть от присутствия специфических факторов транскрипции, которые регулируют транскрипцию ДНК. В отсутствие таких факторов транскрипция ДНК не будет давать удовлетворительные уровни РНК. В результате ограничивается уровень получаемого транслируемого пептида или белка.

При использовании для генной терапии или генетической вакцинации РНК вместо ДНК риск нежелательной интеграции в геном и выработки антител против ДНК сведен к минимуму или отсутствует. Однако РНК, как считается, являются относительно нестабильными типами молекул, которые могут легко деградировать под действием повсеместных РНКаз.

Деградация РНК in vivo вносит вклад в регуляцию периода полужизни РНК. Как предположено и доказано, этот эффект служит для тонкой настройки экспрессии генов эукариот (Friedel et al., Conserved principles of mammalian transcriptional regulation revealed by RNA half-life, Nucleic Acid Research, 2009, 1-12). Соответственно, каждая существующая в природе РНК имеет свой индивидуальный период полужизни в зависимости от гена, от которого происходит мРНК. Это вносит вклад в регуляцию уровня экспрессии этого гена. Нестабильные РНК важны для осуществления кратковременной экспрессии гена в отдельные точки времени. Однако долгоживущие РНК могут быть связаны с аккумуляцией конкретных белков или продолжительной экспрессией генов. Период полужизни мРНК in vivo может также зависеть от факторов окружающей среды, таких как лечение гормонами, как показано, например, для мРНК инсулиноподобного фактора роста I, актина и альбумина (Johnson et al., Newly synthesized RNA: Simultaneous measurement in intact cells of transcription rates and RNA stability of insulin-like growth factor I, actin, and albumin in growth hormone-stimulated hepatocytes, Proc. Natl. Acad. Sci., Vol. 88, pp. 5287-5291, 1991).

Для генной терапии и генетической вакцинации обычно желательна стабильная РНК. Это с одной стороны обусловлено тем фактом, что продукт, кодируемый последовательностью РНК, должен аккумулироваться in vivo. С другой стороны, РНК должна поддерживать свою структурную и функциональную целостность при получении в виде подходящей единицы лекарственной формы, в процессе ее хранения и при введении. Таким образом, существенное внимание уделялось предоставлению стабильных молекул РНК для генной терапии и генетической вакцинации для предохранения их как объекта ранней деградации или распада.

Сообщалось, что содержание G/C в молекулах нуклеиновой кислоты может влиять на их стабильность. Таким образом, нуклеиновые кислоты, включающие повышенное количество остатков гуанина (G) и/или цитозина (С), могут быть функционально более стабильными, чем нуклеиновые кислоты, содержащие большое количество нуклеотидов аденина (A), тимидина (T) или урацила (U). В этом контексте патент WO 02/098443 предлагает фармацевтическую композицию, содержащую мРНК, которая стабилизирована модификациями последовательности в транслируемой области. Такая модификация последовательности имеет преимущество в результате вырожденности генетического кода. Соответственно, кодоны, которые содержат менее благоприятное сочетание нуклеотидов (менее благоприятное в плане стабильности РНК), могут быть заменены альтернативными кодонами без изменения кодируемой аминокислотной последовательности. Этот метод стабилизации РНК ограничен резервами специфической последовательности нуклеотидов каждой отдельной молекулы РНК, которые не позволяют оставить пространство для желаемой аминокислотной последовательности. Этот подход ограничен также кодирующими областями РНК.

В качестве альтернативного варианта стабилизации мРНК, обнаружено, что природные молекулы мРНК эукариот содержат характерные стабилизирующие элементы. Например, они могут включать так называемые нетранслируемые области (UTR) на своем 5'-конце (5'-UTR) и/или на своем 3'-конце (3'-UTR), а также другие структурные характеристики, такие как структура в виде 5'-кэпа или 3'-поли(А)-хвоста. Как 5'-UTR, так и 3'-UTR обычно транскрибируются с геномной ДНК и являются, таким образом, элементами незрелой мРНК. Характерные структурные характеристики зрелой мРНК, такие как 5'-кэп и 3'-поли(А)-хвост (также называемый поли(А)-хвостом или поли(А)-последовательностью), обычно добавляются к транскрибированной (незрелой) мРНК при процессинге мРНК.

