Средство для коррекции патологических состояний клеток органов и тканей и/или органов и тканей человека, на основе гена gpx3, связанных с оксидативным стрессом, способ получения и использования

Средство для коррекции патологических состояний клеток органов и тканей и/или органов и тканей человека, на основе гена gpx3, связанных с оксидативным стрессом, способ получения и использования

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область, к которой относится изобретение

Изобретение относится к молекулярной биологии, биотехнологии, генной инженерии и медицине и может быть использовано для усиления защиты клеток различных органов и тканей, а также собственно органов и тканей человека от оксидативного стресса, в частности, в терапевтических целях.

Предшествующий уровень.

Оксидативный стресс клетки отражает дисбаланс между продукцией реактивных форм кислорода (азота) и антиоксидантной системой защиты. Он проявляется в мембранной дисфункции, повреждении ДНК, инактивации белкового синтеза. Оксидативный стресс приводит к образованию первичных и вторичных реактивных форм кислорода и азота, чаще известных как свободные радикалы.

Избыточная продукция свободных радикалов (O₂⋅-, ОН⋅, NO:⋅), является фактором повреждения клеток организма, в частности они повреждают все компоненты клеточных структур, включая липиды мембран, белки и ДНК, что ведет к мутагенезу и высокому риску опухолеобразования. Избыточная активация реакций свободнорадикального окисления встречается при самых различных заболеваниях таких, как атеросклероз, болезни Паркинсона и Альцгеймера, диабет, катаракта, онкологические заболевания. Гиперпродукция свободных радикалов является также и характеристикой старения, что проявляется токсичностью на разных уровнях - органном, клеточном, генном.

Поэтому в клетке имеется естественная антиоксидантная система. Она представлена ферментами, среди которых наибольшее значение имеют Mn²⁺- и Cu²⁺-зависимые супероксиддисмутазы (гены SOD1 и SOD2), глютатионпероксидаза GPX, глютатионредуктаза и каталаза CAT. SOD преобразует супероксид-анионы в перекись водорода, которая затем трансформируется в воду другими ферментами, GPX и CAT. Ферментные антиоксиданты являются элементами внутриклеточной защиты, поскольку в плазме крови и в лимфе они обнаруживаются лишь в следовых количествах.

На активность антиоксидантных ферментов оказывают влияние возрастные изменения, которые выражаются в снижении их экспрессии. Стимуляция естественных антиоксидантных систем, привнесение экзогенных антиоксидантов - важный момент профилактики воспаления и раннего старения. В настоящее время для предотвращения или коррекции оксидативного стресса применяются препараты с генами антиоксидативных белков, которые обладают разной силой защитного ответа.

Так в патенте US 6045809 для нейтрализации токсического действия активных форм кислорода было предложено использовать фармацевтические композиции для перорального введения фермента - антиоксиданта супероксиддисмутазы в сочетании, по крайней мере, с одним из липидов (на примере керамидов) или белков (на примере проламинов). Недостаток данного подхода состоит в том, что при данном методе введения желаемый терапевтический эффект может оказаться недостигнутым, а также - при недостаточной степени очистки возможны побочные реакции.

В патенте US 8926965 было предложено использовать рекомбинантный модифицированный вариант супероксиддисмутазы-2. В ее аминокислотную последовательность путем создания мутаций в кодирующей нуклеотидной последовательности были внесены изменения по по сайтам К53 и К89 (степень идентичности модифицированного варианта белка и нативного белка не менее 95%). Нуклеотидная последовательность, кодирующая модифицированный белок, была введена в клетку-хозяин (эукариотические или прокариотические клетки, например бактериальные) с помощью рекомбинантного вектора экспрессии. Была показана трансляция белка модифицированной супероксиддисмутазы-2, и что его ферментативная активность более чем в 10 раз выше, чем у немодифицированного белка. Также было заявлено, что модифицированный пептид можно использовать для уменьшения оксидативного стресса и/или окислительного повреждения клетки как собственно лекарственное средство, так и в композиции с другими компонентами.

Недостатком данного подхода является высокая стоимость получения чистого рекомбинантного белка, а также - внесение модификаций в аминокислотную последовательность природного белка может привести к образованию структур, являющихся антигенными детерминантами.

За прототип авторами было принято решение по заявке WO 1988007541 А1, в котором предлагается использовать белок рекомбинантной глутатионпероксидазы человека для снижения оксидативного стресса в клетках, тканях и органах. Глутатионпероксидаза катализирует процесс разложения пероксида водорода и органических перекисей с одновременным окислением глутатиона, что и придает этому ферменту первоочередное значение в антиоксидатной защите организма.

