Линейка биологически активных генно-терапевтических субстанций на основе гена sod1 для коррекции патологических состояний клеток органов и тканей и органов и тканей человека, связанных с оксидативным стрессом, способ получения и использования

Линейка биологически активных генно-терапевтических субстанций на основе гена sod1 для коррекции патологических состояний клеток органов и тканей и органов и тканей человека, связанных с оксидативным стрессом, способ получения и использования

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область, к которой относится изобретение

Изобретение относится к молекулярной биологии, биотехнологии, генной инженерии и медицине и может быть использовано для усиления защиты клеток различных органов и тканей, а также собственно органов и тканей человека от оксидативного стресса, в частности, в терапевтических целях.

Предшествующий уровень.

Оксидативный стресс - нарушение баланса между процессами образования активных форм кислорода (свободных радикалов) и процессами их нейтрализации. Он приводит к повреждениям клеток, тканей и органов живого организма, в частности, к преждевременному старению кожи, поскольку из всех систем живого организма именно кожа наиболее подвержена воздействию активных форм кислорода.

Кроме того наиболее предрасположены к оксидативному стрессу дыхательная система (воздействие большого количества кислорода), мозг (высокая метаболическая активность и низкий уровень эндогенных антиоксидантов), глаза (постоянное УФ-облучение), система кровообращения (колебания уровней кислорода и оксида азота) и репродуктивная система (высокая метаболическая активность сперматозоидов).

Активные формы кислорода могут быть эндогенными, т.е. продуктами различных метаболических процессов в организме. Например, наиболее распространенный окислитель в организме - гидроксид-анион (ОН-) - образуется при многих аэробных процессах. Также активные формы кислорода могут иметь экзогенное происхождение. Они образуются под воздействием ультрафиолетового, ионизирующего и электромагнитного излучения, а также в результате взаимодействия с окислителями из окружающей среды, например, с озоном.

Другой распространенной активной формой кислорода является супероксид-анион (O₂.-). В отличие от гидроксильного радикала, супероксид-анион менее активен, но обладает большим временем жизни. Кроме того, он сам может быть источником образования гидроксид-анионов. В нормальных условиях супероксид-анион, как и другие свободные радикалы, быстро нейтрализуется естественными антиоксидантами - внутриклеточными, мембранными и внеклеточными. К внутриклеточным антиоксидантам относятся белки супероксиддисмутазы, пероксидазы и белка каталазы.

Супероксиддисмутазы - супероксиддисмутаза-1 (цитоплазматическая, или Cu-Zn-содержащая) и супероксиддисмутаза-2 (митохондриальная, или Mn-содержащая) - катализируют превращение супероксид-аниона в кислород и перекись водорода, которая затем утилизируется глутатионпероксидазами и каталазой.

Следовательно, при пониженной активности супероксиддисмутазы или при повышенной скорости образования активных форм кислорода повышаются вероятность и интенсивность оксидативного повреждения клеток и тканей.

Для усиления нейтрализации действия активных форм кислорода и снижения влияния оксидативного стресса существует несколько подходов.

Известно использование органических веществ природного происхождения, обладающих антиоксидантной активностью. Этот принцип положен в основу при производстве косметических средств.

Так была предложена композиция внутреннего применения для коррекции гормонального старения кожи, содержащая гормоноподобное вещество растительного происхождения диосгенин из корня диоскореи, один или более антиоксидант, выбранный из витамина С, витамина Е, коэнзима Q10, а также - гиалуроновую кислоту (RU 2527344). Было показано, что вышеописанная композиция эффективно корректирует гормональное старение кожи, увеличивает плотность и тургор кожи за счет стимулирования выработки коллагено-эластиновых волокон и обеспечения антиоксидантной защиты. Недостаток данного подхода состоит в том, что эти вещества обладают краткосрочным действием и требуют постоянного применения, могут вызвать побочные явления, например, аллергическую реакцию, применение препаратов антиоксидантов дополняет антиоксидантные системы организма, но полностью не компенсирует их недостаточную работу.

Известно также использование в качестве лекарственных средств собственно белков-антиоксидантов.

Так в патенте US 6045809 для нейтрализации токсического действия активных форм кислорода было предложено использовать композиции фермента-антиоксиданта супероксиддисмутазы и, по крайней мере, одного из липидов (на примере керамидов) или белков (на примере проламинов). Новые фармацевтические композиции предназначены для перорального введения. Недостаток данного подхода состоит в том, что при данном методе введения желаемый терапевтический эффект может оказаться недостигнутым, а также - при недостаточной степени очистки возможны побочные реакции.

