Новое антитело для диагностики и (или) прогнозирования рака

Новое антитело для диагностики и (или) прогнозирования рака

Реферат

Настоящее изобретение относится к области прогнозирования и/или диагностики пролиферативного заболевания у пациента. Более конкретно, изобретение относится к новым антителам, способным специфично связываться с человеческим рецептором cMet, а также к аминокислотным последовательностям и последовательностям нуклеиновых кислот, кодирующим данные антитела. Подобным образом, изобретение включает применение указанных антител и соответствующего способа для детекции и диагностики патологических гиперпролиферативных онкогенных расстройств, ассоциированных с экспрессией cMet. В определенных воплощениях расстройствами являются онкогенные расстройства, ассоциированные с повышенной экспрессией полипептида cMet относительно нормальной экспрессии, или с любой другой патологией, связанной со сверхэкспрессией cMet. Наконец, изобретение включает продукты и/или композиции, или наборы, содержащие по меньшей мере такие антитела для прогнозирования или диагностики определенных раковых заболеваний.

Таргетные агенты в отношении рецепторных тирозинкиназ (RTK), такие как ингибиторы трастузумаб, цетуксимаб, бевацизумаб, иматиниб и гефитиниб, проиллюстрировали интерес в использовании данного класса белков в качестве мишени для лечения избранных раковых заболеваний.

cMet является прототипическим членом подсемейства RTK, которое также включает RON и SEA. Семейство RTK cMet структурно отличается от других семейств RTK, и он является единственным известным высокоаффинным рецептором фактора роста гепатоцитов (HGF), также именуемого рассеивающим фактором (SF) [D.P. Bottaro et al., Science 1991, 251: 802-804; L. Naldini et al., Eur. Mol. Biol. Org. J. 1991, 10: 2867-2878]. cMet и HGF широко экспрессируются в целом ряде тканей, и их экспрессия обычно ограничена клетками эпителиального и мезенхимного происхождения соответственно [M.F. Di Renzo et al., Oncogene 1991, 6: 1997-2003; E. Sonnenberg et al., J. Cell. Biol. 1993, 123: 223-235]. Они оба требуются для нормального развития млекопитающих и, как было показано, являются особенно важными в миграции клеток, морфогенетической дифференцировке и организации трехмерных трубчатых структур, а также в росте и ангиогенезе [F. Baldt et al., Nature 1995, 376: 768-771; С. Schmidt et al., Nature. 1995:373:699-702; Tsarfaty et al., Science 1994, 263:98-101]. В то время как было показано, что контролируемая регуляция cMet и HGF являются важными в развитии млекопитающих, поддержании и репарации тканей [Nagayama Т et al., Brain Res. 2004, 5; 999 (2): 155-66; Tahara Y et al., J Pharmacol Exp Ther. 2003, 307 (1): 146-51], их неправильную регуляцию связывали с развитием раковых заболеваний.

Нарушенная сигнализация, управляемая неадекватной активацией cMet, является одним из самых частых изменений, наблюдаемых при человеческих раковых заболеваниях, и она играет решающую роль опухолегенезе и метастазах [Birchmeier et al., Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2003, 4:915-925; L. Trusolino and Comoglio P. M., Nat Rev. Cancer. 2002, 2 (4): 289-300].

Неадекватная активация cMet может возникать посредством лиганд-зависимых и независимых механизмов, которые включают сверхэкспрессию cMet и/или паракринную или автокринную активацию, или посредством мутации, приводящей к приобретению новой функции [J.G. Christensen, Burrows J. and Salgia R., Cancer Latters. 2005, 226: 1-26]. Однако олигомеризация рецептора cMet в присутствии или в отсутствии лиганда требуется для регуляции аффинности связывания и кинетики связывания киназы в отношении АТФ и пептидных субстратов, содержащих тирозин [Hays JL et al., Biochemistry, 2004 Aug 17, 43: 10570-8]. Активированный cMet рекрутирует сигнальные эффекторы к его сайту мультидокинга, расположенному в цитоплазматическом домене, что приводит к активации нескольких ключевых сигнальных путей, включающих Ras-MAPK, PI3K, Src и Stat3 [Gao CF et al., Oncogene. 2000, 19(49):5582-9]. Данные пути являются существенными для пролиферации опухолевых клеток, инвазии и ангиогенеза и для уклонения от апоптоза [Furge КА et al., Trends Cell Biol. 2003 Mar, 13(3): 122-30; Fan S et al., Oncogene. 2000 Apr 27, 19 (18): 2212-23]. Кроме того, уникальным аспектом сигнализации cMet относительно других RTK является его описанное взаимодействие с фокальными комплексами адгезии и некиназными партнерами связывания, такими как α6β4 интегрины [Trusolino L et al., J Biol Chem. 1999, 274 (10): 6499-506], плексин B1 или семафорины [Giordano S et al., Nat Cell Biol. 2002, 4(9):720-4; Conrotto P et al., Blood. 2005, 105(11):4321-9; Conrotto P, Corso S, Gamberini S, Comoglio PM, Giordano S, Oncogene. 2004, 23: 5131-7], что может дополнительно увеличивать сложность регуляции функции клетки данным рецептором. Наконец, недавние данные демонстрируют то, что cMet мог бы участвовать в резистентности опухоли к гефитинибу или эрлотинибу, свидетельствуя о том, что комбинация соединения, имеющего в качестве мишени как EGFR (рецептор эпидермального фактора роста), так и cMet, могла бы представлять значительный интерес [Engelman JA at al., Science, 2007, 316: 1039-43].