Этот белок является одним из немногих белков, известных у высших позвоночных, который содержит селеноцистеин, который находится в активном центре глутатионпероксидазы. Обнаружены несколько изоформ фермента, которые образуются в результате альтернативного сплайсинга. Глутатионпероксидаза формирует высокоактивный интермедиант - селеновую кислоту, селеновая кислота при этом защищена белковым окружением от активных групп внутри самого белка. Механизм действия глутатионпероксидазы базируется на реакции селеновой кислоты с амидами или аминами другого белка, формируя селеноамидные связи.

Продукт гена GPX является фактором в развитии ишемической болезни сердца. Недостаток этого фермента может способствовать возникновению повреждений в эндотелиальной выстилке сосудов, что может привести к преждевременному старению эритроцитов. Снижение активности гена GPX может приводить к формированию катаракты. Глутатионпероксидаза помогает предотвратить нарушение функции сердца в результате реперфузионного синдрома при ишемии. Глутатионпероксидаза человека может быть использована для терапии различных расстройств, обусловленных появлением пероксидов как продуктов метаболизма клетки.

Изобретение по прототипу предлагает способ синтеза глутатионпероксидазы человека в большом количестве с использованием методов рекомбинантной ДНК. В патенте представлен полинуклеотид, с последовательностью кДНК гена GPX человека. Последовательность полинуклеотида или его модифицированные формы были встроены в векторы для экспрессии в эукариотических клетках рекомбинантных продуктов: глутатионпероксидаза человека, фрагменты глутатионпероксидазы человека, аналоги глутатионпероксидазы человека и аналоги фрагментов глутатионпероксидазы человека. Эти рекомбинантные полипептидные продукты имеют потенциальную терапевтическую пользу. Кроме того, они могут быть использованы для получения моноклональных и поликлональных антител к продукту гена GPX человека. Данные антитела применимы для диагностики недостатка продукта гена GPX у человека. Кроме того, аналог глутатионпероксидазы человека, активные фрагменты глутатионпероксидазы человека и моноклональные антитела к глутатионпероксидазе человека могут применяться для определения взаимодействия фермента с различными субстратами на основе взаимодействия фермента с гидрофильными и гидрофобными участками.

Недостатком данного подхода является высокая стоимость получения чистого рекомбинантного белка, более частое его введения при терапии (что увеличивает стоимость терапии и повышает риск побочных явлений) и сложность внутриклеточной доставки препарата. Также при создании терапевтического средства по прототипу не учтены индивидуальные характеристики пациента

Раскрытие изобретения

Задачей данного изобретения является создание линейки высокоэффективных биологически активных генно-терапевтических субстанций, способных препятствовать снижению антиоксидантной активности белка глутатионпероксидазы-3 в клетках органов и тканей и/или органах и тканях человека путем повышения уровня экспрессии гена GPX3 в клетках органов и тканей и/или органах и тканях человека, и/или повышения активности белка глутатионпероксидазы-3, ответственного за поддержание окислительно-восстановительного баланса в клетках органов и тканей и/или органах и тканях организма с учетом индивидуальных особенностей пациента.

