Способ ферментативного получения серусодержащих аминокислот

Группа изобретений относится к области биотехнологии. Предложен способ ферментативного получения серусодержащих аминокислот, включающий стадии, на которых: а) получают микроорганизм семейства Enterobacteriaceae или микроорганизм семейства Corynebacteriaceae, в котором происходит сверхэкспрессия гена, кодирующего полипептид с активностью тиосульфат-сульфотрансферазы; б) ферментируют микроорганизм, полученный на стадии а), в среде, которая содержит неорганический источник серы, выбранный из группы, включающей соль тиосерной кислоты или смесь соли тиосерной кислоты и соли серной кислоты, получая ферментационный бульон, и в) концентрируют серусодержащую аминокислоту в ферментационном бульоне, полученном на стадии б). Предложен микроорганизм Corynebacterium glutamicum, который секретирует или продуцирует L-метионин и сверхэкспрессирует ген, кодирующий полипептид с активностью тиосульфат–сульфотрансферазы. Предложен микроорганизм Escherichia coli, который секретирует или продуцирует L-метионин и сверхэкспрессирует ген, кодирующий полипептид с активностью тиосульфат–сульфотрансферазы. Группа изобретений позволяет повысить продукцию серусодержащих аминокислот, в частности L-метионина. 3 н. и 13 з.п. ф-лы, 1 ил., 4 табл., 7 пр.

Реферат

Настоящее изобретение относится к способу ферментативного получения серусодержащих аминокислот, выбранных из группы, включающей L-метионин, L-цистеин, L-цистин, L-гомоцистеин и L-гомоцистин.

Серусодержащие аминокислоты имеют важное экономическое значение. L-цистеин применяют в качестве пищевой добавки, в качестве сырья для фармакологически активных соединений (например, N-ацетилцистеина) и для косметических средств. Аминокислота L-метионин имеет очень важное значение для питания животных. Она относится к незаменимым аминокислотам, которые не могут образовываться путем биосинтеза в процессе метаболизма у позвоночных животных. Следовательно, при выкармливании животных необходимо гарантировать потребление в достаточных количествах метионина с кормом. Однако, поскольку L-метионин часто присутствует в традиционных кормовых растениях (таких как соя или зерновые культуры) в количествах, слишком низких для того, чтобы гарантировать оптимальное питание животных, прежде всего свиней и домашней птицы, то целесообразно примешивать метионин в качестве добавки к корму для животных. В организме позвоночных животных D-метионин может превращаться в биологически активный L-метионин. Поэтому в корм для животных, как правило, добавляют рацемат D- и L-метионина. В организме животных L-гомоцистеин может превращаться путем трансметилирования в L-метионин и поэтому может служить его заменой.

Из существующего уровня техники известно получение аминокислот, таких как метионин, путем химического синтеза. При таком получении сначала подвергают взаимодействию акролеин и метилмеркаптан с получением 3-метилтиопропиональдегида, из которого путем взаимодействия с цианидом, аммиаком и монооксидом углерода получают гидантоин. На конечной стадии его гидролизуют с получением рацемата, эквимолярной смеси обоих стереоизомеров, т.е. D- и L-метионина. Поскольку обладающая биологической активностью форма молекулы представляет собой исключительно L-форму, то D-форма, входящая в корм, сначала должна превратиться в процессе метаболизма путем де- и трансаминирования в активную L-форму.

В отличие от метионина большинство других встречающихся в естественных условиях протеиногенных аминокислот получают главным образом путем ферментации с использованием микроорганизмов. Этот метод основан на том факте, что для микроорганизмов характерны соответствующие пути биосинтеза, обеспечивающие синтез встречающихся в естественных условиях аминокислот. Кроме того, многие процессы ферментации позволяют осуществлять очень выгодное с точки зрения стоимости производство с выделением недорогих эдуктов, таких как глюкоза и минеральные соли, и кроме того, позволяют получать биологически активную L-форму конкретной аминокислоты.

Однако в штаммах дикого типа пути биосинтеза аминокислот находятся под строгим метаболическим контролем, это гарантирует, что аминокислоты продуцируются только для обеспечения собственных потребностей клетки. Таким образом, важной предпосылкой для эффективных процессов производства является создание соответствующих микроорганизмов, которые в отличие от организмов дикого типа обладают резко увеличенной способностью продуцировать требуемую аминокислоту.

Указанные микроорганизмы, отличающиеся сверхпроизводством аминокислот, можно получать общепринятыми методами осуществления мутации/селекции и/или с использованием современных целенаправленных методов рекомбинации (метаболическая инженерия). В последнем случае прежде всего идентифицируют гены или аллели, которые влияют на сверхпроизводство аминокислот в результате их модификации, активации или инактивации. Затем эти гены/аллели интродуцируют в штамм микроорганизма или инактивируют с использованием методов молекулярной биологии таким образом, чтобы достигать оптимального сверхпроизводства. Однако часто только комбинация нескольких различных путей приводит к действительно эффективному производству.