В патенте US 8916373 было предложено использовать рекомбинантные модифицированные варианты супероксиддисмутазы-1, у которых за счет созданных мутаций в нуклеотидной последовательности произошли изменения аминокислотной структуры белка (степень идентичности модифицированных вариантов белка и нативного белка не менее 80%). Рекомбинантными плазмидами были транфицированы культуры эмбриональных клеток почек человека (HEK клетки, линия HEK293FT) или эмбриональных фибробластов мыши (3T3s, линии NIH 3T3), в которых наличие модифицированных белков определяли методом иммуноблоттинга, после чего определяли их ферментативную активность. Было выявлено, что активность некоторых вариантов увеличилась более чем в 3 раза по сравнению с белком дикого типа. Недостатком данного подхода является то, что внесение модификаций в аминокислотную последовательность природного белка может привести к образованию структур, являющихся антигенными детерминантами.

За прототип авторами было принято решение по патенту US 8926965, в котором предлагается использовать белок рекомбинантной супероксиддисмутазы-2 для снижения оксидативного стресса в клетках, тканях и органах.

Марганец зависимая супероксиддисмутаза-2, локализованная в митохондриях, является важным ферментом, который контролирует уровень свободных радикалов в клетке. Поскольку митохондрия серьезно подвержена оксидантной нагрузке, функциональные особенности супероксиддисмутазы-2 актуальны для применения, поскольку способны компенсировать или усугублять оксидативный стресс (Green D.R., Reed J.С, 1998). Многочисленные исследования подтверждают, что митохондриальная супероксиддисмутаза-2 играет важную роль в предохранении клетки от оксидативного стресса. В патенте US 8926965 было предложено использовать рекомбинантный модифицированный вариант супероксиддисмутазы-2, у которой за счет созданных мутаций в нуклеотидной последовательности произошли изменения аминокислотной структуры белка по меньшей мере по К53 и К89 (степень идентичности модифицированного варианта белка и нативного белка не менее 95%). Нуклеотидная последовательность, кодирующая модифицированный белок, была введена в клетку-хозяин (клетку млекопитающего, например, человека, приматов, грызунов и др., клетку насекомого, дрожжевую клетку, прокариотические клетки, например бактериальные) с помощью рекомбинантного вектора экспрессии, который обеспечивал трансляцию белка. Было показано, что ферментативная активность модифицированной супероксиддисмутазы-2 более чем в 10 раз выше, чем у немодифицированного белка. Также было заявлено, что модифицированный пептид можно использовать для уменьшения оксидативного стресса и/или окислительного повреждения клетки как собственно лекарственное средство, так и в композиции с другими активными и вспомогательными компонентами.

Недостатком данного подхода является высокая стоимость получения чистого рекомбинантного белка, более частое его введения при терапии (что увеличивает стоимость терапии и повышает риск побочных явлений) и сложность внутриклеточной доставки препарата. Кроме того, внесение модификаций в аминокислотную последовательность природного белка может привести к образованию структур, являющихся антигенными детерминантами. Также при создании терапевтического средства по прототипу не учтены индивидуальные характеристики пациента.

Раскрытие изобретения

Задачей данного изобретения является создание линейки высокоэффективных биологически активных генно-терапевтических субстанций, способных препятствовать снижению антиоксидантной активности белка супероксиддисмутазы-1 в клетках органов и тканей и/или органах и тканях человека путем повышения уровня экспрессии гена SOD1 в клетках органов и тканей и/или органах и тканях человека, за счет повышения активности белка супероксиддисмутазы-1, ответственного за поддержание окислительно-восстановительного баланса в клетках органов и тканей и/или органах и тканях организма с учетом индивидуальных особенностей пациента.

