Линейка биологически активных генно-терапевтических субстанций на основе гена col1a1 для коррекции патологических состояний клеток органов и тканей и органов и тканей человека, способ получения и использования

Линейка биологически активных генно-терапевтических субстанций на основе гена col1a1 для коррекции патологических состояний клеток органов и тканей и органов и тканей человека, способ получения и использования

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область, к которой относится изобретение

Изобретение относится к молекулярной биологии, биотехнологии, генной инженерии и медицине и может быть использовано для коррекции патологических состояний клеток различных органов и тканей, а также собственно органов и тканей человека, связанных с пониженным количеством продукта гена COL1A1 - белка альфа-1 цепи коллагена I типа, в частности, в терапевтических целях.

Предшествующий уровень.

Коллаген - основной структурный белок межклеточного матрикса. Он составляет от 25 до 33% общего количества белка в организме. Под термином "коллаген" подразумевают семейство близкородственных фибриллярных белков, которые являются основным белковым элементом кожи, костей, сухожилий, хряща, кровеносных сосудов, зубов. В разных тканях преобладают разные типы коллагена, а это, в свою очередь, определяется той ролью, которую коллаген играет в конкретном органе или ткани.

В тканях человека существует несколько различных типов коллагена. В настоящее время известно 19 типов коллагена, которые отличаются друг от друга по первичной структуре пептидных цепей, функциям и локализации в организме. Наиболее широко в организме присутствует коллаген I типа. Он встречается главным образом в соединительной ткани кожи, костях, сухожилиях, стенке артерий, роговице глаза, склере, плаценте, дентине. Причем около 40% его находится в коже, около 50% - в тканях скелета и 10% - в строме внутренних органов. Присутствие коллагена в коже придает ей эластичность, в хряще и кости - прочность, в сухожилиях - прочность и эластичность, в роговице глаза - обеспечивает прозрачность, также коллаген принимает участие в ранозаживляющих процессах.

Коллаген - внеклеточный белок, но он синтезируется в виде внутриклеточной молекулы предшественника, которая в ходе процессинга трансформируется в проколлаген и далее в коллаген. В коже, сухожилиях, и костях главным образом представлен коллаген, содержащий в своей структуре две молекулы альфа 1 типа и одну альфа 2 типа. Различия в коллагене из перечисленных выше трех типов ткани (кожа, сухожилия, кости) проявляются в уровне гидрокислирования пролиновых и лизиновых остатков. Коллаген имеет трехспиральную альфа структуру.

Ген COL1A1 кодирует белок альфа1-цепи коллагена I типа и является потенциально значимым в формировании генетической предрасположенности к остеопорозу и хрупкости костей с риском переломов. Мутации в локусе данного гена приводит к возникновению особей различных фенотипов, в том числе жизнеспособных и фертильных особей, так и тех, которые характеризуются летальностью еще в эмбриональном периоде развития. У гомозигот по COL1A1 (-/-) аллелю наблюдаются нарушения в формировании костей, и их хрупкость, осетопороз, кожный фиброз, нарушение послеродовой инволюции матки. [PMID: 22589248], [PMID: 18248096], [PMID: 24443344], [PMID: 2402497], [PMID: 10608859]. Снижение активности белка альфа 1-цепи коллагена 1 типа наблюдается при некоторых болезнях при мутациях в гене COL1A1 а также вследствие экологических, возрастных причин, приводящих к снижению активности этого белка, что в свою очередь отражается на свойствах органов и тканей человека. Клиническая картина заболеваний, вызванных дефектами синтеза и созревания коллагена, является очень полиморфной. При многих заболеваниях отмечают не только костно-суставную патологию или изменения со стороны кожи, но и ярко выраженные висцеральные проявления (поражения кишечника, почек, легких, сердца, сосудов).

В связи с этим разработка лечебных средств для коррекции патологических состояний, связанных с понижением экспрессии гена(ов) коллагенов в клетках, тканях, органах человека является актуальной задачей.

Для коррекции патологических состояний в соединительных тканях человека существует несколько подходов с использованием коллагена.

Так в патенте RU 2136265 предложена гелеобразующая основа для косметических средств. Предлагаемая основа предназначена для использования в составах водосодержащих косметических средств для ухода за кожей и волосами. Основа, помимо белка коллагена, дополнительно содержит хитозан при массовом соотношении коллагена и хитозана 1:(0,012-0,48). Технический результат изобретения - расширение арсенала основ косметических средств. При этом известно, что все кремы, содержащие коллаген, эластин и гликозаминогликаны, дают временный незначительный эффект, так как эти субстанции редко проникают глубже эпидермиса и только частично сглаживают морщины и складки. Недостаток подхода наружного применения коллагенсодержащих препаратов кожи состоит в том, что эти вещества обладают краткосрочным действием и требуют постоянного применения, могут вызвать побочные явления, например, аллергическую реакцию, применение таких препаратов полностью не компенсирует недостаточную работу генов, ответственных за синтез коллагена в организме.

