Линейка биологически активных генно-терапевтических субстанций на основе гена clca2 для коррекции патологических состояний клеток органов и тканей и органов и тканей человека, способ получения и использования

Линейка биологически активных генно-терапевтических субстанций на основе гена clca2 для коррекции патологических состояний клеток органов и тканей и органов и тканей человека, способ получения и использования

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область, к которой относится изобретение

Изобретение относится к молекулярной биологии, биотехнологии, генной инженерии и медицине и может быть использовано для коррекции патологических состояний, связанных с количественным снижением белка хлоридного кальций-активируемого канала-2, клеток различных органов и тканей, а также собственно органов и тканей человека в частности, в терапевтических целях.

Предшествующий уровень.

Белки CLCA1 и CLCA2 принадлежат к семейству белков кальций-активируемых хлоридных каналов проводимости. Белки этого семейства имеют высокую степень гомологии в размере, последовательности (75-89%), структуре, но значительно отличаются по своему распределению в тканях организма. Так CLCA1 находится в различных тканях, например, в слизистой оболочке тонкой и толстой кишки, и участвует в процессах секреции и поглощения.

Белок гена CLCA2 играет важную роль в кальцезависимой модуляции тока, индуцированным ионами хлора. Данный канал может выступать в качестве супрессора развития рака груди и рака прямой кишки. Играет ключевую роль в клеточной адгезии в начальных стадиях метастазирования в легких (рак легких) через связывание с ITGB4 (интегрин бета 4). Так как этот белок экспрессируется преимущественно в трахее и легких, поэтому предполагается, что он играет роль в сложном патогенезе муковисцидоза. Также белок вовлечен в качестве гена-супрессора опухоли рака молочной железы. При этом стоит отметить, что в то время как продукт гена CLCA2 экспрессируется в нормальной здоровой ткани молочной железы, экспрессии гена CLCA2 не наблюдается в малигнизированной ткани молочных желез. Был показан высокий уровень экспрессии гена CLCA2 в роговице, коже, влагалище, пищеводе, гортани, а также - в легких, трахее, эпителиальных клетках. Белок гена CLCA2 селективно экспрессируется в эндотелии мелких легочных артерий, артериол, междольковых и субплевральных венулах. В небольшом количестве экспрессируется в почках и семенниках.

Исследования по нокаутным мышам показали, что у гомозигот(-/-) с выключенным геном CLCA2, наблюдается увеличение размеров печени по отношению к размерам тела, а также детектируется гипертрофия гепатоцитов, и был один случай мультифокального некроза печени. (http://www.informatics.jax.org/reference/J:101679.)

Таким образом, белок гена CLCA2 может служить супрессором при онкологических заболеваниях или удобным иммуногистохимическим маркером при диагностике рака (например, при различении плоскоклеточной карциномы (SCC) и аденокарциномы (ADC).

В заявке на изобретение US 20040265859 описаны выделенные и очищенные полипептиды кальций-активируемых хлоридных каналов, которые использованы для ингибирования образования метастатической опухоли (опухоли легкого) у индивидуума, а также способ применения этих пептидов, который включает стадию введения индивидууму пептида в комбинации с фармацевтически приемлемым наполнителем.

В заявке на изобретение WO/2002/094876 показаны способы и композиции для лечения наработки муцина при сопутствующей болезни. В частности, описано, что нуклеотидная последовательность, кодирующая белок гена CLCA4 вставлена в вектор для экспрессии под области инициации и терминации транскрипции, с помощью которого кодирующую последовательность вводят в геном клетки-хозяина. Также показано, что экспрессия введенной последовательности увеличивается или уменьшается в трансгенном животном по сравнении с диким типом. Изобретение содержит способ получения соединения-кандидата модулирующее активность секреции муцина, причем указанный способ включает: (а) контактирование модели CLCA2 / секреция муцина либо CLCA4 / секреция муцина с указанным потенциальным агентом; (б) наблюдение эффекта указанного кандидата на секрецию муцина. Причем модулирующее соединение может оказывать как ингибирующее, так и усиливающее действие на экспрессию. CLCA2 модулирующее соединение может быть представлено как фармацевтический препарат для лечения респираторных заболеваний, связанных с наработкой муцина (хронического бронхита, астмы, муковисцидоза, хронического обструктивного заболевания легких или бронхоэктазов). Изобретение содержит описание способа диагностики секреции муцина дыхательной системой, связанной с болезненным состояниям пациента, причем указанный способ включает: определение уровня экспрессии CLCA2 в дыхательной системе в присутствии или в отсутствие болезненного состояния, причем повышенные уровни экспрессии CLCA2 по сравнению с контролем указывает на наличие указанного болезненное состояние (гиперсекреция муцина). Болезненное состояние может быть связано и с пониженной секрецией муцина, тогда экспрессия CLCA2 будет пониженной.

