Блокада воспалительных протеаз тета-дефензинами

Блокада воспалительных протеаз тета-дефензинами

Иллюстрации

Показать все

Реферат

[0001] Данная заявка испрашивает приоритет на основании предварительной заявки на патент США номер 61/492753, поданной 2 июня 2011.

Область техники

[0002] Настоящее изобретение относится к применению циклических пептидов для модулирования активности цитокинов, включая передачу сигналов и пути воспаления, при различных заболеваниях. В частности, циклические пептиды согласно настоящей заявке обладают ранее неизвестной биологической активностью, такой как ингибирование шеддаз и других родственных протеаз (металлопротеиназ и цистеиновых протеаз), что можно применять при заболеваниях, в случае, когда активность этих протеаз связана с патогенезом такого заболевания.

Предпосылки создания изобретения

[0003] Все публикации включены в настоящую заявку посредством ссылки в равной мере, как если бы каждая отдельная публикация или заявка на патент была бы конкретно и отдельно обозначена как включенная в виде ссылки. Нижеследующее описание содержит сведения, которые могут быть полезны в понимании предмета настоящего изобретения. Это не является признанием того, что любые сведения, предоставленные в настоящей заявке, представляют собой известный уровень техники или имеют отношение к заявленным в настоящее время изобретениям, или что любая публикация, на которую ссылаются непосредственно или неявно, представляет собой известный уровень техники.

[0004] Циклические пептиды, описанные в настоящей заявке, представляют собой недавно обнаруженные терапевтические агенты, направленные на ферменты провоспалительных путе с известным клиническим значением, такие как фермент, конвертирующий фактор некроза опухоли альфа ФНОα («ТАСЕ», также известный как ADAM17), и другие металлоферменты (например, шеддазы и матриксные металлопротеиназы («ММП»), которые вовлечены в патологическое воспаление, деградацию ткани и мобилизацию факторов роста, стимулирующих пролиферацию раковых клеток.

[0005] Металлопротеиназы регулируют множество биологических процессов, от эволюционного программирования, до ответа на повреждение или инфекцию такни, ремоделирования шрамов и стимуляции деления клеток (3). Регуляция активности металлопротеиназ является ключевой для поддержания клеточного и тканевого гомеостаза. Множество болезненных состояний связано со сверхэкспрессией активности металлоферментов. Например, суставы, страдающие от ревматоидного и других форм артрита, характеризуются повышенным уровнем ММП, а также ФНОα, который высвобождается с поверхности клеток, экспрессирующих про- ФНОα под действием ТАСЕ (7, 8, 13, 16). Доказано, что блокада ФНОа с помощью моноклональных антител является эффективной для лечения ревматоидного артрита (РА) у значительной части пациентов с РА, невосприимчивым к препаратам первой линии, таким как низкие дозы метотрексата. Поскольку блокада ФНОα для РА не является эффективной во всех случаях и поскольку существуют серьезные побочные эффекты, связанные с блокаторами ФНОα у некоторых, пациентов, продолжаются попытки разработать альтернативные противовоспалительные стратегии. В этой связи многочисленные фармацевтические компании сфокусировали программы разработки лекарственных препаратов на изучении ингибиторов ТАСЕ (17), но ни один из них не был одобрен FDA.

[0006] Тета дефензины (θ-дефензины) представляют собой природные циклические пептиды, экспрессируемые в тканях макаков-резус, павианов и других мартышковых. Они не экспрессируются у людей или других гоминид. Существующие в природе θ-дефензины состоят из кольца из 18 аминокислот, стабилизированных тремя дисульфидными связями, которые являются консервативными среди всех известных θ-дефензинов (9, 21-23, 25). Как и другие дефензины, θ-дефензины изначально были обнаружены на основании противомикробных свойств этих пептидов. Однако авторы настоящего изобретения обнаружили второе, неизвестное до настоящей заявки свойство θ-дефензинов как потенциальных противовоспалительных факторов. Как описано более подробно в настоящей заявке, природные и модифицированные структуры θ-дефензинов способны к подавлению воспаления как ex vivo, так и in vivo. Что наиболее важно, было обнаружено то, что θ-дефензины и пептиды, производные от структуры θ-дефензинов (т.е., циклические пептиды), способны ингибировать ТАСЕ, ключевой фактор в воспалении, опосредованном ФНОα. Это абсолютно новое открытие того, что θ-дефензины являются природными ингибиторами ТАСЕ, обеспечивает важный источник молекул, способных регулировать воспаление посредством эндогенных цитокин-опосредованных путей передачи сигнала, существующих у субъекта. Эти пептиды являются единственным известным природным продуктом, экспрессируемым у животных, который является растворимым регулятором ТАСЕ. Таким образом, циклические пептиды могут быть полезными терапевтическими агентами в отношении разнообразных стадий или состояний болезни, таких как аутоиммунные и другие воспалительные заболевания, которые являются следствием нарушения активности цитокинов, и разнообразные воспалительные заболевания и/или состояния человека могут возникать в результате потери экспрессии θ-дефензинов в ходе эволюции приматов.