В последние несколько лет было разработано много разных стратегий для ослабления сигнализации cMet в линиях раковых клеток. Данные стратегии включают i) нейтрализующие антитела против cMet или HGF/SF [Сао В et al., Proc Natl Acad Sci USA. 2001, 98 (13): 7443-8; Martens T et al., Clin Cancer Res. 2006, 12 (20): 6144-52] или применение NK4 - антагониста HGF/SF для предупреждения связывания лиганда с cMet [Kuba К et al., Cancer Res., 2000, 60: 6737-43], ii) маленькие ингибиторы АТФ-связывающего сайта cMet, которые блокируют киназную активность [Christensen JG et al., Cancer Res. 2003, 63: 7345-55], iii) сконструированный полипептид с доменом SH2, который препятствует доступу к сайту мультидокинга, и РНКи (интерферирующая РНК) или рибозим, которые уменьшают экспрессию рецептора или лиганда. Большинство данных подходов демонстрируют селективное ингибирование cMet, приводящее к ингибированию опухоли, и показывая, что cMet мог бы представлять интерес для терапевтического вмешательства в раковое заболевание.

Целью настоящего изобретения является предложение по меньшей мере одного реактива, который можно использовать в качестве диагностического или прогнозирующего биомаркера для детектирования и/или отслеживания онкогенных расстройств, особенно онкогенных расстройств, характеризующихся экспрессией cMet, или онкогенных расстройств, которые опосредованы нарушенной экспрессией cMet.

Здесь описаны новые антитела, которые удовлетворяют этим критериям.

Другие отличительные признаки и преимущества изобретения будут очевидными из подробного описания и примеров, которые следуют ниже.

В первом аспекте предметом изобретения является связывающий белок или его функциональный фрагмент, или производное, который специфично связывается с независимой от лиганда активированной формой белка cMet (cMet), предпочтительно с человеческим cMet, с высокой аффинностью и, таким образом, может быть полезным в способах диагностики патологических гиперпролиферативных онкогенных расстройств, опосредованных экспрессией независимой от лиганда активированной формы cMet.

Независимая от лиганда активация связана с конститутивным фосфорилированием cMet либо после 1) димеризации рецептора, которая происходит в отсутствие HGF в случае сверхэкспрессии cMet (обычно связанной с амплиикацией гена cMet), либо после 2) активирующих мутаций во внутриклеточном домене cMet, либо после 3) их обоих.

В первом аспекте изобретение касается связывающего белка или его функционального фрагмента, или производного, который на опухолях 1) специфично связывается с независимой от лиганда активированной формой cMet, но 2) не связывается с неактивированной и/или зависимой от лиганда активированной формой(ами) cMet.

Под выражением «связывающий белок» следует понимать любую пептидную цепь, имеющую специфичную или общую аффинность по отношению к другому белку или молекуле. При возможности связывания белки приводятся в контакт и образуют комплекс. Связывающий белок по изобретению предпочтительно может быть, без ограничения, антителом, фрагментом или производным антитела, белком или пептидом.

Выражения «функциональный фрагмент(ты) и/или производное(ные)» будут подробно определены позднее в настоящем описании изобретения.

Под выражением «на опухоли» следует понимать то, что приведенные свойства связывающего белка согласно изобретению существуют в опухолевом окружении in vivo, а не только в примерах in vitro. Более конкретно, они были продемонстрированы, как будет очевидно из следующих примеров, в экспериментах ex vivo, представляющих среду настолько близкую к природной, насколько это возможно, или в анализе человеческой опухоли на имеющихся в продаже тканевых микрочипах (ТМА).

Здесь следует понимать, что изобретение не относится к белку в природной форме, другими словами, они не находятся в их природном окружении, но их можно было выделять или получать очисткой из природных источников, или иначе получать генетической рекомбинацией, или химическим синтезом, и что они тогда могут содержать неприродные аминокислоты, как будет описано далее.

Согласно одному воплощению изобретения раскрыт связывающий белок или его функциональный фрагмент, или производное, как описано ранее, который не блокирует связывание лиганда - фактора роста гепатоцитов (HGF) с cMet.