За прототип авторами было принято решение по заявке на изобретение US 20030064946, в которой показаны метод и реагент для ингибирования белка хлоридного кальций-активируемого канала-1. В частности, описаны молекула нуклеиновой кислоты, которая понижает экспрессию гена CLCA1, вектор для экспрессии этой молекулы в клетках млекопитающего или человека и использование этой конструкции для лечения состояний, выбранных из группы заболеваний - хроническая обструктивная болезнь легких, хронический бронхит, астма, муковисцидоз, синдром обструктивного кишечника. При этом молекула нуклеиновой кислоты может быть представлена ДНКзимом с ферментными свойствами или антисмысловой молекулой нуклеиновой кислоты, химически синтезирована и содержать модификации, например, по меньшей мере одну модификацию 2'-сахара, одно нуклеиновое основание. Описан также способ уменьшения активности CLCA1 в клетке млекопитающего, включающий стадию контактирования указанной клетки с молекулой нуклеиновой кислоты, которая регулирует экспрессию гена CLCA1, в условиях, подходящих для указанного снижение активности CLCA1. А также - способ лечения пациента, имеющего состояние, связанное с уровнем CLCA1, включающий контакт клетки пациента с молекулой нуклеиновой кислоты, которая регулирует экспрессию гена CLCA1, в условиях, подходящих для указанного лечения.

Данный подход направлен на решение частной задачи уменьшения экспрессии гена CLCA1, продукт которого регулирует процесс уменьшения секреции муцина. Поэтому он не может быть применен для решения проблемы увеличения экспрессии генов белков кальций-активируемых хлоридных каналов проводимости, например, CLCA2 как гена-супрессора рака. Также при создании генно-терапевтического средства в этом изобретении не учитывается индивидуальные характеристики пациента, в связи с чем может понадобиться линейка вариаций для данного средства.

Раскрытие изобретения

Задачей данного изобретения является создание линейки высокоэффективных биологически активных генно-терапевтических субстанций для коррекции патологических состояний организма человека способных препятствовать количественному снижению белка хлоридного кальций-активируемого канала-2 в клетках органов и тканей и/или органах и тканях человека путем повышения уровня экспрессии гена CLCA2 в клетках органов и тканей и/или органах и тканях человека, приводящего к повышению количества белка хлоридного кальций-активируемого канала-2, в клетках органов и тканей и/или органах и тканях организма с учетом индивидуальных особенностей пациента.

Создана линейка биологически активных генно-терапевтических субстанций для коррекции патологических состояний клеток органов и тканей и/или органов и тканей человека, связанных с количественным снижением белка хлоридного кальций-активируемого канала-2, каждая из которых представляет собой генетическую конструкцию на основе векторной плазмиды, содержащей нативную кДНК гена CLCA2 SEQ ID No:1 или одну из модифицированных кДНК гена CLCA2, и содержащей также регуляторные элементы, обеспечивающие транскрипцию этой последовательности в эукариотических клетках, в частности в клетках органов и тканей человека и способную обеспечить высокий уровень экспрессии гена CLCA2 и увеличить количество белка хлоридного кальций-активируемого канала-2 в клетках органов и тканей и/или органах и тканях человека, в частности, клетках эпидермиса, в частности кератиноцитах, фибробластах, в клетках слизистой оболочки, жировой ткани, в частности в адипоцитах, клетках эпителия, клетках эндотелия, клетках молочной железы, клетках легочной и плацентарной ткани, клетках костного мозга, в частности в стволовых клетках, в клетках лимфотических узлов, семенников, гепатоцитах в сочетании с транспортной молекулой или без нее при трансфекции этими биологически активными генно-терапевтическими субстанциями клеток органов и тканей человека и/или в органах и тканях человека в частности, коже, мочевом пузыре, миндалинах, влагалище, матке, шейке матки, костном мозге, молочных железах, трахее, легких, толстом кишечнике, прямой кишке, тонком кишечнике, пищеводе, гортани, глазах, в роговице, зрительном волокне, лимфатических узлах, предстательной железе, семенниках, почках, мочевом пузыре, языке, печени и в слизистой оболочке пищевода, слизистой оболочке полости рта, жировой ткани, легочной ткани, плацентарной ткани, ретикулярной соединительной ткани, в эндотелии мелких легочных артерий, артериол, междольковых и субплевральных венулах в сочетании с транспортной молекулой или без нее при введении этих биологически активных генно-терапевтических субстанций в органы и ткани человека. Каждая из линейки созданных биологически активных генно-терапевтических субстанций представляет собой генетическую конструкцию с кДНК гена CLCA2 содержит последовательность нуклеотидов, включающую в себя белок-кодирующую область кДНК гена CLCA2, которая несет модификации не затрагивающие структуру белка хлоридного кальций-активируемого канала-2, а именно: делеции 5' нетранслируемых областей или делеции 3'-нетранслируемых областей, или нуклеотидные замены, не приводящие к аминокислотным заменам или обрыву аминокислотной цепи, или комбинации вышеперечисленных модификаций и, соответственно, не влияющие на кодируемую этой последовательностью аминокислотную последовательность. В качестве модифицированной кДНК гена CLCA2 используют SEQ ID No:2, или SEQ ID No:3, или SEQ ID No:4, или SEQ ID No:5, или SEQ ID No:6, SEQ ID No:7. В качестве транспортной молекулы используют липосомы, или дендримеры 5-го и выше поколений, или амфифильные блоксополимеры