3'-поли(А)-хвост обычно представляет собой монотонный участок последовательности адениновых нуклеотидов, добавляемый к 3'-концу транскрибируемой мРНК. Он может включать приблизительно до 400 адениновых нуклеотидов. Обнаружено, что длина такого 3'-поли(А)-хвоста потенциально является решающим элементом для стабильности индивидуальной мРНК.

Показано также, что 3'-UTR мРНК α-глобина может быть важным фактором для хорошо известной стабильности мРНК α-глобина (Rodgers et al., Regulated α-globin mRNA decay is a cytoplasmic event proceeding through 3'-to-5' exosome-dependent decapping, RNA, 8, pp. 1526-1537, 2002). 3'-UTR мРНК α-глобина, очевидно, вовлечена в формирование конкретного рибонуклеопротеидного комплекса, α-комплекса, чье присутствие коррелирует со стабильностью мРНК in vitro (Wang et al., An mRNA stability complex functions with poly(A)-binding protein to stabilize mRNA in vitro, Molecular and Cellular biology, Vol 19, No. 7, July 1999, p. 4552-4560).

Независимо от факторов, влияющих на стабильность мРНК, эффективная трансляция вводимых молекул нуклеиновой кислоты клетками или тканями-мишенями имеет решающее значение для любого подхода с использованием молекул нуклеиновой кислоты для генной терапии или генетической вакцинации. Наряду с регуляцией стабильности, трансляция большинства мРНК также регулируется структурными особенностями, такими как UTR, 5'-кэп и 3'-поли(А)-хвост. В этом контексте сообщалось, что длина поли(А)-хвоста может также играть важную роль в эффективности трансляции. Стабилизирующие 3'-элементы, однако, могут также иметь ослабляющий эффект на трансляцию.

Целью настоящего изобретения является предоставление молекул нуклеиновой кислоты, которые могут быть пригодны для применения в генной терапии и/или генетической вакцинации. В частности, целью настоящего изобретения является обеспечение видами мРНК, которые стабилизированы относительно преждевременной деградации или распада без проявления значительной потери функциональности в плане эффективности трансляции. Другой целью настоящего изобретения является предоставление молекул нуклеиновой кислоты, кодирующих такие представленные выше виды мРНК, которые могут быть пригодны для использования при генной терапии и/или генетической вакцинации. Еще одной целью настоящего изобретения является создание фармацевтической композиции для применения при генной терапии и/или генетической вакцинации. Таким образом, целью настоящего изобретения является обеспечение улучшенными видами нуклеиновой кислоты, которые преодолевают описанные выше недостатки предшествующего уровня техники с помощью экономически эффективного и прямого подхода.

Цель, лежащая в основе настоящего изобретения, решается с помощью заявленного предмета изобретения.

Для ясности и понятности предоставляются следующие определения. Любой технический признак, упоминаемый в этих определениях, может быть истолкован в каждом без исключения варианте осуществления изобретения. Дополнительные определения и объяснения могут быть конкретно предоставлены в контексте этих вариантов осуществления.

