Стабильные антитела, связывающиеся с несколькими антигенами

Стабильные антитела, связывающиеся с несколькими антигенами

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ПЕРЕКРЕСТНЫЕ ССЫЛКИ НА РОДСТВЕННЫЕ ПУБЛИКАЦИИ

В настоящей заявке испрашивается приоритет согласно 35 Своду законов США, параграф 119, на предварительную заявку на патент Соединенных Штатов Америки с №61/549482, поданную 20 октября 2011 г., полное содержание которой включено в настоящую заявку посредством ссылки на ее полную версию и для любых целей.

Область техники

Настоящее изобретение относится к стабильным антителам, связывающимся с несколькими антигенами, содержащим по меньшей мере два домена легкой цепи антитела, два домена тяжелой цепи антитела и не содержащим константных доменов, причем каждый вариабельный домен легкой цепи связан с вариабельным доменом тяжелой цепи, образуя конструкцию VH/VL, и причем по меньшей мере один из доменов VH содержит конкретную аминокислоту в положении АНо 12, 103 и/или 144, и по меньшей мере один из доменов VL содержит конкретную аминокислоту в положении АНо 47 и/или 50. Также настоящее изобретение относится к способам получения таких антител и фармацевтическим композициям, содержащим такие антитела.

Уровень техники

Молекулы антител, которые способны связываться с более чем одним антигеном, желательны в качестве потенциальных терапевтических агентов для лечения заболеваний, в развитии которых участвует несколько белков. Например, часто желательны направленное действие на два белка в одном и том же сигнальном пути или модуляция активности в двух разных путях посредством направленного воздействия на белок в каждом из путей. Примеры таких антител включают мультиспецифические антитела (например, биспецифические антитела, которые связываются с двумя разными молекулами-мишенями) и мультивалентные антитела (например, бивалентные антитела, которые связываются с двумя разными сайтами связывания одной молекулы-мишени). В области терапевтических антител было разработано несколько подходов, направленных на сочетание двух терапевтических антител с образованием одной молекулы, чтобы пользоваться преимуществами аддитивного или синергического действия при сохранении стабильности и других желательных свойств. Такие подходы включают рекомбинантные формы, такие как тандемный одноцепочечный вариабельный фрагмент (TdscFv) (Hagemeyer et al., 2009, Thromb Haemost 101:1012-1019; Robinson et al., 2008, Br J Cancer 99:1415-1425), диатела (Hudson et al., 1999, J Immunol Methods 231:177-189), тандемные диатела (Kipriyanov, 2009, Methods Mol Biol 562:177-193), антитела «два-в-одном» (Bostrom et al., 2009, Science 323:1610-1614) и антитела с двойными вариабельными доменами (Wu et al., 2007, Nat Biotechnol 25:1290-1297).

Одним примером заболевания, при котором привлекательным кажется двухкомпонентный терапевтический подход, является неоваскуляризация хороидеи. Сосудистый компонент неоваскуляризации хороидеи представляют клетки эндотелия сосудов, предшественники эндотелиоцитов и перициты. Внесосудистый компонент, который согласно гистопатологическим данным, по-видимому, служит источником ангиогенных стимулов и часто является наиболее выраженным компонентом в объемном выражении, представляют воспалительные, глиальные клетки, клетки пигментного эпителия сетчатки и фибробласты. Повреждение ткани может быть вызвано любым из указанных компонентов. Можно направленно воздействовать на каждый компонент по отдельности посредством разных средств монотерапии. Однако биспецифическое антитело против фактора роста эндотелия сосудов (VEGF) и фактора некроза опухоли (TNF) дает возможность воздействовать на оба компонента одновременно.

Распространенной проблемой, ассоциированной с мультиспецифическими и мультивалентными антителами является низкая стабильность, а также проблемы с промышленным выходом, чистотой и сродством. Были разработаны разные подходы для борьбы с указанными проблемами, включая рациональный дизайн и направленную эволюцию (Mabry and Snavely, 2010, IDrugs 13:543-549). Однако такие подходы занимают время и еще не дали результатов, которые были бы применимы повсюду.

Следовательно, в технике существует потребность в мультиспецифических и мультивалентных формах антител, которые стабильны и растворимы, и лишены недостатков традиционных мультиспецифических и мультивалентных форм антител.

Сущность изобретения

Согласно настоящему изобретению предложено антитело, которое связывается с несколькими антигенами, такое как биспецифические и бивалентные антитела, содержащее остатки определенных аминокислот в конкретных положениях в вариабельной области тяжелой и/или легкой цепи, которое является молекулой с высокой стабильностью.