Способ получения биологически активной генно-терапевтической субстанции для коррекции патологических состояний клеток органов и тканей и/или органов и тканей человека, связанных с количественным снижением белка хлоридного кальций-активируемого канала-2 заключающийся в том, что получают кДНК гена CLCA2, затем помещают кДНК в векторную плазмиду, способную обеспечить высокий уровень экспрессии этой кДНК в клетках различных органов и тканей человека, наращивают и выделяют необходимое количество генетической конструкции, затем комбинируют генетическую конструкцию с транспортной молекулой для трансфекции полученной биологически активной генно-терапевтической субстанцией клеток органов и тканей и/или введения полученной биологически активной генно-терапевтической субстанции в органы и ткани человека.

Или способ получения биологически активной генно-терапевтической субстанции для коррекции патологических состояний клеток различных органов и тканей человека, связанных с количественным снижением белка хлоридного кальций-активируемого канала-2, заключающийся в том, что получают кДНК гена CLCA2, модифицируют его по п.п. 3, или 4, или 5 или 6 или 7 или 8, затем помещают модифицированную кДНК в векторную конструкцию, способную обеспечить высокий уровень экспрессии этой кДНК в клетках различных органов и тканей человека, наращивают и выделяют необходимое количество генетической конструкции, затем комбинируют генетическую конструкцию с транспортной молекулой для трансфекции полученной биологически активной генно-терапевтической субстанцией клеток органов и тканей и/или введения полученной биологически активной генно-терапевтической субстанции в органы и ткани человека.

Способ использования каждой из созданных и представленных в линейке биологически активных генно-терапевтических субстанций для коррекции патологических состояний клеток органов и тканей и/или органов и тканей человека, связанных с количественным снижением белка хлоридного кальций-активируемого канала-2, заключается в трансфекции созданной биологически активной генно-терапевтической субстанцией, выбранной с учетом индивидуальных особенностей каждого конкретного пациента на основе предварительного эксперимента по определению наиболее эффективного варианта из созданных и представленных в линейке биологически активных генно-терапевтических субстанций, клеток органов и тканей человека.

Или способ использования каждой из созданных и представленных в линейке биологически активных генно-терапевтических субстанций для коррекции патологических состояний клеток органов и тканей и/или органов и тканей человека, связанных с количественным снижением белка хлоридного кальций-активируемого канала-2, заключается во введении одной из созданных биологически активных генно-терапевтической субстанций, выбранной именно для данного пациента на основе предварительного эксперимента по определению наиболее эффективного варианта из созданных и представленных в линейке биологически активных генно-терапевтических субстанций, в органы и ткани этого пациента, и/или во введении аутологичных клеток пациента, трансфицированных одной из созданных биологически активных генно-терапевтической субстанций, выбранной именно для данного пациента на основе предварительного эксперимента по определению наиболее эффективного варианта из созданных и представленных в линейке биологически активных генно-терапевтических субстанций, в органы и ткани этого пациента.

Перечень фигур

На фиг. 1

Представлена нуклеотидная последовательность немодифицированной кДНК гена CLCA2, последовательность которой идентична приводимой в базе даных GenBank под номером NM_006536.5 CLCA2 SEQ ID No:1.

На фиг. 2

Представлена нуклеотидная последовательность модифицированной кДНК гена CLCA2, SEQ ID No:2, которая

содержит 2 нуклеотидных замены A→G в позициях 636, 642, одну нуклеотидную замену T→G в позиции 672 и одну нуклеотидную замену G→C в позиции 1071, не приводящие к изменениям в аминокислотной последовательности белка хлоридного кальций-активируемого канала-2.

