Способ применения слизи кожи рыб для активации агрегации тромбоцитов и свертывания крови in vitro

Способ применения слизи кожи рыб для активации агрегации тромбоцитов и свертывания крови in vitro

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Изобретение относится к области ветеринарии и медицины, а именно гематологии. Известны препараты биологического гемостаза, а именно фибриновая пленка, коллагеновая гемостатическая губка [7, 8], гемостоп, желатиновая губка, ГемоКомпакт, Тахокомб и др., которые активно разрабатываются и внедряются в повседневную практику хирурга [4-6]. Общим недостатком гемостатических средств на основе коллагена является то, что коллаген рассасывается только под действием фермента коллагеназы, которой в организме очень мало, и коллагеновые губки следует удалять из раны после осуществления гемостаза, что приводит к повторной травматизации тканей.

Препараты на основе хитозана активно применяются для остановки кровотечений в медицинской и военной практике [2]. Перевязочные материалы с использованием тромбина и фибриногена лосося удачно останавливали как аортальное, так и поверхностное раневое кровотечение, причем результаты этого исследования показали, что многократное воздействие плазменных белков лосося в течение шести месяцев не давало никаких неблагоприятных эффектов со стороны иммунной системы [3]. Стоит отметить и немаловажные отечественные исследования применения биологического клея на основе плавательного пузыря осетра, богатого коллагеном, на искусственно поврежденной печени белых мышей [1]. Проведенные опыты подтвердили кровоостанавливающий эффект и большую регенераторную способность этого биопрепарата, также не вызывавшего ни аллергической реакции, пи цитотоксических эффектов. Несмотря на все свои плюсы, существенными минусами являются их высокая стоимость и сложность получения компонентов для изготовления вышеуказанных препаратов.

Задача изобретения - оценить пригодность слизи рыб для осуществления гемостаза IN VITRO.

Способ осуществляется следующим образом.

Гемостатическую активность определяют путем внесения 100 мкл слизи кожи рыб в плазму крови овец, обогащенную тромбоцитами с последующей оценкой времени образования сгустка в опытной и контрольной пробах (с индуктором агрегации тромбоцитов млекопитающих - АДФ). При укорочении времени свертывания по сравнению с контролем судят о пригодности препарата для осуществления гемостаза.

Заявляемый способ осуществляется следующим способом.

Для оценки агрегационной активности слизи кожи рыб кровь овцы забирают из яремной вены в пробирки с цитратом натрия 3,8% в соотношении 9:1, центрифугируют 5 мин при 1000 об/мин для получения обогащенной тромбоцитами плазмы (ОТП). Часть плазмы отбирают, а оставшуюся центрифугируют при 3000 об/мин в течение 20 мин, получая бедную тромбоцитами плазму (БТП). Для оценки агонистической способности слизи кожи рыб применяют количественный метод, основанный на регистрации изменений светопропускания богатой тромбоцитами плазмы с применением ФЭК по Howard М.А. Определяли суммирующий индекс агрегации тромбоцитов (СИАТ), скорость агрегации (СА) и индекс дезагрегации тромбоцитов (ИДТ) овец со слизью рыб (опытная группа) и индуктором агрегации - АДФ в концентрации 0,1 мг/мл (контрольная группа). АДФ является активатором тромбоцитов. При добавлении его в плазму, богатую тромбоцитами, формируются агрегаты, повышается прозрачность плазмы и, следовательно, увеличивается поток проходящего через кювету света.

Исследуемую ОТП (1,2-1,5 мл) вносят в кювету ФЭК с длиной оптического пути 3 мм и измеряют оптическую плотность при длине волны 500-560 нм (зеленый светофильтр) против дистиллированной воды.

Переливают плазму из кюветы в пробирку, прогревают при температуре 37°С.

Через 1 мин вносят в пробирку один из активаторов и включают секундомер.

Через 1, 3, 5 и 10 мин инкубации измеряют оптическую плотность исследуемой плазмы.

Определяют оптическую плотность исследуемой БТП.

Определяют суммирующий индекс агрегации тромбоцитов (СИАТ) по формуле

где Е - оптическая плотность БТП в единицах оптической плотности;

E₁ - оптическая плотность ОТП до агрегации в единицах оптической плотности;

Е₂ - оптическая плотность ОТП после агрегации в единицах оптической плотности.

