Линейка биологически активных генно-терапевтических субстанций на основе гена tgfbr2 для коррекции патологических состояний клеток органов и тканей и органов и тканей человека, способ получения и использования

Линейка биологически активных генно-терапевтических субстанций на основе гена tgfbr2 для коррекции патологических состояний клеток органов и тканей и органов и тканей человека, способ получения и использования

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область, к которой относится изобретение

Изобретение относится к молекулярной биологии, биотехнологии, генной инженерии и медицине и может быть использовано для коррекции патологических состояний клеток различных органов и тканей, а также собственно органов и тканей человека, связанных с количественным снижением белка рецептора II типа трансформирующего фактора роста бетта, в частности, в терапевтических целях.

Предшествующий уровень.

Факторы роста - полипептиды с молекулярной массой 5-50 кДа, объединенные в группу трофических регуляторных субстанций. Подобно гормонам, эти факторы обладают широким спектром биологического действия на многие клетки - стимулируют или ингибируют митогенез, хемотаксис, дифференцировку. В отличие от гормонов, факторы роста, как правило, продуцируются неспециализированными клетками, находящимися во всех тканях, и обладают эндокринным, паракринным и аутокринным действием.

К факторам роста относятся белки семейства трансформирующих факторов роста, которое включает группу гомологичных гетеродимерных белков из 3х изоформ у млекопитающих. Так основной изоформой, секретируемой клетками иммунной системы, является продукт гена TGFB1 - трансформирующий фактор роста β1. Это полифункциональный цитокин, участвующий в регуляции процессов пролиферации, дифференцировки, миграции и апоптоза, а также ряда метаболических реакций в различных клетках-мишенях. В сущности, каждая клетка организма, включая эпителиальные, эндотелиальные, нервные и соединительно-тканные клетки, продуцирует трансформирующий фактор роста β1 и рецепторы к нему. Белок также продуцируется активированными T-лимфоцитами и макрофагами, тромбоцитами, почками, плацентой. Полагают, что этот белок является цитокином системного действия, поскольку он и его специфические рецепторы выявлены практически во всех типах клеток.

Белок рецептора 2 трансформирующего фактора роста β, кодируемый геном TGFBR2, является важным компонентом сигнального пути трансформирующего фактора роста β. (Massague др., 2005; Фэн и Derynck, 2005). Трансмембранный белок гена TGFBR2 имеет протеинкиназный домен и формирует гетеродимерный комплекс с белком другого рецептора гена TGFBR1, а также связывает трансформирующий фактор роста β1. В частности было показано, что эти активированные белки-рецепторы трансформирующего фактора роста β фосфорилируют специфические сигнальные эффекторы, белки Smad2 и Smad3, вызывая их связывание с опухолевым супрессором Smad4. Образующиеся комплексы транслоцируются из цитоплазмы в ядро, где они регулируют транскрипцию специфических генов, ответственных за клеточную пролиферацию, в частности, ингибиторов циклин-зависимых киназ - ферментов, которые участвуют в смене фаз клеточного цикла; регулируют транскрипцию и процессинг мРНК. Таким образом, ген TGFBR2 известен как ген-супрессор опухоли.

В заявке 2011110736 на патент на изобретение в РФ описан способ лечения индивидуума, имеющего множественную миелому, включающий в себя введение указанному индивидууму изолированных остеогенных плацентарных адгезивных клеток (ОРАС). Введение заметно снижает развитие одного или более симптомов указанной множественной миеломы (боли в костях, остеоцитные повреждения, анемию или почечную недостаточность), останавливает их развитие или улучшает их. Указанные клетки экспрессируют один или более генов (в т.ч. TGFB3, TGFBR1 и/или TGFBR2 - трансформирующий фактор роста бетта, рецептор 2) на заметно более высоком уровне, чем эквивалентное количество CD200⁺ - адгезивных плацентарных стволовых клеток, при этом уровень экспрессии оценивается с помощью количественной ПЦР в режиме реального времени. А также клетки ОРАС экспрессирует один или более генов (в т.ч. TGFB3, TGFBR1 и/или TGFBR2) на заметно более высоком уровне, чем эквивалентное количество полученных из костного мозга мезенхимальных стволовых клеток, или экспрессируют один или более генов (в т.ч. TGFB1, TGFB2, TGFB3, TGFBR1) на заметно более высоком уровне, чем эквивалентное количество клеток фибробластов, и где указанные клетки фибробластов подвергались эквивалентному количеству пассажей.