Указанная задача решается за счет того, что создана линейка биологически активных генно-терапевтических субстанций для коррекции патологических состояний клеток органов и тканей и/или органов и тканей человека, связанных с оксидативным стрессом, каждая из которых представляет собой генетическую конструкцию на основе векторной плазмиды, содержащей нативную кДНК гена SOD1 SEQ ID No: 1 или одну из модифицированных кДНК гена SOD1, и содержащей также регуляторные элементы, обеспечивающие транскрипцию этой последовательности в эукариотических клетках, в частности в клетках органов и тканей человека и способную обеспечить высокий уровень экспрессии гена SOD1 и увеличить активность белка супероксиддисмутазы-1 в клетках органов и тканей и/или органах и тканях человека, в частности, в гемопоэтических клетках, или гепатоцитах, или мезенхимальных стволовых клетках, или хондробластах, или клетках поджелудочной железы, например, в клетках панкреатических островков, или миоцитах или фибробластах кожи, или кератоцитах, или эпителиальных клетках роговицы, или в нейронах, ганглиях, Шванновских клетках, астроцитах, олигодендроцитах, микроглии, или в сперматозоидах, или в нефронах, или эндотелиальных клетках, или эпителиальных клетках в сочетании с транспортной молекулой или без нее при трансфекции этими биологически активными генно-терапевтическими субстанциями клеток органов и тканей человека и/или в органах и тканях человека в частности, в коже, суставах, печени, надпочечниках, почках, головном и спинном мозге, легких, сердце, сосудах, желудочно-кишечном тракте, простате, поджелудочной железе, глазе, роговице, слизистой оболочке, хрящевой ткани, мышечной ткани в сочетании с транспортной молекулой или без нее при введении этих биологически активных генно-терапевтических субстанций в органы и ткани человека. При этом генетическая конструкция с кДНК гена SOD1 содержит последовательность нуклеотидов, включающую в себя белок-кодирующую область кДНК гена SOD1, которая несет модификации не затрагивающие структуру белка супероксиддисмутазы-1, а именно: делеции 5' нетранслируемых областей или делеции 3'-нетранслируемых областей, или нуклеотидные замены, не приводящие к аминокислотным заменам или обрыву аминокислотной цепи, или комбинации вышеперечисленных модификаций и, соответственно, не влияющие на кодируемую этой последовательностью аминокислотную последовательность. В качестве модифицированной кДНК гена SOD1 используют SEQ ID No: 2. Или в качестве модифицированной кДНК гена SOD1 используют SEQ ID No: 3. Или в качестве модифицированной кДНК гена SOD1 используют SEQ ID No: 4. Или в качестве модифицированной кДНК гена SOD1 используют SEQ ID No: 5. Или в качестве модифицированной кДНК гена SOD1 используют SEQ ID No: 6. Или в качестве модифицированной кДНК гена SOD1 используют SEQ ID No: 7. При этом в качестве транспортной молекулы используют липосомы, или дендримеры 5-го и выше поколений, или амфифильные блок-сополимеры.

Способ получения биологически активной генно-терапевтической субстанции для коррекции патологических состояний клеток органов и тканей и/или органов и тканей человека, связанных с оксидативным стрессом из созданной линейки заключающийся в том, что получают кДНК гена SOD1, затем помещают кДНК в векторную плазмиду, способную обеспечить высокий уровень экспрессии этой кДНК в клетках различных органов и тканей человека, наращивают и выделяют необходимое количество генетической конструкции, затем комбинируют генетическую конструкцию с транспортной молекулой для трансфекции полученной биологически активной генно-терапевтической субстанцией клеток органов и тканей и/или введения полученной биологически активной генно-терапевтической субстанции в органы и ткани человека.

Или способ получения каждой биологически активной генно-терапевтической субстанции для коррекции патологических состояний клеток различных органов и тканей человека, связанных с оксидативным стрессом из созданной линейки, заключающийся в том, что получают кДНК гена SOD1, модифицируют его по п.п. 3, или 4, или 5 или 6 или 7 или 8, затем помещают модифицированную кДНК в векторную конструкцию, способную обеспечить высокий уровень экспрессии этой кДНК в клетках различных органов и тканей человека, наращивают и выделяют необходимое количество генетической конструкции, затем комбинируют генетическую конструкцию с транспортной молекулой для трансфекции полученной биологически активной генно-терапевтической субстанцией клеток органов и тканей и/или введения полученной биологически активной генно-терапевтической субстанции в органы и ткани человека.

Способ использования каждой из созданных и представленных в линейке биологически активных генно-терапевтических субстанций для коррекции патологических состояний клеток органов и тканей и/или органов и тканей человека, связанных с оксидативным стрессом, заключается в трансфекции созданной биологически активной генно-терапевтической субстанцией, и выбранной из линейки с учетом индивидуальных особенностей каждого конкретного пациента на основе предварительного эксперимента по определению наиболее эффективного для пациента варианта из созданных и представленных в линейке биологически активных генно-терапевтических субстанций, клеток органов и тканей человека.