Задача решается за счет того, что создана линейка биологически активных генно-терапевтических субстанций для коррекции патологических состояний клеток органов и тканей и/или органов и тканей человека, связанных с оксидативным стрессом, каждая из которых представляет собой генетическую конструкцию на основе векторной плазмиды, содержащей нативную кДНК гена GPX3 SEQ ID No: 1 или одну из модифицированных кДНК гена GPX3, и содержащей также регуляторные элементы, обеспечивающие транскрипцию этой последовательности в эукариотических клетках, в частности в клетках органов и тканей человека и способную обеспечить высокий уровень экспрессии гена GPX3 и увеличить активность белка глутатионпероксидазы-3 в клетках органов и тканей и/или органах и тканях человека, в частности, в гемопоэтических клетках, или гепатоцитах, или мезенхимальных стволовых клетках, или хондробластах, или клетках поджелудочной железы (например, в клетках панкреатических островков), или миоцитах или фибробластах кожи, или кератоцитах, или эпителиальных клетках роговицы, или в нейронах, ганглиях, Шванновских клетках, астроцитах, олигодендроцитах, микроглии, или в сперматозоидах, или в нефронах, или эндотелиальных клетках, или эпителиальных клетках в сочетании с транспортной молекулой или без нее при трансфекции этими биологически активными генно-терапевтическими субстанциями клеток органов и тканей человека и/или в органах и тканях человека в частности, в коже, суставах, печени, надпочечниках, почках, головном и спинном мозге, легких, сердце, сосудах, желудочно-кишечном тракте, простате, поджелудочной железе, глазе, роговице, слизистой оболочке, хрящевой ткани, мышечной ткани в сочетании с транспортной молекулой или без нее при введении этих биологически активных генно-терапевтических субстанций в органы и ткани человека. При этом генетическая конструкция с кДНК гена GPX3 содержит последовательность нуклеотидов, включающую в себя белок-кодирующую область кДНК гена GPX3, которая несет модификации, не затрагивающие структуру белка глутатионпероксидазы-3, а именно: делеции 5' нетранслируемых областей или делеции 3'-нетранслируемых областей, или нуклеотидные замены, не приводящие к аминокислотным заменам или обрыву аминокислотной цепи, или комбинации вышеперечисленных модификаций и, соответственно, не влияющие на кодируемую этой последовательностью аминокислотную последовательность. В качестве модифицированной кДНК гена GPX3 используют SEQ ID No: 2. Или в качестве модифицированной кДНК гена GPX3 используют SEQ ID No: 3. Или в качестве модифицированной кДНК гена GPX3 используют SEQ ID No: 4. Или в качестве модифицированной кДНК гена GPX3 используют SEQ ID No: 5. Или в качестве модифицированной кДНК гена GPX3 используют SEQ ID No: 6. Или в качестве модифицированной кДНК гена GPX3 используют SEQ ID No: 7. При этом в качестве транспортной молекулы используют липосомы, или дендримеры 5-го и выше поколений, или амфифильные блоксополимеры

Способ получения биологически активной генно-терапевтической субстанции для коррекции патологических состояний клеток органов и тканей и/или органов и тканей человека, связанных с оксидативным стрессом заключается в том, что получают кДНК гена GPX3, затем помещают кДНК в векторную плазмиду, способную обеспечить высокий уровень экспрессии этой кДНК в клетках различных органов и тканей человека, наращивают и выделяют необходимое количество генетической конструкции, затем комбинируют генетическую конструкцию с транспортной молекулой для трансфекции полученной биологически активной генно-терапевтической субстанцией клеток органов и тканей и/или введения полученной биологически активной генно-терапевтической субстанции в органы и ткани человека.

Или способ получения биологически активной генно-терапевтической субстанции для коррекции патологических состояний клеток различных органов и тканей человека, связанных с оксидативным стрессом заключается в том, что получают кДНК гена GPX3, модифицируют его по п.п. 3, или 4, или 5 или 6 или 7 или 8, затем помещают модифицированную кДНК в векторную конструкцию, способную обеспечить высокий уровень экспрессии этой кДНК в клетках различных органов и тканей человека, наращивают и выделяют необходимое количество генетической конструкции, затем комбинируют генетическую конструкцию с транспортной молекулой для трансфекции полученной биологически активной генно-терапевтической субстанцией клеток органов и тканей и/или введения полученной биологически активной генно-терапевтической субстанции в органы и ткани человека.

Способ использования каждой из созданных и представленных в линейке биологически активных генно-терапевтических субстанций для коррекции патологических состояний клеток органов и тканей и/или органов и тканей человека, связанных с оксидативным стрессом, заключается в трансфекции созданной биологически активной генно-терапевтической субстанцией, выбранной с учетом индивидуальных особенностей каждого конкретного пациента на основе предварительного эксперимента по определению наиболее эффективного варианта из созданных и представленных в линейке биологически активных генно-терапевтических субстанций, клеток органов и тканей человека.

Или способ использования каждой из созданных и представленных в линейке биологически активных генно-терапевтических субстанций для коррекции патологических состояний клеток органов и тканей и/или органов и тканей человека, связанных с оксидативным стрессом, заключается во введении одной из созданных биологически активных генно-терапевтической субстанций, выбранной именно для данного пациента на основе предварительного эксперимента по определению наиболее эффективного варианта из созданных и представленных в линейке биологически активных генно-терапевтических субстанций, в органы и ткани этого пациента, и/или во введении аутологичных клеток пациента, трансфицированных одной из созданных биологически активных генно-терапевтической субстанций, выбранной именно для данного пациента на основе предварительного эксперимента по определению наиболее эффективного варианта из созданных и представленных в линейке биологически активных генно-терапевтических субстанций, в органы и ткани этого пациента.