[0097] Более того, факторы, такие как ТАСЕ, являются членами более широкого класса молекул, известных как шеддазы, которые обладают биологической активностью по расщеплению внеклеточных доменов белков. Такая активность по расщеплению обеспечила терапевтический путь для увеличения эффективности определенных вариантов лечения, таких как лечение трастузумабом (Герцептином), путем ингибирования шеддазы ADAM10, для применения при лечении рака молочной железы. Обычно расщепление Her2 шеддазой ADAM10 приводит к образованию фрагмента Her2, обладающего конститутивной киназной активностью с лиганд-независимой передачей сигналов к росту и выживанию пролиферирующих клеток. Однако вредные эффекты этого процесса могут быть нивелированы посредством ингибирования шеддазы. Таким образом, циклические пептиды, обладающие способностью ингибировать шеддазы, обеспечивают терапевтические подходы для еще более широкого репертуара заболеваний и/или состояний, включая те, при которых изменения в структуре, экспрессии и/или функции металлопротеиназ связаны с патогенезом заболевания и/или состояния.

[0008] На протяжении более десятка лет фармацевтические компании пытались разработать ингибиторы ТАСЕ (14, 17). Хотя было показано, что некоторые небольшие молекулы (в основном, гидроксаматы) являются эффективными на экспериментальных моделях РА, ни одно из этих соединений не было одобрено из-за неприемлемой токсичности у людей (14, 17). Более того, все существующие антагонисты ФНО имеют предостережение в черной рамке, наиболее суровый тип предупреждения Управления по контролю продуктов питания и лекарственных средств США (FDA) которое лекарственный препарат может иметь и при этом остается на рынке Соединенных Штатов.

[0009] Вследствие этого, появление нетоксичного ингибитора ТАСЕ, который был бы эффективным в лечении таких заболеваний как РА, станет ценным дополнением к терапевтическим подходам к лечению РА, связанных аутоиммунных и воспалительных заболеваний, а также других заболеваний, в которые вовлечена активность металлопротеиназ, таких как рак. В более общих словах, все еще существует потребность в лекарственных средствах, которые лечили бы воспалительные и связанные с воспалением состояния, особенно хронические воспалительные состояния, а также в способах производства, предложения на рынке и введения таких лекарственных средств.

Краткое описание изобретения

[0010] Предмет настоящего изобретения предусматривает аппараты, системы и способы, с помощью которых лекарственная композиция, которая содержит θ-дефензин, его аналог или производное, исследуется и поставляется на рынок для лечения воспалительного состояния.

[0011] В свете данного представления, предпочтительные лекарственные композиции содержат по меньшей мере одно из RTD-1-27, RTD-1-28 и RTD-1-29.

[0012] Рассматриваемыми в исследовательском аспекте предмета настоящего изобретения являются исследования токсичности, эффективности и исследование зависимости «доза-эффект». Любое из таких исследований может быть проведено непосредственно фармацевтической или другой компанией в ее собственных лабораториях или опосредованно - через дочернюю компанию или несвязанную компанию, каждая из которых должна пониматься в настоящей заявке как включенная в концепцию определения эффективности указанной лекарственной композиции.

[0013] Противовоспалительный эффект/противовоспалительные эффекты, рассматриваемые в настоящей заявке, следует интерпретировать как широким образом включающие все варианты клинически значимого ингибирования связанных с воспалением соединений, включая, например, ингибирование фермента, конвертирующего фактор некроза опухоли альфа ФНОα (ТАСЕ), катепсина C или других провоспалительных протеаз, семейства металлопротеиназ ADAM или других шеддаз.

[0014] Этап обеспечения лекарственной композиции на рынке следует интерпретировать в настоящей заявке как осуществляемое или уже осуществленное производство, или руководство, контроль или осуществляющееся любым другим способом влияние на производство коммерческого количества лекарственной композиции. Рассматриваемые минимальные коммерческие количества включают в общей сложности 1 килограмм, 10 килограмм, 100 килограмм, 1000 килограмм, произведенные в течение любого данного периода длительностью в один год на одной или более производственных площадках.

[0015] Один интересный аспект рассматриваемого θ-дефензина, его аналога или производных состоит в том, что любое из этих соединений является высокостабильным по отношению к кислотам и протеазам и может быть введено в лекарственной форме для орального приема.

