Линейка биологически активных генно-терапевтических субстанций на основе гена tgfb1 для коррекции патологических состояний клеток органов и тканей и органов и тканей человека, способ получения и использования

Линейка биологически активных генно-терапевтических субстанций на основе гена tgfb1 для коррекции патологических состояний клеток органов и тканей и органов и тканей человека, способ получения и использования

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область, к которой относится изобретение

Изобретение относится к молекулярной биологии, биотехнологии, генной инженерии и медицине и может быть использовано для коррекции патологических состояний клеток различных органов и тканей, а также собственно органов и тканей человека, связанных с количественным снижением белка трансформирующего фактора роста бета-1, в частности, в терапевтических целях.

Предшествующий уровень.

Факторы роста - полипептиды с молекулярной массой 5-50 кДа, объединенные в группу трофических регуляторных субстанций. Подобно гормонам, эти факторы обладают широким спектром биологического действия на многие клетки - стимулируют или ингибируют митогенез, хемотаксис, дифференцировку.

К факторам роста относятся белки семейства трансформирующих факторов роста, которое включает группу гомологичных гетеродимерных белков из 3х изоформ у млекопитающих. Так основной изоформой, секретируемой клетками иммунной системы, является продукт гена TGFB1 - трансформирующий фактор роста β1. Это полифункциональный цитокин, участвующий в регуляции процессов пролиферации, дифференцировки, миграции и апоптоза, а также ряда метаболических реакций в различных клетках-мишенях. В сущности, каждая клетка организма, включая эпителиальные, эндотелиальные, нервные и соединительно-тканные клетки, продуцирует трансформирующий фактор роста β1 и рецепторы к нему. Белок также продуцируется активированными Т-лимфоцитами и макрофагами, тромбоцитами, почками, плацентой.

Продукт гена TGF-β1 участвует в таких процессах, как воспаление, стимуляция ангиогенеза, миграция фибробластов, ремоделирование внеклеточного матрикса, костной ткани, стимулирует синтез коллагена (в частности коллагена типа I и III). Нарушение регуляции гена TGF-β1 может приводить к апоптозу. Было показано, что TGF-β1 может способствовать дифференциации лимфоцитов как Т-хелперов (Th17), так и линию регуляторных Т-клеток (Treg). При высоких концентрациях трансформирующий фактор роста β1 способствует дифференциации клеток в пользу развития Treg клеток, а при низких концентрациях TGF-β1 - дифференциации клеток в Т-хелперы.

Трансформирующий фактор роста β1 способен как позитивно, так и негативно регулировать работу множества других факторов роста. Он ингибирует синтез металлопротеиназ ММР-1, ММР-3, ММР-и 9 и стимулирует синтез тканевого ингибитора металлопротеиназы (TIMP-1), таким образом снижая уровень распада коллагена. При действии трансформирующего фактора роста β1 на иммунную систему преобладают ингибирующие эффекты. Он является элементом обратной регуляции иммунного ответа и, прежде всего, воспалительной реакции. В то же время он усиливает синтез белков межклеточного матрикса, способствует заживлению ран, оказывает анаболическое действие.

Количественное определение трансформирующего фактора роста β1 в крови рекомендуется при диагностике различных заболеваний. Известно, что продукт гена TGF-β1 участвует в организации реакции при процессах нейродегенерации. В связи с этим, определение этого белка актуально при мониторинге болезни Альцгеймера, синдрома Дауна, СПИДа, болезни Паркинсона. Было показано, что определение уровня продукта гена TGF-β1 в сыворотке и спинномозговой жидкости при рассеянном склерозе имеет большое значение для мониторинга ремиссии и активной фазы заболевания. Трансформирующий фактор роста β1 играет важную роль в костном метаболизме, обсуждается его возможная роль в качестве регулятора остеокласт-остеобластного взаимодействия. Таким образом, он может рассматриваться как маркер при остеопорозе, а также - при аутоиммунном гепатите, при синдроме хронической усталости, при миелофиброзе и миелоидной метаплазии, при раке простаты, раке шейки матки мочевого пузыря, печени, при сепсисе и инсульте, при заболевании малярией.

