Способ увеличения фотосинтетической фиксации углерода с использованием белка слияния из многих субъединиц гликолатдегидрогеназы

Способ увеличения фотосинтетической фиксации углерода с использованием белка слияния из многих субъединиц гликолатдегидрогеназы

Реферат

На урожайность сельскохозяйственных культур влияют многие факторы, среди которых имеются, с одной стороны, факторы, влияющие на способность растения производить биомассу (фотосинтез, поглощение влаги и питательных веществ), а с другой стороны, факторы, влияющие на способность растения противостоять различным стрессам, наподобие биотических стрессов (насекомые, грибы, вирусы и т.п.) или абиотических стрессов (засухи, засоление почвы, нехватка питательных веществ и т.п.).

Одним значительным фактором, влияющим на создание биомассы, является фотосинтез. Фотосинтез представляет собой механизм, с помощью которого растения захватывают атмосферный углекислый газ и преобразуют его в сахар, который затем встраивается в растительные ткани, благодаря чему образуется биомасса. Фотосинтез является основным источником всей первичной продуктивности на Земле.

Большинство растений имеют фотосинтетический механизм, в котором хлоропластный фермент RuBisCo (Рибулозо-1,5-Бифосфат Карбоксилаза/Оксигеназа) является основным ферментом, захватывающим углекислый газ и преобразующим его в сахар. Эти растения, включая некоторые важные сельскохозяйственные растения, например рис, пшеницу, ячмень, картофель, рапс, относятся к так называемым С₃-растениям. Одна известная проблема в фотосинтетическом механизме C₃-растений состоит в том, что эффективность фиксации углерода не является оптимальной в некоторых окружающих условиях, когда часть фиксированного углерода теряется за счет альтернативной активности RuBisCo, называемой окисление.

RuBisCO способен катализировать как карбоксилирование, так и окисление рибулозо-1,5-бифосфата. Баланс между двумя данными функциями зависит главным образом от соотношения в листьях СО₂/О₂, которое может изменяться вслед за реакцией растений на некоторые окружающие условия. Каждая реакция карбоксилирования создает две молекулы фосфоглицерата, который входит в цикл Кальвина, с образованием в конечном итоге крахмала и сахарозы и с регенерацией рибулозо-1,5-бифосфата. Реакция окисления производит по одной молекуле фосфоглицерата и фосфогликолата. Последний рециркулирует в фосфоглицерат за счет фотодыхания (Leegood R.C. et al, 1995). На каждые две молекулы полученного фосфогликолата высвобождается одна молекула СО₂, приводя к общей потере фиксированного углерода, что в конечном итоге снижает производство сахаров и биомассы. В данной реакции также теряется аммоний, и требуется его повторная фиксация через энергозатратные реакции в хлоропласте.

Сообщалось, что преодоление фотодыхания является целью для повышения максимальной эффективности фотосинтеза и повышения его производительности (Zhu et al., 2008), и было описано несколько попыток для того, чтобы снизить потерю углерода в растениях и, вследствие этого, увеличить производство сахаров и биомассы.

Kebeish et al. сообщали, что потери от фотодыхания у Arabidopsis thaliana могут быть устранены за счет введения в хлоропласты бактериального пути для катаболизма фотореспираторного промежуточного гликолата (WO 03/100066; Kebeish R. et al., 2007). Авторы впервые нацелили три субъединицы гликолатдегидрогеназы Escherichia coli в хлоропласты Arabidopsis thaliana, а затем ввели глоксилаткарболигазу Escherichia coli и редуктазу тартронового полуальдегида Escherichia coli для завершения пути, который преобразует гликолат в глицерат параллельно с эндогенным фотореспираторным путем. Данная пошаговая ядерная трансформация с пятью генами Escherichia coli приводит к растениям Arabidopsis, в которых хлоропластный гликолат преобразуется непосредственно в глицерат. Данные трансгенные растения росли быстрее, производили больше биомассы побегов и корней и содержали больше растворимых сахаров.

В PCT/EP2009/059843 раскрыт способ увеличения производства биомассы и/или производства семян и/или фиксации углерода в растениях риса, в котором растения риса трансформируют тремя субъединицами (glcD, glcE и glcF) гликолатдегидрогеназы Escherichia coli, без последующего введения глоксилаткарболигазы Escherichia coli и редуктазы тартронового полуальдегида Escherichia coli.