[0016] По меньшей мере частично, поскольку рассматриваемые терапевтические композиции могут воздействовать на ТАСЕ и/или шеддазы, предполагается, что можно лечить многие различные воспалительные состояния, включая, например, ревматоидный артрит, воспалительное заболевание кишечника и другие хронические воспалительные заболевания, аутоиммунные заболевания, острую бактериемию, сепсис, муковисцедоз, рак, болезнь Альцгеймера, остеоартрит, связанные с воспалением нейродегенеративные заболевания и другие заболевания, связанные с воспалением. В частности предполагается, что способы и композиции, рассматриваемые в настоящей заявке, можно успешно реализовать на рынке для лечения лиц, невосприимчивых к лечению агентами против ФНОα.

[0017] Также рассматриваются лекарственные средства и способы производства лекарственных средств для введения человеку или животному, отличному от человека, где лекарственное средство включает по меньшей мере один из новых θ-дефензинов, его аналог или производное, раскрытые в настоящей заявке или в приоритетной заявке, которые предлагаются на рынке для лечения воспалительного состояния. Особенный интерес вызывают RTD-1-27, RTD-1-28 и RTD-1-29.

[0018] Различные объекты, черты, аспекты и преимущества предмета настоящего изобретения станут более понятными из следующего детального описания предпочтительных вариантов реализации.

Краткое описание чертежей

[0019] Фиг.1. Биосинтез θ-дефензина и его структура. При образовании зрелого пептида RTD-1 происходит вырезание нонапептидов-заместителей (обозначены цветовым кодированием) и сплайсинг (из (21)).

[0020] Фиг.2. Выравнивание препро-θ-дефензинов. А. Аминокислотные последовательности от BTDa до -d, спрогнозированные на основании кДНК, выравнивали вручную с RTD1a до -с, и с превдогеном θ-дефензина человека (HTDp). Точки в выровненных последовательностях обозначают аминокислоты, идентичные аминокислотам в BTD-a, знак звездочки обозначает положение терминирующего кодона, знак # обозначает стоп-кодон, досрочно терминирующий трансляцию. В. Циклические структуры 10 расшифрованных пептидов BTD, происходящих из последовательностей кДНК.

[0021] Фиг.3. RTD-1 снижает смертность при полимикробном сепсисе мыши. Взрослые мыши Balb/c подвергались лигатуре слепой кишки и пункции (ЛСКП) в Т=0. Мыши получали единичную инъекцию (150 мкл) физиологического раствора (•, n=10) через 4 ч после ЛСКП или физиологического раствора, содержащего 5 мг/мг RTD-1 через 4 ч (▲, n=11) или через 24 ч (■, n=5) после операции ЛСКП.

[0022] Фиг.4. Активность θ-дефензинов, направленная против ФНОα. А. Ковалентные структуры RTD 1-6 (23) с цветовым кодированием, демонстрирующим получение элементов нонапептидов (23). В. Цельную кровь человека (в разведении 1:10) инкубировали с 100 КОЭ/мл живых E. coli в течение 4 ч в присутствии 0-10 мг/мл θ-дефензина RTD-1 и двух α-дефензинов человека (HNP-2 и HNP-4) и количественно определяли ФНОα с помощью метода ELISA. С. Изучали влияние RTD 1-5 на высвобождение ФНОα из цельной крови человека, как в секции В; ФНОα количественно определяли с помощью метода ELISA. RTD-6, присутствующий только в следовых количествах в полиморфно-ядерных лейкоцитах, не анализировали.

[0023] Фиг.5. θ-дефензины ингибируют провоспалительные цитокины/хемокины, индуцированные многочисленными агонистами TLR. Клетки периферической крови человека (5×10⁵ клеток/мл) в RPMI 1640 и 5% плазму человека инкубировали с 10 мкг/мл RTD-1 (контроль в отсутствии агонистов) или с растворителем пептидов (0,01% НОАс), или одновременно с агонистами TLR в течение 4 ч при 37°С в 5% CO₂ с легким перемешиванием. Супернатанты собирали с помощью центрифугирования и количественно определяли уровень цитокинов/хемокинов с помощью анализа Luminex xMAP, используя панель цитокинов/хемокинов Milliplex. Агонисты: TLR2 - 1×10⁸ убитых нагреванием L. monocytogenes (УHLm); TLR4 - 3,3 нг/мл E. coli K12 LPS; TLR5 - 30 нг/мл флагеллина S. typhimurium; TLR8 - 0,9 мкг/мл осРНК40.