За прототип авторами было принято решение по патенту US 6291237, в котором показано генно-терапевтическое средство на основе нового полинуклеотида, кодирующего мутантную форму белка рецептора 2 трансформирующего фактора роста β. Нуклеотидная последовательность содержит по меньшей мере одну мутацию (GT вставка или делеция 1-2 A из poly A или замена G на A). Она была встроена в экспрессионный вектор Методы для детекции инактивированного белка рецептора 2 трансформирующего фактора роста бетта предложены для использования в диагностике рака. Недостатком данного подхода является то, что внесение модификаций в аминокислотную последовательность природного белка может привести к образованию структур, являющихся антигенными детерминантами. Также при создании генно-терапевтического средства в этом изобретении не учитывается индивидуальные характеристики пациента, в связи с чем может понадобиться линейка вариаций для данного средства.

Раскрытие изобретения

Задачей данного изобретения является создание линейки высокоэффективных биологически активных генно-терапевтических субстанций для коррекции патологических состояний организма человека способных препятствовать количественному снижению белка рецептора II типа трансформирующего фактора роста бетта в клетках органов и тканей и/или органах и тканях человека путем повышения уровня экспрессии гена TGFBR2 в клетках органов и тканей и/или органах и тканях человека, приводящего к повышению количества белка рецептора II типа трансформирующего фактора роста бетта, в клетках органов и тканей и/или органах и тканях организма с учетом индивидуальных особенностей пациента.

Задача решается за счет того, что создана линейка биологически активных генно-терапевтических субстанций для коррекции патологических состояний клеток органов и тканей и/или органов и тканей человека, связанных с количественным снижением белка рецептора II типа трансформирующего фактора роста бетта, каждая из которых представляет собой генетическую конструкцию на основе векторной плазмиды, содержащей нативную кДНК гена TGFBR2 SEQ ID NO: 1 или одну из модифицированных кДНК гена TGFBR2, и содержащей также регуляторные элементы, обеспечивающие транскрипцию этой последовательности в эукариотических клетках, в частности в клетках органов и тканей человека и способную обеспечить высокий уровень экспрессии гена TGFBR2 и увеличить количество белка рецептора II типа трансформирующего фактора роста бетта в клетках органов и тканей и/или органах и тканях человека, в частности, в лейкоцитах, или T-лимфоцитах (хелперах), или В-лимфоцитах, или моноцитах, или тромбоцитах, или мононуклеарных клетках периферической крови, или остеобластах, или остеоцитах, или хондробластах, или хондроцитах, или HK-клетках (натуральных киллерах), или адипоцитах, или миоцитах, или гладкомышечных клетках, или клетках эпителия, или клетках эндотелия, или нейронах в сочетании с транспортной молекулой или без нее при трансфекции этими биологически активными генно-терапевтическими субстанциями клеток органов и тканей человека и/или в органах и тканях человека в частности, в костном мозге, или коре головного мозга, или слюнных железах, или поджелудочной железе, или желудке, или тонком кишечнике, или двенадцатиперстной кишке, или толстом кишечнике, или селезенке, или бронхах, или лимфатических узлах, или молочных железах, или коже, или гладких мышцах, или сердечной мышце, или скелетных мышцах, или миндалинах, или почках, или надпочечниках, или щитовидной железе, или мочевом пузыре, или предстательной железе, или плаценте, или фаллопиевых трубах, или яичниках, или семенниках, или шейке матки, или глазе или, или его роговице и склере, или зубах, или в костной, хрящевой, мышечной, эпителиальной, эндотелиальной, нервной, жировой тканях, или эндометрии матки, или плацентарной ткани, или твердой мозговой оболочке, или крови, или дентине, или легочной ткани в сочетании с транспортной молекулой или без нее при введении этих биологически активных генно-терапевтических субстанций в органы и ткани человека. Каждая биологически активная генно-терапевтическая субстанция из созданной линейки представляет генетическую конструкцию с кДНК гена TGFBR2, которая содержит последовательность нуклеотидов, включающую в себя белок-кодирующую область кДНК гена TGFBR2, которая несет модификации не затрагивающие структуру белка рецептора II тира трансформирующего фактора роста бетта, а именно: делеции 5' нетранслируемых областей или делеции 3'-нетранслируемых областей, или нуклеотидные замены, не приводящие к аминокислотным заменам или обрыву аминокислотной цепи, или комбинации вышеперечисленных модификаций и, соответственно, не влияющие на кодируемую этой последовательностью аминокислотную последовательность. В качестве модифицированной кДНК гена TGFBR2 используют SEQ ID No: 2, или SEQ ID No: 3, или SEQ ID No: 4, или SEQ ID No: 5, или SEQ ID No: 6, или SEQ ID No: 7. В качестве транспортной молекулы используют липосомы, или дендримеры 5-го и выше поколений, или амфифильные блоксополимеры.