В патенте US 3949073, предложен способ укрепления соединительной ткани различных типов у млекопитающих при помощи введения в место укрепления полимеризующегося in situ раствора нативного коллагена, полученного с применением пепсина, т.е. лишенного неспиральных концов молекулы. Такие растворы коллагена могут быть введены в организм путем инъекции или нанесены на поверхность раны; при температуре тела эти растворы превращаются в гель. В них могут быть включены любые клетки, возможна также добавка к таким растворам других компонентов внеклеточного матрикса или лекарственных веществ. Это обусловило применение нативного коллагена, полученного с применением пепсина, с добавлением клеток и лекарственных препаратов или без них, для репарации различных тканевых патологий.

В патенте RU (11) 2214827 (13) С1 описан способ получения коллагена, изобретение может быть использовано при лечении различной тканевой патологии, в том числе восстановления тканей, для клеточного культивирования. В частности, коллагеном, полученным по указанной методике, проводили усиление соединительной ткани по методу, описанному в патенте US 3949073, после ряда манипуляций коллаген путем инъекции вводили в поврежденную ткань организма. В месте введения коллаген полимеризовался (образовывал гель), и возникал аналог соединительной ткани, который в течение недели начинал заселяться фибробластами и васкуляризоваться. Также полученный коллаген был использован для репарации мочевого сфинктера (лечение недержания мочи). К коллагену могут быть добавлены любые клетки, компоненты межклеточного матрикса или лекарственные препараты, как например в заявке 2000115816 на изобретение РФ, МКИ A61K 35/48, опубл. 13.06.2000, где нативный коллаген с сохраненными неспиральными участками применялся для лечения кожных ран в сочетании с эмбриональными фибробластами человека и другими компонентами межклеточного матрикса, например, хондроитинсульфатом, и лекарственными препаратами. Как показали испытания, полученный по данному способу коллаген обладает низкой иммуногенной и аллергенной активностью. Предлагаемый коллаген также пригоден для получения тканевых эквивалентов и коллагеновых конструкций.

Недостаток данного подхода состоит в том, что при данном методе введения нативного белка коллагена желаемый терапевтический эффект может оказаться недостигнутым, и белок может вызвать побочные реакции.

В патенте US 0008071364 В2 описано генно-терапевтическое средство на основе эластина и коллагена для стимулирования образование хряща, например, суставного хряща.

За прототип авторами было принято решение по патентной заявке US 20030064369 А1, в которой описано генно-терапевтическое средство на основе проколлаген I N-протеиназы. Данный фермент участвует в процессинге проколлагена I и II типа в коллаген. В патенте показан список полипептидов и кодирующие их нуклеотидные последовательности, и антитела, которые иммуноспецифично связываются с полипептидом, а также производные, варианты, мутанты, фрагменты или вышеупомянутого полипептида, или полинуклеотида или антитела. Кроме того, изобретение раскрывает терапевтические, диагностические и исследовательские методы диагностики, лечения и профилактики различных заболеваний, связанных с любой из приведенных в патенте нуклеиновых кислот и белков человека. В списке полипептидов приведен белок, который гомологичен проколлаген I N-протеиназе человека из семейства цинк-связывающих металлопротеиназ. Показано, что кодирующая этот белок нуклеотидная последовательность, собственно полипептид, антитела к нему и родственные соединения согласно изобретению применимы в терапевтических и диагностических целях, например; при лечении синдрома Элерса-Данлоса типа VII C и/или других патологий. Синдром Элерса-Данлоса типа VII C - генетически обусловленное заболевание, которое возникает из-за отсутствия активности проколлаген I N-протеиназы, коллаген не образуется и наблюдается вялая, мягкая, одутловатая кожа. Показанная в патентной заявке опосредованная регуляция синтеза коллагена является частью механизма его процессинга (созревания) в клетке и не может влиять на основной механизм синтеза молекул для сборки коллагена в клетках пациента, что часто является причиной патологических состояний клеток органов и тканей и органов и тканей человека. Также при создании генно-терапевтического средства в этом изобретении не учитывается индивидуальные характеристики пациента.

Раскрытие изобретения

Задачей данного изобретения является создание линейки высокоэффективных биологически активных генно-терапевтических субстанций для коррекции патологических состояний организма человека способных препятствовать количественному снижению белка альфа-1 цепи коллагена I типа в клетках органов и тканей и/или органах и тканях человека путем повышения уровня экспрессии гена COL1A1 в клетках органов и тканей и/или органах и тканях человека, приводящего к повышению количества белка альфа-1 цепи коллагена I типа, в клетках органов и тканей и/или органах и тканях организма с учетом индивидуальных особенностей пациента.