На фиг. 3

Представлена нуклеотидная последовательность модифицированной кДНК гена CLCA2, SEQ ID No:3, которая

содержит три нуклеотидные замены A→G в позициях 636, 642, 1281; две нуклеотидных замены T→G в позициях 672, 1536; и две нуклеотидных замены G→C в позициях 1071, 1749, не приводящие к изменениям в аминокислотной последовательности белка хлоридного кальций-активируемого канала-2.

На фиг. 4

Представлена нуклеотидная последовательность модифицированной кДНК гена CLCA2, SEQ ID No:4, которая

содержит четыре нуклеотидные замены A→G в позициях 636, 642, 1281, 1800; две нуклеотидных замены T→G в позициях 672, 1536; и четыре нуклеотидных замены G→C в позициях 1071, 1749, 2121, 2181, не приводящие к изменениям в аминокислотной последовательности белка хлоридного кальций-активируемого канала-2.

На фиг. 5

Представлена нуклеотидная последовательность модифицированной кДНК гена CLCA2, SEQ ID No:5, которая

содержит шесть нуклеотидных замен A→G в позициях 636, 642, 1281, 1800, 2373, 2640; две нуклеотидных замены T→G в позициях 672, 1536; и пять нуклеотидных замен G→C в позициях 1071, 1749, 2121, 2181, 2697, не приводящие к изменениям в аминокислотной последовательности белка хлоридного кальций-активируемого канала-2.

На фиг. 6

Представлена нуклеотидная последовательность модифицированной кДНК гена CLCA2, SEQ ID No:6, которая

содержит восемь нуклеотидных замен A→G в позициях 636, 642, 1281, 1800, 2373, 2640, 2391, 2763; две нуклеотидных замены T→G в позициях 672, 1536; и шесть нуклеотидных замен G→C в позициях 1071, 1749, 2121, 2181, 2697, 2676, не приводящие к изменениям в аминокислотной последовательности белка хлоридного кальций-активируемого канала-2.

На фиг. 7

Представлена нуклеотидная последовательность модифицированной кДНК гена CLCA2, SEQ ID No:7, которая

не содержит нетранслируемые 5' и 3' области гена и содержит восемь нуклеотидных замен A→G в позициях 636, 642, 1281, 1800, 2373, 2640, 2391, 2763; две нуклеотидных замены T→G в позициях 672, 1536; и шесть нуклеотидных замен G→C в позициях 1071, 1749, 2121, 2181, 2697, 2676, не приводящие к изменениям в аминокислотной последовательности белка хлоридного кальций-активируемого канала-2.

На фиг. 8

С целью последующего корректного определения генно-терапевтического эффекта после трансфекции фибробластов биологически активной генно-терапевтической субстанцией с кДНК гена CLCA2 проводили анализ эндогенной экспрессии гена CLCA2 в культуре первичных фибробластов. На фигуре представлены графики накопления продуктов полимеразной цепной реакции (ПЦР), соответствующих:

1 - кДНК гена CLCA2, фибробласты со сниженной экспрессией гена CLCA2

2 - кДНК гена CLCA2, фибробласты с нормальной экспрессией гена CLCA2

3 - кДНК гена В2М, фибробласты со сниженной экспрессией гена CLCA2

4 - кДНК гена В2М, фибробласты с нормальной экспрессией гена CLCA2

В качестве референтного гена использовали ген В2М (Бета-2-микроглобулин) приведенного в базе данных GenBank под номером NM 004048.2.

На фиг. 9

С целью подтверждения увеличения экспрессии гена CLCA2 в клеточной культуре фибробластов со сниженной экспрессией гена CLCA2 при трансфекции данных клеток биологически активной генно-терапевтической субстанцией с кДНК гена CLCA2 представлены графики накопления ПЦР-продуктов, соответствующих:

1 - кДНК гена CLCA2 в фибробластах с нормальной экспрессией гена CLCA2,

2 - кДНК гена CLCA2 в фибробластах со сниженной экспрессией гена CLCA2 до трансфекции БАГТС с кДНК гена CLCA2

3 - кДНК гена CLCA2 в фибробластах со сниженной экспрессией гена CLCA2 после трансфекции БАГТС с кДНК гена CLCA2

4 - кДНК гена CLCA2 в фибробластах со сниженной экспрессией гена CLCA2 после трансфекции вектором без кДНК гена CLCA2