Адаптивный иммунный ответ: Адаптивный иммунный ответ обычно понимается как ответ иммунной системы, специфичный для антигена. Антигенная специфичность позволяет генерировать ответы, которые адаптированы к конкретным патогенам или клеткам, инфицированным патогеном. Способность закреплять эти адаптивные ответы обычно поддерживается в организме «клетками памяти». Если патоген инфицировал организм более одного раза, эти конкретные клетки памяти используются для быстрого его устранения. В этом контексте первой стадией адаптивного иммунного ответа является активация наивных антигенспецифических Т-клеток или различных иммунных клеток, способных индуцировать антигенспецифический иммунный ответ антигенпрезентирующими клетками. Это происходит в лимфоидных тканях и органах, через которые постоянно проходят наивные Т-клетки. Три типа клеток, которые могут служить в качестве антигенпрезентирующих клеток, представляют собой дендритные клетки, макрофаги и В-клетки. Каждая из этих клеток имеет определенную функцию при индукции иммунных ответов. Дендритные клетки могут захватывать антигены путем фагоцитоза и макропиноцитоза и могут становиться стимулированными в результате контакта, например, с чужеродным антигеном, мигрировать в местную лимфоидную ткань, где они дифференцируются в зрелые дендритные клетки. Макрофаги поглощают частичковые антигены, такие как бактерии, и индуцируются инфекционными агентами или другими соответствующими стимулами для экспрессии молекул МНС. Уникальная способность В-клеток связывать и подвергать интернализации растворимые белковые антигены с помощью своих рецепторов также может быть важной для индукции Т-клеток. Молекулы MHC обычно отвечают за презентацию антигена Т-клеткам. Здесь презентация антигена на молекулах МНС приводит к активации Т-клеток, что вызывает их пролиферацию и дифференцировку в подготовленные к работе эффекторные Т-клетки. Наиболее важной функцией эффекторных Т-клеток является уничтожение инфицированных клеток с помощью CD8+ цитотоксических Т-клеток и активация макрофагов с помощью Th1-клеток, что вместе составляет клеточный иммунитет, а также активация В-клеток с помощью как Th2, так и Th1 клеток для продукции различных классов антител, и, таким образом, управления гуморальным иммунным ответом. Т-клетки распознают антиген своими Т-клеточными рецепторами, которые не распознают и не связывают антиген непосредственно, а вместо этого распознают короткие пептидные фрагменты, например, происходящих от патогена белковых антигенов, например, так называемые эпитопы, которые связаны с молекулами МНС на поверхности других клеток.

Адаптивная иммунная система: Адаптивная иммунная система по существу призвана прекратить или предотвратить рост патогенов. Она обычно регулирует адаптивный иммунный ответ, обеспечивая иммунную систему позвоночных способностью распознавать и запоминать конкретные патогены (для выработки иммунитета) и закреплять все более сильные атаки каждый раз при встрече с патогеном. Система является высоко адаптируемой из-за соматической гипермутации (процесса ускоренных соматических мутаций), и рекомбинации V(D)J (необратимой генетической рекомбинации сегментов гена рецептора антигена). Этот механизм позволяет небольшому количеству генов генерировать огромное количество рецепторов различных антигенов, которые затем уникально экспрессируются на каждом индивидуальном лимфоците. Поскольку перегруппировка генов приводит к необратимому изменению в ДНК каждой клетки, все потомство (потомки) такой клетки затем наследует гены, кодирующие рецептор с одной и той же специфичностью, включая В-клетки памяти и Т-клетки памяти, которые являются ключевыми для продолжительного специфического иммунитета.

Адъювант/компонент адъюванта: Адъювант или компонент адъюванта в самом широком смысле обычно представляет собой фармакологический и/или иммунологический агент, который может модифицировать, например, повышать действие других агентов, таких как лекарство или вакцина. Это следует интерпретировать в широком смысле, и это относится к широкому спектру веществ. Обычно эти вещества способны повысить иммуногенность антигенов. Например, адъюванты могут узнаваться врожденной иммунной системой и, например, могут вызывать врожденный иммунный ответ. «Адъюванты» обычно не вызывают адаптивный иммунный ответ. В этой связи «адъюванты» не могут рассматриваться в качестве антигенов. Их механизм действия отличается от эффектов, запускаемых антигенами, приводя к адаптивному иммунному ответу.

Антиген: В контексте настоящего изобретения «антиген» обычно относится к веществу, которое может узнаваться иммунной системой, предпочтительно адаптивной иммунной системой, и способно запускать антигенспецифический иммунный ответ, например, путем образования антител и/или антигенспецифических Т-клеток как части адаптивного иммунного ответа. Обычно антиген может представлять собой или может включать пептид или белок, который может презентироваться с помощью МНС Т-клеткам.