Целью представленного изобретения являлось использование трансляционных слияний субъединиц ферментов бактериальной гликолатдегидрогеназы (GDH) из множества субъединиц в сельскохозяйственных культурах, избегая затратного по времени и утомительного процесса многократных трансформаций или трансформации с множеством экспрессионных кассет. Бактериальные субъединицы glcD, glcE и glcF сливали с гибкими линкерами в различных расположениях и тестировали в штаммах E. Coli, испытывающих недостаток в GDH, демонстрируя, что рекомбинантные белки DEFp, EFDp и FDEp слияния из многих субъединиц GDH являются активными. Конструкции с наилучшим исполнением переносили в растения Nicotiana tabacum, риса и рапса, и трансгенные растения продемонстрировали значительно усиленный рост и улучшенную интенсивность фотосинтеза.

Представленное изобретение относится к способу увеличения производства биомассы и/или производства семян и/или фиксации углерода в растениях, включающему введение в геном клетки растения нуклеиновой кислоты, кодирующей белок слияния из многих субъединиц гликолатдегидрогеназы, при этом результатом указанного введения указанной одной нуклеиновой кислоты является вновь возникающее экспрессирование одного синтетического полипептида, имеющего ферментативную активность гликолатдегидрогеназы и при этом указанный один полипептид локализован в хлоропластах полученного растения.

В контексте изобретения, белок слияния из многих субъединиц гликолатдегидрогеназы представляет собой один полипептид, состоящий из субъединиц гликолатдегидрогеназы, которые являются существенными для активности гликолатдегидрогеназы, как правило, с пептидными линкерами между данными субъединицами.

В представленном изобретении, авторы изобретения выбрали повторяющуюся линкерную последовательность (Gly₄Ser)₃, подходящую для ковалентного соединения бактериальных доменов glcD, glcE и glcF в полипротеиновый формат, без ухудшения необходимых свойств, таких как правильное складывание, растворимость и активность GDH. Кроме того, линкер не должен быть подвержен протеазному расщеплению в цитозоле растения, обеспечивая возможность сверхэкспрессирования полипептидов в хлоропластах.

В контексте изобретения, биомасса представляет собой количество вещества, производимого отдельными растениями, или площадью поверхности, на которой выращивают растения. Для того, чтобы определить увеличение производства биомассы можно измерить несколько параметров. Примерами подобных параметров являются высота растения, поверхность листовой пластины, сухая масса побегов, сухая масса корней, количество семян, масса семян, размер семян и т.п. Производство семян или урожай семян можно определять на отдельное растение или на площадь поверхности, на которой выращивают растения.

Как правило, данные параметры измеряют после определенного периода выращивания в почве или на конкретной стадии выращивания, например, в конце вегетационного периода, и сравнивают между растениями, трансформированными одной или более нуклеиновыми кислотами согласно изобретению, и растениями, не трансформированными подобными одной или более нуклеиновыми кислотами.

Увеличение фиксации углерода растением можно определить посредством измерения газообмена и параметров флуоресценции хлорофилла. Подходящая методология с использованием системы LI-6400 (Li-Cor) и программного обеспечения, поставляемого производителем, описана в R. Kebeish et al., 2007 и включена в данное описание посредством ссылки.

Нуклеиновая кислота, включенная в способ изобретения, кодирует один полипептид, имеющий ферментативную активность гликолатдегидрогеназы.

Активность гликолатдегидрогеназы может быть оценена согласно Lord J.M. 1972, с использованием технологии, описанной в примере 6 представленной заявки.

В качестве альтернативы, может быть проведен комплементационный анализ с мутантами E. Coli, с дефицитом трех субъединиц, образующих активную эндогенную гликолатдегидрогеназу. Данные мутанты E. coli неспособны к росту на гликолате в качестве единственного источника углерода. Когда сверхэкспрессирование фермента у данных испытывающих недостаток мутантов восстанавливает рост бактерий на среде, содержащей гликолат в качестве единственного источника углерода, это означает, что данный фермент кодирует функциональный эквивалент гликолатдегидрогеназы E.coli. Способ и средство для комплементационного анализа описаны у Bari et al., 2004 и включены в данное описание посредством ссылки.

Молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие один полипептид, имеющий ферментативную активность гликолатдегидрогеназы, могут быть получены посредством методик рекомбинантных ДНК (например, ПЦР) или посредством химического синтеза. Идентификация и выделение молекул подобных нуклеиновых кислот может происходить за счет использования последовательностей, или части данных последовательностей, молекул известных нуклеиновых кислот гликолатдегидрогеназы или, исходя из реальной ситуации, обратных комплементарных цепей данных молекул, например, посредством гибридизации согласно стандартным методам (см., например, Sambrook et al., 1989).

Гликолатдегидрогеназой для цели изобретения может быть любая гликолатдегидрогеназа природного происхождения, или ее любой активный фрагмент или ее любой вариант, в котором некоторые аминокислоты (предпочтительно аминокислоты 1-20, более предпочтительно 1-10, даже более предпочтительно 1-5) были замещены, добавлены или удалены таким образом, чтобы фермент сохранял свою активность гликолатдегидрогеназы.