5 - кДНК гена В2М в фибробластах с нормальной экспрессией гена CLCA2,

6 - кДНК гена В2М в фибробластах со сниженной экспрессией гена CLCA2 до трансфекции БАГТС с кДНК гена CLCA2

7 - кДНК гена В2М в фибробластах со сниженной экспрессией гена CLCA2 после трансфекции БАГТС с кДНК гена CLCA2

8 - кДНК гена В2М в фибробластах со сниженной экспрессией гена CLCA2 после трансфекции вектором без кДНК гена CLCA2

Из графиков следует, что в случае трансфекции вектором без вставки кДНК гена CLCA2 уровень кДНК гена CLCA2 в фибробластах не изменился, а в случае трансфекции вектором с кДНК CLCA2 - уровень кДНК фибробластов со сниженной экспрессией гена CLCA2 многократно увеличился (до уровня выше, чем уровень кДНК гена CLCA2 в нормальных фибробластах).

На фиг. 10

С целью подтверждения увеличения количества белка хлоридного кальций-активируемого канала-2 в клеточной культуре фибробластов с нормальной экспрессией гена CLCA2 при трансфекции данных клеток биологически активной генно-терапевтической субстанцией содержащей кДНК гена CLCA2 представлен график изменения количества белка хлоридного кальций-активируемого канала-2 нетрансфицированных фибробластов (культура А), трансфицированных вектором pCDNA 3.1 (+) не содержащим кДНК CLCA2 (культура В) и трансфицированных биологически активной генно-терапевтической субстанцией на базе генетической конструкции pCDNA 3.1-CLCA2 SEQ ID No:1 (культура С). Из графика следует, что при трансфекции фибробластов биологически активной генно-терапевтической субстанцией с кДНК гена CLCA2 происходит увеличение количества белка хлоридного кальций-активируемого канала-2 в клеточном лизате.

На фиг. 11

С целью подтверждения увеличения количества белка хлоридного кальций-активируемого канала-2 в коже человека при введении в кожу клеточной культуры фибробластов, трансфицированной биологически активной генно-терапевтической субстанцией представлен анализ изменения количества белка хлоридного кальций-активируемого канала-2 в коже пациентов. При этом пациентам вводили три варианта культуры аутологичных фибробластов - нетрансфицированные (А), трансфицированные вектором pCMV6-XL5 (Б) и трансфицированные биологически активной генно-терапевтической субстанцией на базе pCMV6-CLCA2 SEQ ID No:7 (С) - в кожу предплечья. Также анализировали количественный уровень белка хлоридного кальций-активируемого канала-2 в интактной коже. Показано повышение количества белка хлоридного кальций-активируемого канала-2 в коже пациента в области введения фибробластов, трансфицированных биологически активной генно-терапевтической субстанцией кДНК гена CLCA2 (С).

На фиг. 12

С целью подтверждения увеличения количества белка хлоридного кальций-активируемого канала-2 до различного индивидуального уровня в клеточных культурах фибробластов пациентов при трансфекции данных клеток биологически активными генно-терапевтическими субстанциями с модифицированными и нативной кДНК гена CLCA2 в зависимости от наличия и типа в них той или иной модификации кДНК гена CLCA2 представлен анализ изменения количественного уровня белка хлоридного кальций-активируемого канала-2 в культурах фибробластов кожи человека в зависимости от наличия и типа модификаций в кДНК гена CLCA2, используемой для трансфекции фибробластов.

Культуры фибробластов 28 пациентов делили на 8 частей каждую с (А) по (Н); первые части (А) клеточных культур пациентов трансфицировали биологически активной генно-терапевтической субстанцией pCMV6-CLCA2 SEQ ID No:1, части (В) трансфицировали биологически активной генно-терапевтической субстанцией pCMV6-CLCA2 SEQ ID No:2, части (С) трансфицировали биологически активной генно-терапевтической субстанцией pCMV6-CLCA2 SEQ ID No:3, части (D) трансфицировали биологически активной генно-терапевтической субстанцией pCMV6-CLCA2 SEQ ID No:4, части (E) трансфицировали биологически активной генно-терапевтической субстанцией pCMV6-CLCA2 SEQ ID No:5, части (F) трансфицировали биологически активной генно-терапевтической субстанцией pCMV6-CLCA2 SEQ ID No:6, части (G) трансфицировали биологически активной генно-терапевтической субстанцией pCMV6-CLCA2 SEQ ID No:7, части (H) трансфицировали векторной плазмидой, не содержащей кДНК гена CLCA2.