Более конкретно, связывающий белок или его функциональный фрагмент, или производное по изобретению взаимодействует с внеклеточной областью cMet между аминокислотными остатками 1 и 950.

Согласно первому воплощению изобретение относится к связывающему белку или его функциональному фрагменту, или производному, содержащему по меньшей мере одну CDR (область, определяющая комплементарность), выбранную среди CDR последовательностей, содержащих по меньшей мере SEQ ID No. 1, 2, 3, 4, 5, 6, 17, 18, 19, 20 или 21, или по меньшей мере одну CDR, последовательность которой имеет по меньшей мере 80%-ную, предпочтительно 85%-ную, 90%-ную, 95%-ную и 98%-ную идентичность с последовательностями SEQ ID No. 1, 2, 3, 4, 5, 6, 17, 18, 19, 20 или 21 после оптимального выравнивания.

Согласно второму воплощению изобретение относится к связывающему белку или его функциональному фрагменту, или производному, содержащему по меньшей мере одну CDR, выбранную среди CDR последовательностей, включающих по меньшей мере SEQ ID No 9, 10, 11, 12, 13, 14, 22, 23, 24, 25 или 26, или по меньшей мере одну CDR, последовательность которой имеет по меньшей мере 80%-ную, предпочтительно 85%-ную, 90%-ную, 95%-ную и 98%-ную идентичность с последовательностями SEQ ID No. 9, 10, 11, 12, 13, 14, 22, 23, 24, 25 или 26 после оптимального выравнивания.

«Функциональный фрагмент» антитела означает в частности фрагмент антитела, такой как фрагменты Fv, scFv (sc=простая цепь), Fab, F(ab’)₂, Fab’, scFv-Fc или диатела, или любой фрагмент, период полувыведения которого был увеличен. В настоящем описании такие функциональные фрагменты будут подробно описаны позднее.

«Производное соединение» или «производное» антитела означает в частности связывающий белок, состоящий из пептидного каркаса и по меньшей мере одной из CDR исходного антитела для того, чтобы сохранять его способность к распознаванию. В настоящем описании такие производные соединения, хорошо известные специалисту в данной области, будут более подробно описаны позднее.

В первом воплощении связывающий белок или его функциональный фрагмент или производное по изобретению содержит антигенсвязывающий домен, содержащий по меньшей мере одну CDR, выбранную из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID No. 1-6.

В другом воплощении связывающий белок или его функциональный фрагмент или производное по изобретению содержит антигенсвязывающий домен, содержащий по меньшей мере одну CDR, выбранную из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID No. 9-14.

Кроме того, в предпочтительном воплощении изобретения указанный белок или его функциональный фрагмент, или производное состоит из выделенного антитела.

Более предпочтительно, изобретение включает антитела, их производные соединения или их функциональные фрагменты согласно настоящему изобретению, полученные генетической рекомбинацией или химическим синтезом.

Согласно предпочтительному воплощению антитело согласно изобретению или его производные соединения, или функциональные фрагменты характеризуются тем, что они состоят из моноклинального антитела.

Следует понимать, что термин «моноклональное антитело» означает антитело, происходящее из практически гомогенной популяции антител. Более конкретно, индивидуальные антитела популяции являются идентичными за исключением нескольких возможных встречающихся в природе мутаций, которые можно обнаружить в минимальных соотношениях. Другими словами, моноклональное антитело состоит из гомогенного антитела, возникающего в результате роста одиного клона клеток (например, гибридома - эукариотическая клетка-хозяин, трансфицированная молекулой ДНК, кодирующей гомогенное антитело, прокариотическая клетка-хозяин, трансфицированная молекулой ДНК, кодирующей гомогенное антитело и т.д.), и обычно характеризуется тяжелыми цепями одного и только одного класса и подкласса и легкими цепями только одного типа. Моноклональные антитела являются высокоспецифичными и направленными против одного антигена. Кроме того, в отличие от препаратов поликлональных антител, которые типично включают разные антитела, направленные против разных детерминант или эпитопов, каждое моноклональное антитело направлено против одного эпитопа антигена.

Здесь следует понимать, что данное изобретение не относится к антителам в природной форме, т.е. они не взяты из их природного окружения, но выделены или получены посредством очистки из природных источников или получены генетической рекомбинацией или химическим синтезом, и, таким образом, они могут нести неприродные аминокислоты, как будет описано ниже.

Более конкретно антитело по изобретению или один из его функциональных фрагментов или производных характеризуется тем, что оно содержит легкую цепь, содержащую по меньшей мере одну из CDR последовательностей SEQ ID No. 1, 2, 3, 17, 18 или по меньшей мере одну последовательность с по меньшей мере 80%-ной, предпочтительно 85%-ной, 90%-ной, 95%-ной и 98%-ной идентичностью с последовательностями SEQ ID No. 1, 2, 3, 17, 18 после оптимального выравнивания.