Согласно представленному изобретению, "нуклеиновую кислоту" или "молекулу нуклеиновой кислоты" необходимо понимать, как полинуклеотидную молекулу, которая может относиться к типу ДНК или РНК, предпочтительно к типу ДНК, и в частности иметь двойную цепь. Она может иметь природное или синтетическое происхождение. Синтетические нуклеиновые кислоты генерируют in vitro. Примерами подобных синтетических нуклеиновых кислот являются кислоты, в которых кодоны, которые кодируют полипептид (полипептиды), имеющий ферментативную активность гликолатдегидрогеназы согласно изобретению, были оптимизированы в соответствии с организмом хозяина, в котором он должен экспрессироваться (например, посредством замещения кодонов такими кодонами, которые являются более предпочтительными или наиболее предпочтительными в таблицах частоты использования кодонов организма подобного хозяина или группы, к которой относится организм подобного хозяина, по сравнению с первоначальным хозяином). Способы оптимизации кодонов хорошо известны квалифицированным специалистам.

Предпочтительными белками слияния из многих субъединиц гликолатдегидрогеназы являются белки, состоящие из слияния субъединиц бактериальной гликолатдегидрогеназы, более предпочтительно белки, состоящие из слияния трех существенных субъединиц, кодируемых опероном E. coli glc (gi/1141710/gb/L43490.1/ECOGLCC). Наиболее предпочтительными являются полипептиды, которые содержат слитые аминокислотные последовательности SEQ ID №№: 2 (Glc D), 4 (Glc E) и 6 (Glc F), в которых данные аминопоследовательности могут быть связаны линкером. Соответственно, нуклеиновая кислота, включающая полинуклеотидные последовательности SEQ ID NO: 1, 3 и 5, может быть использована для осуществления представленного изобретения.

Способ изобретения охватывает введение в геном клетки растения нуклеиновой кислоты, кодирующей белок слияния из многих субъединиц гликолатдегидрогеназы, имеющий ферментативную активность гликолатдегидрогеназы, при этом указанный полипептид содержит последовательности, имеющие идентичность последовательности, составляющую по меньшей мере 60, 70, 80 или 90%, особенно по меньшей мере 95%, 97%, 98% или по меньшей мере 99% на уровне аминокислотной последовательности с SEQ ID NO: 2, 4 и 6, соответственно, причем результатом введения нуклеиновой кислоты (кислот) является вновь возникающее экспрессирование одного полипептида, имеющего ферментативную активность гликолатдегидрогеназы, и при этом указанная активность локализована внутри хлоропластов.

Способ изобретения также охватывает введение в геном клетки растения нуклеиновой кислоты, кодирующей белок слияния из многих субъединиц гликолатдегидрогеназы, имеющий ферментативную активность гликолатдегидрогеназы, при этом указанная нуклеиновая кислота содержит последовательности нуклеиновых кислот с по меньшей мере 60, 70, 80 или 90%, особенно по меньшей мере 95%, 97%, 98% или по меньшей мере 99% идентичности последовательности к нуклеотидным последовательностям SEQ ID NO: 1, 3 и 5 соответственно, причем результатом введения нуклеиновой кислоты является вновь возникающее экспрессирование по меньшей мере одного полипептида, имеющего ферментативную активность гликолатдегидрогеназы, и при этом указанная активность локализована внутри хлоропластов.

Для цели данного изобретения, "идентичность последовательности" двух родственных нуклеотидных или аминокислотных последовательностей, выраженная в виде процентного соотношения, относится к числу позиций в двух оптимально выровненных последовательностях, которые имеют идентичные остатки (x100), деленные на число сравниваемых позиций. Делеция, т.е. позиция в выравнивании, где остаток присутствует в одной последовательности, но отсутствует в другой, рассматривается как позиция с неидентичными остатками. Выравнивание двух последовательностей может быть выполнено с помощью алгоритма Needleman и Wunsch (Needleman and Wunsch 1970) в EMBOSS (Rice et al., 2000) для поиска оптимального выравнивания по всей длине последовательностей, используя настройки по умолчанию (штраф на внесение делеции 10, штраф на продолжение делеции 0,5).