В заявке 2011110736 на патент на изобретение в РФ описан способ лечения индивидуума, имеющего множественную миелому, включающий в себя введение указанному индивидууму изолированных остеогенных плацентарных адгезивных клеток (ОРАС). Введение заметно снижает развитие одного или более симптомов указанной множественной миеломы (боли в костях, остеоцитные повреждения, анемию или почечную недостаточность), останавливает их развитие или улучшает их. Указанные клетки экспрессируют один или более генов (в т.ч. TGFB3, TGFBR1 и/или TGFBR2 - трансформирующий фактор роста бета, рецептор 2) на заметно более высоком уровне, чем эквивалентное количество CD200⁺ - адгезивных плацентарных стволовых клеток, при этом уровень экспрессии оценивается с помощью количественной ПЦР в режиме реального времени. А также клетки ОРАС экспрессирует один или более генов генов (в т.ч. TGFB3, TGFBR1 и/или TGFBR2) на заметно более высоком уровне, чем эквивалентное количество полученных из костного мозга мезенхимальных стволовых клеток, или экспрессируют один или более генов (в т.ч. TGFB1, TGFB2, TGFB3, TGFBR1) на заметно более высоком уровне, чем эквивалентное количество клеток фибробластов, и где указанные клетки фибробластов подвергались пассажам.

В патенте RU 2542471 описано, что уровень белка коннексина 43 (Cx43) на краю эпидермальной раны естественным образом повышается в течение 24-48 часов. Было показано, что регуляторное снижение уровня белка Cx43 после применения антисмысловых олигодезоксинуклеотидов (asODN) на кожной ране и на участках ожогового повреждения приводит к значительно ускоренному заживлению по сравнению с ранами, обработанными контрольными смысловыми олигодезоксинуклеотидами (sODN). Было выявлено, что ассоциированный с ранами трансформирующий фактор роста β1 играет важную роль в различных стадиях процесса заживления ран. Уровень экспрессии этого белка анализировали в участках ран, обработанных контрольными sODN и Cx43asODN, с помощью RT-ПЦР в 1-ый, 2-ой и 7-ой день после нанесения раны. На 2-ой день после повреждения экспрессия продукта гена TGFB1 в ранах, обработанных asODN, была значительно повышена (Р<0,05) по сравнению с ранами, обработанными контрольными sODN.

В заявке WO 2015047134 А1 показано, что ингибирующий эффект трансформирующего фактора роста β1 можно наблюдать на фоне стимуляции покоящихся кератоцитов с помощью эпидермального фактора роста EGF, поскольку продукт гена TGF-β1 структурно похож на белок гена EGF, и оба эти фактора связываются с одним рецептором. Трансформирующий фактор роста является мощным стимулятором выработки коллагена. Таким образом, увеличение этого фактора может приводить к образованию на месте травмы рубцовой ткани. Кроме того, повышенный уровень белка гена TGF-β1 свидетельствует об активных регенеративных процессах в ране. Фактор HMGB 1 регулирует выработку коллагена, работая как антагонист трансформирующего фактора роста β1, который в свою очередь стимулирует данный процесс.

За прототип авторами было принято решение по патенту RU 2471487, который описывает способ лечения и предупреждения нейродегенеративных заболеваний, в частности болезни Альцгеймера, с использованием генной терапии. Для этого вводят композицию, содержащую одну или более нуклеиновых кислот, индуцирующих клеточный иммунный ответ. Описанные в данном изобретении полинуклеотидные конструкции включают нуклеотидные последовательности, кодирующие элемент клеточного иммунного ответа или его фрагмент. При этом вводимые нуклеиновые кислоты кодируют один или более цитокинов, выбранных из группы, состоящей из IL-4 (интерлейкин-4), IL-10 (интерлейкин-10) и TGF-β (трансформирующий фактор роста бета). Данный полинуклеотид вводят таким образом, например, в виде инъекции, что полинуклеотид включается в клетки и экспрессирует определимое количество профилактически или терапевтически эффективного количества желательного элемента клеточного иммунного ответа или его фрагмента. Предпочтительно, элемент клеточного иммунного ответа увеличивает (экспрессию) гена, который снижает воспаление. Способ обеспечивает уменьшение накопления амилоидных образований в головном мозге больного, т.е. обеспечивает необходимый эффект при лечении нейродегенеративных заболеваний, в частности болезни Альцгеймера.

Недостатком данного подхода является то, что при создании генно-терапевтического средства в этом изобретении не учитывается индивидуальные характеристики пациента, в связи с чем может понадобиться линейка вариаций для данного средства, а также - то, что используются только немодифицированные нуклеотидные последовательности, у которых не наблюдается рост эффективности при использовании на пациенте.

Раскрытие изобретения

Задачей данного изобретения является создание линейки высокоэффективных биологически активных генно-терапевтических субстанций для коррекции патологических состояний организма человека способных препятствовать количественному снижению белка трансформирующего фактора роста бета-1 в клетках органов и тканей и/или органах и тканях человека путем повышения уровня экспрессии гена TGFB1 в клетках органов и тканей и/или органах и тканях человека, приводящего к повышению количества белка трансформирующего фактора роста бета-1, в клетках органов и тканей и/или органах и тканях организма с учетом индивидуальных особенностей пациента.