Способ получения биологически активной генно-терапевтической субстанции для коррекции патологических состояний клеток органов и тканей и/или органов и тканей человека, связанных с количественным снижением белка рецептора II типа трансформирующего фактора роста бетта заключается в том, что получают кДНК гена TGFBR2, затем помещают кДНК в векторную плазмиду, способную обеспечить высокий уровень экспрессии этой кДНК в клетках различных органов и тканей человека, наращивают и выделяют необходимое количество генетической конструкции, затем комбинируют генетическую конструкцию с транспортной молекулой для трансфекции полученной биологически активной генно-терапевтической субстанцией клеток органов и тканей и/или введения полученной биологически активной генно-терапевтической субстанции в органы и ткани человека.

Или способ получения биологически активной генно-терапевтической субстанции для коррекции патологических состояний клеток различных органов и тканей человека, связанных с количественным снижением белка рецептора II типа трансформирующего фактора роста бетта заключается в том, что получают кДНК гена TGFBR2, модифицируют его по п.п. 3, или 4, или 5 или 6 или 7 или 8, затем помещают модифицированную кДНК в векторную конструкцию, способную обеспечить высокий уровень экспрессии этой кДНК в клетках различных органов и тканей человека, наращивают и выделяют необходимое количество генетической конструкции, затем комбинируют генетическую конструкцию с транспортной молекулой для трансфекции полученной биологически активной генно-терапевтической субстанцией клеток органов и тканей и/или введения полученной биологически активной генно-терапевтической субстанции в органы и ткани человека.

Способ использования каждой из созданных и представленных в линейке биологически активных генно-терапевтических субстанций для коррекции патологических состояний клеток органов и тканей и/или органов и тканей человека, связанных с количественным снижением белка рецептора II типа трансформирующего фактора роста бетта, заключается в трансфекции созданной биологически активной генно-терапевтической субстанцией, выбранной с учетом индивидуальных особенностей каждого конкретного пациента на основе предварительного эксперимента по определению наиболее эффективного варианта из созданных и представленных в линейке биологически активных генно-терапевтических субстанций, клеток органов и тканей человека.

Или способ использования каждой из созданных и представленных в линейке биологически активных генно-терапевтических субстанций для коррекции патологических состояний клеток органов и тканей и/или органов и тканей человека, связанных с количественным снижением белка рецептора II типа трансформирующего фактора роста бетта, заключается во введении одной из созданных биологически активных генно-терапевтической субстанций, выбранной именно для данного пациента на основе предварительного эксперимента по определению наиболее эффективного варианта из созданных и представленных в линейке биологически активных генно-терапевтических субстанций, в органы и ткани этого пациента, и/или во введении аутологичных клеток пациента, трансфицированных одной из созданных биологически активных генно-терапевтической субстанций, выбранной именно для данного пациента на основе предварительного эксперимента по определению наиболее эффективного варианта из созданных и представленных в линейке биологически активных генно-терапевтических субстанций, в органы и ткани этого пациента.

Перечень фигур

На фиг. 1

Представлена нуклеотидная последовательность немодифицированной кДНК гена TGFBR2, последовательность которой идентична приводимой в базе данных GenBank под номером NM_001024847.2 TGFBR2 SEQ ID No: 1.

На фиг. 2

Представлена нуклеотидная последовательность модифицированной кДНК гена TGFBR2, SEQ ID No: 2, которая

содержит 3 нуклеотидных замены G→C в позициях 436, 475, 1075; 1 нуклеотидную замену T→G в позиции 439, не приводящие к изменениям в аминокислотной последовательности белка рецептора II типа трансформирующего фактора роста бетта.

На фиг. 3

Представлена нуклеотидная последовательность модифицированной кДНК гена TGFBR2, SEQ ID No: 3, которая

содержит 6 нуклеотидных замен G→C в позициях 436, 451, 475, 1075, 1147, 1384; 1 нуклеотидную замену T→G в позиции 439, не приводящие к изменениям в аминокислотной последовательности белка рецептора II типа трансформирующего фактора роста бетта.

На фиг. 4

Представлена нуклеотидная последовательность модифицированной кДНК гена TGFBR2, SEQ ID No: 4, которая

содержит 8 нуклеотидных замен G→C в позициях 436, 451, 475, 1075, 1147, 1384, 1402, 1471; 1 нуклеотидную замену T→G в позиции 439, не приводящие к изменениям в аминокислотной последовательности белка рецептора II типа трансформирующего фактора роста бетта.