В E. coli и C. glutamicum L-цистеин образуется в результате биохимических процессов из L-серина. L-серин активируется с образованием O-ацетилсерина с помощью серинацетилтрансферазы CysE. Затем O-ацетилсерин-(тиол)лиаза переносит восстановленную серу в форме сульфида в результате чего образуется L-цистеин. В отличие от C. glutamicum у E. coli присутствуют две различные O-ацетилсерин-(тиол)лиазы, в том числе O-ацетилсерин-(тиол)лиаза В («CysM»), которая тоже обладает способностью переносить тиосульфат на 0-ацетилсерин. В результате образуется S-сульфоцистеин, который затем расщепляется на L-цистеин и сульфит или сульфат с помощью пока не изученного механизма (Kredich N.M. в: «Escherichia coli and Salmonella», под ред. Neidhardt F.C. и др., 2-ое изд., 1996, сс. 514-527).

L-метионин наряду с лизином и треонином образуется из аспартата. Серу интродуцируют в L-метионин в форме L-цистеина (через цистатионин в качестве промежуточного продукта) путем транссульфурирования (в C. glutamicum и E. coli; у E. coli этот путь является единственным). Параллельно этому, например, у C. glutamicum, присутствует путь прямого сульфурирования, при котором сульфид ассимилируется в форме L-гомоцистеина (B-J Hwang, H-J Yeom, Y. Kirn, H-S Lee J Bacteriol., 184(5), 2002, сс. 1277-1286). С 1-группа L-метионина образуется в результате С 1-метаболизма и переносится на L-гомоцистеин с помощью метионинсинтаз MetE и MetH (обзор: Greene R.C. в: «Escherichia coli and Salmonella», под ред. Neidhardt F.C. и др., 2-ое изд., 1996, сс. 542-560). Биосинтез L-метионина в C. glutamicum описан у Ruckert с соавторами (Ruckert С., PUhler A., Kalinowski J., J Biotechnol., 104(1-3), 2003, сс. 213-228). Штаммы и методы ферментативного получения L-метионина описаны, например, для E. coli (WO 2006/001616, WO 2009/043803) и C. glutamicum (WO 2009/144270).

Использование тиосульфата в качестве источника серы позволяет значительно увеличивать теоретический выход производства серусодержащих аминокислот (по сравнению с сульфатом) (Krömer J.O., Wittmann С., Schroder H., Heinzle Е., Metab Eng., 8 (4), 2006, сс. 353-369; и WO 2007/020295). Преимущество тиосульфата объясняется следующим образом: в сульфате (S04) присутствует атом серы, имеющий степень окисления +6. Для ассимиляции степень окисления должна быть снижена до -2 (сульфид, S "). Для восстановления сульфата до сульфида клетки должны использовать две молекулы АТФ и 4 НАДФ-Н (т.е. в общей сложности 8 электронов). В тиосульфате центральный атом серы имеет степень окисления +5, а концевой атом серы имеет степень окисления -1 (средняя формальная степень окисления двух атомов серы: +2). Для восстановления обоих атомов серы тиосульфата требуется только 8 электронов по сравнению с 16 электронами, которые требуются для восстановления двух сульфатов.

Применение тиосульфата в качестве источника S для производства L-цистеина с использованием E. coli описано, например, в DE 102007007333 и WO 2001/27307.

В WO 2007/077041 описано, что при применении тиосульфата вместо сульфата можно повышать также в значительной степени производство L-метионина в E. coli.

К настоящему времени пока не продемонстрировано экспериментально, что применение тиосульфата приводит также к повышению производства L-метионина в C. glutamicum. В WO 2007/020295 (с. 240) указано, что при применении Na-тиосульфата в качестве источника серы C. glutamicum образует больше биомассы. Это определяли, используя в качестве показателя снижение уровня потребления АТФ и НАДФ-Н. Производство L-метионина с использованием тиосульфата на практике не изучено.

У E. coli тиосульфат поглощается с помощью транспортера сульфата/тиосульфата CysPUWA-Sbp (Kredich N.M., в: «Escherichia coli and Salmonella», под ред. Neidhardt F.C. и др., 2-ое изд., 1996, сс. 514-527). CysP и Sbp представляют собой два различных периплазматических связывающих белка. CysP обладает повышенной аффинностью к тиосульфату, а Sbp обладает повышенной аффинностью к сульфату. CysA образует АТФ-связывающий компонент.CysU и CysW представляют собой трансмембранные компоненты. В WO 2009/043803 описано усиление экспрессии оперона cysPUWAMb E. coli и достижение тем самым повышения производства L-метионина. Сведения о поглощении тиосульфата у C. glutamicum отсутствуют.«Knock ом/»-мутанты предполагаемой системы поглощения сульфата CysZ (cg3112) все еще могут сохранять способность к росту в присутствии тиосульфата в качестве источника S (Riickert С. и др., ВМС Genomics., т. 6 (121), 2005). Таким образом, CysZ не является (единственным) элементом, ответственным за транспорт тиосульфата.

O-ацетилсерин-(тиол)лиаза В (т.е. CysM, КФ 2.5.1.47) обеспечивает способность E. coli использовать тиосульфат в качестве источника S для синтеза L-цистеина и L-метионина. Указанный фермент катализирует образование S-сульфоцистеина (R-S-SO3) и ацетата из O-ацетилсерина и тиосульфата. Затем S-сульфоцистеин расщепляется на L-цистеин и сульфит или сульфат с помощью пока не известного пути (Kredich N.M. в: «Escherichia coli and Salmonella», под ред. Neidhardt F.C. и др., 2-ое изд., 1996, сс. 514-527). Сульфат восстанавливается до сульфита () в результате трехстадийного процесса с использованием АТФ-сульфурилазы (CysDN), APS-киназы (CysC) и PAPS-сульфотрансферазы (CysH). Затем сульфит восстанавливается с помощью НАДФ⋅Н-сульфитредуктазы с образованием сульфида (S2-), который O-ацетилсерин(тиол)лиаза A (CysK) и O-ацетилсерин(тиол)лиаза В (CysM) могут использовать для синтеза второй молекулы L-цистеина.