Скорость агрегации (СА) рассчитывают по формуле

где E₁ - оптическая плотность ОТП до агрегации в единицах оптической плотности;

Е₂ - оптическая плотность ОТП после агрегации в единицах оптической плотности;

t - время, за которое произошло максимальное падение оптической плотности, в мин.

Рассчитывают Индекс дезагрегации тромбоцитов (ИДТ):

где Е₃ - максимальная оптическая плотность ОТП, измеренная через 10 мин после добавления активатора;

Е₂ - оптическая плотность ОТП после агрегации в единицах оптической плотности.

Результаты определения индуцированной агрегации тромбоцитов у овец контрольной и опытной групп приведены в табл. 1.

^* Различия достоверны (р<0,05).

Данные табл. 1 свидетельствуют о влиянии слизи рыб на агрегацию тромбоцитов млекопитающих in vitro. При использовании слизи кожи рыб как агониста тромбоцитов получили достоверно более высокий индекс и скорость агрегации, чем при использовании АДФ, сильнейшего агониста тромбоцитов млекопитающих.

Способ поясняется следующим примером.

На одно предметное стекло наносят автоматическим дозатором каплю нативной крови овцы в объеме 200 мкл, на второе предметное стекло - 100 мкл крови и 100 мкл слизи кожи рыб, каждые 30 сек определяют при осторожном наклоне стекла образование плотного сгустка.

Точность метода оценивалась на основании результатов повторных определений гемостатической активности слизи с одной и той же порцией крови донора (не менее 9 определений).

Результаты повторных определений приведены в табл.2.

* Различия достоверны (р<0,05).

Слизь кожи рыб активирует тромбоциты овец и пригодна для осуществления гемостаза IN VITRO.

Литература

1. Ксенофонтов, А.М., Никифоров, П.В., Федоров, А.П. Экспериментальный метод применения биологического клея на основе плавательного пузыря осетра при операциях на печени /A.M. Ксенофонтов, П.В. Никифоров, А.П. Федоров // Здоровье и образование в XXI веке. - 2012. Т.14. - №1. - С. 223-224.

2. В России разработано новое гемостатическое средство//Военно-промышленный курьер [Электронный ресурс]. - Режим доступа: http://vpk-news.ru/news/25817

3. The long term immunological response of swine after two exposures lo a salmon thrombin and fibrinogen hemostatic bandage / S.W. Rothwell, T. Settle, S. Wallace et al // Biologicals. - November 2010. - V. 38, I. 6. - P. 619-628, ISSN 1045-1056,

4. Горский В.А., Шуркалин Б.К., Фаллер А.П. Окончательный гемостаз при вмешательствах на паренхиматозных органах // Анн. хирург. гепатол. - 2007. - Т.12. - №3. - С. 253.

5. Ткачев П.В., Акопян А.А. Возможности гемостаза ложа желчного пузыря при экстренных лапароскопических холецистэктомиях // XXX Итоговая конференция общества молодых ученых. Труды конференции. М.: МГМСУ, 2008. - С. 332-334.

6. Борисов А.Е., Митин С.Е., Шолков СИ. Использование тахокомба в нестандартных ситуациях // Анн. хирург. гепатол. - 2007. - Т. 12. - №3. - С. 48.

7. Заявка на патент РФ 96119573/14, МКИ6 А61L 15/32, опубл. 10.01.99. БИ 1.

8. Патент РФ 2034572, МКИ6 А61L 15/32, опубл. 10.05.95. БИ 13.

Способ определения пригодности слизи кожи рыб для осуществления гемостаза путем активации агрегации тромбоцитов и свертывания крови IN VITRO путем внесения слизи в плазму крови овец, обогащенную тромбоцитами (ОТП), нативную кровь и определения времени образования сгустка, отличающийся тем, что в качестве испытуемого препарата используют слизь кожи рыб, в качестве биологической жидкости - кровь и плазму, время образования сгустка определяют визуально и путем фотометрии на фотоэлектроколориметре (ФЭК) в опытной и контрольной пробах и при ускорении образования сгустка по сравнению с контролем судят о пригодности слизи кожи рыб для осуществления гемостаза.