После того как последовательность чужеродной ДНК становится известной, можно разрабатывать праймеры и зонды, которые специфично узнают данные последовательности в нуклеиновой кислоте (ДНК или РНК) образца с помощью методики молекулярной биологии. Например, может быть разработан метод ПЦР для идентификации генов, используемых в способе изобретения (генов gdh) в биологических образцах (таких как образцы растений, растительный материал или продукты, содержащие растительный материал). Подобная ПЦР основана по меньшей мере на двух специфичных "праймерах", при этом, например, оба узнают последовательность внутри кодирующей области gdh, используемой в изобретении (например, кодирующей области SEQ ID № 1, 3, 5), или один узнает последовательность внутри кодирующей области gdh, а другой узнает последовательность внутри соответствующей последовательности транзитного пептида или внутри регуляторных областей, таких как промотор или 3’-конец химерного гена, содержащего ДНК gdh, используемого в изобретении. Праймеры предпочтительно имеют последовательность между 15 и 35 нуклеотидами, которые в условиях оптимизированной ПЦР специфически распознают последовательность внутри химерного гена gdh, используемого в изобретении, так что специфичный фрагмент ("фрагмент интеграции" или дискриминирующий ампликон) амплифицируется из образца нуклеиновой кислоты, содержащего ген gdh, используемый в изобретении. Это означает, что в условиях оптимизировнной ПЦР амплифицируется только намеченный фрагмент интеграции, и никакая другая последовательность в геноме растения или чужеродной ДНК.

Способ изобретения охватывает также введение в геном клетки растения нуклеиновой кислоты, кодирующей белок слияния из многих субъединиц гликолатдегидрогеназы, имеющий ферментативную активность гликолатдегидрогеназы, при этом указанная одна нуклеиновая кислота гибридизирует в жестких условиях в нуклеотидную последовательность, выбранную из группы SEQ ID NO: 1, 3 и 5, при этом результатом введения нуклеиновой кислоты (кислот) является вновь возникающее экспрессирование одного полипептида, имеющего ферментативную активность гликолатдегидрогеназы, и при этом указанная активность локализована внутри хлоропластов. Жесткие условия гибридизации, как используется в данном описании, относится в частности к следующим условиям: иммобилизация релевантных последовательностей ДНК на фильтре, и предварительная гибридизация фильтров на протяжении каждых 1-2 часов в 50% формамиде, 5% SSPE, 2x растворе Денхардта и 0,1% SDS при 42°C, или 1-2 часов в 6x SSC, 2x растворе Денхардта и 0,1% SDS при 68°C. Денатурированный зонд, меченый dig или радиоактивной меткой, затем добавляли непосредственно в предгибридизационную текучую среду и проводили инкубацию на протяжении от 16 до 24 часов при соответствующей температуре, указанной выше. После инкубации фильтры затем промывали в течение 30 минут при комнатной температуре в 2x SSC, 0,1% SDS, с последующими 2 промываниями по 30 минут каждое при 68°C в 0,5 × SSC и 0,1% SDS. Авторадиограф установили посредством экспозиции фильтров в течение 24-48 часов на рентгеновской пленке (Kodak XAR-2 или аналогичной) при -70°C с усиливающим экраном. Конечно, в данном процессе могут быть использованы аналогичные условия и параметры, при этом все еще сохраняются необходимые жесткие условия гибридизации.

Терминология ДНК или белок, "включающий в себя" определенную последовательность X, как используется на протяжении всего текста, относится к ДНК или белку, включающему или содержащему по меньшей мере последовательность X, так что другие последовательности нуклеотидов или аминокислот могут быть включены в 5’-(или N-терминальный) и/или 3’-(или C-терминальный) конец, например (нуклеотидная последовательность кодирования) селектируемый маркер белок, (нуклеотидная последовательность кодирования) транзитный пептид, и/или 5’-лидерную последовательность или 3’-трейлерную последовательность. Аналогичным образом, должно быть понятно, что применение термина "содержат", "содержащие" или "содержит" на протяжении всего текста и формулы изобретения данной заявки подразумевает включение приведенного числа или стадии или группы чисел или стадий, но не исключение какого-либо другого числа или стадии или стадии или группы чисел или стадий.

Способ представленного изобретения состоит в инсталляции активности гликолатдегидрогеназы внутрь хлоропласта. Это может быть произведено либо посредством введения нуклеиновой кислоты, кодирующей активность гликолатдегидрогеназы, в ядерный геном клеток растения, при этом кодирующую последовательность белка затем сливают с нуклеиновой кислотой, кодирующей хлоропластный транзитный пептид. В качестве альтернативы, активность гликолатдегидрогеназы может быть добавлена хлоропласту с помощью непосредственной трансформации генома хлоропласта нуклеиновой кислотой (кислотами), кодирующей соответствующий фермент.