На фиг. 5

Представлена нуклеотидная последовательность модифицированной кДНК гена TGFBR2, SEQ ID No: 5, которая

содержит 9 нуклеотидных замен G→C в позициях 436, 451, 475, 1075, 1147, 1384, 1402, 1471, 2101; 2 нуклеотидных замены T→G в позициях 439, 1666; 2 нуклеотидных замены A→G в позициях 1942, 1948, не приводящие к изменениям в аминокислотной последовательности белка рецептора II типа трансформирующего фактора роста бетта.

На фиг. 6

Представлена нуклеотидная последовательность модифицированной кДНК гена TGFBR2, SEQ ID No: 6, которая

содержит 11 нуклеотидных замен G→C в позициях 436, 451, 475, 1075, 1147, 1384, 1402, 1471, 2005, 2101, 2116; 3 нуклеотидных замены T→G в позициях 439, 1666, 2041; 2 нуклеотидных замены A→G в позициях 1942, 1948, не приводящие к изменениям в аминокислотной последовательности белка рецептора II типа трансформирующего фактора роста бетта.

На фиг. 7

Представлена нуклеотидная последовательность модифицированной кДНК гена TGFBR2, SEQ ID No: 7, которая

не содержит нетранслируемые 5' и 3' области гена и содержит 11 нуклеотидных замен G→C в позициях 436, 451, 475, 1075, 1147, 1384, 1402, 1471, 2005, 2101, 2116; 3 нуклеотидных замены T→G в позициях 439, 1666, 2041; 2 нуклеотидных замены A→G в позициях 1942, 1948, не приводящие к изменениям в аминокислотной последовательности белка рецептора II типа трансформирующего фактора роста бетта.

На фиг. 8

С целью последующего корректного определения генно-терапевтического эффекта после трансфекцей фибробластов биологически активной генно-терапевтической субстанцией с кДНК гена TGFBR2 проводили анализ эндогенной экспрессии гена TGFBR2 в культуре первичных фибробластов. На фигуре представлены графики накопления продуктов полимеразной цепной реакции (ПЦР), соответствующих:

1 - кДНК гена TGFBR2, фибробласты со сниженной экспрессией гена TGFBR2

2 - кДНК гена TGFBR2, фибробласты с нормальной экспрессией гена TGFBR2

3 - кДНК гена В2М, фибробласты со сниженной экспрессией гена TGFBR2

4 - кДНК гена В2М, фибробласты с нормальной экспрессией гена TGFBR2

В качестве референтного гена использовали ген В2М (Бетта-2-микроглобулин) приведенного в базе данных GenBank под номером NM 004048.2.

На фиг. 9

С целью подтверждения увеличения экспрессии гена TGFBR2 в клеточной культуре фибробластов со сниженной экспрессией гена TGFBR2 при трансфекции данных клеток биологически активной генно-терапевтической субстанцией с кДНК гена TGFBR2 представлены графики накопления ПЦР-продуктов, соответствующих:

1 - кДНК гена TGFBR2 в фибробластах с нормальной экспрессией гена TGFBR2,

2 - кДНК гена TGFBR2 в фибробластах со сниженной экспрессией гена TGFBR2 до трансфекции БАГТС с кДНК гена TGFBR2

3 - кДНК гена TGFBR2 в фибробластах со сниженной экспрессией гена TGFBR2 после трансфекции БАГТС с кДНК гена TGFBR2

4 - кДНК гена TGFBR2 в фибробластах со сниженной экспрессией гена TGFBR2 после трансфекции вектором без кДНК гена TGFBR2

5 - кДНК гена В2М в фибробластах с нормальной экспрессией гена TGFBR2,

6 - кДНК гена В2М в фибробластах со сниженной экспрессией гена TGFBR2 до трансфекции БАГТС с кДНК гена TGFBR2

7 - кДНК гена В2М в фибробластах со сниженной экспрессией гена TGFBR2 после трансфекции БАГТС с кДНК гена TGFBR2

8 - кДНК гена В2М в фибробластах со сниженной экспрессией гена TGFBR2 после трансфекции вектором без кДНК гена TGFBR2

Из графиков следует, что в случае трансфекции вектором без вставки кДНК гена TGFBR2 уровень кДНК гена TGFBR2 в фибробластах не изменился, а в случае трансфекции вектором с кДНК TGFBR2 - уровень кДНК фибробластов со сниженной экспрессией гена TGFBR2 многократно увеличился (до уровня выше, чем уровень кДНК гена TGFBR2 в нормальных фибробластах).