Согласно одному аспекту настоящего изобретения предложены молекулы антител, связывающихся с несколькими антигенами, содержащие:

a) два вариабельных домена тяжелой цепи, один со специфичностью к антигену A (VH-A), а другой со специфичностью к антигену В (VH-B), и

b) два вариабельных домена легкой цепи, один со специфичностью к антигену A (VL-A), а другой со специфичностью к антигену В (VL-B),

причем по меньшей мере один из указанных двух вариабельных доменов тяжелой цепи содержит по меньшей мере один из следующих остатков: серии в положении АНо 12, серии или треонин в положении АНо 103, и серии или треонин в положении АНо 144; и/или причем по меньшей мере один из двух вариабельных доменов легкой цепи содержит аргинин в положении АНо 50.

Согласно определенным аспектам, указанный VH-A соединен с VL-A, и вместе они образуют одноцепочечное антитело со специфичностью к антигену A (scFv A), a VH-B соединен с VL-B, и вместе они образуют одноцепочечное антитело со специфичностью к антигену В (scFv В).

Согласно одному аспекту настоящего изобретения предложена молекула антитела, связывающегося с несколькими антигенами, содержащая: вариабельный домен тяжелой цепи со специфичностью к антигену A (VH-A), связанный с вариабельным доменом легкой цепи со специфичностью к антигену В (VL-B) пептидным линкером 1, и вместе они образуют конструкцию VH-A/VL-B; вариабельный домен тяжелой цепи со специфичностью к антигену В (VH-B), связанный с вариабельным доменом легкой цепи со специфичностью к антигену A (VL-A) пептидным линкером 2, и вместе они образуют конструкцию VH-B/VL-A; причем указанное антитело, связывающееся с несколькими антигенами, лишено константных доменов, по меньшей мере один из VL-A и VL-B содержит аргинин в положении АНо 50, и по меньшей мере один из VH-A и VH-B содержит по меньшей мере один из следующих остатков: серии в положении АНо 12, серии или треонин в положении АНо 103, и серии или треонин в положении АНо 144.

Согласно определенным аспектам конструкция VH-A/VL-B находится в ориентации VH-А-(линкер 1)-VL-B или в ориентации VH-В-(линкер 1)-VL-A. Согласно другим аспектам конструкция VH- В /VL- А находится в ориентации VH-В-(линкер 2)-VL-A или в ориентации VH-А-(линкер 2)-VL-B.

Согласно еще одному аспекту по меньшей мере один из VL-A или VL-B содержит каркасную последовательность, которая по меньшей мере на 65% идентична последовательности SEQ ID №: 6.

Согласно еще одному аспекту по меньшей мере один из VH-A или VH-B содержит каркасную последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности SEQ ID №:7.

Согласно еще одному аспекту по меньшей мере одна из конструкций VL-A/VH-B и VH-B/VL-A содержит вариабельную область легкой цепи человека из семейства Vkappal, вариабельную область легкой цепи человека из семейства Vlambda 1 или вариабельную область легкой цепи человека из семейства Vkappa3.

Согласно еще одному аспекту по меньшей мере одна из конструкций VL-A/VH-B и VH-B/VL-A содержит вариабельную область тяжелой цепи человека из семейства VH3, вариабельную область тяжелой цепи человека из семейства VH1a или вариабельную область тяжелой цепи человека из семейства VH1b.

Согласно еще одному аспекту домены VH и домены VL содержат CDR (гипервариабельные области) из антитела зайцеобразных.

Согласно еще одному аспекту настоящего изобретения также предложено антитело, связывающееся с несколькими антигенами, содержащее:

a) одноцепочечное антитело, содержащее вариабельный домен тяжелой цепи со специфичностью к антигену A (VH-A), связанный с вариабельным доменом легкой цепи со специфичностью к антигену A (VL-A) пептидным линкером 3, которые вместе образуют scFv-A;

b) одноцепочечное антитело, содержащее вариабельный домен тяжелой цепи со специфичностью к антигену В (VH-B), связанный с вариабельным доменом легкой цепи со специфичностью к антигену В (VL-B) пептидным линкером 3, которые вместе образуют scFv-B;

причем scFv-A соединен с scFv-B пептидным линкером 1, и по меньшей мере один из VL-A и VL-B содержит аргинин в положении АНо 50, и по меньшей мере один из VH-А и VH-B содержит по меньшей мере один из следующих остатков: серии в положении АНо 12, серии или треонин в положении АНо 103, и серии или треонин в положении АНо 144.

Согласно одному аспекту антитело, связывающееся с несколькими антигенами, согласно настоящему изобретению, содержит одноцепочечное антитело со специфичностью к антигену А и одноцепочечное антитело со специфичностью к антигену В в следующей форме: VH-A/VL-A - линкер - VH-B/VL-B. Согласно предпочтительному аспекту указанный линкер состоит из 20 аминокислот. Согласно другому предпочтительному аспекту указанный линкер содержит последовательность SEQ ID №: 4.