Указанная задача решается за счет того, что создана линейка биологически активных генно-терапевтических субстанций для коррекции патологических состояний клеток органов и тканей и/или органов и тканей человека, связанных с количественным снижением белка альфа-1 цепи коллагена I типа, каждая из которых представляет собой генетическую конструкцию на основе векторной плазмиды, содержащей нативную кДНК гена COL1A1 SEQ ID No: 1 или одну из модифицированных кДНК гена COL1A1, и содержащей также регуляторные элементы, обеспечивающие транскрипцию этой последовательности в эукариотических клетках, в частности в клетках органов и тканей человека и способную обеспечить высокий уровень экспрессии гена COL1A1 и увеличить количество белка альфа-1 цепи коллагена I типа в клетках органов и тканей и/или органах и тканях человека, в частности, в гемопоэтических клетках, или мезенхимальных стволовых клетках, или хондробластах, или миоцитах, или миобластах, или фибробластах, или остеобластах, или кератоцитах, или эпителиальных клетках, или клетках роговицы, или эндотелиальных клетках, или эпителиальных клетках, в сочетании с транспортной молекулой или без нее при трансфекции этими биологически активными генно-терапевтическими субстанциями клеток органов и тканей человека и/или в органах и тканях человека в частности, в соединительно-тканных структурах, или коже, или суставах, или хрящевой ткани, или костной ткани, или мышечной ткани, или сухожилиях, или связках, или кровеносных сосудах, или стенке артерий, или роговице глаза, или склере, или плаценте, или дентине, или строме внутренних органов, в сочетании с транспортной молекулой или без нее при введении этих биологически активных генно-терапевтических субстанций в органы и ткани человека. Линейка биологически активных генно-терапевтических субстанций содержит последовательность нуклеотидов, включающую в себя белок-кодирующую область кДНК гена COL1A1, которая несет модификации не затрагивающие структуру белка альфа-1 цепи коллагена I типа, а именно: делеции 5' нетранслируемых областей или делеции 3'-нетранслируемых областей, или нуклеотидные замены, не приводящие к аминокислотным заменам или обрыву аминокислотной цепи, или комбинации вышеперечисленных модификаций и, соответственно, не влияющие на кодируемую этой последовательностью аминокислотную последовательность. В качестве модифицированной кДНК гена COL1A1 используют SEQ ID No: 2, или в качестве модифицированной кДНК гена COL1A1 используют SEQ ID No: 3, или что в качестве модифицированной кДНК гена COL1A1 используют SEQ ID No: 4, или в качестве модифицированной кДНК гена COL1A1 используют SEQ ID No: 5, или в качестве модифицированной кДНК гена COL1A1 используют SEQ ID NO: 6, или в качестве модифицированной кДНК гена COL1A1 используют SEQ ID No: 7. В качестве транспортной молекулы используют липосомы, или дендримеры 5-го и выше поколений, или амфифильные блоксополимеры. Способ получения биологически активной генно-терапевтической субстанции для коррекции патологических состояний клеток органов и тканей и/или органов и тканей человека, связанных с количественным снижением белка альфа-1 цепи коллагена I типа заключается в том, что получают кДНК гена COL1A1, затем помещают кДНК в векторную плазмиду, способную обеспечить высокий уровень экспрессии этой кДНК в клетках различных органов и тканей человека, наращивают и выделяют необходимое количество генетической конструкции, затем комбинируют генетическую конструкцию с транспортной молекулой для трансфекции полученной биологически активной генно-терапевтической субстанцией клеток органов и тканей и/или введения полученной биологически активной генно-терапевтической субстанции в органы и ткани человека. Или Способ получения биологически активной генно-терапевтической субстанции для коррекции патологических состояний клеток различных органов и тканей человека, связанных с количественным снижением белка альфа-1 цепи коллагена I типа заключается в том, что получают кДНК гена COL1A1, модифицируют его, затем помещают модифицированную кДНК в векторную конструкцию, способную обеспечить высокий уровень экспрессии этой кДНК в клетках различных органов и тканей человека, наращивают и выделяют необходимое количество генетической конструкции, затем комбинируют генетическую конструкцию с транспортной молекулой для трансфекции полученной биологически активной генно-терапевтической субстанцией клеток органов и тканей и/или введения полученной биологически активной генно-терапевтической субстанции в органы и ткани человека.