На фиг. 10

С целью подтверждения увеличения количества белка рецептора II типа трансформирующего фактора роста бетта в клеточной культуре фибробластов с нормальной экспрессией гена TGFBR2 при трансфекции данных клеток биологически активной генно-терапевтической субстанцией содержащей кДНК гена TGFBR2 представлен график изменения количества белка рецептора II типа трансформирующего фактора роста бетта нетрансфицированных фибробластов (культура A), трансфицированных вектором pCDNA 3.1 (+) не содержащим кДНК TGFBR2 (культура B) и трансфицированных биологически активной генно-терапевтической субстанцией на базе генетической конструкции pCDNA 3.1-TGFBR2 SEQ ID No: 1 (культура С). Из графика следует, что при трансфекции фибробластов биологически активной генно-терапевтической субстанцией с кДНК гена TGFBR2 происходит увеличение количества белка рецептора II типа трансформирующего фактора роста бетта в клеточном лизате.

На фиг. 11

С целью подтверждения увеличения количества белка рецептора II типа трансформирующего фактора роста бетта в коже человека при введении в кожу клеточной культуры фибробластов, трансфицированной биологически активной генно-терапевтической субстанцией представлен анализ изменения количества белка рецептора II типа трансформирующего фактора роста бетта в коже пациентов. При этом пациентам вводили три варианта культуры аутологичных фибробластов - нетрансфицированные (А), трансфицированные вектором pCMV6-XL5 (Б) и трансфицированные биологически активной генно-терапевтической субстанцией на базе pCMV6-TGFBR2 SEQ ID No: 7 (С) - в кожу предплечья. Также анализировали количественный уровень белка рецептора II типа трансформирующего фактора роста бетта в интактной коже. Показано повышение количества белка рецептора II типа трансформирующего фактора роста бетта в коже пациента в области введения фибробластов, трансфицированных биологически активной генно-терапевтической субстанцией кДНК гена TGFBR2 (С).

На фиг. 12

С целью подтверждения увеличения количества белка рецептора II типа трансформирующего фактора роста бетта до различного индивидуального уровня в клеточных культурах фибробластов пациентов при трансфекции данных клеток биологически активными генно-терапевтическими субстанциями с модифицированными и нативной кДНК гена TGFBR2 в зависимости от наличия и типа в них той или иной модификации кДНК гена TGFBR2 представлен анализ изменения количественного уровня белка рецептора II типа трансформирующего фактора роста бетта в культурах фибробластов кожи человека в зависимости от наличия и типа модификаций в кДНК гена TGFBR2, используемой для трансфекции фибробластов.

Культуры фибробластов 29 пациентов делили на 8 частей каждую с (А) по (Н); первые части (А) клеточных культур пациентов трансфицировали биологически активной генно-терапевтической субстанцией pCMV6-TGFBR2 SEQ ID No: 1, части (В) трансфицировали биологически активной генно-терапевтической субстанцией pCMV6-TGFBR2 SEQ ID No: 2, части (С) трансфицировали биологически активной генно-терапевтической субстанцией pCMV6-TGFBR2 SEQ ID No: 3, части (D) трансфицировали биологически активной генно-терапевтической субстанцией pCMV6-TGFBR2 SEQ ID No: 4, части (E) трансфицировали биологически активной генно-терапевтической субстанцией pCMV6-TGFBR2 SEQ ID No: 5, части (F) трансфицировали биологически активной генно-терапевтической субстанцией pCMV6-TGFBR2 SEQ ID No: 6, части (G) трансфицировали биологически активной генно-терапевтической субстанцией pCMV6-TGFBR2 SEQ ID No: 7, части (H) трансфицировали векторной плазмидой, не содержащей кДНК гена TGFBR2.

По итогам анализа количественного уровня белка рецептора II типа трансформирующего фактора роста бетта выбрали показатели, касательно каждой части клеточной культуры от каждого пациента, продемонстрировавшие максимальное количество белка рецептора II типа трансформирующего фактора роста бетта и объединили их в семь групп, исходя из следующего критерия:

В группе 1 максимальное количество белка рецептора II типа трансформирующего фактора роста бетта наблюдалась при трансфекции pCMV6-TGFBR2 SEQ ID No: 1,

в группе 2 максимальное количество белка рецептора II типа трансформирующего фактора роста бетта наблюдалась при трансфекции pCMV6-TGFBR2 SEQ ID No: 2,

в группе 3 максимальное количество белка рецептора II типа трансформирующего фактора роста бетта наблюдалась при трансфекции pCMV6-TGFBR2 SEQ ID No: 3,

в группе 4 максимальное количество белка рецептора II типа трансформирующего фактора роста бетта наблюдалась при трансфекции pCMV6-TGFBR2 SEQ ID No: 4,

в группе 5 максимальное количество белка рецептора II типа трансформирующего фактора роста бетта наблюдалась при трансфекции pCMV6-TGFBR2 SEQ ID No: 5,

в группе 6 максимальное количество белка рецептора II типа трансформирующего фактора роста бетта наблюдалась при трансфекции pCMV6-TGFBR2 SEQ ID No: 6,

в группе 7 максимальное количество белка рецептора II типа трансформирующего фактора роста бетта наблюдалась при трансфекции pCMV6-TGFBR2 SEQ ID No: 7.