[0024] Фиг.6. θ-дефензины являются конкурентными ингибиторами ТАСЕ. А. Рекомбинантный ТАСЕ (рТАСЕ) инкубировали с указанными концентрациями пептидов и ТАСЕ-специфичным субстратом (Mca-PLAQAV-Dpa-RSSSR-NH₂) и флуориметрически измеряли ферментативную активность. В. Анализировали способность RTD 1-5 ингибировать ТАСЕ, как в секции А. С. Анализ Лайнуивера-Берка ингибирования RTD-1 рТАСЕ при концентрации пептидов 0, 50, 100 и 150 нг/мл. D. Сравнение структур RTD-1 и «природного» ациклического аналога (S-7). Е. Сравнительное ингибирование рТАСЕ RTD-1 и RTD-1-S7 аналогом. F. Ингибирование рТАСЕ RTD-1 в покоящихся или LPS-стимулированных (2 ч) клеток ТНР-1 (1).

[0025] Фиг.7. θ-дефензины являются потенциальными ингибиторами ADAM 10. Рекомбинантный ADAM10 и субстрат (Mca-PLAQAV-Dpa-RSSSR-NH₂; 0,05 мкг/мл) инкубировали с RTD 1-3 в течение 60 мин при 37°С, и флуориметрически измеряли ферментативную активность.

[0026] Фиг.8. Эффективность in vivo, а также активность против ФНОα. и блокирующее ТАСЕ действие мини-θ-дефензинов. А. Ковалентные структуры мини-θ-дефензинов. В. Эффективность мини-θ-дефензинов при сепсисе ЛСКП. Операцию ЛСКП проводили у BALB/c мышей в Т=0. Через 4 ч после операции мыши получали в.в. ФБР (контроль плацебо) или 5 мг/кг указанного мини-θ-дефензина в ФБР. Эффективность лечения оценивали как выживание до включительно 15 дней. С. Оценивали действие мини-θ-дефензинов на высвобождение ФНОα из цельной крови человека. EDTA-антикоагулированную цельную кровь разводили в соотношении 1:10 в RPMI 1640 и инкубировали с живыми клетками E. coli в течение 4 ч с 0-10 мкг/мл RTD-1 (природный θ-дефензин) или с тремя указанными мини-θ-дефензинами. D. Влияние RTD-1 и трех мини-θ-дефензинов на активность ТАСЕ определяли, как описано для Фиг.5.

[0027] Фиг.9. Влияние RTD-1 на пристан-индуцированный артрит крыс (ПИА). У крыс DA индуцировали ПИА, как описано в тексте, и разбивали животных на группы, которые получали ежедневные в.в. инъекции солевого раствора (N=10) или 5 мг/кг RTD-1 (N=11). Оценивали и рассчитывали степень макропатологии (20). Каждый символ представляет собой степень макропатологии у отдельного животного. Во всех случаях обработка RTD-1 вызывала прекращение болезни суставов, которое сопровождалось восстановлением нормальной способности передвигаться.

Подробное описание изобретения

[0028] Содержание всех ссылок, приведенных в настоящей заявке, включены в нее посредством ссылки во всей своей полноте, как если бы они были полностью изложены. Если не указано обратное, технические и научные термины, используемые в настоящей заявке, имеют то же значение, как обычно понимается средним специалистом в той области техники, к которой принадлежит предмет настоящего изобретения. Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology 3^rd ed., J. Wiley & Sons (New York, NY 2001); March, Advanced Organic Chemistry Reactions, Mechanisms and Structure 5^th ed, Wiley & Sons (New York, NY 2001); и Sambrook and Russel, Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press (Cold Spring Harbor, NY 2001); обеспечат специалисту в данной области техники общее указание ко многим терминам, используемым в настоящей заявке.

[0029] Специалисту в данной области техники известно множество способов и материалов, подобных или эквивалентных тем, которые раскрыты в настоящей заявке, которые можно использовать при практическом применении заявленных изобретений. Более того, предмет настоящего изобретения не следует интерпретировать как ограниченный описанными способами и материалами. Для настоящих целей следующие термины определены ниже.

[0030] Если контекст не предписывает обратного, все диапазоны, изложенные в настоящей заявке, следует интерпретировать как включающие их предельные точки, и неограниченные диапазоны следует интерпретировать как включающие коммерчески реальные объемы. Аналогично все списки значений следует рассматривать как охватывающие промежуточные значения, если контекст не свидетельствует об обратном.