Перечень фигур

На фиг. 1

Представлена нуклеотидная последовательность немодифицированной кДНК гена GPX3, последовательность которой идентична приводимой в базе даных GenBank под номером NM_002084.3 - SEQ ID No: 1.

На фиг. 2

Представлена нуклеотидная последовательность модифицированной кДНК гена GPX3, SEQ ID No: 2, которая

содержит 1 нуклеотидную замену G→C в позиции 238 и 1 нуклеотидную замену G→T в позиции 277, не приводящие к изменениям в аминокислотной последовательности белка глутатионпероксидазы-3.

На фиг. 3

Представлена нуклеотидная последовательность модифицированной кДНК гена GPX3, SEQ ID No: 3, которая

содержит 1 нуклеотидную замену G→C в позиции 238; две нуклеотидных замены G→T в позициях 277, 301; 1 нуклеотидную замену А→С в позиции 325, не приводящие к изменениям в аминокислотной последовательности белка глутатионпероксидазы-3.

На фиг. 4

Представлена нуклеотидная последовательность модифицированной кДНК гена GPX3, SEQ ID No: 4, которая

содержит 1 нуклеотидную замену G→C в позиции 238; две нуклеотидных замены G→T в позициях 277, 301; 1 нуклеотидную замену А→С в позиции 325; 1 нуклеотидную замену G→A в позиции 445; 1 нуклеотидную замену A→G в позиции 472, не приводящие к изменениям в аминокислотной последовательности белка глутатионпероксидазы-3.

На фиг. 5

Представлена нуклеотидная последовательность модифицированной кДНК гена GPX3, SEQ ID No: 5, которая

содержит 1 нуклеотидную замену G→C в позиции 238; две нуклеотидных замены G→T в позициях 277, 301; 1 нуклеотидную замену А→С в позиции 325; 1 нуклеотидную замену G→А в позиции 445; 3 нуклеотидных замены A→G в позиции 472, 586, 673, не приводящие к изменениям в аминокислотной последовательности белка глутатионпероксидазы-3.

На фиг. 6

Представлена нуклеотидная последовательность модифицированной кДНК гена GPX3, SEQ ID No: 6, которая

содержит 2 нуклеотидных замены G→C в позициях 238, 826; три нуклеотидных замены G→T в позициях 277, 301, 697; 2 нуклеотидных замены А→С в позиции 325, 796; 1 нуклеотидную замену G→A в позиции 445; 3 нуклеотидных замены A→G в позиции 472, 586, 673, не приводящие к изменениям в аминокислотной последовательности белка глутатионпероксидазы-3.

На фиг. 7

Представлена нуклеотидная последовательность модифицированной кДНК гена GPX3, SEQ ID No: 7, которая

не содержит нетранслируемые 5' и 3' области гена и содержит 2 нуклеотидных замены G→C в позициях 238, 826; три нуклеотидных замены G→T в позициях 277, 301, 697; 2 нуклеотидных замены А→С в позиции 325, 796; 1 нуклеотидную замену G→A в позиции 445; 3 нуклеотидных замены A→G в позиции 472, 586, 673, не приводящие к изменениям в аминокислотной последовательности белка глутатионпероксидазы-3.

На фиг. 8

С целью последующего корректного определения генно-терапевтического эффекта после трансфекции фибробластов биологически активной генно-терапевтической субстанции с кДНК гена GPX3 проводили анализ эндогенной экспрессии гена GPX3 в культуре первичных фибробластов. На фигуре представлены графики накопления продуктов полимеразной цепной реакции (ПЦР), соответствующих:

1 - кДНК гена GPX3, фибробласты со сниженной экспрессией гена GPX3

2 - кДНК гена GPX3, фибробласты с нормальной экспрессией гена GPX3

3 - кДНК гена В2М, фибробласты со сниженной экспрессией гена GPX3

4 - кДНК гена В2М, фибробласты с нормальной экспрессией гена GPX3

В качестве референтного гена использовали ген В2М (Бета-2-микроглобулин) приведенного в базе данных GenBank под номером NM 004048.2.

На фиг. 9

С целью подтверждения увеличения экспрессии гена GPX3 в клеточной культуре фибробластов со сниженной экспрессией гена GPX3 при трансфекции данных клеток биологически активной генно-терапевтической субстанцией с кДНК гена GPX3 представлены графики накопления ПЦР-продуктов, соответствующих:

1 - кДНК гена GPX3 в фибробластах с нормальной экспрессией гена GPX3,

2 - кДНК гена GPX3 в фибробластах со сниженной экспрессией гена GPX3 до трансфекции БАГТС с кДНК гена GPX3.