C. glutamicum может расти в минимальной среде с тиосульфатом в качестве источника серы (Rflckert С. и др., ВМС Genomics., т.6(121), 2005). Однако у C. glutamicum отсутствует O-ацетилсерин(тиол)лиаза В («CysM») (Ruckert и Kalinowski в: «Corynebacteria: Genomics and Molecular Biology», под ред. А. Burkovski, изд-во Caister Academic Press, 2008). Таким образом, тиосульфат может ассимилироваться иным образом.

В основу настоящего изобретения была положена задача разработать способ и штаммы микроорганизмов, позволяющие увеличивать сверхпроизводство серусодержащих аминокислот, в частности L-метионина.

Указанная задача решается с помощью способа ферментативного получения серусодержащих аминокислот, выбранных из группы, включающей L-метионин, L-цистеин, L-цистин, L-гомоцистеин и L-гомоцистин, заключающегося в том, что осуществляют стадии, на которых:

а) получают микроорганизм семейства Enterobacteriaceae или микроорганизм семейства Corynebacteriaceae, который обладает повышенной тиосульфат-сульфотрансферазной активностью по сравнению с конкретным исходным штаммом;

б) ферментируют микроорганизм, полученный на стадии а), в среде, которая содержит соль дитиосерной кислоты или смесь соли дитиосерной кислоты и соли серной кислоты в качестве неорганического источника серы, получая ферментационный бульон, и

в) концентрируют серусодержащую аминокислоту в ферментационном бульоне, полученном на стадии б).

Изобретение относится также к способу ферментативного получения серусодержащих аминокислот, выбранных из группы, включающей L-метионин, L-цистеин, L-цистин, L-гомоцистеин и L-гомоцистин, заключающемуся в том, что осуществляют стадии, на которых:

а) получают микроорганизм семейства Enterobacteriaceae или микроорганизм семейства Corynebacteriaceae, в котором имеет место сверхэкспрессия гена, кодирующего полипептид с активностью тиосульфат-сульфотрансферазы;

б) ферментируют микроорганизм, полученный на стадии а), в среде, которая содержит соль дитиосерной кислоты или смесь соли дитиосерной кислоты и соли серной кислоты в качестве неорганического источника серы, получая ферментационный бульон, и

в) концентрируют серусодержащую аминокислоту в ферментационном бульоне, полученном на стадии б).

Тиосульфат-сульфотрансферазы, которые обозначают также как «роданазы» (КФ 2.8.1.1), представляют собой ферменты, которые переносят восстановленный атом серы с тиосульфата на цианид (CN-).

Некоторые тиосульфат-сульфотрансферазы могут переносить также восстановленный атом серы на альтернативные субстраты, например, на дигидролипоат (Alexander К., Volini M, J. Biol. Chem., 262, 1987, сс. 6595-6604). В базе данных «Clusters of Orthologous Groups of proteins» (кластеры ортологичных групп белков) (COG) в категории COG0607 «Rhodanese-related sulphurtransferase» в настоящее время присутствуют 168 гомологов сульфотрансфераз во всех трех доменах жизни (Tatusov R.L., Fedorova N.D., Jackson J.D., Jacobs A.R., Kiryutin В., Koonin E.V., Krylov D.M., Mazumder R., Mekhedov S.L., Nikolskaya A.N., Rao B.S., Smirnov S., Sverdlov A.V., Vasudevan S., Wolf Y.I., Yin J.J., Natale D.A., BMC Bioinformatics, 4, 2003, с. 41; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/COG/). Родоназы имеют один или несколько характерных роданазаподобных доменов (база данных PFAMe PF00581, http://pfam.sanger.ac.uk/: Gliubich F., Gazerro M., Zanotti G., Delbono S., Bombieri G., Berni R., J Biol Chem., 271 (35), 1996, сс. 21054210-61).

Ген RDL2 (rhodanese-like protein) (роданазаподобный белок) из Saccharomyces cerevisiae S288c кодирует состоящий из 149 аминокислот белок Rdl2p.Он содержит роданазаподобный домен (база данных PFAM PF00581, http://pfam.sanger.ac.uk/). Экспериментально установлено, что Rdl2p представляет собой тиосульфат-сульфотрансферазу (роданаза, КФ 2.8.1.1; Foster M.W., Forrester M.T., Stamler J.S., Proc Nati Acad Sci USA, 106(45), 2009, сс. 18948-18953). В SEQ ID NO: 1 представлена ДНК-последовательность гена RDL2. В SEQ ID NO: 2 представлена аминокислотная последовательность белка Rdl2p, кодируемого RDL2.

E. coli несет помимо хорошо охарактеризованных роданаз GlpE и PspE (Adams H., Teertstra W., Koster M., Tommassen J., FEBS Lett. 518, 2002, сс. 173-176) семь дополнительных паралогичных ферментов с роданазаподобными доменами (Cheng H., Donahue J.L., Battle S.E., Ray W.K., Larson T.J., Open Microbiol J., 2, 2008, сс. 18-28):

Фермент YgaP содержит N-концевой роданазаподобный домен и два трансмембранных домена. Для него обнаружена in vitro роданазная активность (Ahmed F., 2003, диссертация).