Молекула искусственной нуклеиновой кислоты: Молекула искусственной нуклеиновой кислоты может обычно пониматься как молекула нуклеиновой кислоты, например, ДНК или РНК, которая не существует в природе. Другими словами, молекула искусственной нуклеиновой кислоты может пониматься как неприродная молекула нуклеиновой кислоты. Такая молекула нуклеиновой кислоты может быть неприродной из-за своей индивидуальной последовательности (которая не встречается в природе) и/или за счет других модификаций, например, структурных модификаций нуклеотидов, которые не встречаются в природе. Молекула искусственной нуклеиновой кислоты может представлять собой молекулу ДНК, молекулу РНК или гибридную молекулу, включающую части ДНК и РНК. Обычно молекулы искусственной нуклеиновой кислоты могут быть сконструированы и/или созданы методами генной инженерии, чтобы соответствовать желаемой искусственной последовательности нуклеотидов (гетерологичная последовательность). В этом контексте искусственная последовательность обычно представляет собой последовательность, которая не может существовать в природе, т.е. она отличается от последовательности дикого типа по меньшей мере одним нуклеотидом. Термин «дикий тип» можно понимать как последовательность, существующую в природе. Кроме того, термин «молекула искусственной нуклеиновой кислоты» не ограничивается обозначением «одной единственной молекулы», но, обычно, понимается как включающий множество идентичных молекул. Соответственно, он может относиться к множеству идентичных молекул, содержащихся в аликвоте.

Бицистронная РНК, мультицистронная РНК: Бицистронная или мультицистронная РНК обычно представляет собой РНК, предпочтительно мРНК, которая обычно может иметь две (бицистронная) или более (мультицистронная) открытых рамок считывания (ORF). Открытая рамка считывания в данном контексте представляет собой последовательность кодонов, которая способна к трансляции в пептид или белок.

Носитель/полимерный носитель: Носитель в контексте настоящего изобретения обычно может представлять собой соединение, которое облегчает транспорт и/или комплексирование другого соединения (груза). Полимерный носитель обычно представляет собой носитель, который образован из полимера. Носитель может быть связан со своим грузом путем ковалентного или нековалентного взаимодействия. Носитель может транспортировать нуклеиновые кислоты, например, РНК или ДНК, в клетки-мишени. Носитель в некоторых вариантах осуществления может быть катионным компонентом.

Катионный компонент: Термин «катионный компонент» обычно относится к заряженной молекуле, которая является положительно заряженной (катионом) при величине рН обычно от 1 до 9, предпочтительно при величине рН 9 или ниже (например, от 5 до 9), 8 или ниже (например, от 5 до 8), 7 или ниже (например, от 5 до 7), наиболее предпочтительно при физиологическом рН, например, от 7,3 до 7,4. Таким образом, катионный компонент может представлять собой любое положительно заряженное соединение или полимер, предпочтительно катионный пептид или белок, который положительно заряжен в физиологических условиях, особенно в физиологических условиях in vivo. «Катионный пептид или белок» может содержать по меньшей мере одну положительно заряженную аминокислоту или более одной положительно заряженной аминокислоты, например, выбранных из Arg, His, Lys или Orn. Таким образом, «поликатионные» компоненты, имеющие более одного положительного заряда в данных условиях, также включены в объем изобретения.

5'-кэп: 5'-кэп является участком, обычно участком модифицированных нуклеотидов, который обычно «кэпирует» 5'-конец зрелой мРНК. 5'-кэп может обычно образовываться с помощью модифицированного нуклеотида, в частности, производного нуклеотида гуанина. Предпочтительно 5'-кэп связан с 5'-концом через 5'-5'-трифосфатную связь. 5'-кэп может быть метилированным, например, m7GpppN, где N представляет собой концевой 5'-нуклеотид нуклеиновой кислоты, несущей 5'-кэп, обычно 5'-конец РНК. Другие примеры структур 5'-кэпа включают глицерил, инвертированный дезоксиабазический остаток (часть), 4',5'-метиленнуклеотид, 1-(бета-D-эритрофуранозил)нуклеотид, 4'-тионуклеотид, карбоциклический нуклеотид, 1,5-ангидрогекситолнуклеотид, L-нуклеотиды, альфа-нуклеотид, модифицированное нуклеотидное основание, трео-пентофуранозилнуклеотид, ациклический 3',4'-секонуклеотид, ациклический 3,4-дигидроксибутилнуклеотид, ациклический 3,5-дигидроксипентилнуклеотид, 3'-3'-инвертированную нуклеотидную часть, 3'-3'-инвертированную абазическую часть, 3'-2'-инвертированную нуклеотидную часть, 3'-2'-инвертированную абазическую часть, 1,4-бутандиолфосфат, 3'-фосфороамидат, гексилфосфат, аминогексилфосфат, 3'-фосфат, 3'-фосфоротиоат, фосфородитиоат или связанную или не связанную мостиком метилфосфонатную часть.