3 - кДНК гена GPX3 в фибробластах со сниженной экспрессией гена GPX3 после трансфекции БАГТС с кДНК гена GPX3.

4 - кДНК гена GPX3 в фибробластах со сниженной экспрессией гена GPX3 после трансфекции вектором без кДНК гена GPX3.

5 - кДНК гена В2М в фибробластах с нормальной экспрессией гена GPX3.

6 - кДНК гена В2М в фибробластах со сниженной экспрессией гена GPX3 до трансфекции БАГТС с кДНК гена GPX3.

5 - кДНК гена В2М в фибробластах со сниженной экспрессией гена GPX3 после трансфекции БАГТС с кДНК гена GPX3.

8 - кДНК гена В2М в фибробластах со сниженной экспрессией гена GPX3 после трансфекции вектором без кДНК гена GPX3.

Из графиков следует, что в случае трансфекции вектором без вставки кДНК гена GPX3 уровень кДНК гена GPX3 в фибробластах не изменился, а в случае трансфекции вектором с кДНК GPX3-уровень кДНК фибробластов со сниженной экспрессией гена GPX3 многократно увеличился (до уровня выше, чем уровень кДНК гена GPX3 в нормальных фибробластах).

На фиг. 10

С целью подтверждения увеличения активности белка глутатионпероксидазы-3 в клеточной культуре фибробластов с нормальной экспрессией гена GPX3 при трансфекции данных клеток биологически активной генно-терапевтической субстанцией содержащим кДНК GPX3 представлен график изменения активности белка глутатионпероксидазы-3 в зависимости от разведения клеточного лизата немодифицированных фибробластов (культура А), трансфицированных вектором pCDNA 3.1 (+) не содержащим кДНК GPX3 (культура В) и трансфицированных биологически активной генно-терапевтической субстанцией на базе вектора pCDNA 3.1, содержащего GPX3 SEQ ID No: 1 (культура С). Из графика следует, что при трансфекции фибробластов биологически активной генно-терапевтической субстанцией с кДНК гена GPX3 происходит увеличение активности глутатионпероксидазы-3 в клеточном лизате.

Обозначения:

культура А

культура В

культура С

На фиг. 11

С целью подтверждения увеличения активности глутатионпероксидазы-3 в коже человека при введении в кожу клеточной культуры фибробластов, трансфицированной биологически активной генно-терапевтической субстанцией представлен анализ изменения активности глутатионпероксидазы-3 в коже пациентов. При этом пациентам вводили три варианта культуры аутологичных фибробластов - нетрансфицированные (А), трансфицированные вектором pCMV6-XL5 (Б) и трансфицированные биологически активной генно-терапевтической субстанцией на базе pCMV6-GPX3 SEQ ID No: 7 (С) - в кожу предплечья. Также анализировали активность глутатионпероксидазы-3 в интактной коже. Показано повышение активности глутатионпероксидазы-3 в коже пациента в области введения фибробластов, трансфицированных биологически активной генно-терапевтической субстанцией кДНК гена GPX3.(C)

Обозначения:

культура А

культура В

культура С

контрольная биопсия

На фиг. 12

С целью подтверждения увеличения активности глутатионпероксидазы-3 до различного индивидуального уровня в клеточных культурах фибробластов пациентов при трансфекции данных клеток биологически активными генно-терапевтическими субстанциями с модифицированными и нативной кДНК гена GPX3 в зависимости от наличия и типа в них той или иной модификации кДНК гена GPX3 представлен анализ изменения активности глутатионпероксидазы-3 в культурах фибробластов кожи человека в зависимости от наличия и типа модификаций в кДНК гена GPX3, используемой для трансфекции фибробластов.

Культуры фибробластов 23-х пациентов делили на 8 частей каждую с (А) по (Н); первые части (А) клеточных культур пациентов трансфицировали биологически активной генно-терапевтической субстанцией pCMV6-GPX3 SEQ ID No: 1, части (В) трансфицировали биологически активной генно-терапевтической субстанцией pCMV6-GPX3 SEQ ID No: 2, части (С) трансфицировали биологически активной генно-терапевтической субстанцией pCMV6-GPX3 SEQ ID No: 3, части (D) трансфицировали биологически активной генно-терапевтической субстанцией pCMV6-GPX3 SEQ ID No: 4, части (E) трансфицировали биологически активной генно-терапевтической субстанцией pCMV6-GPX3 SEQ ID No: 5, части (F) трансфицировали биологически активной генно-терапевтической субстанцией pCMV6-GPX3 SEQ ID No: 6, части (G) трансфицировали биологически активной генно-терапевтической субстанцией pCMV6-GPX3 SEQ ID No: 7, части (H) трансфицировали векторной плазмидой, не содержащей кДНК гена GPX3.