Фермент YbbB представляет собой тРНК-2-селенуридинсинтазу и имеет N-концевой роданазаподобный домен (Wolfe M.D., Ahmed F., Lacourciere G.M., Lauhon C.T., Stadtman T.C., Larson T.J., J Biol Chem., 279(3), 2004, сс. 1801-1809).

Фермент ThiI необходим для синтеза тиамина и играет роль в превращении уридина в тиоуридин в положении 8 в тРНК (Palenchar P.M., Buck C.J., Cheng H., Larson T.J., Mueller E.G., J Biol Chem., 275(12), 2000, сс. 8283-8286).

Фермент SseA представляет собой 3-меркаптопуриватщианид-сульфотрансферазу, которая главным образом переносит 3-меркаптопуриват вместо тиосульфата на цианид (Colnaghi R., Cassinelli G., Drummond M., Forlani F., Pagani S., FEBS Lett., 500(3), 2001, сс. 153-156). Фермент имеет два роданазаподобных домена.

OPC ynjE кодирует предполагаемую сульфотрансферазу с тремя роданазаподобными доменами (Hanzelmann P., Dahl J.U., Kuper J., Urban A., Muller-Theissen U., Leimkuhler S., Schindelin H., Protein Sci., 18 (12), 2009, сс. 2480-2491).

OPC yibN кодирует предполагаемую сульфотрансферазу с одним C-концевым роданазаподобным доменом.

OPC yceA кодирует предполагаемую сульфотрансферазу с одним роданазаподобным доменом.

У Corynebacterium glutamicum по меньшей мере 7 OPC кодируют предполагаемые сульфотрансферазы:

OPC thtR (т.е. cg0803, NCg10671) кодирует предполагаемую сульфотрансферазу с двумя роданазаподобными доменами, состоящую из 301 аминокислоты.

OPC sseA2 (т.е. eg 1613, NCg11369) кодирует предполагаемую сульфотрансферазу с двумя роданазаподобными доменами, состоящую из 289 аминокислот.

OPC cg3000 (т.е. NCg12616) кодирует предполагаемую сульфотрансферазу с одним роданазаподобным доменом, состоящую из 96 аминокислот.

OPC cg0073 (т.е. NCg10053) кодирует предполагаемую сульфотрансферазу с одним роданазаподобным доменом, состоящую из 97 аминокислот.

ORF cg0074 (т.е. NCg10054) кодирует предполагаемую сульфотрансферазу с одним роданазаподобным доменом, состоящую из 197 аминокислот.

OPC sseAl (т.е. cg3073, NCg12678) кодирует предполагаемую сульфотрансферазу с двумя роданазаподобными доменами, состоящую из 274 аминокислот.

OPCF cg3319 (т.е. NCg12890) кодирует предполагаемую сульфотрансферазу с одним роданазаподобным доменом, состоящую из 312 аминокислот.

Тиосульфат-сульфотрансфераза из быков (Bos taurus) имеет два роданазаподобных домена и хорошо охарактеризована (Cannella С., Costa М., Pensa В., Ricci G., Pecci L., Cavallini D., Eur J Biochem., 119 (3), 1981, сс. 491-495).

В предпочтительном варианте способа у микроорганизма происходит сверхэкспрессия одного гена или нескольких генов, кодирующего(их) полипептид с активностью тиосульфат-сульфотрансферазы, при этом полипептид с активностью тиосульфат-сульфотрансферазы выбирают из следующих полипептидов, указанных в подпунктах а)- г):

а) полипептид, состоящий из или содержащий полипептиды Rdl2p, GlpE, PspE, YgaP, ThiI, YbbB, SseA, YnjE, YceA, YibN, NCg10671, NCg11369, NCg12616, NCg10053, NCg10054, NCg12678, NCg12890; тиосульфат-сульфотрансферазу млекопитающих, например, тиосульфат-сульфотрансферазу из бычьей печени (Bos taurus); предпочтительно Rdl2p, GlpE, PspE и наиболее предпочтительно Rdl2p;

б) полипептид, состоящий из или содержащий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2;

в) полипептид, аминокислотная последовательность которого идентична на 70% или более аминокислотной последовательности, указанной в подпунктах а) или б), где полипептид обладает тиосульфат-сульфотрансферазной активностью;

г) полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, которая имеет делецию, замену, инсерцию и/или добавление от 1 до 45 аминокислотных остатков относительно аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 2, где полипептид обладает тиосульфат-сульфотрансферазной активностью.

Как отмечалось выше, полипептиды с активностью тиосульфат-сульфотрансферазы включают также варианты ферментов, указанных в подпунктах а) или б), аминокислотная последовательность которых идентична на 70% или более аминокислотной последовательности последовательностей, указанных в подпунктах а) или б), где вариант обладает тиосульфат-сульфотрансферазной активностью. Предпочтительными вариантами осуществления изобретения являются варианты, которые идентичны по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% описанным выше аминокислотным последовательностям, т.е. в которых по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% аминокислотных положений идентичны положениям в указанных выше аминокислотных последовательностях. Процент идентичности предпочтительно рассчитывают для всей длины аминокислотной или нуклеотидной области. Специалистам в данной области доступен ряд программ для сравнительного анализа последовательностей на основе большого количества алгоритмов. В этом плане наиболее надежные результаты дают алгоритмы Needleman и Wunsch или Smith и Waterman. Для сравнительного анализа первичной структуры последовательностей можно использовать программа PileUp (J. Mol. Evolution., 25, 1987, сс. 351-360, Higgins и др., CABIOS, 5, 1989, сс. 151-153) или программы Gap и BestFit [Needleman и Wunsch (J. Mol. Biol. 48, 1970, сс. 443-453) и Smith и Waterman (Adv. Appl. Math. 2, 1981, сс. 482-489)], которые входят в пакет программ GCG [Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Мэдисон, шт.Висконсин, США 53711, 1991]. Указанные выше величины процентов, характеризующие идентичность последовательностей, для всей области последовательности предпочтительно рассчитывают с помощью программы GAP.