Ни в одной из клеточных культур не наблюдалось того, что максимальное количество белка рецептора II типа трансформирующего фактора роста бетта присутствует при трансфекции вектором без вставки кДНК гена TGFBR2.

На фигуре 12 для каждой группы клеточных культур приведены диаграммы показателей концентрации белка рецептора II типа трансформирующего фактора роста бетта (усредненных в рамках группы, в случае, если в группу входит более одной клеточной культуры) применительно ко всем, участвующим в эксперименте активным генно-терапевтическим субстанциям, после трансфекции этих клеточных культур активными генно-терапевтическими субстанциями, содержащими модифицированные и нативную кДНК гена TGFBR2.

Из фигуры следует, что достижение максимального количества белка рецептора II типа трансформирующего фактора роста бетта в культурах фибробластов кожи различных пациентов при их трансфекции биологически активными генно-терапевтическими субстанциями, связано с индивидуальными особенностями пациентов и зависит от наличия и типа модификаций в кДНК гена TGFBR2, входящих в биологически активные генно-терапевтические субстанции.

Каждая биологически активная генно-терапевтическая субстанция из линейки биологически активных генно-терапевтических субстанций является эффективной в некоторой значительной группе пациентов. Следовательно для выбора наиболее эффективной биологически активной генно-терапевтической субстанции из линейки биологически активных генно-терапевтических субстанций для терапевтических целей необходимо предварительное персонализированное исследование пациента.

Обозначения:

части клеточных культур, трансфицированных БАГТС TGFBR2 SEQ ID No: 1 (А)

части клеточных культур, трансфицированных БАГТС TGFBR2 SEQ ID No: 2 (В)

части клеточных культур, трансфицированных БАГТС TGFBR2 SEQ ID No: 3 (С)

части клеточных культур, трансфицированных БАГТС TGFBR2 SEQ ID No: 4 (D)

части клеточных культур, трансфицированных БАГТС TGFBR2 SEQ ID No: 5 (Е)

части клеточных культур, трансфицированных БАГТС TGFBR2 SEQ ID No: 6 (F)

части клеточных культур, трансфицированных БАГТС TGFBR2 SEQ ID No: 7 (G)

части клеточных культур, трансфицированных плацебо (H)

На фиг. 13

С целью подтверждения увеличения экспрессии гена TGFBR2 в клеточной культуре кератоцитов и эпителиальных клеток глаза при трансфекции данных клеток биологически активной генно-терапевтической субстанцией с кДНК гена TGFBR2 приведены графики накопления ПЦР-продуктов, соответствующих:

1 - кДНК гена TGFBR2, кератоциты до трансфекции

2 - кДНК гена TGFBR2, эпителий роговицы до трансфекции

3 - кДНК гена TGFBR2, кератоциты после трансфекции

4 - кДНК гена TGFBR2, эпителий роговицы после трансфекции

5 - кДНК гена В2М, кератоциты до трансфекции

6 - кДНК гена В2М, эпителий роговицы до трансфекции

7 - кДНК гена В2М, кератоциты после трансфекции

8 - кДНК гена В2М, эпителий роговицы после трансфекции

Ген В2М использовали в качестве референтного.

Из фигуры следует, что в результате трансфекции уровень специфической кДНК гена TGFBR2 в культуре кератоцитов и в культуре эпителия многократно вырос.

На фиг. 14

С целью подтверждения увеличения экспрессии гена TGFBR2 в клеточной культуре хондробластов при трансфекции данных клеток биологически активной генно-терапевтической субстанцией с кДНК гена TGFBR2 приведены графики накопления ПЦР-продуктов, соответствующих:

1 - кДНК гена TGFBR2, до трансфекции

2 - кДНК гена TGFBR2, после трансфекции

3 - кДНК гена В2М, до трансфекции

4 - кДНК гена В2М, после трансфекции

Ген В2М использовали в качестве референтного. Из фигуры следует, что в результате трансфекции уровень специфической кДНК гена TGFBR2 вырос многократно.