По итогам анализа количественного уровня белка хлоридного кальций-активируемого канала-2 выбрали показатели, касательно каждой части клеточной культуры от каждого пациента, продемонстрировавшие максимальное количество белка хлоридного кальций-активируемого канала-2 и объединили их в семь групп, исходя из следующего критерия:

В группе 1 максимальное количество белка хлоридного кальций-активируемого канала-2 наблюдалась при трансфекции pCMV6-CLCA2 SEQ ID No:1,

в группе 2 максимальное количество белка хлоридного кальций-активируемого канала-2 наблюдалась при трансфекции pCMV6-CLCA2 SEQ ID No:2,

в группе 3 максимальное количество белка хлоридного кальций-активируемого канала-2 наблюдалась при трансфекции pCMV6-CLCA2 SEQ ID No:3,

в группе 4 максимальное количество белка хлоридного кальций-активируемого канала-2 наблюдалась при трансфекции pCMV6-CLCA2 SEQ ID No:4,

в группе 5 максимальное количество белка хлоридного кальций-активируемого канала-2 наблюдалась при трансфекции pCMV6-CLCA2 SEQ ID No:5,

в группе 6 максимальное количество белка хлоридного кальций-активируемого канала-2 наблюдалась при трансфекции pCMV6-CLCA2 SEQ ID No:6,

в группе 7 максимальное количество белка хлоридного кальций-активируемого канала-2 наблюдалась при трансфекции pCMV6-CLCA2 SEQ ID No:7.

Ни в одной из клеточных культур не наблюдалось того, что максимальное количество белка хлоридного кальций-активируемого канала-2 присутствует при трансфекции вектором без вставки кДНК гена CLCA2.

На фигуре 12 для каждой группы клеточных культур приведены диаграммы показателей концентрации белка хлоридного кальций-активируемого канала-2 (усредненных в рамках группы, в случае, если в группу входит более одной клеточной культуры) применительно ко всем, участвующим в эксперименте активным генно-терапевтическим субстанциям, после трансфекции этих клеточных культур активными генно-терапевтическими субстанциями, содержащими модифицированные и нативную кДНК гена CLCA2.

Из рисунка следует, что достижение максимального количества белка хлоридного кальций-активируемого канала-2 в культурах фибробластов кожи различных пациентов при их трансфекции биологически активными генно-терапевтическими субстанциями, связано с индивидуальными особенностями пациентов и зависит от наличия и типа модификаций в кДНК гена CLCA2, входящих в биологически активные генно-терапевтические субстанции.

Каждая биологически активная генно-терапевтическая субстанция из линейки биологически активных генно-терапевтических субстанций является эффективной в некоторой значительной группе пациентов. Следовательно для выбора наиболее эффективной биологически активной генно-терапевтической субстанции из линейки биологически активных генно-терапевтических субстанций для терапевтических целей необходимо предварительное персонализированное исследование пациента.

Обозначения:

части клеточных культур, трансфицированных БАГТС CLCA2 SEQ ID No:1 (А)

части клеточных культур, трансфицированных БАГТС CLCA2 SEQ ID No:2 (В)

части клеточных культур, трансфицированных БАГТС CLCA2 SEQ ID No:3 (С)

части клеточных культур, трансфицированных БАГТС CLCA2 SEQ ID No:4 (D)

части клеточных культур, трансфицированных БАГТС CLCA2 SEQ ID No:5 (Е)

части клеточных культур, трансфицированных БАГТС CLCA2 SEQ ID No:6 (F)

части клеточных культур, трансфицированных БАГТС CLCA2 SEQ ID No:7 (G)

части клеточных культур, трансфицированных плацебо (Н)

На фиг. 13

С целью подтверждения увеличения экспрессии гена CLCA2 в клеточной культуре кератоцитов и эпителиальных клеток глаза при трансфекции данных клеток биологически активной генно-терапевтической субстанцией с кДНК гена CLCA2 приведены графики накопления ПЦР-продуктов, соответствующих:

1 - кДНК гена CLCA2, кератоциты до трансфекции

2 - кДНК гена CLCA2, эпителий роговицы до трансфекции

3 - кДНК гена CLCA2, кератоциты после трансфекции

4 - кДНК гена CLCA2, эпителий роговицы после трансфекции

5 - кДНК гена В2М, кератоциты до трансфекции

6 - кДНК гена В2М, эпителий роговицы до трансфекции

7 - кДНК гена В2М, кератоциты после трансфекции

8 - кДНК гена В2М, эпителий роговицы после трансфекции

Ген В2М использовали в качестве референтного.