Кроме того, полипептиды с активностью тиосульфат-сульфотрансферазы включают также фрагменты ферментов, указанных в подпунктах а) или б). Эти фрагменты обладают описанной выше активностью. Фрагмент полипептида с активностью тиосульфат-сульфотрансферазы в контексте настоящего описания предпочтительно содержит по меньшей мере 30, по меньшей мере 50 или по меньшей мере 80 последовательно расположенных аминокислотных остатков одной из указанных выше аминокислотных последовательностей.

Как отмечалось выше, полипептиды с активностью тиосульфат-сульфотрансферазы включают также варианты ферментов, указанных в подпунктах а) или б), имеющие аминокислотную последовательность, которая имеет делецию, замену, инсерцию и/или добавление от 1 до 45 аминокислотных остатков относительно аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 2, где полипептид обладает тиосульфат-сульфотрансферазной активностью. В предпочтительных вариантах осуществления изобретения аминокислотная последовательность имеет делецию, замену, инсерцию и/или добавление от 1 до 40, более предпочтительно от 1 до 30, еще более предпочтительно от 1 до 20, предпочтительно от 1 до 15, еще более предпочтительно от 1 до 10 и наиболее предпочтительно от 1 до 5 аминокислотных остатков относительно аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 2.

В другом предпочтительном способе полипептид кодируется геном, который включает нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: I, соответствующую последовательности дикого типа гена RDL2 из штамма Saccharomyces cerevisiae S288c.

Предпочтительно также полипептид может кодироваться геном, который включает нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 3. В этом случае наиболее часто встречающийся кодон в определенной степени адаптируют для E. coli.

В другом предпочтительном способе полипептид кодируется геном, который включает нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 4. В этом случае наиболее часто встречающийся кодон адаптируют для E. coli в существенно большей степени.

В другом предпочтительном способе полипептид кодируется геном, который включает нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 5. В этом случае наиболее часто встречающийся кодон полностью адаптируют для E. coli.

При осуществлении способа, предлагаемого в изобретении, экспрессию гена, кодирующего полипептид с активностью тиосульфат-сульфотрансферазы, предпочтительно повышают с помощью одного или нескольких следующих путей:

а) Экспрессию гена осуществляют под контролем промотора, который в применяемом для осуществления способа микроорганизме обеспечивает усиленную экспрессию по сравнению с исходным штаммом. Для этой цели можно применять конститутивный промотор GAPDH гена gapA Escherichia coli или индуцибельный промотор lac, tac, trc, lambda, ara или tet (обзор: Makrides SC. Micro-biol Rev. 60(3), сентябрь 1996 г., сс. 512-538).

б) Увеличивают количество копий гена, кодирующего полипептид с активностью тиосульфат-сульфотрансферазы, по сравнению с исходным штаммом. Для достижения этого можно, например, встраивать ген в плазмиды с увеличенным количеством копий, или интегрировать ген в несколько копий хромосомы микроорганизма (Baneyx F., Curr. Opin. Biotechnol. 10, 1999, сс. 411-421).

в) Экспрессию гена осуществляют с использованием сайта связывания рибосом, что приводит к усиленной трансляции в применяемом для осуществления способа микроорганизме по сравнению с исходным штаммом (Makrides S.C. Microbiol Rev., 60 (3), сентябрь 1996 г., сс. 512-538).

г) Усиливают экспрессию гена путем оптимизации наиболее часто встречающегося кодона гена применительно к используемому для осуществления способа микроорганизму (Welch, Villalobos, Gustafsson и Minshull, J R Soc Interface, 6, 2009, сс. 467-476). Например, индекс адаптации кодонов (CAI), можно применять в качестве меры адаптации наиболее часто встречающего кодона гена к организму (Sharp P.M., Li W.H., Nucleic Acids Res., 15(3), 1987, сс. 1281-1295).

д) Усиливают экспрессию гена путем снижения уровня вторичных структур мРНК в мРНК, транскрибируемой с гена (Kudia G., Murray A.W., Tollervey D., Plotkin J.B., Science, 10, 324(5924), апрель 2009 г., сс. 25525-8; Welch, Villalobos, Gustafsson и Minshull, J R Soc Interface, 6, 2009, сс. 467-476).

е) Усиливают экспрессию гена путем элиминации терминаторов для РНК-полимеразы в мРНК, транскрибируемой с гена (Welch, Villalobos, Gustafsson иа Mmshull, J R Soc Interface, 6, 2009, сс. 467-476).

ж) Осуществляют экспрессию гена с использованием стабилизирующих мРНК последовательностей в мРНК, транскрибируемой с гена (Carrier T.A., Keasling J.D., Biotechnol Prog., 13(6), ноябрь-декабрь 1997 г, сс. 699-708). В качестве примера последовательности, стабилизирующей мРНК гена metF E. coli, можно упомянуть последовательность ARNmstl7 (WO 2009/043803).