На фиг. 15

С целью подтверждения увеличения количества белка рецептора II типа трансформирующего фактора роста бетта в коже человека при введении в кожу биологически активной генно-терапевтической субстанции представлен анализ изменения количественного уровня белка рецептора II типа трансформирующего фактора роста бетта в коже. При этом пациенту вводили биологически активную генно-терапевтическую субстанцию, содержащую векторную плазмиду с кДНК гена TGFBR2 pCMV6-TGFBR2 SEQ ID No: 4 (В) и параллельно вводили плацебо, представляющее собой комбинацию векторной плазмиды pCMV-XL5 не содержащей кДНК гена TGFBR2 с транспортной молекулой (А) - в кожу предплечья. Показано увеличение количества белка рецептора II типа трансформирующего фактора роста бетта в биоптате кожи пациента 1B, которому вводились биологически активная генно-терапевтическая субстанция, содержащая генетическую конструкцию с кДНК гена TGFBR2, что говорит об эффективности биологически активной генно-терапевтической субстанции.

Обозначения:

На фиг. 16

С целью подтверждения увеличения количества белка рецептора II типа трансформирующего фактора роста бетта в хрящевой ткани человека при введении в хрящевую ткань биологически активной генно-терапевтической субстанции представлен анализ изменения количественного уровня белка рецептора II типа трансформирующего фактора роста бетта в хрящевой ткани. При этом пациенту вводили биологически активную генно-терапевтическую субстанцию, содержащую векторную плазмиду с кДНК гена TGFBR2 pCDNA 3.1 TGFBR2 SEQ ID No: 5 (В) и параллельно вводили плацебо pCDNA 3.1(+), представляющее собой комбинацию векторной плазмиды не содержащей кДНК гена TGFBR2 с транспортной молекулой (А) - в хрящевую ткань.

Показано увеличение количественного уровня белка рецептора II типа трансформирующего фактора роста бетта в лизате биоптата хрящевой ткани пациента 1B, которому вводились биологически активная генно-терапевтическая субстанция, содержащая генетическую конструкцию с кДНК гена TGFBR2, что говорит об эффективности биологически активной генно-терапевтической субстанции.

Обозначения:

На фиг. 17

С целью подтверждения увеличения количества белка рецептора II типа трансформирующего фактора роста бетта в мышечной ткани человека при введении в мышечную ткань биологически активной генно-терапевтической субстанции представлен анализ изменения количества белка рецептора II типа трансформирующего фактора роста бетта в мышечной ткани. При этом пациенту вводили биологически активную генно-терапевтическую субстанцию, содержащую векторную плазмиду с кДНК гена TGFBR2 - pCMV6-Kan/Neo TGFBR2 SEQ ID No: 6 (В) и параллельно вводили плацебо pCMV6-Kan/Neo, представляющее собой комбинацию векторной плазмиды не содержащей кДНК гена TGFBR2 с транспортной молекулой (А) - в мышечную ткань в зоне предплечья. Показано увеличение количества белка рецептора II типа трансформирующего фактора роста бетта в биоптате мышечной ткани пациента 1B, которому вводились биологически активная генно-терапевтическая субстанция, содержащая генетическую конструкцию с кДНК гена TGFBR2, что говорит об эффективности биологически активной генно-терапевтической субстанции.

Обозначения:

На фиг. 18

С целью подтверждения увеличения количества белка рецептора II типа трансформирующего фактора роста бетта до различного индивидуального уровня при введении в кожу пациентов биологически активных генно-терапевтических субстанций с модифицированными и нативной кДНК гена TGFBR2 анализировали количественный уровень белка рецептора II типа трансформирующего фактора роста бетта в коже человека в зависимости от наличия и типа модификаций в кДНК гена TGFBR2.

Каждому из 22-х пациентов, отобранных в случайном порядке, вводили в кожу предплечья 7 биологически активных генно-терапевтических субстанций pCMV6 - SEQ ID No: 1, pCMV6 - SEQ ID No: 2, pCMV6 - SEQ ID No: 3, pCMV6 - SEQ ID No: 4, pCMV6 - SEQ ID No: 5, pCMV6 - SEQ ID No: 6, pCMV6 - SEQ ID No: 7, и плацебо pCMV6 - XL5.

По итогам анализа количества белка рецептора II типа трансформирующего фактора роста бетта в биоптатах выбрали показатели, касательно каждого биоптата от каждого пациента, продемонстрировавшие максимальные количественные уровни белка рецептора II типа трансформирующего фактора роста бетта и объединили их в семь групп, исходя из следующего критерия:

В группе 1 максимальное количество белка рецептора II типа трансформирующего фактора роста бетта наблюдалась при введении pCMV6-TGFBR2 SEQ ID No: 1,

в группе 2 максимальное количество белка рецептора II типа трансформирующего фактора роста бетта наблюдалась при введении pCMV6-TGFBR2 SEQ ID No: 2,

в группе 3 максимальное количество белка рецептора II типа трансформирующего фактора роста бетта наблюдалась при введении pCMV6-TGFBR2 SEQ ID No: 3,

в группе 4 максимальное количество белка рецептора II типа трансформирующего фактора роста бетта наблюдалась при введении pCMV6-TGFBR2 SEQ ID No: 4,

в группе 5 максимальное количество белка рецептора II типа трансформирующего фактора роста бетта наблюдалась при введении pCMV6-TGFBR2 SEQ ID No: 5,

в группе 6 максимальное количество белка рецептора II типа трансформирующего фактора роста бетта наблюдалась при введении pCMV6-TGFBR2 SEQ ID No: 6,

в группе 7 максимальное количество белка рецептора II типа трансформирующего фактора роста бетта наблюдалась при введении pCMV6-TGFBR2 SEQ ID No: 7.