Согласно еще одному аспекту настоящего изобретения предложена молекула антитела, связывающегося с несколькими антигенами, содержащая: CDR из антитела зайцеобразных; вариабельный домен тяжелой цепи со специфичностью к антигену A (VH-А), связанный с вариабельным доменом легкой цепи со специфичностью к антигену В (VL-B) пептидным линкером 1, и вместе они образуют конструкцию VH-A/VL-B; вариабельный домен тяжелой цепи со специфичностью к антигену В (VH-B), связанный с вариабельным доменом легкой цепи со специфичностью к антигену A (VL-A) пептидным линкером 2, и вместе они образуют конструкцию VH-B/VL-A; причем по меньшей мере один из указанных вариабельных доменов тяжелой цепи содержит по меньшей мере три из следующих остатков: треонин (Т) в положении АНо 24, валин (V) в положении АНо 25, аланин (А) или глицин (G) в положении АНо 56, лизин (К) в положении АНо 82, треонин (Т) в положении АНо 84, валин (V) в положении АНо 89 и аргинин (R) в положении АНо 108. Согласно определенным аспектам такие антитела также содержат глутаминовую кислоту (Е) в положении АНо 1, валин (V) в положении АНо 3, лейцин (L) в положении АНо 4, серии (S) в положении АНо 10; аргинин (R) в положении АНо 47, серии (S) в положении АНо 57, фенилаланин (F) в положении АНо 91 и/или валин (V) в положении АНо 103 по меньшей мере в одном из указанных вариабельных доменов легкой цепи.

Специфические предпочтительные варианты реализации настоящего изобретения станут очевидны из следующего более подробного описания конкретных предпочтительных вариантов реализации и пунктов формулы изобретения.

Подробное описание

Подробные сведения, которые приводятся в настоящей заявке, даны только для примера и для иллюстрированного обсуждения предпочтительных вариантов реализации, ради представления в таком виде, который считается наиболее полезным и легко понятным описанием принципов и концептуальных аспектов разных вариантов реализации настоящего изобретения. В этой связи не совершается попыток показать структурные подробности настоящего изобретения более подробно, чем требуется для фундаментального понимания изобретения, и описание в совокупности с чертежами и/или примерами делает понятным специалистам в данной области техники, как несколько форм настоящего изобретения могут реализовываться на практике.

Чтобы настоящее изобретение могло быть более понятным, конкретные термины имеют определения, как указано далее, в подробном описании. Предполагается, что определения и объяснения должны контролироваться при любом последующем построении, если они явно и недвусмысленно не модифицированы в следующих примерах, или когда применение значения делает какое-либо построение лишенным смысла или в существенной степени лишенным смысла. В случаях, когда построение термина может делать его лишенным смысла или в существенной степени лишенным смысла, определение следует брать из Webster's Dictionary, 3-е издание, или словаря, известного специалистам в данной области техники, такого как Oxford Dictionary of Biochemistry and Molecular Biology (Ed. Anthony Smith, Oxford University Press, Oxford, 2004).

Основная цель настоящего изобретения состоит в том, чтобы предложить антитела, способные связываться с несколькими антигенами, которые применимы для терапевтических целей. Как впервые описано в настоящей заявке, свойства таких антител могут быть улучшены, когда определенные аминокислоты присутствуют в определенных положениях вариабельного домена легкой цепи и вариабельного домена тяжелой цепи. Такие улучшенные свойства включают, например, повышенную стабильность, выход продукции и чистоту.

Следовательно, согласно настоящему изобретению предложены антитела, которые связываются с несколькими антигенами, антитела, содержащие:

a) вариабельный домен тяжелой цепи со специфичностью к антигену A (VH-А), связанный с вариабельным доменом легкой цепи со специфичностью к антигену В (VL-B) пептидным линкером 1, и вместе они образуют конструкцию VH-A/VL-B;

b) вариабельный домен тяжелой цепи со специфичностью к антигену В (VH-В), связанный с вариабельным доменом легкой цепи со специфичностью к антигену A (VL-A) пептидным линкером 2, и вместе они образуют конструкцию VH-B/VL-A;

причем по меньшей мере один из VL-A и VL-B содержит аргинин в положении АНо 47 и/или 50, и по меньшей мере один из VH-A и VH-B содержит серии в положении АНо 12, серии или треонин в положении АНо 103, и/или серии или треонин в положении АНо 144. Согласно одному варианту реализации VL содержит аргинин в положении АНо 50, a VH содержит серии в положении АНо 12, треонин в положении АНо 103, и треонин в положении АНо 144.