[0031] Используемый в настоящей заявке термин «тета-дефензины» или «θ-дефензины» включают членов семейства θ-дефензинов из белков дефензинов, которые обнаружены у многих видов обезьян, таких как мартышковые и приматы (примерами служат макака-резус, павиан анубис, сиаманг и орангутанг), при этом предшественники θ-дефензинов транскрипционно экспрессируются и процессируются посредством пост-трансляционных модификаций в θ-дефензин. Они также включают псевдогены, найденные у человекообразных приматов (примерами служат человек, шимпанзе, бонобо и горилла), где генетические модификации псевдогенов θ-дефензина могут быть изменены в соответствии с методиками, широко известными в данной области техники, для обеспечения экспрессии белков θ-дефензинов в клетках млекопитающих. Они также включают белки θ-дефензины, которые могут быть идентифицированы в одном и том же или в различных видах, в соответствии с методиками, известными в данной области техники, такими как методики компьютерного моделирования, описывающие гомологичность последовательностей или консервативную структуру в окне сравнения последовательностей нуклеиновой кислоты и/или аминокислоты, или методики селективной гибридизации с использованием проб нуклеиновой кислоты для идентификации гомологичных θ-дефензинов. θ-дефензины можно выделить из эндогенных источников, наработать в автологичных или гетерологичных клеточных линиях, получить посредством пептидного синтеза или в соответствии с любым доступным способом, известным специалисту в данной области техники. Примеры θ-дефензинов включают RTD-1, RTD-2, RTD-3, RTD-4, RTD-5, RTD-6, BTD-1, BTD-2, BTD-3, BTD-4, BTD-5, BTD-6, BTD-7, BTD-8, BTD-9, BTD-19 или HTDp.

[0032] Термин «шеддазы», используемый в настоящей заявке, охватывает белки ферментов, которые расщепляют внеклеточные части трансмембранных белков. Примеры включают, среди прочих, членов семейств белков дезинтегринов и металлопротеиназ (ADAM), семейства белков аспарагиновых протеаз (ВАСЕ). Примеры белков ADAM, которые являются шеддазами, включают ADAM2, ADAM7, ADAM8, ADAM9, ADAM10, ADAM11, ADAM12, ADAM15, ADAM17, ADAM18 (также известный как ADAM27), ADAM19, ADAM29, ADAM21 (также известный как ADAM31), ADAM22, ADAM23, ADAM28, ADAM29, ADAM39 и ADAM33.

[0033] Термин «аналог», применяемый в настоящей заявке по отношению к θ-дефензинам, относится к полипептидам и пептидам, которые содержат коровую структуру, происходящую от дефензина, такого как θ-дефензин, которые способны модулировать активность цитокинов, ингибировать активность протеолитических шеддаз, изменять функцию ферментов, связанных с рецепторами клеточной поверхности, и/или обладают противомикробным действием. Примеры включают циклические пептиды, содержащие одну, две, три, четыре или более дисульфидных связей между множеством остатков цистеина или существенно подобных заместителей, причем указанный аналог может иметь длину, варьирующую от 8 до 24 аминокислот, и содержит суммарный положительный заряд.

[0034] Дефензины представляют собой небольшие богатые цистеином катионные белки, которые являются эволюционно высоко консервативными и которые обнаружены у позвоночных, беспозвоночных, а также у растений. Эти белки обладают биологической активностью, направленной против широкого спектра организмов, таких как бактерии, грибы и многие оболочечные и безоболочечные вирусы. Обычно дефензины состоят из 18-45 аминокислот, включая от 6 (у позвоночных) до 8 консервативных остатков цистеина. Различные иммунные клетки, такие как нейтрофильные гранулоциты и почти все эпителиальные клетки, содержат эти пептиды с ключевой функцией уничтожения фагоцитированных или внеклеточных микроорганизмов. Многие дефензины функционируют посредством связывания с мембраной микробиальной клетки и, однажды внедрившись в нее, образуют пороподобные дефекты мембраны, которые обеспечивают выход важных ионов и питательных веществ с разрушением целостности микроба. Однако, как будет далее описано в настоящей заявке, некоторые члены белков дефензинов, включая θ-дефензины, также функционируют посредством модулирования иммунной функции клетки-хозяина. Это включает пути воспаления, связанные с цитокинами, такими как ФНОα.

[0035] Дефензины, в общем смысле. Дефензины представляют собой катионные, тридисульфид-содержащие противомикробные пептиды, которые продуцируются лейкоцитами и различными эпителиальными клетками. Они подразделяются на подсемейства α, β, θ-дефензинов, которые отличаются размером пептида и различными дисульфидными мотивами. У человека четыре α-дефензина (от HNP-1 до HNP-4) были выделены из нейтрофилов, а два кишечных α-дефензина (HD-5 и HD-6) экспрессируются клетками Панета в криптах тонкой кишки. Экспрессия HD-5 была также обнаружена в мочеполовых путях женщин. Три β-дефензина человека (от hBD-1 до hBD-3) были выделены из эпителиальных и неэпителиальных типов клеток различных органов, и экспрессия некоторых других была выявлена с помощью анализа кДНК или благодаря анализу генома человека. Многочисленные данные свидетельствуют, что дефензины обеспечивают противомикробную эффекторную функцию в коже, респираторном эпителии, мочеполовых путях и в различных лейкоцитах (т.е., нейтрофилах, моноцитах и клетках NK). Более того, дефензины активируют клетки, вовлеченные как во врожденный, так и в приобретенный иммунный ответ, свидетельствуя, что они действуют в рамках двух ветвей иммунитета и объединяют их.