Даже более предпочтительно антитело по изобретению или один из его функциональных фрагментов или производных характеризуется тем, что оно содержит легкую цепь, содержащую следующие три CDR, соответственно CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3, где:

- CDR-L1 содержит последовательность SEQ ID No. 1 или 17, или последовательность с по меньшей мере 80%-ной идентичностью с последовательностью SEQ ID No. 1 или 17 после оптимального выравнивания;

- CDR-L2 содержит последовательности SEQ ID No. 2 или 18, или последовательность с по меньшей мере 80%-ной идентичностью с последовательностью SEQ ID No. 2 или 18 после оптимального выравнивания; и

- CDR-L3 содержит последовательность SEQ ID No. 3, или последовательность с по меньшей мере 80%-ной идентичностью с последовательностью SEQ ID No. 3 после оптимального выравнивания.

В настоящем изобретении, таким образом, описано антитело или его функциональный фрагмент, или производное, которое на опухолях i) специфично связывается с независимой от лиганда активированной формой cMet, но и) не связывается с неактивированной и/или зависимой от лиганда активированной формой(ами) cMet, причем указанное антитело характеризуется тем, что оно содержит легкую цепь, содержащую следующие три CDR, как определено согласно IGMT, соответственно CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3, где CDR-L1 содержит последовательность SEQ ID No. 1, CDR-L2 содержит последовательность SEQ ID No. 2, CDR-L3 содержит последовательность SEQ ID No. 3.

Согласно другому конкретному воплощению антитело по изобретению или один из его функциональных фрагментов или произвдных характеризуется тем, что оно содержит легкую цепь, содержащую следующие три CDR, как определено согласно Kabat, соответственно CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3, где CDR-L1 содержит последовательность SEQ ID No. 17, CDR-L2 содержит последовательность SEQ ID No. 18, и CDR-L3 содержит последовательность SEQ ID No. 3.

Согласно другому воплощению антитело по изобретению или один из его функциональных фрагментов или производных характеризуется тем, что оно содержит тяжелую цепь, содержащую по меньшей мере одну из CDR последовательностей SEQ ID No. 4, 5, 6, 19, 20 или 21, или по меньшей мере одну последовательность с по меньшей мере 80%-ной, предпочтительно 85%-ной, 90%-ной, 95%-ной и 98%-ной идентичностью с последовательностями SEQ ID No. 4, 5, 6, 19, 20 или 21 после оптимального выравнивания.

Предпочтительным образом антитело по изобретению или один из его функциональных фрагментов или производных характеризуется тем, что оно содержит тяжелую цепь, содержащую следующие три CDR, соответственно CDR-Н1, CDR-H2 и CDR-H3, где:

- CDR-H1 содержит последовательность SEQ ID No. 4 или 19, или последовательность с по меньшей мере 80%-ной, предпочтительно 85%-ной, 90%-ной, 95%-ной и 98%-ной идентичностью с последовательностью SEQ ID No. 4 или 19 после оптимального выравнивания;

- CDR-H2 содержит последовательности SEQ ID No. 5 или 20, или последовательность с по меньшей мере 80%-ной, предпочтительно 85%-ной, 90%-ной, 95%-ной и 98%-ной идентичностью с последовательностью SEQ ID No. 5 или 20 после оптимального выравнивания; и

- CDR-H3 содержит последовательность SEQ ID No. 6 или 21, или последовательность с по меньшей мере 80%-ной, предпочтительно 85%-ной, 90%-ной, 95%-ной и 98%-ной идентичностью с последовательностью SEQ ID No. 6 или 21 после оптимального выравнивания.

В настоящем изобретении, таким образом, описано антитело или его функциональный фрагмент, или производное, которое на опухолях i) специфично связывается с независимой от лиганда активированной формой cMet, но ii) не связывается с неактивированной и/или зависимой от лиганда активированной формой(ами) cMet, причем указанное антитело характеризуется тем, что оно содержит тяжелую цепь, содержащую следующие три CDR, как определено согласно IGMT, соответственно CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3, где CDR-H1 содержит последовательность SEQ ID No. 4, CDR-H2 содержит последовательность SEQ ID No. 5, и CDR-H3 содержит последовательность SEQ ID No. 6.

Согласно другому конкретному воплощению антитело по изобретению или один из его функциональных фрагментов или производных характеризуется тем, что оно содержит тяжелую цепь, содержащую следующие три CDR, как определено согласно Kabat, соответственно CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3, где CDR-Н1 содержит последовательность SEQ ID No. 19, CDR-H2 содержит последовательность SEQ ID No. 20, и CDR-H3 содержит последовательность SEQ ID No. 21.