Создана линейка биологически активных генно-терапевтических субстанций для коррекции патологических состояний клеток органов и тканей и/или органов и тканей человека, связанных с количественным снижением белка трансформирующего фактора роста бета-1, каждая из которых представляет собой генетическую конструкцию на основе векторной плазмиды, содержащей нативную кДНК гена TGFB1 SEQ ID No: 1 или одну из модифицированных кДНК гена TGFB1, и содержащей также регуляторные элементы, обеспечивающие транскрипцию этой последовательности в эукариотических клетках, в частности в клетках органов и тканей человека и способную обеспечить высокий уровень экспрессии гена TGFB1 и увеличить количество белка трансформирующего фактора роста бета-1 в клетках органов и тканей и/или органах и тканях человека, в частности, в лейкоцитах, или лимфоцитах, или моноцитах, или тромбоцитах, или остеобластах, или остеоцитах, или фибробластах, или хондробластах, или хондроцитах, или НК-клетках (натуральных киллерах), или адипоцитах, или миоцитах, или гладкомышечных клетках, или клетках эпителия, или клетках эндотелия, или нейронах в сочетании с транспортной молекулой или без нее при трансфекции этими биологически активными генно-терапевтическими субстанциями клеток органов и тканей человека и/или в органах и тканях человека в частности, в костном мозге, или коре головного мозга, или слюнных железах, или поджелудочной железе, или желудке, или тонком кишечнике, или двенадцатиперстной кишке, или толстом кишечнике, или селезенке, или бронхах, или лимфатических узлах, или молочных железах, или коже, или гладких мышцах, или сердечной мышце, или кровеносных сосудах, или миндалинах, или почках, или надпочечниках, или щитовидной железе, или мочевом пузыре, или предстательной железе, или плаценте, или фаллопиевых трубах, или яичниках, или семенниках, или шейке матки, или глазе, или роговице и склере, или зубах, или в костной, хрящевой, мышечной, эпителиальной, эндотелиальной, нервной, жировой тканях, или эндометрии матки, или плацентарной ткани, или твердой мозговой оболочке, или крови, или дентине, или легочной ткани в сочетании с транспортной молекулой или без нее при введении этих биологически активных генно-терапевтических субстанций в органы и ткани человека. Созданная линейка биологически активных генно-терапевтических субстанций имеет генетическую конструкцию с кДНК гена TGFB1 и содержит последовательность нуклеотидов, включающую в себя белок-кодирующую область кДНК гена TGFB1, которая несет модификации, не затрагивающие структуру белка трансформирующего фактора роста бета-1, а именно: делеции 5' нетранслируемых областей или делеции 3'-нетранслируемых областей, или нуклеотидные замены, не приводящие к аминокислотным заменам или обрыву аминокислотной цепи, или комбинации вышеперечисленных модификаций и, соответственно, не влияющие на кодируемую этой последовательностью аминокислотную последовательность. В качестве модифицированной кДНК гена TGFB1 используют SEQ ID No: 2, или SEQ ID No: 3, или SEQ ID No: 4, или SEQ ID No: 5, или SEQ ID No: 6, или SEQ ID No: 7. В качестве транспортной молекулы используют липосомы, или дендримеры 5-го и выше поколений, или амфифильные блок-сополимеры.

Способ получения биологически активной генно-терапевтической субстанции для коррекции патологических состояний клеток органов и тканей и/или органов и тканей человека, связанных с количественным снижением белка трансформирующего фактора роста бета-1 заключается в том, что получают кДНК гена TGFB1, затем помещают кДНК в векторную плазмиду, способную обеспечить высокий уровень экспрессии этой кДНК в клетках различных органов и тканей человека, наращивают и выделяют необходимое количество генетической конструкции, затем комбинируют генетическую конструкцию с транспортной молекулой для трансфекции полученной биологически активной генно-терапевтической субстанцией клеток органов и тканей и/или введения полученной биологически активной генно-терапевтической субстанции в органы и ткани человека.

Или способ получения биологически активной генно-терапевтической субстанции для коррекции патологических состояний клеток различных органов и тканей человека, связанных с количественным снижением белка трансформирующего фактора роста бета-1 заключается в том, что получают кДНК гена TGFB1, модифицируют его по п.п. 3, или 4, или 5 или 6 или 7 или 8, затем помещают модифицированную кДНК в векторную конструкцию, способную обеспечить высокий уровень экспрессии этой кДНК в клетках различных органов и тканей человека, наращивают и выделяют необходимое количество генетической конструкции, затем комбинируют генетическую конструкцию с транспортной молекулой для трансфекции полученной биологически активной генно-терапевтической субстанцией клеток органов и тканей и/или введения полученной биологически активной генно-терапевтической субстанции в органы и ткани человека.