Ни в одном из биоптатов не наблюдалось того, что максимальное количество белка рецептора II типа трансформирующего фактора роста бетта присутствует в случае введения плацебо.

На фигуре 18 для каждой группы биоптатов приведены диаграммы показателей концентрации белка рецептора II типа трансформирующего фактора роста бетта (усредненных в рамках группы, в случае, если в группу входит более одного биоптата) применительно ко всем, участвующим в эксперименте активным генно-терапевтическим субстанциям, после введения пациентам этих активных генно-терапевтических субстанций, содержащих модифицированные и нативную кДНК гена TGFBR2.

Из данного примера следует, что достижение максимального количества белка рецептора II типа трансформирующего фактора роста бетта в биоптатах кожи различных пациентов при введении им в кожу биологически активных генно-терапевтических субстанций, связано с индивидуальными особенностями пациентов и зависит от наличия и типа модификаций в кДНК гена TGFBR2, входящих в биологически активные генно-терапевтические субстанции.

Каждая биологически активная генно-терапевтическая субстанция из линейки биологически активных генно-терапевтических субстанций является эффективной в некоторой значительной группе пациентов. Следовательно, для выбора наиболее эффективной биологически активной генно-терапевтической субстанции из линейки биологически активных генно-терапевтических субстанций для терапевтических целей, необходимо предварительное персонализированное исследование пациента.

Обозначения:

биоптаты пациентов после введения БАГТС TGFBR2 SEQ ID No: 1 (А)

биоптаты пациентов после введения БАГТС TGFBR2 SEQ ID No: 2 (В)

биоптаты пациентов после введения БАГТС TGFBR2 SEQ ID No: 3 (С)

биоптаты пациентов после введения БАГТС TGFBR2 SEQ ID No: 4 (D)

биоптаты пациентов после введения БАГТС TGFBR2 SEQ ID No: 5 (Е)

биоптаты пациентов после введения БАГТС TGFBR2 SEQ ID No: 6 (F)

биоптаты пациентов после введения БАГТС TGFBR2 SEQ ID No: 7 (G)

биоптаты пациентов после введения плацебо (H) На фиг. 19

С целью определения наиболее эффективной применительно к конкретному пациенту биологически активной генно-терапевтической субстанции анализировали количественный уровень белка рецептора II типа трансформирующего фактора роста бетта в клеточных лизатах фибробластов этого пациента, трансфицированных разными генетическими конструкциями, содержащими нативную или модифицированные кДНК гена TGFBR2.

По итогам анализа количества белка рецептора II типа трансформирующего фактора роста бетта в культуре фибробластов пациента выделили вариант биологически активной генно-терапевтической субстанции, при трансфекции которой выявляется максимальная концентрация белка рецептора II типа трансформирующего фактора роста бетта в лизате клеточной культуры. В данном эксперименте максимальная концентрация белка рецептора II типа трансформирующего фактора роста бетта в лизате наблюдается при трансфекции биологически активной генно-терапевтической субстанцией на базе pCMV6 TGFBR2 SEQ ID No: 5, содержащей модифицированную кДНК TGFBR2, что показано на фигуре 19.

Таким образом, выбрана наиболее эффективная применительно к данному пациенту биологически активная генно-терапевтическая субстанция для последующей трансфекции клеток пациента в рамках терапевтической процедуры. Обозначения:

1 - клеточный лизат после трансфекции БАГТС TGFBR2 SEQ ID No: 1 (А)

2 - клеточный лизат после трансфекции БАГТС TGFBR2 SEQ ID No: 2 (В)

3 - клеточный лизат после трансфекции БАГТС TGFBR2 SEQ ID No: 3 (С)

4 - клеточный лизат после трансфекции БАГТС TGFBR2 SEQ ID No: 4 (D)

5 - клеточный лизат после трансфекции БАГТС TGFBR2 SEQ ID No: 5 (Е)

6 - клеточный лизат после трансфекции БАГТС TGFBR2 SEQ ID No: 6 (F)

7 -