Более конкретно, антитело по изобретению или один из его функциональных фрагментов или производных характеризуется тем, что оно содержит легкую цепь, содержащую по меньшей мере одну из CDR последовательностей SEQ ID No. 9, 10, 11, 22, 23 или по меньшей мере одну последовательность с по меньшей мере 80%-ной, предпочтительно 85%-ной, 90%- ной, 95%-ной и 98%-ной идентичностью с последовательностями SEQ ID No. 9, 10, 11, 22, 23 после оптимального выравнивания.

Даже более предпочтительно антитело по изобретению или один из его функциональных фрагментов или производных характеризуется тем, что оно содержит легкую цепь, содержащую следующие три CDR, соответственно CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3, где:

- CDR-L1 содержит последовательность SEQ ID No. 9 или 22, или последовательность с по меньшей мере 80%-ной, предпочтительно 85%-ной, 90%-ной, 95%-ной и 98%-ной идентичностью с последовательностью SEQ ID No. 9 или 22 после оптимального выравнивания;

- CDR-L2 содержит последовательности SEQ ID No. 10 или 23, или последовательность с по меньшей мере 80%-ной, предпочтительно 85%-ной, 90%-ной, 95%-ной и 98%-ной идентичностью с последовательностью SEQ ID No. 10 или 23 после оптимального выравнивания; и

- CDR-L3 содержит последовательность SEQ ID No. 11, или последовательность с по меньшей мере 80%-ной, предпочтительно 85%-ной, 90%-ной, 95%-ной и 98%-ной идентичностью с последовательностью SEQ ID No. 11 после оптимального выравнивания.

В настоящем изобретении, таким образом, описано антитело или его функциональный фрагмент, или производное, которое на опухолях i) специфично связывается с независимой от лиганда активированной формой cMet, но ii) не связывается с неактивированной и/или зависимой от лиганда активированной формой(ами) cMet, причем указанное антитело характеризуется тем, что оно содержит легкую цепь, содержащую следующие три CDR, как определено согласно IGMT, соответственно CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3, где CDR-L1 содержит последовательность SEQ ID No. 9, CDR-L2 содержит последовательность SEQ ID No. 10, и CDR-L3 содержит последовательность SEQ ID No. 11.

Согласно другому конкретному воплощению антитело по изобретению или один из его функциональных фрагментов или производных характеризуется тем, что оно содержит легкую цепь, содержащую следующие три CDR, как определено согласно Kabat, соответственно CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3, где CDR-L1 содержит последовательность SEQ ID No. 22, CDR-L2 содержит последовательность SEQ ID No. 23, и CDR-L3 содержит последовательность SEQ ID No. 11.

Согласно другому воплощению антитело по изобретению или один из его функциональных фрагментов или производных характеризуется тем, что оно содержит тяжелую цепь, содержащую по меньшей мере одну из CDR последовательностей SEQ ID No. 12, 13, 14, 24, 25, 26, или по меньшей мере одну последовательность с по меньшей мере 80%-ной, предпочтительно 85%-ной, 90%-ной, 95%-ной и 98%-ной идентичностью с последовательностями SEQ ID No. 12, 13, 14, 24, 25, 26 после оптимального выравнивания.

Предпочтительным образом антитело по изобретению или один из его функциональных фрагментов или производных характеризуется тем, что оно содержит тяжелую цепь, содержащую следующие три CDR, соответственно CDR-Н1, CDR-H2 и CDR-H3, где:

- CDR-H1 содержит последовательность SEQ ID No. 12 или 24, или последовательность с по меньшей мере 80%-ной, предпочтительно 85%-ной, 90%-ной, 95%-ной и 98%-ной идентичностью с последовательностью SEQ ID No. 12 или 24 после оптимального выравнивания;

- CDR-H2 содержит последовательности SEQ ID No. 13 или 25, или последовательность с по меньшей мере 80%-ной, предпочтительно 85%-ной, 90%-ной, 95%-ной и 98%-ной идентичностью с последовательностью SEQ ID No. 13 или 25 после оптимального выравнивания; и

- CDR-H3 содержит последовательности SEQ ID No. 14 или 26, или последовательность с по меньшей мере 80%-ной, предпочтительно 85%-ной, 90%-ной, 95%-ной и 98%-ной идентичностью с последовательностью SEQ ID No. 14 или 26 после оптимального выравнивания.

В настоящем изобретении, таким образом, описано антитело или его функциональный фрагмент, или производное, которое на опухолях i) специфично связывается с независимой от лиганда активированной формой cMet, но ii) не связывается с неактивированной и/или зависимой от лиганда активированной формой(ами) cMet, причем указанное антитело характеризуется тем, что оно содержит тяжелую цепь, содержащую следующие три CDR, как определено согласно IGMT, соответственно CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3, где CDR-H1 содержит последовательность SEQ ID No. 12, CDR-H2 содержит последовательность SEQ ID No. 13, и CDR-H3 содержит последовательность SEQ ID No. 14.