Способ использования каждой из созданных и представленных в линейке биологически активных генно-терапевтических субстанций для коррекции патологических состояний клеток органов и тканей и/или органов и тканей человека, связанных с количественным снижением белка трансформирующего фактора роста бета-1, заключается в трансфекции созданной биологически активной генно-терапевтической субстанцией, выбранной с учетом индивидуальных особенностей каждого конкретного пациента на основе предварительного эксперимента по определению наиболее эффективного варианта из созданных и представленных в линейке биологически активных генно-терапевтических субстанций, клеток органов и тканей человека.

Или способ использования каждой из созданных и представленных в линейке биологически активных генно-терапевтических субстанций для коррекции патологических состояний клеток органов и тканей и/или органов и тканей человека, связанных с количественным снижением белка трансформирующего фактора роста бета-1, заключается во введении одной из созданных биологически активных генно-терапевтической субстанций, выбранной именно для данного пациента на основе предварительного эксперимента по определению наиболее эффективного варианта из созданных и представленных в линейке биологически активных генно-терапевтических субстанций, в органы и ткани этого пациента, и/или во введении аутологичных клеток пациента, трансфицированных одной из созданных биологически активных генно-терапевтической субстанций, выбранной именно для данного пациента на основе предварительного эксперимента по определению наиболее эффективного варианта из созданных и представленных в линейке биологически активных генно-терапевтических субстанций, в органы и ткани этого пациента.

Перечень фигур

На фиг. 1

Представлена нуклеотидная последовательность немодифицированной кДНК гена TGFB1, последовательность которой идентична приводимой в базе даных GenBank под номером NM_000660.5 TGFB1 SEQ ID No: 1.

На фиг. 2

Представлена нуклеотидная последовательность модифицированной кДНК гена TGFB1, SEQ ID No: 2, которая

содержит 1 нуклеотидную замену G→C в позиции 955 и 1 нуклеотидную замену A→G в позиции 1312, не приводящие к изменениям в аминокислотной последовательности белка трансформирующего фактора роста бета-1.

На фиг. 3

Представлена нуклеотидная последовательность модифицированной кДНК гена TGFB1, SEQ ID No: 3, которая

содержит 1 нуклеотидную замену G→C в позиции 955; 2 нуклеотидных замены A→G в позициях 1312, 1429; 1 нуклеотидную замену T→G в позиции 1357, не приводящие к изменениям в аминокислотной последовательности белка трансформирующего фактора роста бета-1.

На фиг. 4

Представлена нуклеотидная последовательность модифицированной кДНК гена TGFB1, SEQ ID No: 4, которая

содержит 2 нуклеотидных замены G→C в позициях 955, 1465; 2 нуклеотидных замены A→G в позициях 1312, 1429; 2 нуклеотидных замены T→G в позициях 1357, 1519, не приводящие к изменениям в аминокислотной последовательности белка трансформирующего фактора роста бета-1.

На фиг. 5

Представлена нуклеотидная последовательность модифицированной кДНК гена TGFB1, SEQ ID NO: 5, которая

содержит 2 нуклеотидных замены G→C в позициях 955, 1465; 4 нуклеотидных замены A→G в позициях 1312, 1429, 1621, 1723; 2 нуклеотидных замены T→G в позициях 1357, 1519, не приводящие к изменениям в аминокислотной последовательности белка трансформирующего фактора роста бета-1.

На фиг. 6

Представлена нуклеотидная последовательность модифицированной кДНК гена TGFB1, SEQ ID No: 6, которая

содержит 5 нуклеотидных замен G→C в позициях 955, 1465, 1756, 1891, 1942; 4 нуклеотидных замены A→G в позициях 1312, 1429, 1621, 1723; 2 нуклеотидных замены T→G в позициях 1357, 1519, не приводящие к изменениям в аминокислотной последовательности белка трансформирующего фактора роста бета-1.

На фиг. 7

Представлена нуклеотидная последовательность модифицированной кДНК гена TGFB1, SEQ ID No: 7, которая

не содержит нетранслируемые 5' и 3' области гена и содержит 5 нуклеотидных замен G→C в позициях 955, 1465, 1756, 1891, 1942; 4 нуклеотидных замены A→G в позициях 1312, 1429, 1621, 1723; 2 нуклеотидных замены T→G в позициях 1357, 1519, не приводящие к изменениям в аминокислотной последовательности белка трансформирующего фактора роста бета-1.