[0036] Макроциклические θ-дефензины. θ-дефензины представляют собой циклические октадекапептиды, образованные посредством посттрансляционного сплайсинга из двух нонапептидов, происходящих от родственного θ-дефензину предшественника, состоящего из 76 аминокислот. У людей не экспрессируются пептиды θ-дефензина, поскольку экспрессия θ-дефензина прекратилась приблизительно в то время, когда в ходе эволюции возникли орангутанги в результате мутации, которая ввела преждевременный стоп-кодон в предшественник пептида.

[0037] θ-дефензины можно получить путем биосинтеза, используя сплайсинг по типу «голова-к-хвосту», последовательностей, состоящих из 9 аминокислот, происходящих от предшественника θ-дефензина. θ-дефензины впервые идентифицировали в нейтрофилах и моноцитах макаков-резусов. Последовательное филогенетическое исследование обнаружило существование генов θ-дефензина у других человекообразных обезьян и у двух приматов (сиаманга и орангутанга), но о существовании θ-дефензинов у капуцинообразных обезьян или полуобезьян не сообщалось. У людей, шимпанзе, бонобо и горилл экспрессируются псевдогены θ-дефензина, в которых мРНК предшественника содержит мутацию, которая образует стоп-кодон в сигнальной последовательности, и тем самым предотвращает трансляцию предшественника θ-дефензина. θ-дефензин-1 резуса (RTD-1) продуцируется в результате гетеродимерного сплайсинга двух предшественников θ-дефензина, proRTD1a и proRTD1b. Гомодимерные реакции отщепления/лигирования, в которые вовлечены proRTD1a и proRTD1b, обнаружили путем изолирования RTD-2 и RTD-3. RTD-1, -2, и -3 оказывают сильное микробиологическое действие против бактерий и грибов; известно, что они обладают противовирусной активностью против вируса иммунодефицита человека типа 1 (HTV-1) и вируса простого герпеса (HSV).

[0038] Нами была разработана структура синтетических θ-дефензинов на основании последовательности природного θ-дефензина, которые обладают противобактериальным и противовирусным действием. В дополнение обнаружено, что θ-дефензины связывают летальные токсины Bacillus anthracis и инактивируют их. θ-дефензины проявляют бактерицидные свойства в присутствии физиологических концентраций соли, двухвалентных катионов и сыворотки. Напротив, противомикробные свойства α- и β-дефензинов значительно снижаются в присутствии соли и двухвалентных катионов. Ациклический RTD-1 является неактивным против Staphylococcus aureus в физиологическом растворе, тогда как природная циклическая форма пептида сохраняет в этих условиях потенциальную лизирующую активность. Эти данные свидетельствуют, что циклическая структура остова θ-дефензинов предоставляет соединению нечувствительность к соли, обеспечивая стабильность молекулы и способность поддерживать потенциальную ее биологическую активность в физиологических соответствующих условиях.

[0039] Противомикробная активность θ-дефензинов. Архетипический пептид θ-дефензина представляет собой θ-дефензин-1 (RTD-1) резуса, макроциклический пептид, состоящий из 18 аминокислот (22). Как было описано, зрелый пептид продуцируется в результате уникального процесса, в ходе которого два пептида, состоящие из 9 аминокислот, происходящие из усеченного θ-дефензин-подобного предшественника, подвергаются сплайсингу по принципу «голова-к-хвосту» для образования макроциклической молекулы, стабилизированной тремя дисульфидами (Фиг.1). Путь биосинтеза, который приводит к образованию зрелого макроцикличеекого θ-дефензина, является новым. Макак-резус (22, 23, 25) и павиан анубис (9) экспрессируют 3 и 4 предшественников θ-дефензина соответственно. Каждый предшественник является донором уникального нонапептида, который образует пару с идентичным (гомодимерный сплайсинг) или отличным от него (гетеродимерный сплайсинг) нонапептидом во всех бинарных комбинациях. Это делает возможным получение 6 уникальных θ-дефензинов макака и 10 θ-дефензинов павиана. Авторы настоящего изобретения выделили все шесть из предсказанных пептидов макак (23) и выделили семь из предсказанных пептидов павиана (9).