Могут использоваться общие методики для трансформирования клеток растений или тканей растений. Одна группа способов содержит бомбардирование клеток, протопластов или тканей частицами, с которыми соединены последовательности ДНК. Еще одна группа способов содержит применение, в качестве средства для переноса в растение, химерного гена, который вставляют в плазмиду Ti Agrobacterium tumefaciens или плазмиду Ri Agrobacterium rhizogenes. Могут быть использованы другие способы, такие как микроинъекции или электропорация, или прямая преципитация иным образом с использованием PEG. Квалифицированные специалисты могут выбрать любой подходящий способ и средство для трансформации клетки растения или растения.

С целью экспрессирования нуклеиновой кислоты, которая кодирует полипептид, обладающий ферментативной активностью, которая требуется для представленного изобретения в клетках растений, могут использоваться любые подходящие регуляторные последовательности. Регуляторные последовательности будут предоставлять области инициации транскрипции и трансляции, а также терминальные области, в которых инициация транскрипции может быть конститутивной или индуцируемой. Кодирующая область является функционально связанной с такими регуляторными последовательностями. Подходящие регуляторные последовательности представлены конститутивным промотором 35S. В качестве альтернативы, может быть использован конститутивный промотор убиквитина, в частности промотор убиквитина кукурузы (GenBank: gi19700915). Примеры для индуцируемых промоторов представлены светоиндуцируемыми промоторами малой субъединицы RUBISCO и промоторами "белков, связывающих светоулавливающий комплекс (lhcb)". Преимущественно, может быть использована промоторная область gos2 гена Oryza sativa, включающая 5’-нетранслируемую область гена GOS2 с интроном (de Pater et al., 1992), промоторная область рибулозо-1,5-бифосфонаткарбоксилазы малой субъединицы гена Oryza sativa (Kyozuka J. et al., 1993), или промоторная область гена актина 1 Oryza sativa (McElroy D. et al., 1990).

Согласно изобретению, можно осуществить применение, в сочетании с промотором, других регуляторных последовательностей, которые распложены между промотором и кодирующей последовательностью, такой как активаторы транскрипции ("энхансеры"), например активатор трансляции вируса табачной мозаики (TMV), описанный в заявке WO 87/07644, или вируса гравировки табака (TEV), описанный Carrington & Freed 1990, например, или интроны, такие как интрон adhl кукурузы или интрон актина 1 риса.

В качестве регуляторного терминатора или последовательности полиаденилирования, можно осуществить применение любой соответствующей последовательности бактериального происхождения, такой как, например, терминатор nos Agrobacterium tumefaciens, вирусного происхождения, такой как, например, терминатор CaMV 35S, или растительного происхождения, такой как, например, терминатор гистон, как описано в заявке EP 0633317.

В одном отдельном варианте осуществления изобретения, в результате того, что предпочтительной является трансформация ядерного генома, нуклеиновая кислота, которая кодирует транзитный пептид хлоропласта, задействует 5’ последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей гликолатдегидрогеназу, при этом данная последовательность транзитного пептида расположена между областью промотора и нуклеиновой кислотой, кодирующей гликолатдегидрогеназу, таким образом, чтобы позволить экспрессирование транзитного пептида/белка слияния гликолатдегидрогеназы. Транзитный пептид делает возможным направить гликолатдегидрогеназу в пластиды, более конкретно в хлоропласты, при этом белок слияния расщепляется между транзитным пептидом и гликолатдегидрогеназой, когда последний попадает в пластиду. Транзитный пептид может быть единственным пептидом, таким как транзитный пептид EPSPS (описанный в патенте США 5188642), или транзитный пептид малой субъединицы рибулозобискарбоксилазы/оксигеназы (RuBisCO ssu) растения, например, транзитный пептид хлоропласта, полученный из гена рибулозо-1,5-бифосфаткарбоксилазы из Solanum tuberosum (GenBank: ген gi21562, кодирующий белок G68077, аминокислоты 1-58), при включении соответствующим образом нескольких аминокислот N-терминальной части зрелой RuBisCO ssu (EP 189707), или направляющий пептид хлоропласта гена rbcS1 (gi21562) картофеля. Транзитный пептид может быть целым транзитным пептидом природного происхождения (дикий тип), его функциональным фрагментом, его функционально активным мутантом. Он также может представлять собой химерный транзитный пептид, в котором по меньшей мере два транзитных пептида связаны друг с другом, или в котором части различных транзитных пептидов связаны друг с другом функциональным образом. Один пример такого химерного транзитного пептида включает транзитный пептид RuBisCO ssu подсолнечника, слитый с N-терминальной частью RuBisCO ssu кукурузы, слитой с транзитным пептидом кукурузы RuBisCO ssu, как описано в патенте EP 508909.