Или способ использования каждой из созданных и представленных в линейке биологически активных генно-терапевтических субстанций для коррекции патологических состояний клеток органов и тканей и/или органов и тканей человека, связанных с оксидативным стрессом, заключающийся во введении одной из созданных биологически активных генно-терапевтической субстанций, выбранной из линейки именно для данного пациента на основе предварительного эксперимента по определению наиболее эффективного для пациента варианта из созданных и представленных в линейке биологически активных генно-терапевтических субстанций, в органы и ткани этого пациента, и/или во введении аутологичных клеток пациента, трансфицированных одной из созданных биологически активных генно-терапевтической субстанций, выбранной именно для данного пациента на основе предварительного эксперимента по определению наиболее эффективного для пациента варианта из созданных и представленных в линейке биологически активных генно-терапевтических субстанций, в органы и ткани этого пациента.

Реализация изобретения

Перечень фигур

На фиг. 1

Представлена нуклеотидная последовательность немодифицированной кДНК гена SOD1, последовательность которой идентична приводимой в базе даных GenBank под номером NM_000454.4 - SOD1 SEQ ID No: 1.

На фиг. 2

Представлена нуклеотидная последовательность модифицированной кДНК гена SOD1, SEQ ID No: 2, которая

содержит 2 нуклеотидных замены G→C в позициях 154 и 157, не приводящие к изменениям в аминокислотной последовательности белка супероксиддисмутазы-1.

На фиг. 3

Представлена нуклеотидная последовательность модифицированной кДНК гена SOD1, SEQ ID No: 3, которая

содержит нуклеотидные замены G→C в позициях 154 и 157 и Т→С в позиции 334, не приводящие к изменениям в аминокислотной последовательности белка супероксиддисмутазы-1.

На фиг. 4

Представлена нуклеотидная последовательность модифицированной кДНК гена SOD1, SEQ ID No: 4, которая содержит нуклеотидные замены G→C в позициях 154 и 157, Т→С в позиции 334 и A→G в позиции 352, не приводящие к изменениям в аминокислотной последовательности белка супероксиддисмутазы-1.

На фиг. 5

Представлена нуклеотидная последовательность модифицированной кДНК гена SOD1, SEQ ID No: 5, которая содержит нуклеотидные замены G→C в позициях 154 и 157, Т→С в позиции 334, A→G в позиции 352 и T→G в позиции 580, не приводящие к изменениям в аминокислотной последовательности белка супероксиддисмутазы-1.

На фиг. 6

Представлена нуклеотидная последовательность модифицированной кДНК гена SOD1, SEQ ID No: 6, которая

содержит нуклеотидные замены G→C в позициях 154 и 157, Т→С в позиции 334, A→G в позиции 352, T→G в позиции 580 и A→G в позиции 595, не приводящие к изменениям в аминокислотной последовательности белка супероксиддисмутазы-1.

На фиг. 7

Представлена нуклеотидная последовательность модифицированной кДНК гена SOD1, SEQ ID No: 7, которая не содержит нетранслируемые 5' и 3' области гена и содержит нуклеотидные замены G→C в позициях 154 и 157, Т→С в позиции 334, A→G в позиции 352, T→G в позиции 580 и A→G в позиции 595, не приводящие к изменениям в аминокислотной последовательности белка супероксиддисмутазы-1.

На фиг. 8

С целью последующего корректного определения генно-терапевтического эффекта после трансфекции фибробластов биологически активной генно-терапевтической субстанции с кДНК гена SOD1 проводили анализ эндогенной экспрессии гена SOD1 в культуре первичных фибробластов. На фигуре представлены графики накопления продуктов полимеразной цепной реакции (ПЦР), соответствующих:

1 - кДНК гена SOD1, фибробласты со сниженной экспрессией гена SOD1

2 - кДНК гена SOD1, фибробласты с нормальной экспрессией гена SOD1

3 - кДНК гена В2М, фибробласты со сниженной экспрессией гена SOD1

4 - кДНК гена В2М, фибробласты с нормальной экспрессией гена SOD1

В качестве референтного гена использовали ген В2М (Бета-2-микроглобулин) приведенного в базе данных GenBank под номером NM 004048.2.