[0040] Подобно другим θ-дефензинам, таким как α-дефензины, θ-дефензины упакованы в первичные гранулы нейтрофилов макак и павиана, а также экспрессируются в моноцитах (23). Поскольку микробы фагоцитируются нейтрофилами, моноцитами и макрофагами, дефензины мобилизуются в фагосоме, где они участвуют во внутриклеточном уничтожении в качестве бактерицидного вещества. θ-дефензины в субмикромолярных концентрациях являются бактерицидным веществом в отношении грамм-положительных бактерий, грибов (9, 22, 25) и ингибируют захват клетками HIV-1 (5, 6, 27, 28). Используя специфические нейтрализующие антитела, авторы настоящего изобретения продемонстрировали, что θ-дефензины отвечают за большинство опосредованных гранулами противомикробных активностей нейтрофилов макак против S. aureus, E. coli и С. albicans in vitro (23). Более того, было показано, что θ-дефензины отвечают за наивысшую лизирующую способность экстракта гранул полиморфно-ядерных лейкоцитов макака в сравнении с экстрактом гранул нейтрофилов человека (23). Во время системного воспаления (например, сепсиса) у людей θ-дефензины высвобождаются направленным и/или случайным способом во внеклеточное пространство (2, 18). θ-дефензины павиана (22) подобным образом высвобождаются в сыворотку бактериемийных животных. Также внеклеточные θ-дефензины появляются для осуществления способности модулировать воспаление посредством противовоспалительных механизмов, которые являются агентами в диапазоне видов от грызунов до человека, что также описано в настоящей заявке. Таким образом, θ-дефензины и пептиды, происходящие от структуры θ-дефензинов, представляют собой важный класс модуляторов иммунной функции.

[0041] ФНОα и воспаление. Фактор некроза опухоли альфа («ФНОα», также известный как катексин или кахектин) представляет собой цитокин, вовлеченный в системное воспаление, и является членом группы цитокинов, которые стимулируют реакции острой фазы.

[0042] ФНОα играет ключевую роль в регуляции иммунных клеток, включая индукцию апоптотической гибели клетки, стимулирование воспаления, ингибирование онкогенеза и репликации вируса. Принимая во внимание широкое варьирование эффектов активности ФНОα, неудивительно открытие того, что нарушение регуляции экспрессии ФНОα, его продукции и передачи сигналов связано с разнообразием болезней человека, включая, среди многих прочих, ревматоидный артрит, болезнь Альцгеймера, туберкулез, болезнь Крона.

[0043] Сигнальный белок ФНОα первоначально синтезируется как трансмембранный белок типа II массой 26 кДа длиной 212 аминокислот, который затем встраивается в клеточную мембрану в процессе созревания. На поверхности клетки мембраносвязанный ФНОα («про-ФНОα») является биологически активным и способен индуцировать иммунные ответы посредством юкстакринной межклеточной передачи сигналов. Однако про-ФНОα может подвергаться протеолитическому расщеплению по амидной связи Ala76-Val77 металлопротеиназой - ферментом, конвертирующим ФНОα («ТАСЕ», также известным как ADAM17). Из этой мембраносвязанной формы высвобождается растворимый внеклеточный домен массой 17 кДа (эктодомен), обычно известный как ФНОα, что имеет важнейшее значение в паракринной передаче сигналов.

[0044] Как правило, существующие терапевтические стратегии, направленные на активность ФНОα, сфокусированы на разработке антител против растворимой и/или трансмембранной связанной формы ФНОα для предотвращения связывания рецептора, или на создании растворимых гибридных слитых рецепторов для нейтрализации уровня циркулирующего ФНОα. Несмотря на важные преимущества этих терапевтических подходов, около 1/3 пациентов не реагируют ни на какую форму терапии против ФНОα, тогда как было сообщено о некоторых побочных эффектах, включая иммуногенность, инфекции, реакции отложенной гиперчувствительности и аутоиммунные заболевания, такие как синдром лекарственной волчанки и димиелинизация.

[0045] ТАСЕ и активность шеддаз. Как было описано, ключевым этапом в активности по передаче сигналов от ФНОα является высвобождение мембраносвязанной формы белка в растворимую форму циркулирующего ФНОα, что катализируется ТАСЕ. Этот процесс известен как «шеддинг». ТАСЕ, белок массой 70 кДа, состоящий из 824 аминокислот, принадлежит к семейству белков ADAM - дезинтегринов и металлопротеиназ (A Disintegrin And Metalloproteinase). Члены семейства белков ADAM обладают как эволюционно консервативными структурами, так и функциональной способностью отщепления и высвобождения растворимого эктодомена из мембраносвязанных пробелков. Принимая во внимание роль ФНОα как потенциального и центрального медиатора в процессе воспаления, циклические пептиды, которые функционируют как ингибиторы ТАСЕ, могут предложить жизненную альтернативу существующим агентам против ФНОα, таким как композиции на основании антител или растворимых рецепторов.