Способ использования каждой из созданных и представленных в линейке биологически активных генно-терапевтических субстанций для коррекции патологических состояний клеток органов и тканей и/или органов и тканей человека, связанных с количественным снижением белка альфа-1 цепи коллагена I типа, заключается в трансфекции созданной биологически активной генно-терапевтической субстанцией по п. 1, выбранной с учетом индивидуальных особенностей каждого конкретного пациента на основе предварительного эксперимента по определению наиболее эффективного варианта из созданных и представленных в линейке биологически активных генно-терапевтических субстанций, клеток органов и тканей человека.

Или способ использования каждой из созданных и представленных в линейке биологически активных генно-терапевтических субстанций для коррекции патологических состояний клеток органов и тканей и/или органов и тканей человека, связанных с количественным снижением белка альфа-1 цепи коллагена I типа, заключается во введении одной из созданных биологически активных генно-терапевтической субстанций по п. 1, выбранной именно для данного пациента на основе предварительного эксперимента по определению наиболее эффективного варианта из созданных и представленных в линейке биологически активных генно-терапевтических субстанций, в органы и ткани этого пациента, и/или во введении аутологичных клеток пациента, трансфицированных одной из созданных биологически активных генно-терапевтической субстанций, выбранной именно для данного пациента на основе предварительного эксперимента по определению наиболее эффективного варианта из созданных и представленных в линейке биологически активных генно-терапевтических субстанций, в органы и ткани этого пациента.

Перечень фигур

На фиг. 1

Представлена нуклеотидная последовательность немодифицированной кДНК гена COL1A1, последовательность которой идентична приводимой в базе данных GenBank под номером NM_000088.3 COL1A1 SEQ ID No: 1.

На фиг. 2

Представлена нуклеотидная последовательность модифицированной кДНК гена COL1A1, SEQ ID No: 2, которая

содержит 1 нуклеотидную замену A→G в позиции 4485, 5 нуклеотидных замен T→G в позициях 687, 846, 858, 1038, 1092, не приводящие к изменениям в аминокислотной последовательности белка альфа-1 цепи коллагена I типа.

На фиг. 3

Представлена нуклеотидная последовательность модифицированной кДНК гена COL1A1, SEQ ID No: 3, которая

содержит 1 нуклеотидную замену A→G в позиции 4485, 10 нуклеотидных замен T→G в позициях 687, 846, 858, 1038, 1236, 1092, 1587, 1659, 1710, 1848, не приводящие к изменениям в аминокислотной последовательности белка альфа-1 цепи коллагена I типа.

На фиг. 4

Представлена нуклеотидная последовательность модифицированной кДНК гена COL1A1, SEQ ID No: 4, которая

содержит 1 нуклеотидную замену A→G в позиции 4485, 15 нуклеотидных замен T→G в позициях 687, 846, 858, 1038, 1236, 1092, 1587, 1605, 1659, 1710, 1848, 2181, 2325, 2415, 2514, не приводящие к изменениям в аминокислотной последовательности белка альфа-1 цепи коллагена I типа.

На фиг. 5

Представлена нуклеотидная последовательность модифицированной кДНК гена COL1A1, SEQ ID No: 5, которая

содержит 1 нуклеотидную замену A→G в позиции 4485, 20 нуклеотидных замен T→G в позициях 687, 846, 858, 1038, 1236, 1092, 1587, 1605, 1659, 1710, 1848, 2181, 2325, 2415, 2514, 2532, 2856, 3000, 3108, 3168, не приводящие к изменениям в аминокислотной последовательности белка альфа-1 цепи коллагена I типа.

На фиг. 6

Представлена нуклеотидная последовательность модифицированной кДНК гена COL1A1, SEQ ID No: 6, которая

содержит 1 нуклеотидную замену A→G в позиции 4485, 29 нуклеотидных замен T→G в позициях 687, 846, 858, 1038, 1236, 1092, 1587, 1605, 1659, 1710, 1848, 2181, 2325, 2415, 2514, 2532, 2856, 2880, 3000, 3108, 3168, 3234, 3324, 3378, 3405, 3459, 3801, 3807, 3906, не приводящие к изменениям в аминокислотной последовательности белка альфа-1 цепи коллагена I типа.

На фиг. 7

Представлена нуклеотидная последовательность модифицированной кДНК гена COL1A1, SEQ ID No: 7, которая

не содержит нетранслируемые 5' и 3' области гена и содержит 1 нуклеотидную замену A→G в позиции 4485, 29 нуклеотидных замен T→G в позициях 687, 846, 858, 1038, 1236, 1092, 1587, 1605, 1659, 1710, 1848, 2181, 2325, 2415, 2514, 2532, 2856, 2880, 3000, 3108, 3168, 3234, 3324, 3378, 3405, 3459, 3801, 3807, 3906, не приводящие к изменениям в аминокислотной последовательности белка альфа-1 цепи коллагена I типа.