На фиг. 9

С целью подтверждения увеличения экспрессии гена SOD1 в клеточной культуре фибробластов со сниженной экспрессией гена SOD1 при трансфекции данных клеток биологически активной генно-терапевтической субстанцией с кДНК гена SOD1 представлены графики накопления ПЦР-продуктов, соответствующих:

1 - кДНК гена SOD1 в фибробластах с нормальной экспрессией гена SOD1,

2 - кДНК гена SOD1 в фибробластах со сниженной экспрессией гена SOD1 до трансфекции БАГТС с кДНК гена SOD1

3 - кДНК гена SOD1 в фибробластах со сниженной экспрессией гена SOD1 после трансфекции БАГТС с кДНК гена SOD1

4 - кДНК гена SOD1 в фибробластах со сниженной экспрессией гена SOD1 после трансфекции вектором без кДНК гена SOD1

5 - кДНК гена В2М в фибробластах с нормальной экспрессией гена SOD1,

6 - кДНК гена В2М в фибробластах со сниженной экспрессией гена SOD1 до трансфекции БАГТС с кДНК гена SOD1

7 - кДНК гена В2М в фибробластах со сниженной экспрессией гена SOD1 после трансфекции БАГТС с кДНК гена SOD1

8 - кДНК гена В2М в фибробластах со сниженной экспрессией гена SOD1 после трансфекции вектором без кДНК гена SOD1

Из графиков следует, что в случае трансфекции вектором без вставки кДНК гена SOD1 уровень кДНК гена SOD1 в фибробластах не изменился, а в случае трансфекции вектором с кДНК SOD1 - уровень кДНК фибробластов со сниженной экспрессией гена SOD1 многократно увеличился (до уровня выше, чем уровень кДНК гена SOD1 в нормальных фибробластах).

На фиг. 10

С целью подтверждения увеличения активности белка супероксиддисмутазы-1 в клеточной культуре фибробластов с нормальной экспрессией гена SOD1 при трансфекции данных клеток биологически активной генно-терапевтической субстанцией содержащим кДНК SOD1 представлен график изменения активности белка супероксиддисмутазы-1 в зависимости от разведения клеточного лизата нетрансфицированных фибробластов (культура А), трансфицированных вектором pCDNA 3.1(+) не содержащим кДНК SOD1 (культура В) и трансфицированных биологически активной генно-терапевтической субстанцией на базе вектора pCDNA 3.1, содержащего SOD1 SEQ ID No: 1 (культура С). Из графика следует, что при трансфекции фибробластов биологически активной генно-терапевтической субстанцией с кДНК гена SOD1 происходит увеличение активности супероксиддисмутазы-1 в клеточном лизате.

Обозначения:

культура А

культура В

культура С

На фиг. 11

С целью подтверждения увеличения активности супероксиддисмутазы-1 в коже человека при введении в кожу клеточной культуры фибробластов, трансфицированной биологически активной генно-терапевтической субстанцией представлен анализ изменения активности супероксиддисмутазы-1 в коже пациентов. При этом пациентам вводили три варианта культуры аутологичных фибробластов - нетрансфицированные (А), трансфицированные вектором pCMV6-XL5 (Б) и трансфицированные биологически активной генно-терапевтической субстанцией на базе pCMV6-SOD1 SEQ ID No: 7 (С) - в кожу предплечья. Также анализировали активность супероксиддисмутазы-1 в интактной коже. Показано повышение активности супероксиддисмутазы-1 в коже пациента в области введения фибробластов, трансфицированных биологически активной генно-терапевтической субстанцией кДНК гена SOD1. (C)

Обозначения:

культура А

культура В

культура С

контрольная биопсия

На фиг. 12

С целью подтверждения увеличения активности супероксиддисмутазы-1 до различного индивидуального уровня в клеточных культурах фибробластов пациентов при трансфекции данных клеток биологически активными генно-терапевтическими субстанциями с модифицированными и нативной кДНК гена SOD1 в зависимости от наличия и типа в них той или иной модификации кДНК гена SOD1 представлен анализ изменения активности супероксиддисмутазы-1 в культурах фибробластов кожи человека в зависимости от наличия и типа модификаций в кДНК гена SOD1, используемой для трансфекции фибробластов.

Культуры фибробластов 25 пациентов делили на 8 частей каждую с (А) по (Н); первые части (А) клеточных культур пациентов трансфицировали биологически активной генно-терапевтической субстанцией pCMV6-SOD1 SEQ ID No: 1, части (В) трансфицировали биологически активной генно-терапевтической субстанцией pCMV6-SOD1 SEQ ID No: 2, части (С) трансфицировали биологически активной генно-терапевтической субстанцией pCMV6-SOD1 SEQ ID No: 3, части (D) трансфицировали биологически активной генно-терапевтической субстанцией pCMV6-SOD1 SEQ ID No: 4, части (E) трансфицировали биологически активной генно-терапевтической субстанцией pCMV6-SOD1 SEQ ID No: 5, части (F) трансфицировали биологически активной генно-терапевтической субстанцией pCMV6-SOD1 SEQ ID No: 6, части (G) трансфицировали биологически активной генно-терапевтической субстанцией pCMV6-SOD1 SEQ ID No: 7, части (H) трансфицировали векторной плазмидой, не содержащей кДНК гена SOD1.