В другом варианте способа, предлагаемого в изобретении, предпочтительным является, чтобы соль дитиосерной кислоты представляла собой соль, выбранную из группы, включающей соль щелочного металла, соль щелочноземельного металла, соль аммония и их смеси, предпочтительно аммониевую соль.

Предпочтительно также, чтобы соль серной кислоты представляла собой соль, выбранную из группы, включающей соль щелочного металла, соль щелочноземельного металла, соль аммония (и их смеси), предпочтительно аммониевую соль.

Предпочтительно концентрация соли дитиосерной кислоты в среде или ферментативном бульоне составляет от 0,05 до 100 г/кг, предпочтительно от 0,1 до 20 г/кг и наиболее предпочтительно от 0,2 до 12 г/кг.

В предпочтительном варианте способа концентрацию соли дитиосерной кислоты в среде или в ферментационном бульоне в процессе ферментации поддерживают на уровне, составляющем по меньшей мере от 0,05 до 100 г/кг, предпочтительно от 0,1 до 20 г/кг и наиболее предпочтительно от 0,2 до 12 г/кг.

В другом предпочтительном варианте способа в процессе ферментации содержание соли дитиосерной кислоты в пересчете на общее содержание неорганической серы в среде и в ферментационном бульоне поддерживают на уровне, составляющем по меньшей мере 5 мол.%.

Способ, предлагаемый в изобретении, можно осуществлять в виде периодического процесса, периодического процесса с подпиткой, периодического процесса с повторной подпиткой и непрерывного процесса.

Кроме того, серусодержащую аминокислоту можно получать из ферментационного бульона в виде твердого продукта или в растворенной форме в виде жидкого продукта.

В предпочтительном способе, предлагаемом в настоящем изобретении, получаемая серусодержащая аминокислота представляет собой L-метионин.

Предпочтительно также, чтобы микроорганизм принадлежал к роду Escherichia, наиболее предпочтительно виду Escherichia coli.

В альтернативном способе микроорганизм принадлежит к роду Corynebacterium, наиболее предпочтительно виду Corynebacterium glutamicum.

В наиболее предпочтительном способе, предлагаемом в настоящем изобретении, микроорганизм выбирают из

- Corynebacterium glutamicum с повышенной активностью и/или уровнем экспрессии аспартаткиназы и с ослабленным по сравнению с исходным штаммом или с удаленным путем делеции регуляторным белком McbR;

- Escherichia coli с повышенной активностью и/или уровнем экспрессии аспартаткиназы и с ослабленным по сравнению с исходным штаммом или с удаленным путем делеции регуляторным белком MetJ.

Изобретение относится также к микроорганизму, выбранному из

- Corynebacterium glutamicum с повышенной активностью и/или уровнем экспрессии аспартаткиназы и с ослабленным по сравнению с исходным штаммом или с удаленным путем делеции регуляторным белком McbR;

- Escherichia coli с повышенной активностью и/или уровнем экспрессии аспартаткиназы и с ослабленным по сравнению с исходным штаммом или с удаленным путем делеции регуляторным белком MetJ;

где микроорганизм секретирует или продуцирует L-метионин и где микроорганизм обладает повышенной тиосульфат-сульфотрансферазной активностью по сравнению с исходным штаммом.

Изобретение относится также к микроорганизму, выбранному из

- Corynebacterium glutamicum с повышенной активностью и/или уровнем экспрессии аспартаткиназы и с ослабленным по сравнению с исходным штаммом или с удаленным путем делеции регуляторным белком McbR;

- Escherichia coli с повышенной активностью и/или уровнем экспрессии аспартаткиназы и с ослабленным по сравнению с исходным штаммом или с удаленным путем делеции регуляторным белком MetJ;

где микроорганизм секретирует или продуцирует L-метионин и где микроорганизм сверхэкспрессирует ген, кодирующий полипептид с активностью тиосульфат-сульфотрансферазы.

Штамм C. glutamicum, который секретирует или продуцирует L-метионин, предпочтительно обладает повышенной ферментативной активностью аспартаткиназы (КФ 2.7.2.4), при этом предпочтительными являются устойчивые к регуляции по типу обратной связи аллели. У представителей Corynebacterium указанная аспартаткиназа кодируется геном lysC. Из-за ослабления или делеции регуляторного белка McbR (который кодируется геном mcbR), имеет место также дополнительная утилизация серы. McbR является репрессором полного каскада утилизации серы у C. glutamicum (Rey D.A., Nentwich S.S., Koch D.J., Riickert C., Puhler A., Tauch A., Kalinowski J., Mol Microbiol., 56 (4), 2005, сс. 871-887).

Штамм E. coli, который секретирует или продуцирует L-метионин, предпочтительно обладает повышенной ферментативной активностью аспартаткиназы (КФ 2.7.2.4), при этом предпочтительными являются устойчивые к регуляции по типу обратной связи аллели. У E. coli присутствуют три различные аспартаткиназы, которые кодируются генами thrA, metL или lysC. Из-за ослабления или делеции регуляторного белка MetJ, который кодируется геном metJ, имеет место дополнительный биосинтез L-метионина. MetJ является основным репрессором биосинтеза L-метионина у E. coli.