На фиг. 8

С целью последующего корректного определения генно-терапевтического эффекта после трансфекции фибробластов биологически активной генно-терапевтической субстанцией с кДНК гена COL1A1 проводили анализ эндогенной экспрессии гена COL1A1 в культуре первичных фибробластов. На фигуре представлены графики накопления продуктов полимеразной цепной реакции (ПЦР), соответствующих:

1 - кДНК гена COL1A1, фибробласты со сниженной экспрессией гена COL1A1

2 - кДНК гена COL1A1, фибробласты с нормальной экспрессией гена COL1A1

3 - кДНК гена В2М, фибробласты со сниженной экспрессией гена COL1A1

4 - кДНК гена В2М, фибробласты с нормальной экспрессией гена COL1A1

В качестве референтного гена использовали ген В2М (Бета-2-микроглобулин) приведенного в базе данных GenBank под номером NM 004048.2.

На фиг. 9

С целью подтверждения увеличения экспрессии гена COL1A1 в клеточной культуре фибробластов со сниженной экспрессией гена COL1A1 при трансфекции данных клеток биологически активной генно-терапевтической субстанцией с кДНК гена COL1A1 представлены графики накопления ПЦР-продуктов, соответствующих:

1 - кДНК гена COL1A1 в фибробластах с нормальной экспрессией гена COL1A1,

2 - кДНК гена COL1A1 в фибробластах со сниженной экспрессией гена COL1A1 до трансфекции БАГТС с кДНК гена COL1A1

3 - кДНК гена COL1A1 в фибробластах со сниженной экспрессией гена COL1A1 после трансфекции БАГТС с кДНК гена COL1A1

4 - кДНК гена COL1A1 в фибробластах со сниженной экспрессией гена COL1A1 после трансфекции вектором без кДНК гена COL1A1

5 - кДНК гена В2М в фибробластах с нормальной экспрессией гена COL1A1,

6 - кДНК гена В2М в фибробластах со сниженной экспрессией гена COL1A1 до трансфекции БАГТС с кДНК гена COL1A1

7 - кДНК гена В2М в фибробластах со сниженной экспрессией гена COL1A1 после трансфекции БАГТС с кДНК гена COL1A1

8 - кДНК гена В2М в фибробластах со сниженной экспрессией гена COL1A1 после трансфекции вектором без кДНК гена COL1A1

Из графиков следует, что в случае трансфекции вектором без вставки кДНК гена COL1A1 уровень кДНК гена COL1A1 в фибробластах не изменился, а в случае трансфекции вектором с кДНК COL1A1 - уровень кДНК фибробластов со сниженной экспрессией гена COL1A1 многократно увеличился (до уровня выше, чем уровень кДНК гена COL1A1 в нормальных фибробластах).

На фиг. 10

С целью подтверждения увеличения количества белка альфа-1 цепи коллагена I типа в клеточной культуре фибробластов с нормальной экспрессией гена COL1A1 при трансфекции данных клеток биологически активной генно-терапевтической субстанцией содержащей кДНК гена COL1A1 представлен график изменения количества белка альфа-1 цепи коллагена I типа нетрансфицированных фибробластов (культура А), трансфицированных вектором pCDNA 3.1 (+) не содержащим кДНК COL1A1 (культура В) и трансфицированных биологически активной генно-терапевтической субстанцией на базе генетической конструкции pCDNA 3.1-COL1A1 SEQ ID No: 1 (культура С). Из графика следует, что при трансфекции фибробластов биологически активной генно-терапевтической субстанцией с кДНК гена COL1A1 происходит увеличение количества белка альфа-1 цепи коллагена I типа в клеточном лизате.

На фиг. 11

С целью подтверждения увеличения количества белка альфа-1 цепи коллагена I типа в коже человека при введении в кожу клеточной культуры фибробластов, трансфицированной биологически активной генно-терапевтической субстанцией представлен анализ изменения количества белка альфа-1 цепи коллагена I типа в коже пациентов. При этом пациентам вводили три варианта культуры аутологичных фибробластов - нетрансфицированные (А), трансфицированные вектором pCMV6-XL5 (Б) и трансфицированные биологически активной генно-терапевтической субстанцией на базе pCMV6-COL1A1 SEQ ID No: 7 (С) - в кожу предплечья. Также анализировали количественный уровень белка альфа-1 цепи коллагена I типа в интактной коже. Показано повышение количества белка альфа-1 цепи коллагена I типа в коже пациента в области введения фибробластов, трансфицированных биологически активной генно-терапевтической субстанцией с кДНК гена COL1A1 (С).