На фиг. 8

С целью последующего корректного определения генно-терапевтического эффекта после трансфекции фибробластов биологически активной генно-терапевтической субстанцией с кДНК гена TGFB1 проводили анализ эндогенной экспрессии гена TGFB1 в культуре первичных фибробластов. На фигуре представлены графики накопления продуктов полимеразной цепной реакции (ПЦР), соответствующих:

1 - кДНК гена TGFB1, фибробласты со сниженной экспрессией гена TGFB1

2 - кДНК гена TGFB1, фибробласты с нормальной экспрессией гена TGFB1

3 - кДНК гена В2М, фибробласты со сниженной экспрессией гена TGFB1

4 - кДНК гена В2М, фибробласты с нормальной экспрессией гена TGFB1

В качестве референтного гена использовали ген В2М (Бета-2-микроглобулин) приведенного в базе данных GenBank под номером NM 004048.2.

На фиг. 9

С целью подтверждения увеличения экспрессии гена TGFB1 в клеточной культуре фибробластов со сниженной экспрессией гена TGFB1 при трансфекции данных клеток биологически активной генно-терапевтической субстанцией с кДНК гена TGFB1 представлены графики накопления ПЦР-продуктов, соответствующих:

1 - кДНК гена TGFB1 в фибробластах с нормальной экспрессией гена TGFB1,

2 - кДНК гена TGFB1 в фибробластах со сниженной экспрессией гена TGFB1 до трансфекции БАГТС с кДНК гена TGFB1

3 - кДНК гена TGFB1 в фибробластах со сниженной экспрессией гена TGFB1 после трансфекции БАГТС с кДНК гена TGFB1

4 - кДНК гена TGFB1 в фибробластах со сниженной экспрессией гена TGFB1 после трансфекции вектором без кДНК гена TGFB1

5 - кДНК гена В2М в фибробластах с нормальной экспрессией гена TGFB1,

6 - кДНК гена В2М в фибробластах со сниженной экспрессией гена TGFB1 до трансфекции БАГТС с кДНК гена TGFB1

7 - кДНК гена В2М в фибробластах со сниженной экспрессией гена TGFB1 после трансфекции БАГТС с кДНК гена TGFB1

8 - кДНК гена В2М в фибробластах со сниженной экспрессией гена TGFB1 после трансфекции вектором без кДНК гена TGFB1

Из графиков следует, что в случае трансфекции вектором без вставки кДНК гена TGFB1 уровень кДНК гена TGFB1 в фибробластах не изменился, а в случае трансфекции вектором с кДНК TGFB1 - уровень кДНК фибробластов со сниженной экспрессией гена TGFB1 многократно увеличился (до уровня выше, чем уровень кДНК гена TGFB1 в нормальных фибробластах).

На фиг. 10

С целью подтверждения увеличения количества белка трансформирующего фактора роста бета-1 в клеточной культуре фибробластов с нормальной экспрессией гена TGFB1 при трансфекции данных клеток биологически активной генно-терапевтической субстанцией содержащей кДНК гена TGFB1 представлен график изменения количества белка трансформирующего фактора роста бета-1 нетрансфицированных фибробластов (культура А), трансфицированных вектором pCDNA 3.1(+) не содержащим кДНК TGFB1 (культура В) и трансфицированных биологически активной генно-терапевтической субстанцией на базе генетической конструкции pCDNA 3.1-TGFB1 SEQ ID No: 1 (культура С). Из графика следует, что при трансфекции фибробластов биологически активной генно-терапевтической субстанцией с кДНК гена TGFB1 происходит увеличение количества белка трансформирующего фактора роста бета-1 в клеточном лизате.

На фиг. 11

С целью подтверждения увеличения количества белка трансформирующего фактора роста бета-1 в коже человека при введении в кожу клеточной культуры фибробластов, трансфицированной биологически активной генно-терапевтической субстанцией представлен анализ изменения количества белка трансформирующего фактора роста бета-1 в коже пациентов. При этом пациентам вводили три варианта культуры аутологичных фибробластов - нетрансфицированные (А), трансфицированные вектором pCMV6-XL5 (Б) и трансфицированные биологически активной генно-терапевтической субстанцией на базе pCMV6-TGFB1 SEQ ID No: 7 (С) - в кожу предплечья. Также анализировали количественный уровень белка трансформирующего фактора роста бета-1 в интактной коже. Показано повышение количества белка трансформирующего фактора роста бета-1 в коже пациента в области введения фибробластов, трансфицированных биологически активной генно-терапевтической субстанцией кДНК гена TGFB1 (С).