Клеточный иммунитет/клеточный иммунный ответ: Клеточный иммунитет обычно относится к активации макрофагов, естественных клеток-киллеров (NK), антигенспецифических цитотоксических Т-лимфоцитов, а также к секреции различных цитокинов в ответ на антиген. В более общем плане клеточный иммунитет основан не на антителах, а на активации клеток иммунной системы. Обычно клеточный иммунный ответ может быть охарактеризован, например, активацией антигенспецифических цитотоксических Т-лимфоцитов, которые способны индуцировать апоптоз в клетках, например, в специфических иммунных клетках, таких как дендритные клетки или другие клетки, экспонирующие эпитопы чужеродных антигенов на своей поверхности. Такие клетки могут быть инфицированы вирусом или инфицированы внутриклеточными бактериями или являются раковыми клетками, экспонирующими опухолевые антигены. Другие характеристики могут представлять собой активацию макрофагов и естественных клеток-киллеров, что позволяет им уничтожить патогены и стимулировать клетки к секреции разнообразных цитокинов, которые влияют на функцию других клеток, вовлеченных в адаптивные иммунные ответы и врожденные иммунные ответы.

ДНК: ДНК представляет собой обычно сокращенное название дезоксирибонуклеиновой кислоты. Она представляет собой молекулу нуклеиновой кислоты, т.е. полимера, состоящего из нуклеотидов. Эти нуклеотиды обычно представляют собой мономеры дезоксиаденозинмонофосфата, дезокситимидинмонофосфата, дезоксигуанозинмонофосфата и дезоксицитидинмонофосфата, которые сами состоят из части сахара (дезоксирибозы), части основания и части фосфата, и полимеризуются в характерную структуру остова. Структура остова обычно образуется с помощью фосфодиэфирных связей между частью сахара, т.е. дезоксирибозой, первого нуклеотида и фосфатной частью второго соседнего мономера. Конкретный порядок мономеров, т.е. порядок оснований, связанных с сахаро/фосфатным остовом, называют последовательностью ДНК. ДНК может быть одноцепочечной или двухцепочечной. В двухцепочечной форме, нуклеотиды первой цепи обычно гибридизуются с нуклеотидами второй цепи, например, путем спаривания оснований A/T и спаривания оснований G/C.

Эпитоп: (также называемый «антигенной детерминантой») может быть подразделен на Т-клеточные эпитопы и B-клеточные эпитопы. Т-клеточные эпитопы или части белков в контексте настоящего изобретения могут включать фрагменты, предпочтительно имеющие в длину от приблизительно 6 до приблизительно 20 или даже более аминокислот, например, фрагменты, прошедшие процессинг и презентируемые молекулами класса I МНС, предпочтительно имеющие в длину от приблизительно 8 до приблизительно 10 аминокислот, например, 8, 9 или 10, (или даже 11 или 12 аминокислот), или фрагменты, прошедшие процессинг и презентируемые молекулами класса II МНС, предпочтительно имеющие в длину приблизительно 13 или более аминокислот, например, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 или даже более аминокислот, причем эти фрагменты могут быть выбраны из любой части аминокислотной последовательности. Эти фрагменты обычно узнаются Т-клетками в виде комплекса, состоящего из пептидного фрагмента и молекулы МНС, т.е. фрагменты обычно не узнаются в их нативной форме. В-клеточные эпитопы обычно представляют собой фрагменты, расположенные на наружной поверхности (нативных) белковых или пептидных антигенов, как определено в настоящем описании, предпочтительно содержащие от 5 до 15 аминокислот, более предпочтительно содержащие от 5 до 12 аминокислот, еще более предпочтительно содержащие от 6 до 9 аминокислот, которые могут узнаваться антителами, т.е. в их нативной форме.