Из фигуры следует, что в результате трансфекции уровень специфической кДНК гена CLCA2 в культуре кератоцитов и в культуре эпителия многократно вырос.

На фиг. 14

С целью подтверждения увеличения экспрессии гена CLCA2 в клеточной культуре эпителия слизистой оболочки полости рта при трансфекции данных клеток биологически активной генно-терапевтической субстанцией с кДНК гена CLCA2 приведены графики накопления ПЦР-продуктов, соответствующих:

1 - кДНК гена CLCA2, до трансфекции

2 - кДНК гена CLCA2, после трансфекции

3 - кДНК гена В2М, до трансфекции

4 - кДНК гена В2М, после трансфекции

Ген В2М использовали в качестве референтного.

Из фигуры следует, что в результате трансфекции уровень специфической кДНК гена CLCA2 вырос многократно.

На фиг. 15

С целью подтверждения увеличения количества белка хлоридного кальций-активируемого канала-2 в коже человека при введении в кожу биологически активной генно-терапевтической субстанции представлен анализ изменения количественного уровня белка хлоридного кальций-активируемого канала-2 в коже. При этом пациенту вводили биологически активную генно-терапевтическую субстанцию, содержащую векторную плазмиду с кДНК гена CLCA2 pCMV6-CLCA2 SEQ ID No:4 (В) и параллельно вводили плацебо, представляющее собой комбинацию векторной плазмиды pCMV-XL5 не содержащей кДНК гена CLCA2 с транспортной молекулой (А) - в кожу предплечья. Показано увеличение количества белка хлоридного кальций-активируемого канала-2 в биоптате кожи пациента 1В, которому вводились биологически активная генно-терапевтическая субстанция, содержащая генетическую конструкцию с кДНК гена CLCA2, что говорит об эффективности биологически активной генно-терапевтической субстанции.

Обозначения:

пациент 1А

пациент 1В

пациент 1В до введения БАГТС

На фиг. 16

С целью подтверждения увеличения количества белка хлоридного кальций-активируемого канала-2 в слизистой оболочке рта человека при введении в слизистую оболочку рта биологически активной генно-терапевтической субстанции представлен анализ изменения количественного уровня белка хлоридного кальций-активируемого канала-2 в слизистой оболочке рта. При этом пациенту вводили биологически активную генно-терапевтическую субстанцию, содержащую векторную плазмиду с кДНК гена CLCA2 pCDNA 3.1 CLCA2 SEQ ID No5 (В) и параллельно вводили плацебо pCDNA 3.1(+), представляющее собой комбинацию векторной плазмиды не содержащей кДНК гена CLCA2 с транспортной молекулой (А) - в слизистую оболочку рта.

Показано увеличение количественного уровня белка хлоридного кальций-активируемого канала-2 в лизате биоптата слизистой оболочки рта пациента 1В, которому вводились биологически активная генно-терапевтическая субстанция, содержащая генетическую конструкцию с кДНК гена CLCA2, что говорит об эффективности биологически активной генно-терапевтической субстанции.

Обозначения:

пациент 1А

пациент 1В

пациент 1В до введения БАГТС

На фиг. 17

С целью подтверждения увеличения количества белка хлоридного кальций-активируемого канала-2 в мышечной ткани человека при введении в мышечную ткань биологически активной генно-терапевтической субстанции представлен анализ изменения количества белка хлоридного кальций-активируемого канала-2 в мышечной ткани. При этом пациенту вводили биологически активную генно-терапевтическую субстанцию, содержащую векторную плазмиду с кДНК гена CLCA2 - pCMV6-Kan/Neo CLCA2 SEQ ID No:6 (В) и параллельно вводили плацебо pCMV6-Kan/Neo, представляющее собой комбинацию векторной плазмиды не содержащей кДНК гена CLCA2 с транспортной молекулой (А) - в мышечную ткань в зоне предплечья. Показано увеличение количества белка хлоридного кальций-активируемого канала-2 в биоптате мышечной ткани пациента 1В, которому вводились биологически активная генно-терапевтическая субстанция, содержащая генетическую конструкцию с кДНК гена CLCA2, что говорит об эффективности биологически активной генно-терапевтической субстанции.

Обозначения:

пациент 1А

пациент 1В

пациент 1В до введения БАГТС

На фиг. 18

С целью подтверждения увеличения количества белка хлоридного кальций-активируемого канала-2 до различного индивидуального уровня при введении в кожу пациентов биологически активных генно-терапевтических субстанций с модифицированными и нативной кДНК гена CLCA2 анализировали количественный уровень белка хлоридного кальций-активируемого канала-2 в коже человека в зависимости от наличия и типа модификаций в кДНК гена CLCA2.