На фиг. 12

С целью подтверждения увеличения количества белка альфа-1 цепи коллагена I типа до различного индивидуального уровня в клеточных культурах фибробластов пациентов при трансфекции данных клеток биологически активными генно-терапевтическими субстанциями с модифицированными и нативной кДНК гена COL1A1 в зависимости от наличия и типа в них той или иной модификации кДНК гена COL1A1 представлен анализ изменения количественного уровня белка альфа-1 цепи коллагена I типа в культурах фибробластов кожи человека в зависимости от наличия и типа модификаций в кДНК гена COL1A1, используемой для трансфекции фибробластов.

Культуры фибробластов 29 пациентов делили на 8 частей каждую с (А) по (Н); первые части (А) клеточных культур пациентов трансфицировали биологически активной генно-терапевтической субстанцией pCMV6-COL1A1 SEQ ID No: 1, части (В) трансфицировали биологически активной генно-терапевтической субстанцией pCMV6-COL1A1 SEQ ID No: 2, части (С) трансфицировали биологически активной генно-терапевтической субстанцией pCMV6-COL1A1 SEQ ID No: 3, части (D) трансфицировали биологически активной генно-терапевтической субстанцией pCMV6-COL1A1 SEQ ID No: 4, части (E) трансфицировали биологически активной генно-терапевтической субстанцией pCMV6-COL1A1 SEQ ID No: 5, части (F) трансфицировали биологически активной генно-терапевтической субстанцией pCMV6-COL1A1 SEQ ID NO: 6, части (G) трансфицировали биологически активной генно-терапевтической субстанцией pCMV6-COL1A1 SEQ ID No: 7, части (H) трансфицировали векторной плазмидой, не содержащей кДНК гена COL1A1.

По итогам анализа количественного уровня белка альфа-1 цепи коллагена I типа выбрали показатели, касательно каждой части клеточной культуры от каждого пациента, продемонстрировавшие максимальное количество белка альфа-1 цепи коллагена I типа и объединили их в семь групп, исходя из следующего критерия:

В группе 1 максимальное количество белка альфа-1 цепи коллагена I типа наблюдалась при трансфекции pCMV6-COL1A1 SEQ ID No: 1,

в группе 2 максимальное количество белка альфа-1 цепи коллагена I типа наблюдалась при трансфекции pCMV6-COL1A1 SEQ ID No: 2,

в группе 3 максимальное количество белка альфа-1 цепи коллагена I типа наблюдалась при трансфекции pCMV6-COL1A1 SEQ ID No: 3,

в группе 4 максимальное количество белка альфа-1 цепи коллагена I типа наблюдалась при трансфекции pCMV6-COL1A1 SEQ ID No: 4,

в группе 5 максимальное количество белка альфа-1 цепи коллагена I типа наблюдалась при трансфекции pCMV6-COL1A1 SEQ ID No: 5,

в группе 6 максимальное количество белка альфа-1 цепи коллагена I типа наблюдалась при трансфекции pCMV6-COL1A1 SEQ ID No: 6,

в группе 7 максимальное количество белка альфа-1 цепи коллагена I типа наблюдалась при трансфекции pCMV6-COL1A1 SEQ ID No: 7.

Ни в одной из клеточных культур не наблюдалось того, что максимальное количество белка альфа-1 цепи коллагена I типа присутствует при трансфекции вектором без вставки кДНК гена COL1A1.

На фигуре 12 для каждой группы клеточных культур приведены диаграммы показателей концентрации белка альфа-1 цепи коллагена I типа (усредненных в рамках группы, в случае, если в группу входит более одной клеточной культуры) применительно ко всем, участвующим в эксперименте активным генно-терапевтическим субстанциям, после трансфекции этих клеточных культур активными генно-терапевтическими субстанциями, содержащими модифицированные и нативную кДНК гена COL1A1.

Из фигуры следует, что достижение максимального количества белка альфа-1 цепи коллагена I типа в культурах фибробластов кожи различных пациентов при их трансфекции биологически активными генно-терапевтическими субстанциями, связано с индивидуальными особенностями пациентов и зависит от наличия и типа модификаций в кДНК гена COL1A1, входящих в биологически активные генно-терапевтические субстанции.

Каждая биологически активная генно-терапевтическая субстанция из линейки биологически активных генно-терапевтических субстанций является эффективной в некоторой значительной группе пациентов. Следовательно для выбора наиболее эффективной биологически активной генно-терапевтической субстанции из линейки биологически активных генно-терапевтических субстанций для терапевтических целей необходимо предварительное персонализированное исследование пациента.