Такие эпитопы белков или пептидов кроме того могут быть выбраны из любых упомянутых в данном документе вариантов таких белков или пептидов. В этом контексте антигенные детерминанты могут представлять собой конформационные или прерывистые эпитопы, которые включают сегменты белков или пептидов, как определено в настоящем описании, которые являются прерывистыми по аминокислотной последовательности белков или пептидов, как определено в настоящем описании, но собраны вместе в трехмерную структуру, или непрерывные или линейные эпитопы, которые состоят из одной полипептидной цепи.

Фрагмент последовательности: Фрагмент последовательности обычно может представлять собой более короткую часть полноразмерной последовательности, например, молекулы нуклеиновой кислоты или аминокислотной последовательности. Таким образом, фрагмент обычно состоит из последовательности, идентичной соответствующему участку в полноразмерной последовательности. Предпочтительный фрагмент последовательности в контексте настоящего изобретения состоит из непрерывного участка элементов, таких как нуклеотиды или аминокислоты, соответствующих непрерывному участку элементов в молекуле, из которой произошел фрагмент, который состоит из по меньшей мере 20%, предпочтительно по меньшей мере 30%, более предпочтительно по меньшей мере 40%, более предпочтительно по меньшей мере 50%, еще более предпочтительно по меньшей мере 60%, еще более предпочтительно по меньшей мере 70% и наиболее предпочтительно по меньшей мере 80% полной (т.е. полноразмерной) молекулы, из которой происходит этот фрагмент.

G/C модифицированная: G/С-модифицированная нуклеиновая кислота обычно может представлять собой нуклеиновую кислоту, предпочтительно молекулу искусственной нуклеиновой кислоты, как определено в настоящем описании, на основе модифицированной последовательности дикого типа, включающей предпочтительно повышенное количество гуанозиновых и/или цитозиновых нуклеотидов по сравнению с последовательностью дикого типа. Такое повышенное количество может быть создано путем замены кодонов, содержащих аденозиновые или тимидиновые нуклеотиды, кодонами, содержащими гуанозиновые или цитозиновые нуклеотиды. Если обогащенное содержание G/С присутствует в кодирующей области ДНК или РНК, пользуются вырожденностью генетического кода. Соответственно, замены кодонов предпочтительно не изменяют кодируемые аминокислотные остатки, а исключительно повышают содержание G/C в молекуле нуклеиновой кислоты.

Генная терапия: Генная терапия может обычно подразумевать способ лечения организма больного или выделенных элементов организма больного, например, выделенных тканей/клеток, с помощью нуклеиновых кислот, кодирующих пептид или белок. Он обычно может включать по меньшей мере одну из стадий: а) введения нуклеиновой кислоты, предпочтительно молекулы искусственной нуклеиновой кислоты, как определено в настоящем описании, непосредственно больному любым способом введения, или in vitro в выделенные клетки/ткани больного, что приводит к трансфекции клеток больного либо in vivo/ex vivo либо in vitro; б) транскрипции и/или трансляции введенной молекулы нуклеиновой кислоты; и, необязательно, с) повторного введения выделенных, трансфицированных клеток больному, если нуклеиновая кислота не была введена непосредственно больному.

Генетическая вакцинация: Генетическая вакцинация может обычно пониматься как вакцинация путем введения молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей антиген или иммуноген, или их фрагменты. Молекула нуклеиновой кислоты может быть введена в организм индивидуума или в выделенные клетки индивидуума. После трансфекции определенных клеток организма или трансфекции выделенных клеток антиген или иммуноген может экспрессироваться этими клетками, а затем презентироваться иммунной системе, вызывая адаптивный, т.е. антигенспецифический, иммунный ответ. Таким образом, генетическая вакцинация обычно включает по меньшей мере одну из стадий: а) введения нуклеиновой кислоты, предпочтительно молекулы искусственной нуклеиновой кислоты, как определено в настоящем описании, индивидууму, предпочтительно больному, или в выделенные клетки индивидуума, предпочтительно больного, что обычно приводит к трансфекции клеток индивидуума либо in vivo, либо in vitro, б) транскрипции и/или трансляции введенной молекулы нуклеиновой кислоты; и, необязательно, с) повторного введения выделенных, трансфицированных клеток индивидууму, предпочтительно больному, если нуклеиновая кислота не была введена непосредственно больному.