В качестве альтернативы, полипептиды могут быть непосредственно экспрессированы в хлоропласт с использованием трансформации генома хлоропласта. Способы для интегрирования интересующих нуклеиновых кислот в геном хлоропласта являются известными в данной области, в частности способы, основанные на механизме гомологичной рекомбинации. Подходящие векторы и системы селекции являются известными квалифицированным специалистам в данной области. Кодирующие последовательности для полипептидов могут либо переноситься в отдельные векторы, либо в одну конструкцию, в которой отдельные открытые рамки считывания могут быть слиты с одной или несколькими полицистронными РНК с сайтами, связанными рибосомами, добавленными перед каждой отдельной открытой рамкой считывания для того, чтобы допустить независимую трансляцию. Пример средств и способов, которые могут использоваться для данной интеграции в геном хлоропласта, приведен, например, в WO 06/108830, содержание который включено в данное описание посредством ссылки.

Когда нуклеиновые кислоты непосредственно интегрируют в геном хлоропласта, последовательность транзитного пептида не требуется. В таком случае, инициирующий трансляцию кодон (Met) может быть добавлен к последовательности, кодирующей зрелый белок, чтобы обеспечить инициирование трансляции.

Объектом представленного изобретения также являются нуклеиновые кислоты, кодирующие белок слияния из многих субъединиц гликолатдегидрогеназы.

В отдельном варианте осуществления, нуклеиновая кислота изобретения кодирует белок слияния из многих субъединиц гликолатдегидрогеназы, который содержит аминокислотную последовательность, которая нацеливает указанный белок в хлоропласт.

В еще одном отдельном варианте осуществления, нуклеиновая кислота изобретения кодирует белок слияния из многих субъединиц гликолатдегидрогеназы, который представляет собой результат слияния субъединиц бактериальной гликолатдегидрогеназы.

В еще одном отдельном варианте осуществления, нуклеиновая кислота изобретения кодирует белок слияния из многих субъединиц гликолатдегидрогеназы, который представляет собой результат слияния трех субъединиц, кодируемых опероном glc E. coli.

В еще одном отдельном варианте осуществления, нуклеиновая кислота изобретения кодирует белок слияния из многих субъединиц гликолатдегидрогеназы, который содержит аминокислотные последовательности, имеющие по меньшей мере 60% идентичности последовательности к последовательностям SEQ ID NO: 2, 4 и 6 соответственно.

В еще одном отдельном варианте осуществления, нуклеиновая кислота изобретения кодирует белок слияния из многих субъединиц гликолатдегидрогеназы, который содержит полинуклеотидные последовательности, имеющие по меньшей мере 60% идентичности последовательности к полинуклеотидным последовательностям SEQ ID NO: 1, 3 и 5, соответственно.

Объектом представленного изобретения также являются клетки растений, ткани растений, растения и их часть или семена, включающие одну нуклеиновую кислоту, кодирующую белок слияния из многих субъединиц гликолатдегидрогеназы, и экспрессирующие внутри хлоропласта один полипептид, обладающий ферментативной активностью гликолатдегидрогеназы.

Отдельные варианты осуществления нуклеиновых кислот, введенных в клетки растений, ткани растений, растения и часть или их семена, упомянуты выше.

Представленное изобретение также относится к растениям, которые содержат трансформированные клетки, в частности растения, которые являются регенерированными из трансформированных клеток. Регенерация может быть получена посредством любого подходящего способа. Могут быть использованы следующие патенты и патентные заявки, в частности, относящиеся к способам транформирования клеток растений и регенерации растений: US 4459355, US 4536475, US 5464763, US 5177010, US 5187073, EP 267159, EP 604662, EP 672752, US 4945050, US 5036006, US 5100792, US 5371014, US 5478744, US 5179022, US 5565346, US 5484956, US 5508468, US 5538877, US 5554798, US 5489520, US 5510318, US 5204253, US 5405765, EP 442174, EP 486233, EP 486234, EP 539563, EP 674725, WO 91/02071 и WO 95/06128.

Представленное изобретение также относится к трансформированным растениям или их частям, которые получены посредством культивирования и/или скрещиванием с регенерированными растениями, и к семенам трансформированных растений, характеризующимся тем, что они содержат трансформированную клетку растения согласно изобретению.

В отдельном варианте осуществления изобретения, трансформированные растения или их части выбраны из риса, пшеницы, ячменя, картофеля, рапса, табака.

В отдельном варианте осуществления изобретения, трансгенные семена и мука, масло или пища, полученная из них, происходят из растений риса, пшеницы, ячменя, рапса или табака.

Представленное изобретение также относится к любым продуктам, таким как мука, которые получены посредством переработки растений, их частей или семян изобретения. Например, изобретение охватывает зерна, полученные при переработке семян согласно изобретению, но также муку, полученную при дальнейшей переработке семян или зерен, а также любой пищевой продукт, полученный из указанной муки.