Согласно другому конкретному воплощению антитело по изобретению или один из его функциональных фрагментов или производных характеризуется тем, что оно содержит тяжелую цепь, содержащую следующие три CDR, как определено согласно Kabat, соответственно CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3, где CDR-Н1 содержит последовательность SEQ ID No. 24, CDR-H2 содержит последовательность SEQ ID No. 25, и CDR-H3 содержит последовательность SEQ ID No. 26.

В настоящем описании термины «полипептиды», «полипептидные последовательности», «пептиды» и «белки, присоединенные к соединениям антитела или к их последовательностям» являются взаимозаменимыми.

Здесь следует понимать, что данное изобретение не относится к антителам в природной форме, т.е. они не взяты из их природного окружения, но выделены или получены посредством очистки из природных источников или получены генетической рекомбинацией или химическим синтезом, и, таким образом, они могут нести неприродные аминокислоты, как будет описано ниже.

В первом воплощении область, определяющая комплементарность, или CDR, означает гипервариабельные области тяжелой и легкой цепей иммуноглобулинов, как определено Kabat et al. (Kabat et al., Sequences of proteins of immunological interest, 5^th Ed., U.S. Department of Health and Human Services, NIH, 1991 и более поздние издания). Имеются три CDR тяжелой цепи и три CDR легкой цепи. Здесь термин «CDR» используется для указания, в зависимости от случая, одной или более чем одной, или даже всех областей, содержащих большинство аминокислотных остатков, ответственных за аффинность связывания антитела в отношении антигена или эпитопа, который оно распознает.

Во втором воплощении подразумевается, что области CDR или CDR указывают гипервариабельные области тяжелой и легкой цепей иммуноглобулинов, как определено IMGT.

Уникальная нумерация IMGT была определена для сравнения вариабельных доменов, независимо от антигенного рецептора, типа цепи или вида [Lefranc М.-Р., Immunology Today 18, 509 (1997) / Lefranc М.-Р., The Immunologist, 7, 132-136 (1999) / Lefranc, M.-P., Pommié, C, Ruiz, M., Giudicelli, V., Foulquier, E., Truong, L., Thouvenin-Contet, V. and Lefranc, Dev. Comp. Immunol., 27, 55-77 (2003)]. При уникальной нумерации IMGT консервативные аминокислоты всегда имеют одинаковое положение, например, цистеин 23 (1st-CYS), триптофан 41 (CONSERVED-TRP), гидрофобная аминокислота 89, цистеин 104 (2nd-CYS), фенилаланин или триптофан 118 (J-PHE или J-TRP). Уникальная нумерация IMGT дает стандартизированное разграничение каркасных областей (FR1-IMGT: положения от 1 до 26, FR2-IMGT: от 39 до 55, FR3-IMGT: от 66 до 104 и FR4-IMGT: от 118 до 128) и областей, определяющих комплементарность: CDR1-IMGT: от 27 до 38, CDR2-IMGT: от 56 до 65 и CDR3-IMGT: от 105 до 117. Поскольку пробелы представляют собой незанятые положения, длины CDR-IMGT (показанные в скобках и разделенные точками, например, [8.8.13]) становятся важной информацией. Уникальная нумерация IMGT используется в двухмерных графических представлениях, обозначенных как IMGT Colliers de Perles [Ruiz, M. and Lefranc, M.-P., Immunogenetics, 53, 857-883 (2002) / Kaas, Q. and Lefranc, M.-P., Current Bioinformatics, 2, 21-30 (2007)] и в трехмерных структурах в IMGT/3Dstructure-DB [Kaas, Q., Ruiz, M. and Lefranc, M.-P., T cell receptor and MHC structural data. Nucl. Acids. Res., 32, D208-D210 (2004)].

Существуют три CDR тяжелой цепи и 3 CDR легкой цепи. Термин CDR используется здесь для того, чтобы указать, в соответствии с ситуацией, одну из данных областей или несколько, или даже все эти области, которые содержат большинство аминокислотных остатков, ответственных за аффинность связывания антитела в отношении антигена или эпитопа, который оно распознает.

Для большей ясности следует понимать, что в следующем описании и, более конкретно, в таблицах 2а, 2б и 3 CDR будут определены нумерацией IMGT и нумерацией Kabat.

Фраза «процентная доля идентичности» между двумя последовательностями нуклеиновых кислот или аминокислот в том смысле, в котором она используется в настоящем изобретении, означает процентную долю идентичных нуклеотидов или аминокислотных остатков между двумя последовательностями, подлежащими сравнению, полученную после оптимального выравнивания, причем данная процентная доля является чисто статистической, и различия между двумя последовательностями распределены по их длине случайным образом. Сравнение двух последовательностей нуклеиновых кислот или аминокислотных последовательностей традиционно проводится сравнением последовательностей после их оптимального выравнивания, причем указанное сравнение можно проводить по отрезкам или с использованием «интервала выравнивания». Оптимальное выравнивание последовательностей для сравнения может проводиться, помимо сравнения вручную, посредством алгоритма локальной гомологии Smith and Waterman (1981) [Ad. App.Math. 2:482], посредством алгоритма локальной гомологии Neddleman and Wunsch (1970) [J. Mol. Biol. 48:443], посредством способа поиска сходства Pearson and Lipman (1988) [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 2444] или посредством компьютерной программы, использующей данные алгоритмы (GAP, BESTFIT, FASTA и TFASTA в Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI, или программой для сравнения BLAST NR или BLAST P).