На фиг. 12

С целью подтверждения увеличения количества белка трансформирующего фактора роста бета-1 до различного индивидуального уровня в клеточных культурах фибробластов пациентов при трансфекции данных клеток биологически активными генно-терапевтическими субстанциями с модифицированными и нативной кДНК гена TGFB1 в зависимости от наличия и типа в них той или иной модификации кДНК гена TGFB1 представлен анализ изменения количественного уровня белка трансформирующего фактора роста бета-1 в культурах фибробластов кожи человека в зависимости от наличия и типа модификаций в кДНК гена TGFB1, используемой для трансфекции фибробластов.

Культуры фибробластов 29 пациентов делили на 8 частей каждую с (А) по (Н); первые части (А) клеточных культур пациентов трансфицировали биологически активной генно-терапевтической субстанцией pCMV6-TGFB1 SEQ ID No: 1, части (В) трансфицировали биологически активной генно-терапевтической субстанцией pCMV6-TGFB1 SEQ ID No: 2, части (С) трансфицировали биологически активной генно-терапевтической субстанцией pCMV6-TGFB1 SEQ ID No: 3, части (D) трансфицировали биологически активной генно-терапевтической субстанцией pCMV6-TGFB1 SEQ ID No: 4, части (E) трансфицировали биологически активной генно-терапевтической субстанцией pCMV6-TGFB1 SEQ ID No: 5, части (F) трансфицировали биологически активной генно-терапевтической субстанцией pCMV6-TGFB1 SEQ ID No: 6, части (G) трансфицировали биологически активной генно-терапевтической субстанцией pCMV6-TGFB1 SEQ ID No: 7, части (H) трансфицировали векторной плазмидой, не содержащей кДНК гена TGFB1.

По итогам анализа количественного уровня белка трансформирующего фактора роста бета-1 выбрали показатели, касательно каждой части клеточной культуры от каждого пациента, продемонстрировавшие максимальное количество белка трансформирующего фактора роста бета-1 и объединили их в семь групп, исходя из следующего критерия:

В группе 1 максимальное количество белка трансформирующего фактора роста бета-1 наблюдалась при трансфекции pCMV6-TGFB1 SEQ ID No: 1,

в группе 2 максимальное количество белка трансформирующего фактора роста бета-1 наблюдалась при трансфекции pCMV6-TGFB1 SEQ ID No: 2,

в группе 3 максимальное количество белка трансформирующего фактора роста бета-1 наблюдалась при трансфекции pCMV6-TGFB1 SEQ ID No: 3,

в группе 4 максимальное количество белка трансформирующего фактора роста бета-1 наблюдалась при трансфекции pCMV6-TGFB1 SEQ ID No: 4,

в группе 5 максимальное количество белка трансформирующего фактора роста бета-1 наблюдалась при трансфекции pCMV6-TGFB1 SEQ ID No: 5,

в группе 6 максимальное количество белка трансформирующего фактора роста бета-1 наблюдалась при трансфекции pCMV6-TGFB1 SEQ ID No: 6,

в группе 7 максимальное количество белка трансформирующего фактора роста бета-1 наблюдалась при трансфекции pCMV6-TGFB1 SEQ ID No: 7.

Ни в одной из клеточных культур не наблюдалось того, что максимальное количество белка трансформирующего фактора роста бета-1 присутствует при трансфекции вектором без вставки кДНК гена TGFB1.

На фигуре 12 для каждой группы клеточных культур приведены диаграммы показателей концентрации белка трансформирующего фактора роста бета-1 (усредненных в рамках группы, в случае, если в группу входит более одной клеточной культуры) применительно ко всем, участвующим в эксперименте активным генно-терапевтическим субстанциям, после трансфекции этих клеточных культур активными генно-терапевтическими субстанциями, содержащими модифицированные и нативную кДНК гена TGFB1.

Из фигуры следует, что достижение максимального количества белка трансформирующего фактора роста бета-1 в культурах фибробластов кожи различных пациентов при их трансфекции биологически активными генно-терапевтическими субстанциями, связано с индивидуальными особенностями пациентов и зависит от наличия и типа модификаций в кДНК гена TGFB1, входящих в биологически активные генно-терапевтические субстанции.

Каждая биологически активная генно-терапевтическая субстанция из линейки биологически активных генно-терапевтических субстанций является эффективной в некоторой значительной группе пациентов. Следовательно для выбора наиболее эффективной биологически активной генно-терапевтической субстанции из линейки биологически активных генно-терапевтических субстанций для терапевтических целей необходимо предварительное персонализированное исследование пациента.