Обозначения:

части клеточных культур, трансфицированных БАГТС COL1A1 SEQ ID No: 1 (А)

части клеточных культур, трансфицированных БАГТС COL1A1 SEQ ID No: 2 (В)

части клеточных культур, трансфицированных БАГТС COL1A1 SEQ ID No: 3 (С)

части клеточных культур, трансфицированных БАГТС COL1A1 SEQ ID No: 4 (D)

части клеточных культур, трансфицированных БАГТС COL1A1 SEQ ID No: 5 (E)

части клеточных культур, трансфицированных БАГТС COL1A1 SEQ ID NO: 6 (F)

части клеточных культур, трансфицированных БАГТС COL1A1 SEQ ID No: 7 (G)

части клеточных культур, трансфицированных плацебо (Н)

На фиг. 13

С целью подтверждения увеличения экспрессии гена COL1A1 в клеточной культуре кератоцитов и эпителиальных клеток роговицы глаза при трансфекции данных клеток биологически активной генно-терапевтической субстанцией с кДНК гена COL1A1 приведены графики накопления ПЦР-продуктов, соответствующих:

1 - кДНК гена COL1A1, кератоциты до трансфекции

2 - кДНК гена COL1A1, эпителий роговицы до трансфекции

3 - кДНК гена COL1A1, кератоциты после трансфекции

4 - кДНК гена COL1A1, эпителий роговицы после трансфекции

5 - кДНК гена В2М, кератоциты до трансфекции

6 - кДНК гена В2М, эпителий роговицы до трансфекции

7 - кДНК гена В2М, кератоциты после трансфекции

8 - кДНК гена В2М, эпителий роговицы после трансфекции

Ген В2М использовали в качестве референтного.

Из фигуры следует, что в результате трансфекции уровень специфической кДНК гена COL1A1 в культуре кератоцитов и в культуре эпителия многократно вырос.

На фиг. 14

С целью подтверждения увеличения экспрессии гена COL1A1 в клеточной культуре хондробластов при трансфекции данных клеток биологически активной генно-терапевтической субстанцией с кДНК гена COL1A1 приведены графики накопления ПЦР-продуктов, соответствующих:

1 - кДНК гена COL1A1, до трансфекции

2 - кДНК гена COL1A1, после трансфекции

3 - кДНК гена В2М, до трансфекции

4 - кДНК гена В2М, после трансфекции

Ген В2М использовали в качестве референтного.

Из фигуры следует, что в результате трансфекции уровень специфической кДНК гена COL1A1 вырос многократно.

На фиг. 15

С целью подтверждения увеличения количества белка альфа-1 цепи коллагена I типа в коже человека при введении в кожу биологически активной генно-терапевтической субстанции представлен анализ изменения количественного уровня белка альфа-1 цепи коллагена I типа в коже. При этом пациенту вводили биологически активную генно-терапевтическую субстанцию, содержащую генетическую конструкцию pCMV6-COL1A1 SEQ ID No: 4 (В) и параллельно вводили плацебо, представляющее собой комбинацию векторной плазмиды pCMV-XL5 не содержащей кДНК гена COL1A1 с транспортной молекулой (А) - в кожу предплечья. Показано увеличение количества белка альфа-1 цепи коллагена I типа в биоптате кожи пациента 1В, которому вводились биологически активная генно-терапевтическая субстанция, содержащая генетическую конструкцию с кДНК гена COL1A1, что говорит об эффективности биологически активной генно-терапевтической субстанции.

Обозначения:

пациент 1A

пациент 1B

пациент 1B до введения БАГТС

На фиг. 16

С целью подтверждения увеличения количества белка альфа-1 цепи коллагена I типа в хрящевой ткани человека при введении в хрящевую ткань биологически активной генно-терапевтической субстанции представлен анализ изменения количественного уровня белка альфа-1 цепи коллагена I типа в хрящевой ткани. При этом пациенту вводили биологически активную генно-терапевтическую субстанцию, содержащую векторную плазмиду с кДНК гена COL1A1 pCDNA 3.1 COL1A1 SEQ ID No: 5 (В) и параллельно вводили плацебо pCDNA 3.1(+), представляющее собой комбинацию векторной плазмиды не содержащей кДНК гена COL1A1 с транспортной молекулой (А) - в хрящевую ткань.

Показано увеличение количественного уровня белка альфа-1 цепи коллагена I типа в лизате биоптата хрящевой ткани пациента 1В, которому вводились биологически активная генно-терапевтическая субстанция, содержащая генетическую конструкцию с кДНК гена COL1A1, что говорит об эффективности биологически активной генно-терапевтической субстанции.