Процентная доля идентичности между двумя последовательностями нуклеиновых кислот или аминокислотными последовательностями определяется сравнением двух оптимально выровненных последовательностей, в которых последовательность нуклеиновой кислоты или аминокислотная последовательность, подлежащая сравнению, может иметь присоединения или делеции по сравнению с контрольной последовательностью для оптимального выравнивания между двумя последовательностями. Процентная доля идентичности рассчитывается определением числа положений, в которых аминокислота, нуклеотид или остаток являются идентичными между двумя последовательностями, путем деления числа идентичных положений на общее число положений в интервале выравнивания и умножения результата на 100 с получением процентной доли идентичности между двумя последовательностями.

Например, можно использовать программу BLAST, "BLAST 2 sequences" (Tatusova et al., "Blast 2 sequences - a new tool for comparing protein and nucleotide sequences", FEMS Microbiol., 1999, Lett. 174: 247-250), доступную на сайте http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/bl2.html, с параметрами по умолчанию (а именно для параметров «штраф за создание пробела»: 5 и «штраф за удлинение пробела»: 2; причем выбранной матрицей является, например, матрица «BLOSUM 62», предложенная программой); процентная доля идентичности между двумя последовательностями, подлежащими сравнению, рассчитывается непосредственно программой.

Для аминокислотной последовательности, демонстрирующей по меньшей мере 80%-ную, предпочтительно 85%-ную, 90%-ную, 95%-ную и 98%-ную идентичность с контрольной аминокислотной последовательностью, предпочтительные примеры включают примеры, содержащие контрольную последовательность, определенные модификации, а именно делецию, присоединение или замену по меньшей мере одной аминокислоты, усечение или удлинение. В случае замены одной или более чем одной последовательных или непоследовательных аминокислот, предпочтительными являются замены, при которых замененные аминокислоты заменяются «эквивалентными» аминокислотами. Здесь подразумевается, что выражение «эквивалентные аминокислоты» указывает на любые аминокислоты, вероятно подлежащие замене на одну из структурных аминокислот, однако, без модификации биологических активностей соответствующих антител и из тех конкретных примеров, которые определены ниже.

Эквивалентные аминокислоты можно определять либо по их структурной гомологии с аминокислотами, которыми они заменяются, либо по результатам сравнительных тестов биологической активности между разными антителами, которые вероятно будут получены.

В качестве неограничивающего примера, в таблице 1, приведенной ниже, обобщены возможные замены, которые вероятно будут проводиться, не приводя к значительной модификации биологической активности соответствующего модифицированного антитела; естественно, при тех же самых условиях возможны обратные замены.

Таблица 1
Исходный остаток	Замена(ны)
Ala (А)	Val, Gly, Pro
Arg (R)	Lys, His
Asn (N)	Gln
Asp (D)	Glu
Cys (C)	Ser
Gln (Q)	Asn
Glu (G)	Asp
Gly (G)	Ala
His (H)	Arg
Ile (I)	Leu
Leu (L)	Ile, Val, Met
Lys (K)	Arg
Met (M)	Leu
Phe (F)	Tyr
Pro (P)	Ala
Ser (S)	Thr, Cys
Thr (T)	Ser
Trp (W)	Tyr
Tyr (Y)	Phe, Trp
Val (V)	Leu, Ala

Специалистам в данной области известно, что при современном уровне техники наибольшая изменчивость (по длине и составу) между шестью CDR обнаруживается в трех CDR тяжелой цепи и, более конкретно, в CDR-H3 данной тяжелой цепи.

В конкретном воплощении настоящее изобретение относится к мышиному антителу или его производным соединениям, или функциональным фрагментам.