Гетерологичная последовательность: Две последовательности обычно считаются «гетерологичными», если они не происходят от одного и того же гена. Т.е., хотя гетерологичные последовательности могут происходить от одного и того же организма, они в естественных условиях (в природе) не присутствуют в одной и той же молекуле нуклеиновой кислоты, например, в одной и той же мРНК.

Гуморальный иммунитет/гуморальный иммунный ответ: Гуморальный иммунитет обычно относится к продукции антител и необязательно к дополнительным процессам, сопровождающим продукцию антител. Гуморальный иммунный ответ обычно может быть охарактеризован, например, активацией Th2 и продукцией цитокинов, формированием зародышевого центра и переключением изотипов, созреванием аффинности и генерацией клеток памяти. Гуморальный иммунитет также обычно может относиться к эффекторным функциям антител, которые включают нейтрализацию патогена и токсина, активацию классического комплемента и стимулируемый опсонином фагоцитоз и уничтожение патогенов.

Иммуноген: В контексте настоящего изобретения иммуноген может обычно пониматься как соединение, которое способно стимулировать иммунный ответ. Предпочтительно иммуноген представляет собой пептид, полипептид или белок. В особенно предпочтительном варианте осуществления иммуноген по настоящему изобретению представляет собой продукт трансляции предлагаемой молекулы нуклеиновой кислоты, предпочтительно молекулы искусственной нуклеиновой кислоты, как определено в настоящем описании. Обычно иммуноген вызывает, по меньшей мере, адаптивный иммунный ответ.

Иммуностимулирующая композиция: В контексте данного изобретения иммуностимулирующая композиция может обычно пониматься как композиция, содержащая по меньшей мере один компонент, который способен индуцировать иммунный ответ или из которой происходит компонент, который способен индуцировать иммунный ответ. Такой иммунный ответ может предпочтительно представлять собой врожденный иммунный ответ или сочетание адаптивного и врожденного иммунного ответа. Предпочтительно иммуностимулирующая композиция в контексте настоящего изобретения содержит по меньшей мере одну молекулу искусственной нуклеиновой кислоты, более предпочтительно РНК, например, молекулу мРНК. Иммуностимулирующий компонент, такой как мРНК, может комплексироваться с подходящим носителем. Таким образом, иммуностимулирующая композиция может включать комплекс мРНК/носитель. Кроме того, иммуностимулирующая композиция может включать адъювант и/или подходящий носитель для иммуностимулирующего компонента, такого как мРНК.

Иммунный ответ: Иммунный ответ может обычно представлять собой специфическую реакцию адаптивной иммунной системы на определенный антиген (так называемый специфический или адаптивный иммунный ответ) или неспецифическую реакцию врожденной иммунной системы (так называемый неспецифический или врожденный иммунный ответ) или их сочетание.

Иммунная система: Иммунная система может защищать организмы от инфекции. Если патогену удалось пройти через физический барьер организма и поступить в этот организм, врожденная иммунная система обеспечивает немедленный, но неспецифический ответ. Если патогены ускользают от этого врожденного ответа, позвоночные обладают вторым уровнем защиты, адаптивной иммунной системой. В этом случае иммунная система адаптирует свой ответ в процессе инфекции, чтобы улучшить свое узнавание патогена. Этот улучшенный ответ затем сохраняется после уничтожения патогена в виде иммунологической памяти и позволяет адаптивной иммунной системе закреплять более быстрые и более сильные атаки каждый раз при встрече с этим патогеном. В соответствии с этим, иммунная система состоит из врожденной и адаптивной иммунной системы. Каждая из этих двух частей обычно содержит так называемые гуморальные и клеточные компоненты.

Иммуностимулирующая РНК: Иммуностимулирующая РНК (isRNA) в контексте настоящего изобретения обычно может представлять собой РНК, которая способна индуцировать врожденный иммунный ответ. Она обычно не имеет открытой рамки считывания и, таким образом, не обеспечивает пептидом-антигеном или иммуногеном, но вызывает иммунный ответ, например, путем связывания с конкретным видом Toll-подобного рецептора (TLR) или другими подходящими рецепторами. Однако разумеется, мРНК, имеющие открытую рамку считывания и кодирующие пептид/белок, также могут вызвать врожденный иммунный ответ и, таким образом, могут представлять