Предпочтительным является также, если для указанного микроорганизма характерна сверхэкспрессия одного или нескольких гена(ов), кодирующего(их) полипептид с активностью тиосульфат-сульфотрансферазы, где полипептид с активностью тиосульфат-сульфотрансферазы можно выбирать из полипептидов, указанных в следующих подпунктах а)-г):

а) полипептид, состоящий из или содержащий полипептиды Rdl2p, GlpE, PspE, YgaP, ThiI, YbbB, SseA, YnjE, YceA, YibN, NCg10671, NCg11369, NCg12616, NCg10053, NCg10054, NCg12678, NCg12890; тиосульфат-сульфотрансферазу млекопитающих, например, тиосульфат-сульфотрансферазу из бычьей печени (Bos taurus); предпочтительно Rdl2p, GlpE, PspE и наиболее предпочтительно Rdl2p;

б) полипептид, состоящий из или содержащий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2;

в) полипептид, аминокислотная последовательность которого идентична на 70% или более аминокислотной последовательности, указанной в подпунктах а) или б), где полипептид обладает тиосульфат-сульфотрансферазной активностью;

г) полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, которая несет делецию, замену инсерцию и/или добавление от 1 до 45 аминокислотных остатков относительно аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 2, где полипептид обладает тиосульфат-сульфотрансферазной активностью.

Предпочтительно также исходный штамм микроорганизма выводят из группы, включающей Escherichia coli MG1655, Escherichia coli W3110, Escherichia coli DH5a, Escherichia coli DH10B, Escherichia coli BW2952, Escherichia coli REL606, Corynebacterium glutamicum ATCC13032, Corynebacterium glutamicum R, Corynebacterium glutamicum DSM20411 (прежнее название Brevibacterium flavum), Corynebacterium glutamicum DSM20412 (прежнее название Brevibacterium lactofermentum), Corynebacterium glutamicum DSM1412 (прежнее название Brevibacterium lactofermentum), Corynebacterium efficiens YS-314T (=DSM44549), Corynebacterium glutamicum ATCC21608, Corynebacterium glutamicum DSM17322.

Другим штаммом, который секретирует или продуцирует L-метионин, является, например, продуктивный штамм E. coli MG1655 AmetJ Ptrc-metH Ptrc-metF PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHP, содержащий продуктивную плазмиду pME101-thrA*1-cysE-Pgap-metA*11 (WO 2009/043803).

Клонирование продуктивного штамма E. coli MG1655AmetJ Ptrc-metH Ptrc-metF PtrcF-cysPUWAM PtrcF-cysJIH Ptrc09-gcvTHP описано в заявке на патент WO 2009/043803. Основой указанного штамма является штамм дикого типа E. coli K12 MG1655. В геном указанного штамма были интродуцированы следующие модификации:

- Удаляли путем делеции ген репрессора биосинтеза L-метионина metJ.

- Против хода транскрипции относительно гена metH (кодирует кобаламинзависимую метионинсинтазу), встраивали сильный промотор trc.

- Против хода транскрипции относительно гена metF (кодирует 5,10-метилентетрагидрофолатредуктазу), встраивали сильный промотор trc.

- Против хода транскрипции относительно оперона cysPUWAM встраивали сильный промотор trcF. cysPUWA кодирует транспортер поглощения сульфата/тиосульфата. cysM кодирует цистеинсинтазу B.

- Против хода транскрипции относительно оперона cysJIH встраивали сильный промотор trcF. cysJI кодирует сульфитредуктазу, a cysH кодирует 3'-фосфоаденилил-сульфатредуктазу.

- Против хода транскрипции относительно оперона gcvTHP встраивали сильный промотор trcO. gcvT, gcvH и gcvP кодируют три компонента системы расщепления глицина.

Клонирование в E. coli продуктивной плазмиды pME101-thrA*1-cysE-Pgap-metA*11 описано в заявке на патент WO 2007/077041. Основой этой плазмиды с малым количеством копий (малокопийная плазмида) являлся вектор pCL1920 (Lerner C.G. и Inouye M., Nucl. Acids Res. 18, 1990, с.4631 [PMID: 2201955]). Незагруженная (пустая) плазмида pMe101 несет ген lacIq, который кодирует высокоэкспрессируемый аллель репрессора lac. Ген thra*1 клонировали по ходу транскрипции относительно сильного промотора trc, который может подавляться репрессором Lac. Он кодирует устойчивый к регуляции по типу обратной связи вариант аспартаткиназы /гомосериндегидрогеназы ThrA из E. coli. В той же ориентации за ним расположен ген cysE вместе с его встречающимся в естественных условиях промотором. Он кодирует серинацетилтрансферазу из E. coli. По ходу транскрипции относительно cysE расположен сильный промотор gapA из E. coli, который контролирует экспрессию гена metA*11. Ген metA*11 кодирует устойчивый к регуляции по типу обратной связи вариант гомосерин-O-сукцинилтрансферазы из E. coli.

В качестве примеров других микроорганизмов, которые секретируют или продуцируют L-метионин, можно упомянуть следующие штаммы:

- C. glutamicum Ml 179 (DSM17322) (WO 2007/011939)

- E. coli TF4076BJF metA#10 + metYX (Lm) (WO 2008/127240; с 46);

- E. coli W3110ΔJ/pKP451 (EP 1445 31 OBI, с.7, пример 4);

- E. coli WΔthrBCΔmetJmetK32 pMWPthrmetA4Δ569 (Yoshihiro Usuda и Osamu Kurahashi, Applied and Environmental Microbiology, т.71, №6, 2005, сс. 3228-3234);

- W3HO/pHC34 (WO 01/27307 с.13, пример 3).