Обозначения:

части клеточных культур, трансфицированных БАГТС TGFB1 SEQ ID No: 1 (А)

части клеточных культур, трансфицированных БАГТС TGFB1 SEQ ID No: 2 (В)

части клеточных культур, трансфицированных БАГТС TGFB1 SEQ ID No: 3 (С)

части клеточных культур, трансфицированных БАГТС TGFB1 SEQ ID No: 4 (D)

части клеточных культур, трансфицированных БАГТС TGFB1 SEQ ID No: 5 (Е)

части клеточных культур, трансфицированных БАГТС TGFB1 SEQ ID No: 6 (F)

части клеточных культур, трансфицированных БАГТС TGFB1 SEQ ID No: 7 (G)

части клеточных культур, трансфицированных плацебо (Н)

На фиг. 13

С целью подтверждения увеличения экспрессии гена TGFB1 в клеточной культуре кератоцитов и эпителиальных клеток глаза при трансфекции данных клеток биологически активной генно-терапевтической субстанцией с кДНК гена TGFB1 приведены графики накопления ПЦР-продуктов, соответствующих:

1 - кДНК гена TGFB1, кератоциты до трансфекции

2 - кДНК гена TGFB1, эпителий роговицы до трансфекции

3 - кДНК гена TGFB1, кератоциты после трансфекции

4 - кДНК гена TGFB1, эпителий роговицы после трансфекции

5 - кДНК гена В2М, кератоциты до трансфекции

6 - кДНК гена В2М, эпителий роговицы до трансфекции

7 - кДНК гена В2М, кератоциты после трансфекции

8 - кДНК гена B2M, эпителий роговицы после трансфекции

Ген В2М использовали в качестве референтного.

Из фигуры следует, что в результате трансфекции уровень специфической кДНК гена TGFB1 в культуре кератоцитов и в культуре эпителия многократно вырос.

На фиг. 14

С целью подтверждения увеличения экспрессии гена TGFB1 в клеточной культуре хондробластов при трансфекции данных клеток биологически активной генно-терапевтической субстанцией с кДНК гена TGFB1 приведены графики накопления ПЦР-продуктов, соответствующих:

1 - кДНК гена TGFB1, до трансфекции

2 - кДНК гена TGFB1, после трансфекции

3 - кДНК гена В2М, до трансфекции

4 - кДНК гена В2М, после трансфекции

Ген В2М использовали в качестве референтного.

Из фигуры следует, что в результате трансфекции уровень специфической «ДНК гена TGFB1 вырос многократно.

На фиг. 15

С целью подтверждения увеличения количества белка трансформирующего фактора роста бета-1 в коже человека при введении в кожу биологически активной генно-терапевтической субстанции представлен анализ изменения количественного уровня белка трансформирующего фактора роста бета-1 в коже. При этом пациенту вводили биологически активную генно-терапевтическую субстанцию, содержащую векторную плазмиду с кДНК гена TGFB1 pCMV6-TGFB1 SEQ ID No: 4 (В) и параллельно вводили плацебо, представляющее собой комбинацию векторной плазмиды pCMV-XL5 не содержащей кДНК гена TGFB1 с транспортной молекулой (А) - в кожу предплечья. Показано увеличение количества белка трансформирующего фактора роста бета-1 в биоптате кожи пациента 1В, которому вводились биологически активная генно-терапевтическая субстанция, содержащая генетическую конструкцию с кДНК гена TGFB1, что говорит об эффективности биологически активной генно-терапевтической субстанции.

Обозначения:

пациент 1А

пациент 1В

пациент 1В до введения БАГТС

На фиг. 16

С целью подтверждения увеличения количества белка трансформирующего фактора роста бета-1 в хрящевой ткани человека при введении в хрящевую ткань биологически активной генно-терапевтической субстанции представлен анализ изменения количественного уровня белка трансформирующего фактора роста бета-1 в хрящевой ткани. При этом пациенту вводили биологически активную генно-терапевтическую субстанцию, содержащую векторную плазмиду с кДНК гена TGFB1 pCDNA 3.1 TGFB1 SEQ ID No: 5 (В) и параллельно вводили плацебо pCDNA 3.1(+), представляющее собой комбинацию векторной плазмиды не содержащей кДНК гена TGFB1 с транспортной молекулой (А) - в хрящевую ткань.

Показано увеличение количественного уровня белка трансформирующего фактора роста бета-1 в лизате биоптата хрящевой ткани пациента 1В, которому вводились биологически активная генно-терапевтическая субстанция, содержащая генетическую конструкцию с кДНК гена TGFB1, что говорит об эффективности биологически активной генно-терапевтической субстанции.