По итогам анализа уровня активности супероксиддисмутазы-1 выбрали показатели, касательно каждой части клеточной культуры от каждого пациента, продемонстрировавшие максимальные уровни активности супероксиддисмутазы-1 и объединили их в семь групп, исходя из следующего критерия:

В группе 1 максимальная активность белка супероксиддисмутазы-1 наблюдалась при трансфекции

pCMV6-SOD1 SEQ ID No: 1.

В группе 2 максимальная активность белка супероксиддисмутазы-1 наблюдалась при трансфекции

pCMV6-SOD1 SEQ ID No: 2.

В группе 3 максимальная активность белка супероксиддисмутазы-1 наблюдалась при трансфекции

pCMV6-SOD1 SEQ ID No: 3.

В группе 4 максимальная активность белка супероксиддисмутазы-1 наблюдалась при трансфекции

pCMV6-SOD1 SEQ ID No: 4

В группе 5 максимальная активность белка супероксиддисмутазы-1 наблюдалась при трансфекции

pCMV6-SOD1 SEQ ID No: 5,

В группе 6 максимальная активность белка супероксиддисмутазы-1 наблюдалась при трансфекции

pCMV6-SOD1 SEQ ID No: 6.

В группе 7 максимальная активность белка супероксиддисмутазы-1 наблюдалась при трансфекции

pCMV6-SOD1 SEQ ID No: 7.

Ни в одной из клеточных культур не наблюдалось того, что максимальная активность супероксиддисмутазы-1 присутствует при трансфекции вектором без вставки кДНК гена SOD1.

На фигуре 12 для каждой группы клеточных культур приведены диаграммы показателей ингибирования цветной реакции (усредненных в рамках группы, в случае, если в группу входит более одной клеточной культуры) применительно ко всем, участвующим в эксперименте активным генно-терапевтическим субстанциям, после трансфекции этих клеточных культур активными генно-терапевтическими субстанциями, содержащими модифицированные и нативную кДНК гена SOD1

Из фигуры следует, что достижение максимальной активности супероксиддисмутазы-1 в культурах фибробластов кожи различных пациентов при их трансфекции биологически активными генно-терапевтическими субстанциями, связан с индивидуальными особенностями пациентов и зависит от наличия и типа модификаций в кДНК гена SOD1, входящих в биологически активные генно-терапевтические субстанции.

Каждая биологически активная генно-терапевтическая субстанция из линейки биологически активных генно-терапевтических субстанций является эффективной в некоторой значительной группе пациентов. Следовательно для выбора наиболее эффективной биологически активной генно-терапевтической субстанции из линейки биологически активных генно-терапевтических субстанций для терапевтических целей необходимо предварительное персонализированное исследование пациента.

Обозначения:

части клеточных культур, трансфицированных БАГТС SOD1 SEQ ID No: 1(А)

части клеточных культур, трансфицированных БАГТС SOD1 SEQ ID No: 2(В)

части клеточных культур, трансфицированных БАГТС SOD1 SEQ ID No: 3(С)

части клеточных культур, трансфицированных БАГТС SOD1 SEQ ID No: 4(D)

части клеточных культур, трансфицированных БАГТС SOD1 SEQ ID No: 5(Е)

части клеточных культур, трансфицированных БАГТС SOD1 SEQ ID No: 6(F)

части клеточных культур, трансфицированных БАГТС SOD1 SEQ ID No: 7(G)

части клеточных культур, трансфицированных плацебо (Н)

На фиг. 13

С целью подтверждения увеличения экспрессии гена SOD1 в клеточной культуре кератоцитов и эпителиальных клеток глаза при трансфекции данных клеток биологически активной генно-терапевтической субстанцией с кДНК гена SOD1 приведены графики накопления ПЦР-продуктов, соответствующих:

1 - кДНК гена SOD1, кератоциты до трансфекции

2 - кДНК гена SOD1, эпителий роговицы до трансфекции

3 - кДНК гена SOD1, кератоциты после трансфекции

4 - кДНК гена SOD1, эпителий роговицы после трансфекции

5 - кДНК гена В2М, кератоциты до трансфекции

6 - кДНК гена В2М, эпителий роговицы до трансфекции

7 - кДНК гена В2М, кератоциты после трансфекции

8 - кДНК гена В2М, эпителий роговицы после трансфекции

Ген В2М использовали в качестве референтного.