Дополнительные примеры различных пригодных микроорганизмов описаны у Gomes и др.. Enzyme and Microbial Technology 37, 2005, сс. 3-18.

В других предпочтительных вариантах осуществления бактерии, которые продуцируют L-метионин, обладают одним или несколькими признаками, выбранными из группы:

1) способность к сверхэкспрессии полинуклеотида, который кодирует один или несколько компонентов транспортной системы тиосульфата/сульфата CysPUWA (КФ 3.6.3.25),

2) способность к сверхэкспрессии полинуклеотида, который кодирует 3'-фосфоаденозин-5'фосфосульфатредуктазу CysH (КФ 1.8.4.8),

3) способность к сверхэкспрессии полинуклеотида, который кодирует один или несколько компонентов сульфитредуктазы CysJI (КФ 1.8.1.2),

4) способность к сверхэкспрессии полинуклеотида, который кодирует цистеинсинтазу A CysK (КФ 2.5.1.47),

5) способность к сверхэкспрессии полинуклеотида, который кодирует цистеинсинтазу В CysM (КФ 2.5.1.47),

6) способность к сверхэкспрессии полинуклеотида, который кодирует серинацетилтрансферазу CysE (КФ 2.3.1.30),

7) способность к сверхэкспрессии полинуклеотида, который кодирует один или несколько компонентов системы расщепления глицина GcvTHP-Lpd (КФ 2.1.2.10, КФ 1.4.4.2, КФ 1.8.1.4),

8) способность к сверхэкспрессии полинуклеотида, который кодирует липоилсинтазу LipA (КФС 2.8.1.8),

9) способность к сверхэкспрессии полинуклеотида, который кодирует липоилпротеинлигазу LipB (КФ 2.3.1.181),

10) способность к сверхэкспрессии полинуклеотида, который кодирует фосфоглицератдегидрогеназу SerA (КФ 1.1.1.95),

11) способность к сверхэкспрессии полинуклеотида, который кодирует 3-фосфосеринфосфатазу SerB (КФС 3.1.3.3),

12) способность к сверхэкспрессии полинуклеотида, который кодирует 3-фосфосерин/фосфогидрокситреонин-аминотрансферазу SerC (КФ 2.6.1.52),

13) способность к сверхэкспрессии полинуклеотида, который кодирует серингидроксиметилтрансферазу GlyA (EC 2.1.2.1),

14) способность к сверхэкспрессии полинуклеотида, который кодирует аспартокиназу I и гомосериндегидрогеназу I ThrA (КФ 2.7.2.4, КФ 1.1.1.3),

15) способность к сверхэкспрессии полинуклеотида, который кодирует аспартаткиназу LysC (КФ 2.7.2.4),

16) способность к сверхэкспрессии полинуклеотида, который кодирует гомосериндегидрогеназу Нот (КФ 1.1.1.3),

17) способность к сверхэкспрессии полинуклеотида, который кодирует гомосерин-0-ацетилтрансферазу MetX (КФ 2.3.1.31),

18) способность к сверхэкспрессии полинуклеотида, который кодирует гомосерин-0-сукцинилтрансферазу MetA (КФ 2.3.1.46),

19) способность к сверхэкспрессии полинуклеотида, который кодирует цистатионин-гамма-синтазу MetB (КФ 2.5.1.48),

20) способность к сверхэкспрессии полинуклеотида, который кодирует β-С-S-лиазу AecD (КФ 4.4.1.8, обозначают также как бета-лиаза),

21) способность к сверхэкспрессии полинуклеотида, который кодирует цистатионин-бета-лиазу MetC (КФ 4.4.1.8),

22) способность к сверхэкспрессии полинуклеотида, который кодирует В12-независимую гомоцистеин-3-метилтрансферазу MetE (КФ 2.1.1.14),

23) способность к сверхэкспрессии полинуклеотида, который кодирует В12-зависимую гомоцистеин-8-метилтрансферазу MetH (КФ 2.1.1.13),

24) способность к сверхэкспрессии полинуклеотида, который кодирует метилентетрагидрофолатредуктазуМе1Р (КФ 1.5.1.20),

25) способность к сверхэкспрессии полинуклеотида, который кодирует один или несколько компонентов экспортера L-метионина BrnFE из Corynebacterium glutamicum,

26) способность к сверхэкспрессии полинуклеотида, который кодирует один или несколько компонентов экспортера валина YgaZH из Escherichia coli (b2682, b2683),

27) способность к сверхэкспрессии полинуклеотида, который кодирует предполагаемый транспортер YjeH из Escherichia coli (b4141),

28) способность к сверхэкспрессии полинуклеотида, который кодирует один или несколько компонентов пиридин-нуклеотид-трансгидрогеназы PntAB (КФ 1.6.1.2),

29) способность к сверхэкспрессии полинуклеотида, который кодирует 0-сукцинилгомосеринсульфгидрилазу MetZ (КФ 2.5.1.48),

30) способность к сверхэкспрессии полинуклеотида, который кодирует фосфоенолпируваткарбоксилазу Рус (КФ 4.1.1.31).

В контексте настоящего описания предпочтительными признаками является(ются) один или несколько признаков, выбранных из группы:

1) способность к сверхэкспрессии полинуклеотида, который кодирует один или