Обозначения:

пациент 1А

пациент 1В

пациент 1В до введения БАГТС

На фиг. 17

С целью подтверждения увеличения количества белка трансформирующего фактора роста бета-1 в мышечной ткани человека при введении в мышечную ткань биологически активной генно-терапевтической субстанции представлен анализ изменения количества белка трансформирующего фактора роста бета-1 в мышечной ткани. При этом пациенту вводили биологически активную генно-терапевтическую субстанцию, содержащую векторную плазмиду с кДНК гена TGFB1 - pCMV6-Kan/Neo TGFB1 SEQ ID No: 6 (В) и параллельно вводили плацебо pCMV6-Kan/Neo, представляющее собой комбинацию векторной плазмиды не содержащей кДНК гена TGFB1 с транспортной молекулой (А) - в мышечную ткань в зоне предплечья. Показано увеличение количества белка трансформирующего фактора роста бета-1 в биоптате мышечной ткани пациента 1В, которому вводились биологически активная генно-терапевтическая субстанция, содержащая генетическую конструкцию с кДНК гена TGFB1, что говорит об эффективности биологически активной генно-терапевтической субстанции.

Обозначения:

пациент 1А

пациент 1В

пациент 1В до введения БАГТС

На фиг. 18

С целью подтверждения увеличения количества белка трансформирующего фактора роста бета-1 до различного индивидуального уровня при введении в кожу пациентов биологически активных генно-терапевтических субстанций с модифицированными и нативной кДНК гена TGFB1 анализировали количественный уровень белка трансформирующего фактора роста бета-1 в коже человека в зависимости от наличия и типа модификаций в кДНК гена TGFB1.

Каждому из 21-го пациентов, отобранных в случайном порядке, вводили в кожу предплечья 7 биологически активных генно-терапевтических субстанций pCMV6- SEQ ID No: 1, pCMV6-SEQ ID No: 2, pCMV6- SEQ ID No: 3, pCMV6- SEQ ID No: 4, pCMV6-SEQ ID No: 5, pCMV6- SEQ ID No: 6, pCMV6- SEQ ID No: 7, и плацебо pCMV6- XL5.

По итогам анализа количества белка трансформирующего фактора роста бета-1 в биоптатах выбрали показатели, касательно каждого биоптата от каждого пациента, продемонстрировавшие максимальные количественные уровни белка трансформирующего фактора роста бета-1 и объединили их в семь групп, исходя из следующего критерия:

В группе 1 максимальное количество белка трансформирующего фактора роста бета-1 наблюдалась при введении pCMV6-TGFB1 SEQ ID No: 1,

в группе 2 максимальное количество белка трансформирующего фактора роста бета-1 наблюдалась при введении pCMV6-TGFB1 SEQ ID No: 2,

в группе 3 максимальное количество белка трансформирующего фактора роста бета-1 наблюдалась при введении pCMV6-TGFB1 SEQ ID No: 3,

в группе 4 максимальное количество белка трансформирующего фактора роста бета-1 наблюдалась при введении pCMV6-TGFB1 SEQ ID No: 4,

в группе 5 максимальное количество белка трансформирующего фактора роста бета-1 наблюдалась при введении pCMV6-TGFB1 SEQ ID No: 5,

в группе 6 максимальное количество белка трансформирующего фактора роста бета-1 наблюдалась при введении pCMV6-TGFB1 SEQ ID No: 6,

в группе 7 максимальное количество белка трансформирующего фактора роста бета-1. наблюдалась при введении pCMV6-TGFB1 SEQ ID No: 7.

Ни в одном из биоптатов не наблюдалось того, что максимальное количество белка трансформирующего фактора роста бета-1 присутствует в случае введения плацебо.

На фигуре 18 для каждой группы биоптатов приведены диаграммы показателей концентрации белка трансформирующего фактора роста бета-1 (усредненных в рамках группы, в случае, если в группу входит более одного биоптата) применительно ко всем, участвующим в эксперименте активным генно-терапевтическим субстанциям, после введения пациентам этих активных генно-терапевтических субстанций, содержащих модифицированные и нативную кДНК гена TGFB1.

Из данного примера следует, что достижение максимального количества белка трансформирующего фактора роста бета-1 в биоптатах кожи различных пациентов при введении им в кожу биологически активных генно-терапевтических субстанций, связано с индивидуальными особенностями пациентов и зависит от наличия и типа модификаций в кДНК гена TGFB1, входящих в биологически активные генно-терапевтические субстанции.

Каждая биологически активная генно-терапевтическая субстанция из линейки биологически активных генно-терапевтических субстанций является эффективной в некоторой значительной группе пациентов. Следовательно, для выбора наиболее эффективной биологически активной генно-терапевтической субстанции из линейки биологически активных генно-терапевтических субстанций для