Список последовательностей:

SEQ ID № 1: ДНК последовательность glc D Escherichia coli

SEQ ID № 2: аминокислотная последовательность, кодируемая SEQ ID № 1

SEQ ID № 3: ДНК последовательность glc E Escherichia coli

SEQ ID № 4: аминокислотная последовательность, кодируемая SEQ ID № 3

SEQ ID № 5: ДНК последовательность glc F Escherichia coli

SEQ ID № 6: аминокислотная последовательность, кодируемая SEQ ID № 5

ФИГУРЫ

Фиг.1: Конструирование синтетических, состоящих из множества субъединиц кассет слияния. glcD, glcE и glcF: бактериальные гены, кодирующие субъединицы D, E и F GDH. I: линкер (Gly₄Ser)₃. T: метка His6. Стрелка: сайт расщепления энтерокиназы. Указаны введенные сайты рестрикции.

Фиг.2: Параметры роста трансгенных и нетрансгенных линий. A: Фенотип 4-недельных трансгенных растений T_0, продуцирующих DEFp в хлоропласте. B: Площадь листьев 7-недельных растений табака. DEFp (n=6), EFDp (n=5), FDEp (n=4), C: растения нетрансгенного N. tabacum cv. Petit Havana SR1 (n=6).

ПРИМЕР 1: Создание синтетических, состоящих из множества субъединиц генных конструкций

Бактериальные кДНК glcD, glcE и glcF, кодирующие субъединицы D, E и F GDH, были слиты с гибким линкером, кодирующим мотив (Gly₄Ser)₃, в генной конструкции из множества субъединиц (Фиг.1).

Сайты рестрикции, показанные в Фиг.1, ввели, чтобы обеспечить реаранжировку субъединиц glcD, glcE и glcF и субклонирование кассет, состоящих из множества субъединиц, в бактериальные и растительные векторы экспрессии. Кроме того, внутренние сайты рестрикции (PstI/SalI и NcoI/XhoI) ввели, чтобы облегчить замену линкера (Gly₄Ser)₃ другими гибкими линкерами. В дополнение, генерирование кассет слияния двух генов будет возможным посредством делеции кДНК в срединном положении через сайты рестрикции SalI/XhoI.

C-терминальную метку His6 ввели, чтобы обеспечить возможность обнаружения и очистки рекомбинантных белков. Чтобы избежать возможного влияния метки His6 на ферментативную активность фермента энтерокиназы, состоящего из множества субъединиц GDH, добавили сайт расщепления перед меткой His6, обеспечивая возможность удаления C-терминальной метки.

ПРИМЕР 2: Синтез кассет слияния множества субъединиц

Разработали три кассеты слияния множества субъединиц, содержащие кДНК трех бактериальных субъединиц в трех различных компоновках glcD-glcE-glcF, glcE-glcF-glcD и glcF-glcD-glcE, и синтезировали синтетические гены, кодирующие соответствующие полипептиды DEFp, EFDp и FDEp, соответственно. Перед синтезом, кодоны синтетических генов оптимизировали для максимального результата экспрессирования в соответствии с частотой использования кодона Brassica napus. Кроме того, на основании генетического алгоритма, синтетические гены одновременно оптимизировали по большому набору конкурирующих параметров, таких как вторичная структура мРНК, скрытые участки сплайсинга, повторения кодонов и мотивов, и гомогенного содержания GC.

ПРИМЕР 3: Комплементационный анализ мутантов E. coli испытывающих недостаток в трех субъединицах, образующих активную эндогенную гликолатдегидрогеназу

Чтобы определить, способны ли DEFp, EFDp и FDEp дополнять гликолатоксидазные мутанты E. coli, провели комплементационный анализ с мутантом E. coli JA155, который несет транспозонную вставку в субъединице glcD оперона glc и неспособен к росту на гликолате в качестве единственного источника углерода. Сверхэкспрессия DEFp, EFDp и FDEp в данном мутанте сохранила рост бактерий в среде, содержащей гликолат в качестве единственного источника углерода, показывая, что все три полипротеина являются функциональными in vivo и могут дополнять субъединицу glcD активного фермента EcGO.

ПРИМЕР 4: Субклонирование кДНК DEFp, EFDp и FDEp в растительные векторы экспрессии

Чтобы in vivo оценить действие бактериального полипротеина из множества субъединиц DEFp, EFDp и FDEp на активность GDH и производство биомассы в растениях N. tabacum cv. Petit Havanna SR1, кДНК, кодирующую DEFp, EFDp и FDEp, вставляли в растительный вектор экспрессии, обеспечивая нацеливание рекомбинантного белка на хлоропласты клеток растения. Трансгенной экспрессией управляли с помощью промотора CaMV 35S с дуплицированной областью энхансера.