По итогам анализа уровня активности глутатионпероксидазы-3 выбрали показатели, касательно каждой части клеточной культуры от каждого пациента, продемонстрировавшие максимальные уровни активности глутатионпероксидазы-3 и объединили их в семь групп, исходя из следующего критерия:

В группе 1 максимальная активность глутатионпероксидазы-3 наблюдалась при трансфекции pCMV6-GPX3 SEQ ID No: 1.

В группе 2 максимальная активность глутатионпероксидазы-3 наблюдалась при трансфекции pCMV6-GPX3 SEQ ID No: 2.

В группе 3 максимальная активность глутатионпероксидазы-3 наблюдалась при трансфекции pCMV6-GPX3 SEQ ID No: 3.

В группе 4 максимальная активность глутатионпероксидазы-3 наблюдалась при трансфекции pCMV6-GPX3 SEQ ID No: 4.

В группе 5 максимальная активность глутатионпероксидазы-3 наблюдалась при трансфекции pCMV6-GPX3 SEQ ID No: 5.

В группе 6 максимальная активность глутатионпероксидазы-3 наблюдалась при трансфекции pCMV6-GPX3 SEQ ID No: 6.

В группе 7 максимальная активность глутатионпероксидазы-3 наблюдалась при трансфекции pCMV6-GPX3 SEQ ID No: 7.

Ни в одной из клеточных культур не наблюдалось того, что максимальная активность глутатионпероксидазы-3 присутствует при трансфекции вектором без вставки кДНК гена GPX3.

На фигуре 12 для каждой группы клеточных культур приведены диаграммы показателей ингибирования цветной реакции (усредненных в рамках группы, в случае, если в группу входит более одной клеточной культуры) применительно ко всем, участвующим в эксперименте активным генно-терапевтическим субстанциям, после трансфекции этих клеточных культур активными генно-терапевтическими субстанциями, содержащими модифицированные и нативную кДНК гена GPX3

Из фигуры следует, что достижение максимальной активности глутатионпероксидазы-3 в культурах фибробластов кожи различных пациентов при их трансфекции биологически активными генно-терапевтическими субстанциями, связано с индивидуальными особенностями пациентов и зависит от наличия и типа модификаций в кДНК гена GPX3, входящих в биологически активные генно-терапевтические субстанции.

Каждая биологически активная генно-терапевтическая субстанция из линейки биологически активных генно-терапевтических субстанций является эффективной в некоторой значительной группе пациентов. Следовательно для выбора наиболее эффективной биологически активной генно-терапевтической субстанции из линейки биологически активных генно-терапевтических субстанций для терапевтических целей необходимо предварительное персонализированное исследование пациента.

Обозначения:

части клеточных культур, трансфицированных БАГТС GPX3 SEQ ID No: 1 (А)

части клеточных культур, трансфицированных БАГТС GPX3 SEQ ID No: 2 (В)

части клеточных культур, трансфицированных БАГТС GPX3 SEQ ID No: 3 (С)

части клеточных культур, трансфицированных БАГТС GPX3 SEQ ID No: 4 (D)

части клеточных культур, трансфицированных БАГТС GPX3 SEQ ID No: 5 (Е)

части клеточных культур, трансфицированных БАГТС GPX3 SEQ ID No: 6 (F)

части клеточных культур, трансфицированных БАГТС GPX3 SEQ ID No: 7 (G)

части клеточных культур, трансфицированных плацебо (Н)

На фиг. 13

С целью подтверждения увеличения экспрессии гена GPX3 в клеточной культуре кератоцитов и эпителиальных клеток глаза при трансфекции данных клеток биологически активной генно-терапевтической субстанцией с кДНК гена GPX3 приведены графики накопления ПЦР-продуктов, соответствующих:

1 - кДНК гена GPX3, кератоциты до трансфекции

2 - кДНК гена GPX3, эпителий роговицы до трансфекции

3 - кДНК гена GPX3, кератоциты после трансфекции

4 - кДНК гена GPX3, эпителий роговицы после трансфекции

5 - кДНК гена В2М, кератоциты до трансфекции

6 - кДНК гена В2М, эпителий роговицы до трансфекции

7 - кДНК гена В2М, кератоциты после трансфекции

6 - кДНК гена В2М, эпителий роговицы после трансфекции

Ген В2М использовали в качестве референтного.