Из фигуры следует, что в результате трансфекции уровень специфической кДНК гена SOD1 в культуре кератоцитов и в культуре эпителия многократно вырос.

На фиг. 14

С целью подтверждения увеличения экспрессии гена SOD1 в клеточной культуре хондробластов при трансфекции данных клеток биологически активной генно-терапевтической субстанцией с кДНК гена SOD1 приведены графики накопления ПЦР-продуктов, соответствующих:

1 - кДНК гена SOD1, до трансфекции

2 - кДНК гена SOD1, после трансфекции

3 - кДНК гена В2М, до трансфекции

4 - кДНК гена В2М, после трансфекции

Ген В2М использовали в качестве референтного.

Из фигуры следует, что в результате трансфекции уровень специфической кДНК гена SOD1 вырос многократно.

На фиг. 15

С целью подтверждения увеличения активности белка супероксиддисмутазы-1 в коже человека при введении в кожу биологически активной генно-терапевтической субстанции представлен анализ изменения активности белка супероксиддисмутазы-1 в коже. При этом пациенту вводили биологически активную генно-терапевтическую субстанцию, содержащую векторную плазмиду с кДНК гена SOD1 pCMV6-SOD1 SEQ ID No: 4(В) и параллельно вводили плацебо, представляющее собой комбинацию векторной плазмиды pCMV-XL5 не содержащей кДНК гена SOD1 с транспортной молекулой (А) - в кожу предплечья. Показано увеличение активности белка супероксиддисмутазы-1 в биоптате кожи пациента 1В, которому вводились биологически активная генно-терапевтическая субстанция, содержащая генетическую конструкцию с кДНК гена SOD1, что говорит об эффективности биологически активной генно-терапевтической субстанции.

Обозначения:

пациент 1А

пациент 1В

пациент 1В до введения БАГТС

На фиг. 16

С целью подтверждения увеличения активности супероксиддисмутазы-1 в слизистой оболочке рта человека при введении в слизистую оболочку рта биологически активной генно-терапевтической субстанции представлен анализ изменения активности супероксиддисмутазы-1 в слизистой оболочке рта. При этом пациенту вводили биологически активную генно-терапевтическую субстанцию, содержащую векторную плазмиду с кДНК гена SOD1 pCDNA 3.1 SOD1 SEQ ID No: 5(В) и параллельно вводили плацебо pCDNA 3.1(+), представляющее собой комбинацию векторной плазмиды не содержащей кДНК гена SOD1 с транспортной молекулой (А) - в слизистую оболочку рта.

Показано увеличение активности супероксиддисмутазы-1 в лизате биоптата слизистой оболочки рта пациента 1В, которому вводились биологически активная генно-терапевтическая субстанция, содержащая генетическую конструкцию с кДНК гена SOD1, что говорит об эффективности биологически активной генно-терапевтической субстанции.

Обозначения:

пациент 1А

пациент 1В

пациент 1В до введения БАГТС

На фиг. 17

С целью подтверждения увеличения активности супероксиддисмутазы-1 в мышечной ткани человека при введении в мышечную ткань биологически активной генно-терапевтической субстанции представлен анализ изменения активности супероксиддисмутазы-1 в мышечной ткани. При этом пациенту вводили биологически активную генно-терапевтическую субстанцию, содержащую векторную плазмиду с кДНК гена SOD1-pCMV6-Kan/Neo SOD1 SEQ ID No: 6(В) и параллельно вводили плацебо pCMV6-Kan/Neo, представляющее собой комбинацию векторной плазмиды не содержащей кДНК гена SOD1 с транспортной молекулой (А) - в мышечную ткань в зоне предплечья. Показано увеличение активности супероксиддисмутазы-1 в биоптате мышечной ткани пациента 1В, которому вводились биологически активная генно-терапевтическая субстанция, содержащая генетическую конструкцию с кДНК гена SOD1, что говорит об эффективности биологически активной генно-терапевтической субстанции.