Синтезированную кДНК DEFp первоначально вставляли в челночный вектор pTRAkc, используя сайты рестрикции EcoRI и XbaI перед терминатором CaMV 35S, генерируя плазмиду pTRA-nptll-DEFp. Плазмида pTRA содержит область крепления каркаса гена RB7 табака (gi3522871) и кассету nptll pPCV002 (Konz и Schell, 1986) для отбора трансгенных растений на канамицине (Фиг.2). Вслед за этим, конститутивный дважды усиленный промотор CaMV 35S, нетранслируемую 5’-область гена хальконсинтазы и последовательность направляющего пептида хлоропласта гена rbcS1 картофеля амплицифировали посредством ПЦР, используя в качестве шаблона плазмиду pTRAkc-rbcs1-cTP. Амплифицированный с помощью ПЦР фрагмент затем субклонировали в pTRA-nptll-DEF, используя сайты рестрикции AscI и AatII.

Клонирование кДНК EFDp и FDEp в растительный вектор экспрессии проводили аналогичным образом. Три итоговые конструкции обозначили: pTRA-35S-rbcs-cTP:DEFp, pTRA-35S-rbcs-cTP:EFDp и pTRA-35S-rbcs-cTP:FDEp, соответственно.

ПРИМЕР 5: Трансформация и регенерация растения табака

Растительные векторы экспрессии вводили в клетки GV3101 Agrobacterium tumefaciens, используя систему электропорации Gene Pulser II (BioRad, Hercules, CA, USA) согласно инструкциям производителя. Для исследования эффекта накопления DEFp, EFDp и FDEp в устойчиво трансформированных растениях табака (N. tabacum cv. Petit Havana SR1), трансгенные растения T₀ генерировали посредством трансформации листового диска рекомбинантной A. tumefaciens (Horsch et al., 1985), используя в качестве маркера селекции канамицин. Полученные растения культивировали в парнике в стандартной почве DE73 с фотопериодом естественного дневного освещения 16 часов и температурой дневного времени 22°C /ночного времени 20°C.

До 33 трансгенных растений T₀ скринировали на наличие трансгена и рекомбинантного белка с помощью множественной ПЦР и анализа методом иммуноблоттинга, соответственно. 33-48% исследованных линий продуцировали DEFp, EFDp или FDEp, соответственно, с ожидаемым размером молекул, составляющим 142 кДа. Семь линий T_0, показывающих наивысший уровень рекомбинантных белков (от 0,03 до 0,09% общего растворимого белка), использовали для создания поколения T₁.

ПРИМЕР 6: Выделение хлоропласта и ферментные анализы

Интактные хлоропласты выделяли, используя методику, описанную Kleffmann et al., 2007. Данные препараты свободны от действия загрязняющей каталазы ифумаразы (>95% чистоты).

Функцию гликолатдегидрогеназы измеряли, как описано у Lord J.M., 1972. 100 мкг экстракта белка хлоропласта добавляли к 100 мкмоль фосфата калия (pH 8,0), 0,2 мкмоль DCIP, 0,1 мл 1% (м/о) PMS, и 10 мкмоль гликолата калия в итоговом объеме, составляющем 2,4 мл. В фиксированные временные интервалы отдельные исследования завершали, добавляя 0,1 мл 12 M HCI. После выдерживания в течение 10 мин, добавляли 0,5 мл 0,1 M фенилгидразин-HCI. Обеспечивали возможность выдерживания смеси на протяжении дальнейших 10 мин, а затем торможение вследствие образования глиоксилатфенилгидразона измеряли при 324 нм.

ПРИМЕР 7: Высвобождение СО₂ из меченого гликолата в экстрактах хлоропластов

1 мкCi [1,2-14C]-гликолата (Hartmann Analytics) добавляли в 50 мкг экстракта белка хлоропласта в плотно закупоренной 15-мл пробирке. Высвобожденный СО ₂ абсорбировали в 500-мкл пробирке, содержащей 0,5 M NaOH, присоединенный к внутренней стенке 15-мл пробирки. Образцы инкубировали в течение 5 часов, при этом газовую фазу в пробирке часто перемешивали с помощью шприца.

ПРИМЕР 8: Оценка фенотипа растений, экспрессирующих GDH E.coli

Рост трансгенных растений, продуцирующих рекомбинантный белок DEFp, EFDp или FDEp в хлоропласте, отслеживали посредством измерения площади листьев согласно формуле:

Площадь листьев (см²) = 3,73 × (длина