Каждому из 24-ти пациентов, отобранных в случайном порядке, вводили в кожу предплечья 7 биологически активных генно-терапевтических субстанций pCMV6- SEQ ID No:1, pCMV6- SEQ ID No:2, pCMV6- SEQ ID No:3, pCMV6- SEQ ID No:4, pCMV6- SEQ ID No:5, pCMV6- SEQ ID No:6, pCMV6- SEQ ID No:7, и плацебо pCMV6- XL5.

По итогам анализа количества белка хлоридного кальций-активируемого канала-2 в биоптатах выбрали показатели, касательно каждого биоптата от каждого пациента, продемонстрировавшие максимальные количественные уровни белка хлоридного кальций-активируемого канала-2 и объединили их в семь групп, исходя из следующего критерия:

В группе 1 максимальное количество белка хлоридного кальций-активируемого канала-2 наблюдалась при введении pCMV6-CLCA2 SEQ ID No:1,

в группе 2 максимальное количество белка хлоридного кальций-активируемого канала-2 наблюдалась при введении pCMV6-CLCA2 SEQ ID No:2,

в группе 3 максимальное количество белка хлоридного кальций-активируемого канала-2 наблюдалась при введении pCMV6-CLCA2 SEQ ID No:3,

в группе 4 максимальное количество белка хлоридного кальций-активируемого канала-2 наблюдалась при введении pCMV6-CLCA2 SEQ ID No:4,

в группе 5 максимальное количество белка хлоридного кальций-активируемого канала-2 наблюдалась при введении pCMV6-CLCA2 SEQ ID No:5,

в группе 6 максимальное количество белка хлоридного кальций-активируемого канала-2 наблюдалась при введении pCMV6-CLCA2 SEQ ID No:6,

в группе 7 максимальное количество белка хлоридного кальций-активируемого канала-2. наблюдалась при введении pCMV6-CLCA2 SEQ ID No:7.

Ни в одном из биоптатов не наблюдалось того, что максимальное количество белка хлоридного кальций-активируемого канала-2 присутствует в случае введения плацебо.

На фигуре 18 для каждой группы биоптатов приведены диаграммы показателей концентрации белка хлоридного кальций-активируемого канала-2 (усредненных в рамках группы, в случае, если в группу входит более одного биоптата) применительно ко всем, участвующим в эксперименте активным генно-терапевтическим субстанциям, после введения пациентам этих активных генно-терапевтических субстанций, содержащих модифицированные и нативную кДНК гена CLCA2.

Из данного примера следует, что достижение максимального количества белка хлоридного кальций-активируемого канала-2 в биоптатах кожи различных пациентов при введении им в кожу биологически активных генно-терапевтических субстанций, связано с индивидуальными особенностями пациентов и зависит от наличия и типа модификаций в кДНК гена CLCA2, входящих в биологически активные генно-терапевтические субстанции.

Каждая биологически активная генно-терапевтическая субстанция из линейки биологически активных генно-терапевтических субстанций является эффективной в некоторой значительной группе пациентов. Следовательно, для выбора наиболее эффективной биологически активной генно-терапевтической субстанции из линейки биологически активных генно-терапевтических субстанций для терапевтических целей, необходимо предварительное персонализированное исследование пациента.

Обозначения:

биоптаты пациентов после введения БАГТС CLCA2 SEQ ID No:1 (А)

биоптаты пациентов после введения БАГТС CLCA2 SEQ ID No:2 (В)

биоптаты пациентов после введения БАГТС CLCA2 SEQ ID No:3 (С)

биоптаты пациентов после введения БАГТС CLCA2 SEQ ID No:4 (D)

биоптаты пациентов после введения БАГТС CLCA2 SEQ ID No:5 (Е)

биоптаты пациентов после введения БАГТС CLCA2 SEQ ID No:6 (F)

биоптаты пациентов после введения БАГТС CLCA2 SEQ ID No:7 (G)

биоптаты пациентов после введения плацебо (Н)

На фиг. 19

С целью определения наиболее эффективной применительно к конкретному пациенту биологически активной генно-терапевтической субстанции анализировали количественный уровень белка хлоридного кальций-активируемого канала-2 в клеточных лизатах фибробластов этого пациента, трансфицированных разными генетическими конструкциями, содержащими нативную или модифицированные кДНК гена CLCA2.

По итогам анализа количества белка хлоридного кальций-активируемого канала-2 в культуре фибробластов пациента выделили вариант биологически активной генно-терапевтической субстанции, при трансфекции кото