Обозначения:

пациент 1А

пациент 1В

пациент 1В до введения БАГТС

На фиг. 18

С целью подтверждения увеличения активности супероксиддисмутазы-1 до различного индивидуального уровня при введении в кожу пациентов биологически активных генно-терапевтических субстанций с модифицированными и нативной кДНК гена SOD1 анализировали уровень активности супероксиддисмутазы-1 в коже человека в зависимости от наличия и типа модификаций в кДНК гена SOD1.

Каждому из 18-ти пациентов, отобранных в случайном порядке, вводили в кожу предплечья 7 биологически активных генно-терапевтических субстанций pCMV6-SEQ ID No: 1, pCMV6-SEQ ID No: 2, pCMV6-SEQ ID No: 3, pCMV6-SEQ ID No: 4, pCMV6-SEQ ID No: 5, pCMV6-SEQ ID No: 6, pCMV6-SEQ ID No: 7, и плацебо pCMV6-XL5.

По итогам анализа уровня активности супероксиддисмутазы-1 в биоптатах выбрали показатели, касательно каждого биоптата от каждого пациента, продемонстрировавшие максимальные уровни активности супероксиддисмутазы-1 и объединили их в семь групп, исходя из следующего критерия:

В группе 1 максимальная активность белка супероксиддисмутазы-2 наблюдалась при введении

pCMV6-SOD1 SEQ ID No: 1.

В группе 2 максимальная активность белка супероксиддисмутазы-1 наблюдалась при введении

pCMV6-SOD1 SEQ ID No: 2.

В группе 3 максимальная активность белка супероксиддисмутазы-1 наблюдалась при введении

pCMV6-SOD1 SEQ ID No: 3.

В группе 4 максимальная активность белка супероксиддисмутазы-2 наблюдалась при введении

pCMV6-SOD1 SEQ ID No: 4,

В группе 5 максимальная активность белка супероксиддисмутазы-1 наблюдалась при введении

pCMV6-SOD1 SEQ ID No: 5.

В группе 6 максимальная активность белка супероксиддисмутазы-1 наблюдалась при введении

pCMV6-SOD1 SEQ ID No: 6.

В группе 7 максимальная активность белка супероксиддисмутазы-1 наблюдалась при введении

pCMV6-SOD1 SEQ ID No: 7.

Ни в одном из биоптатов не наблюдалось того, что максимальная активность белка супероксиддисмутазы-1

На фигуре 18 для каждой группы биоптатов приведены диаграммы показателей ингибирования цветной реакции (усредненных в рамках группы, в случае, если в группу входит более одного биоптата) применительно ко всем, участвующим в эксперименте активным генно-терапевтическим субстанциям, после введения пациентам этих активных генно-терапевтических субстанций, содержащих модифицированные и нативную кДНК гена SOD1

Из данного примера следует, что достижение максимальной активности супероксиддисмутазы-1 в биоптатах кожи различных пациентов при введении им в кожу биологически активных генно-терапевтических субстанций, связано с индивидуальными особенностями пациентов и зависит от наличия и типа модификаций в кДНК гена SOD1, входящих в биологически активные генно-терапевтические субстанции.

Каждая биологически активная генно-терапевтическая субстанция из линейки биологически активных генно-терапевтических субстанций является эффективной в некоторой значительной группе пациентов. Следовательно, для выбора наиболее эффективной биологически активной генно-терапевтической субстанции из линейки биологически активных генно-терапевтических субстанций для терапевтических целей, необходимо предварительное персонализированное исследование пациента.

Обозначения:

биоптаты пациентов после введения БАГТС SOD1 SEQ ID No: 1(А)

биоптаты пациентов после введения БАГТС SOD1 SEQ ID No: 2(В)

биоптаты пациентов после введения БАГТС SOD1 SEQ ID No: 3(С)

биоптаты пациентов после введения БАГТС SOD1 SEQ ID No: 4(D)

биоптаты пациентов после введения БАГТС SOD1 SEQ ID No: 5(Е)

биоптаты пациентов после введения БАГТС SOD1 SEQ ID No: 6(F)

биоптаты пациентов после введения БАГТС SOD1 SEQ ID No: 7(G)

биоптаты пациентов после введения плацебо (Н)

На фиг. 19

С целью определения наиболее эффективной применительно к конкретному пациенту биологически активной генно-терапевтической субстанции анализировали активность супероксиддисмутазы-1 в клеточных лизатах фибробластов этого пациента, трансфицированных разными генетическими конструкциями, содержащими нативную или модифицированные кДНК гена SOD1.

По итогам анализа активности супероксиддисмутазы-1 в культуре фибробластов пациента выделили вариант биологически активной генно-терапевтической субстанции, п