Обозначения:

пациент 1A

пациент 1B

пациент 1B до введения БАГТС

На фиг. 17

С целью подтверждения увеличения количества белка альфа-1 цепи коллагена I типа в мышечной ткани человека при введении в мышечную ткань биологически активной генно-терапевтической субстанции представлен анализ изменения количества белка альфа-1 цепи коллагена I типа в мышечной ткани. При этом пациенту вводили биологически активную генно-терапевтическую субстанцию, содержащую векторную плазмиду с кДНК гена COL1A1 - pCMV6-Kan/Neo COL1A1 SEQ ID NO: 6 (В) и параллельно вводили плацебо pCMV6-Kan/Neo, представляющее собой комбинацию векторной плазмиды не содержащей кДНК гена COL1A1 с транспортной молекулой (А) - в мышечную ткань в зоне предплечья. Показано увеличение количества белка альфа-1 цепи коллагена I типа в биоптате мышечной ткани пациента 1B, которому вводились биологически активная генно-терапевтическая субстанция, содержащая генетическую конструкцию с кДНК гена COL1A1, что говорит об эффективности биологически активной генно-терапевтической субстанции.

Обозначения:

пациент 1A

пациент 1B

пациент 1B до введения БАГТС

На фиг. 18

С целью подтверждения увеличения количества белка альфа-1 цепи коллагена I типа до различного индивидуального уровня при введении в кожу пациентов биологически активных генно-терапевтических субстанций с модифицированными и нативной кДНК гена COL1A1 анализировали количественный уровень белка альфа-1 цепи коллагена I типа в коже человека в зависимости от наличия и типа модификаций в кДНК гена COL1A1.

Каждому из 23-ти пациентов, отобранных в случайном порядке, вводили в кожу предплечья 7 биологически активных генно-терапевтических субстанций pCMV6-SEQ ID No: 1, pCMV6-SEQ ID No: 2, pCMV6-SEQ ID No: 3, pCMV6-SEQ ID No: 4, pCMV6-SEQ ID No: 5, pCMV6-SEQ ID No: 6, pCMV6-SEQ ID No: 7, и плацебо pCMV6-XL5.

По итогам анализа количества белка альфа-1 цепи коллагена I типа в биоптатах выбрали показатели, касательно каждого биоптата от каждого пациента, продемонстрировавшие максимальные количественные уровни белка альфа-1 цепи коллагена I типа и объединили их в семь групп, исходя из следующего критерия:

В группе 1 максимальное количество белка альфа-1 цепи коллагена I типа наблюдалась при введении pCMV6-COL1A1 SEQ ID No: 1,

в группе 2 максимальное количество белка альфа-1 цепи коллагена I типа наблюдалась при введении pCMV6-COL1A1 SEQ ID No: 2,

в группе 3 максимальное количество белка альфа-1 цепи коллагена I типа наблюдалась при введении pCMV6-COL1A1 SEQ ID No: 3,

в группе 4 максимальное количество белка альфа-1 цепи коллагена I типа наблюдалась при введении pCMV6-COL1A1 SEQ ID No: 4,

в группе 5 максимальное количество белка альфа-1 цепи коллагена I типа наблюдалась при введении pCMV6-COL1A1 SEQ ID No: 5,

в группе 6 максимальное количество белка альфа-1 цепи коллагена I типа наблюдалась при введении pCMV6-COL1A1 SEQ ID No: 6,

в группе 7 максимальное количество белка альфа-1 цепи коллагена I типа наблюдалась при введении pCMV6-COL1A1 SEQ ID No: 7.

Ни в одном из биоптатов не наблюдалось того, что максимальное количество белка альфа-1 цепи коллагена I типа присутствует в случае введения плацебо.

На фигуре 18 для каждой группы биоптатов приведены диаграммы показателей концентрации белка альфа-1 цепи коллагена I типа (усредненных в рамках группы, в случае, если в группу входит более одного биоптата) применительно ко всем, участвующим в эксперименте активным генно-терапевтическим субстанциям, после введения пациентам этих активных генно-терапевтических субстанций, содержащих модифицированные и нативную кДНК гена COL1A1.

Из данного примера следует, что достижение максимального количества белка альфа-1 цепи коллагена I типа в биоптатах кожи различных пациентов при введении им в кожу биологически активных генно-терапевтических субстанций, связано с индивидуальными особенностями пациентов и зависит от наличия и типа модификаций в кДНК гена COL1A1, входящих в биологически активные генно-терапевтические субстанции.

Каждая биологически активная генно-терапевтическая субстанция из линейки биологически активных генно-терапевтических субстанций является эффективной в некоторой значительной группе пациентов. Следовательно, для выбора наиболее эффективной биологически активной генно-терапевтической субстанции из линейки биологически активных генно-терапевтических субстанций для терапев