[0046] Также ФНОα и ТАСЕ представляют только две из нескольких потенциальных мишеней терапевтической активности циклических пептидов, принимая во внимание широту и разнообразие шеддинговых активностей нескольких различных белков, вовлеченных во многие различные стадии и/или состояния заболевания. ТАСЕ и другие молекулы из семейства ADAM представляют собой большинство членов большего семейства «шеддаз». Однако другие шеддазы включают членов белкового семейства аспарагиновых протеаз (ВАСЕ). В пределах различных типов шеддаз, функция шеддазной активности варьирует от активности по передаче сигналов посредством отщепления трансмембранного белкового рецепторного эктодомена (например, Her2), или последующего связывания агониста с рецептором для обеспечения способности высвобожденного агониста затем стимулировать другой рецептор (например, EGFR). Благодаря этой жизненно важной роли в осуществлении и расширении функции передачи сигналов, ингибирование активности шеддаз обеспечивает важную терапевтическую стратегию для открытия новых терапевтических путей, и также к потенцированию эффективности существующих лекарственных препаратов. Например, расщепление шеддазой ADAM10 Her2 приводит к образованию фрагмента Her2, обладающего конститутивной киназной активностью с лиганд-независимыми сигналами к росту и выживанию пролиферирующих клеток. Вредные эффекты этого процесса могут быть сведены на нет посредством введения трастузумаба (герцептина) и ингибирования шеддазной активности ADAM10 (30, 31). В результате, циклические пептиды можно использовать для ограничения вредной активности цитокинов по отношению к иммунной функции, открывая даже более широкие терапевтические возможности для лечения заболеваний, таких как рак, или других заболеваний и/или состояний, включающих дисфункцию шеддаз. С помощью этого аспекта θ-дефензинов как осуществляющих эндогенную активность по ингибированию шеддаз можно объяснить многочисленные аутоиммунные, воспалительные заболевания и другие болезненные состояния у пациентов людей, возникающие в результате утраты экспрессии θ-дефензинов в процессе эволюции приматов. Таким образом, θ-дефензины и циклические пептиды, происходящие от структуры различных θ-дефензинов, можно использовать в качестве совместимых терапевтических агентов у пациентов людей, имеющих заболевания, или состояния, связанные с нарушением регуляции металлопротеиназ.

[0047] В различных вариантах реализации, предмет настоящего изобретения предусматривает циклические пептиды. В одном классе вариантов реализации, циклический пептид представляет собой дефензин, его аналог или производное. В другом классе вариантов реализации, циклический пептид представляет собой α-дефензин, β-дефензин, θ-дефензин, их аналог или производное. В другом классе вариантов реализации, циклический пептид представляет собой θ-дефензин, его аналог или производное.

[0048] В другом классе вариантов реализации, θ-дефензин эндогенно экспрессируется у примата. В другом классе вариантов реализации, θ-дефензин эндогенно экспрессируется у макак-резуса. В другом классе вариантов реализации, θ-дефензин представляет собой RTD-1, RTD-2, RTD-3, RTD-4, RTD-5 или RTD-6. В другом классе вариантов реализации, θ-дефензин эндогенно экспрессируется у павиана анубиса. В другом классе вариантов реализации, θ-дефензин представляет собой BTD-1, BTD-2, BTD-3, BTD-4, BTD-5, BTD-6, BTD-7, BTD-8, BTD-9 или BTD-10. В другом классе вариантов реализации, θ-дефензин эндогенно экспрессируется у человека. В другом классе вариантов реализации, θ-дефензин представляет собой псевдоген θ-дефензина человека (HTDp). В другом классе вариантов реализации, θ-дефензин экспрессируется у сиаманга или орангутанга.

[0049] В другом классе вариантов реализации, θ-дефензин выделяют из млекопитающего. В другом классе вариантов реализации, θ-дефензин выделяют из приматов. В другом классе вариантов реализации, θ-дефензин выделяют из человека. В другом классе вариантов реализации, θ-дефензин является очищенным из биологического образца, полученного от млекопитающего. В другом классе вариантов реализации, θ-дефензин является очищенным из биологического образца, полученного от примата. В другом классе вариантов реализации, θ-дефензин является очищенным из биологического образца, полученного от человека.

[0050] В другом классе вариантов реализации, циклический пептид составляет в длину 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 или 24 аминокислот. В другом классе вариантов реализации, циклический пептид составляет в длин