Из фигуры следует, что в результате трансфекции уровень специфической кДНК гена GPX3 в культуре кератоцитов и в культуре эпителия многократно вырос.

На фиг. 14

С целью подтверждения увеличения экспрессии гена GPX3 в клеточной культуре хондробластов при трансфекции данных клеток биологически активной генно-терапевтической субстанцией с кДНК гена GPX3 приведены графики накопления ПЦР-продуктов, соответствующих:

1 - кДНК гена GPX3, до трансфекции

2 - кДНК гена GPX3, после трансфекции

3 - кДНК гена В2М, до трансфекции

4 - кДНК гена В2М, после трансфекции

Ген В2М использовали в качестве референтного.

Из фигуры следует, что в результате трансфекции уровень специфической кДНК гена GPX3 вырос многократно.

На фиг. 15

С целью подтверждения увеличения активности глутатионпероксидазы-3 в коже человека при введении в кожу биологически активной генно-терапевтической субстанции представлен анализ изменения активности глутатионпероксидазы-3 в коже. При этом пациенту вводили биологически активную генно-терапевтическую субстанцию, содержащую векторную плазмиду с кДНК гена GPX3 pCMV6-GPX3 SEQ ID No: 4 (В) и параллельно вводили плацебо, представляющее собой комбинацию векторной плазмиды pCMV-XL5 не содержащей кДНК гена GPX3 с транспортной молекулой (А) - в кожу предплечья. Показано увеличение активности глутатионпероксидазы-3 в биоптате кожи пациента 1В, которому вводились биологически активная генно-терапевтическая субстанция, содержащая генетическую конструкцию с кДНК гена GPX3, что говорит об эффективности биологически активной генно-терапевтической субстанции.

Обозначения:

пациент 1А

пациент 1В

пациент 1В до введения БАГТС

На фиг. 16

С целью подтверждения увеличения активности глутатионпероксидазы-3 в слизистой оболочке рта человека при введении в слизистую оболочку рта биологически активной генно-терапевтической субстанции представлен анализ изменения активности глутатионпероксидазы-3 в слизистой оболочке рта. При этом пациенту вводили биологически активную генно-терапевтическую субстанцию, содержащую векторную плазмиду с кДНК гена GPX3 pCDNA 3.1 GPX3 SEQ ID No: 5 (В) и параллельно вводили плацебо pCDNA 3.1(+), представляющее собой комбинацию векторной плазмиды не содержащей кДНК гена GPX3 с транспортной молекулой (А) - в слизистую оболочку рта.

Показано увеличение активности глутатионпероксидазы-3 в лизате биоптата слизистой оболочки рта пациента 1В, которому вводились биологически активная генно-терапевтическая субстанция, содержащая генетическую конструкцию с кДНК гена GPX3, что говорит об эффективности биологически активной генно-терапевтической субстанции.

Обозначения:

пациент 1А

пациент 1В

пациент 1В до введения БАГТС

На фиг. 17

С целью подтверждения увеличения активности глутатионпероксидазы-3 в мышечной ткани человека при введении в мышечную ткань биологически активной генно-терапевтической субстанции представлен анализ изменения активности глутатионпероксидазы-3 в мышечной ткани. При этом пациенту вводили биологически активную генно-терапевтическую субстанцию, содержащую векторную плазмиду с кДНК гена GPX3-pCMV6-Kan/Neo GPX3 SEQ ID No: 6 (В) и параллельно вводили плацебо pCMV6-Kan/Neo, представляющее собой комбинацию векторной плазмиды не содержащей кДНК гена GPX3 с транспортной молекулой (А) - в мышечную ткань в зоне предплечья. Показано увеличение активности глутатионпероксидазы-3 в биоптате мышечной ткани пациента 1В, которому вводились биологически активная генно-терапевтическая субстанция, содержащая генетическую конструкцию с кДНК гена GPX3, что говорит об эффективности биологически активной генно-терапевтической субстанции.

Обозначения:

пациент 1А

пациент 1В

пациент 1В до введения БАГТС

На фиг. 18

С целью подтверждения увеличения активности глутатионпероксидазы-3 до различного индивидуального уровня при введении в кожу пациентов биологически активных генно-терапевтических субстанций с модифицированными и нативной кДНК гена GPX3 анализировали уровень активности глутатионпероксидазы-3 в коже человека в зависимости от наличия и типа модификаций в кДНК гена GPX3.