В другом воплощении изобретения раскрыто антитело или один из его функциональных фрагментов или производных, содержащее легкую цепь, содержащую следующие три CDR согласно IMGT:

- CDR-L1 последовательности SEQ ID No. 1 или последовательности с по меньшей мере 80%-ной, предпочтительно 85%-ной, 90%-ной, 95%-ной и 98%-ной идентичностью с последовательностью SEQ ID No. 1 после оптимального выравнивания;

- CDR-L2 последовательности SEQ ID No. 2 или последовательности с по меньшей мере 80%-ной, предпочтительно 85%-ной, 90%-ной, 95%-ной и 98%-ной идентичностью с последовательностью SEQ ID No. 2 после оптимального выравнивания; и

- CDR-L3 последовательности SEQ ID No. 3 или последовательности с по меньшей мере 80%-ной, предпочтительно 85%-ной, 90%-ной, 95%-ной и 98%-ной идентичностью с последовательностью SEQ ID No. 3 после оптимального выравнивания, и

тяжелую цепь, содержащую следующие три CDR согласно IMGT:

- CDR-H1 последовательности SEQ ID No. 4 или последовательности с по меньшей мере 80%-ной, предпочтительно 85%-ной, 90%-ной, 95%-ной и 98%-ной идентичностью с последовательностью SEQ ID No. 4 после оптимального выравнивания;

- CDR-H2 последовательности SEQ ID No. 5 или последовательности с по меньшей мере 80%-ной, предпочтительно 85%-ной, 90%-ной, 95%-ной и 98%-ной идентичностью с последовательностью SEQ ID No. 5 после оптимального выравнивания; и

- CDR-H3 последовательности SEQ ID No. 6 или последовательности с по меньшей мере 80%-ной, предпочтительно 85%-ной, 90%-ной, 95%-ной и 98%-ной идентичностью с последовательностью SEQ ID No. 6 после оптимального выравнивания.

В предпочтительном воплощении антитело или его функциональный фрагмент, или производное по изобретению, которое на опухолях 1) специфично связывается с независимой от лиганда активированной формой cMet, но 2) не связывается с неактивированной и/или зависимой от лиганда активированной формой(ами) cMet, содержит а) легкую цепь, содержащую следующие три CDR, как определено согласно IMGT, соответственно CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3, где CDR-L1 содержит последовательность SEQ ID No. 1, CDR-L2 содержит последовательность SEQ ID No. 2, и CDR-L3 содержит последовательность SEQ ID No. 3, и б) тяжелую цепь, содержащую следующие три CDR, как определено согласно IMGT, соответственно CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3, где CDR-H1 содержит последовательность SEQ ID No. 4, CDR-H2 содержит последовательность SEQ ID No. 5, и CDR-H3 содержит последовательность SEQ ID No. 6.

Кроме того, в другом воплощении изобретения раскрыто антитело или один из его функциональных фрагментов или производных, содержащее легкую цепь, содержащую следующие три CDR согласно IMGT:

- CDR-L1 последовательности SEQ ID No. 9 или последовательности с по меньшей мере 80%-ной, предпочтительно 85%-ной, 90%-ной, 95%-ной и 98%-ной идентичностью с последовательностью SEQ ID No. 9 после оптимального выравнивания;

- CDR-L2 последовательности SEQ ID No. 10 или последовательности с по меньшей мере 80%-ной, предпочтительно 85%-ной, 90%-ной, 95%-ной и 98%-ной идентичностью с последовательностью SEQ ID No. 10 после оптимального выравнивания; и

- CDR-L3 последовательности SEQ ID No. 11 или последовательности с по меньшей мере 80%-ной, предпочтительно 85%-ной, 90%-ной, 95%-ной и 98%-ной идентичностью с последовательностью SEQ ID No. 11 после оптимального выравнивания, и

тяжелую цепь, содержащую следующие три CDR согласно IMGT:

- CDR-H1 последовательности SEQ ID No. 12 или последовательности с по меньшей мере 80%-ной, предпочтительно 85%-ной, 90%-ной, 95%-ной и 98%-ной идентичностью с последовательностью SEQ ID No. 12 после оптимального выравнивания;

- CDR-H2 последовательности SEQ ID No. 13 или последовательности с по меньшей мере 80%-ной, предпочтительно 85%-ной, 90%-ной, 95%-ной и 98%-ной идентичностью с последовательностью SEQ ID No. 13 после оптимального выравнивания; и

- CDR-H3 последовательности SEQ ID No. 14 или последовательности с по меньшей мере 80%-ной, предпочтительно 85%-ной, 90%-ной, 95%-ной и 98%-ной идентичностью с последовательностью SEQ ID No. 14 после оптимального выравнивания.

В предпочтительном воплощении антитело или его функциональный фрагмент, или производное по изобретению, которое на опухолях 1) специфично связывается с независимой от лиганда активированной формой cMet, но 2) не связывается с неактивированной и/или зависимой от лиганда активированной формой(ами) cMet, содержит а) легкую цепь, содержащую следующие три CDR, как определено согласно IMGT, соответственно CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3, где CDR-L1 содержит последовательность SEQ ID No. 9, CDR-L2 содержит последовательность SEQ ID No. 10, и CDR-L3 содержит последовательность SEQ ID No. 11, и б) тяжелую цепь, содержащую следующие три CDR, как определено согласно IMGT, соответственно CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3, где CDR-H1 содержит последовательность SEQ ID No. 12, CDR-H2 сод