Каждому из 21-го пациента, отобранных в случайном порядке, вводили в кожу предплечья 7 биологически активных генно-терапевтических субстанций pCMV6- SEQ ID No: 1, pCMV6- SEQ ID No: 2, pCMV6- SEQ ID No: 3, pCMV6- SEQ ID No: 4, pCMV6- SEQ ID No: 5, pCMV6- SEQ ID No: 6, pCMV6- SEQ ID No: 7, и плацебо pCMV6- XL5.

По итогам анализа уровня активности глутатионпероксидазы-3 в биоптатах выбрали показатели, касательно каждого биоптата от каждого пациента, продемонстрировавшие максимальные уровни активности глутатионпероксидазы-3 и объединили их в семь групп, исходя из следующего критерия:

В группе 1 максимальная активность глутатионпероксидазы-3 наблюдалась при введении pCMV6-GPX3 SEQ ID No: 1.

В группе 2 максимальная активность глутатионпероксидазы-3 наблюдалась при введении pCMV6-GPX3 SEQ ID No: 2.

В группе 3 максимальная активность глутатионпероксидазы-3 наблюдалась при введении pCMV6-GPX3 SEQ ID No: 3.

В группе 4 максимальная активность глутатионпероксидазы-3 наблюдалась при введении pCMV6-GPX3 SEQ ID No: 4.

В группе 5 максимальная активность глутатионпероксидазы-3 наблюдалась при введении pCMV6-GPX3 SEQ ID No: 5.

В группе 6 максимальная активность глутатионпероксидазы-3 наблюдалась при введении pCMV6-GPX3 SEQ ID No: 6.

В группе 7 максимальная активность глутатионпероксидазы-3 наблюдалась при введении pCMV6-GPX3 SEQ ID No: 7.

Ни в одном из биоптатов не наблюдалось того, что максимальная активность глутатионпероксидазы-3 присутствует в случае введения плацебо.

На фигуре 18 для каждой группы биоптатов приведены диаграммы показателей ингибирования цветной реакции (усредненных в рамках группы, в случае, если в группу входит более одного биоптата) применительно ко всем, участвующим в эксперименте активным генно-терапевтическим субстанциям, после введения пациентам этих активных генно-терапевтических субстанций, содержащих модифицированные и нативную кДНК гена GPX3.

Из данного примера следует, что достижение максимальной активности глутатионпероксидазы-3 в биоптатах кожи различных пациентов при введении им в кожу биологически активных генно-терапевтических субстанций, связано с индивидуальными особенностями пациентов и зависит от наличия и типа модификаций в кДНК гена GPX3, входящих в биологически активные генно-терапевтические субстанции.

Каждая биологически активная генно-терапевтическая субстанция из линейки биологически активных генно-терапевтических субстанций является эффективной в некоторой значительной группе пациентов. Следовательно, для выбора наиболее эффективной биологически активной генно-терапевтической субстанции из линейки биологически активных генно-терапевтических субстанций для терапевтических целей, необходимо предварительное персонализированное исследование пациента.

Обозначения:

биоптаты пациентов после введения БАГТС GPX3 SEQ ID No: 1 (А)

биоптаты пациентов после введения БАГТС GPX3 SEQ ID No: 2 (В)

биоптаты пациентов после введения БАГТС GPX3 SEQ ID No: 3 (С)

биоптаты пациентов после введения БАГТС GPX3 SEQ ID No: 4 (D)

биоптаты пациентов после введения БАГТС GPX3 SEQ ID No: 5 (Е)

биоптаты пациентов после введения БАГТС GPX3 SEQ ID No: 6 (F)

биоптаты пациентов после введения БАГТС GPX3 SEQ ID No: 7 (G)

биоптаты пациентов после введения плацебо (Н)

На фиг. 19

С целью определения наиболее эффективной применительно к конкретному пациенту биологически активной генно-терапевтической субстанции анализировали активность глутатионпероксидазы-3 в клеточных лизатах фибробластов этого пациента, трансфицированных разными генетическими конструкциями, содержащими нативную или модифицированные кДНК гена GPX3.

По итогам анализа активности глутатионпероксидазы-3 в культуре фибробластов пациента выделили вариант биологически активной генно-терапевтической субстанции, при трансфекции которой происходит максимальное ингибирование в лизате клеточной культуры и соответственно наблюдается максимальная активность глутатионпероксидазы-3. В данном эксперименте максимальное