Согласно предпочтительному варианту реализации антитело согласно настоящему изобретению является антителом, связывающимся с несколькими антигенами, которое лишено константных доменов, такое как антитело scFv.

Термин «scFv» относится к молекуле, содержащей вариабельный домен тяжелой цепи антитела (или область; VH) и вариабельный домен легкой цепи антитела (или область; VL), соединенные линкером, и лишенной константных доменов. Такие молекулы scFv могут обладать общей структурой: NH2-VL-линкер-VH-COOH или NH2-VH-линкер-VL-COOH. Подходящие линкеры описаны в настоящей заявке и известны специалистам в данной области техники, включая линкеры, описанные, например, в международной заявке на патент WO 2010/006454.

В настоящей заявке термин «антитело, связывающееся с несколькими антигенами» описывает антитело, которое содержит по меньшей мере четыре вариабельных домена и может связываться с двумя или более антигенами разных молекул-мишеней (например, биспецифические антитела) или двумя или более антигенами одной и той же молекулы-мишени (например, бивалентное антитело). Формы антител, связывающихся с несколькими антигенами, согласно настоящему изобретению включают без ограничений диатело, одноцепочечное диатело и тандемное диатело, которые известны специалистам в данной области техники.

В настоящей заявке термин «биспецифическое антитело» обозначает антитело, которое может связываться с двумя разными молекулами-мишенями.

В настоящей заявке термин «бивалентное антитело» обозначает антитело, которое может связываться с двумя разными сайтами одной молекулы-мишени.

Согласно определенным вариантам реализации, VL антитела, связывающегося с несколькими антигенами, согласно настоящему изобретению содержит по меньшей мере одну конкретную аминокислоту по меньшей мере в одном конкретном положении, что, как было показано в настоящей заявке, повышает стабильность формы антитела, связывающегося с несколькими антигенами, a VH антитела, связывающегося с несколькими антигенами, согласно настоящему изобретению содержит по меньшей мере одну из трех конкретных аминокислот по меньшей мере в одном из трех конкретных положений, что, как было показано в настоящей заявке, повышает стабильность формы антитела, связывающегося с несколькими антигенами. Согласно конкретному варианту реализации указанное положение в VL является положением АНо 50 и/или положением АНо 47, а аминокислота в указанном положении(ях) является аргинином. Согласно другому конкретному варианту реализации указанные положения в VH являются положениями АНо 12, 103 и 144, а предпочтительные аминокислоты в указанных положениях следующие: серии в положении АНо 12, серии или треонин в положении АНо 103 и серии или треонин в положении АНо 144. Согласно предпочтительному варианту реализации указанными аминокислотами в VH являются серии в положении АНо 12, треонин в положении АНо 103 и треонин в положении АНо 144. Согласно определенным вариантам реализации указанные предпочтительные аминокислоты можно вводить в VL и/или VH путем замены существующей в природе аминокислоты в идентифицированном положении(ях).

Система нумерации АНо более подробно описана у Honegger, А. и Pluckthun, А. (2001) J. Mol. Biol. 309:657-670). В качестве альтернативы можно применять систему нумерации Кабата, описанную более подробно у Kabat et al. (Kabat, Ε. Α., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242). Таблицы перевода для двух разных систем нумераций, применяемых для идентификации положений остатков аминокислот в областях легких и тяжелых цепей антитела, приведены в A. Honegger, 2001, J.Mol.Biol. 309:657-670. Соответствующий номер по Кабату для положения АНо 47 в VL равен 39. Соответствующий номер по Кабату для положения АНо 50 в VL равен 42. Соответствующий номер по Кабату для положения АНо 12 в VH равен 11. Соответствующий номер по Кабату для положения АНо 103 в VH равен 89. Соответствующий номер по Кабату для положения АНо 144 в VH равен 108.

Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения предложены антитела, связывающиеся с несколькими антигенами, содержащие одну или более предпочтительных аминокислот в предпочтительных положениях, раскрываемых в настоящей заявке, и которые обладают специфичностью связывания в отношении по меньшей мере двух антител, или фрагменты таких антител, включая, например, Fab, Fab', F(ab')₂, Fv или одноцепочечный Fv. Также такие антитела могут быть димером легких или тяжелых цепей, или любым их минимальным фрагментом, таким как Fv или одноцепочечная конструкция, описанные в Ladner et al. Патент США №4946778, содержание которого в явном виде включено посредством ссылки. Согласно определенным вариантам реализации такие антитела, связывающиеся с несколькими антигенами, содержат по меньшей мере один VL, содержащий аргинин в положении АНо 50, и по меньшей мере один VH, содержащий серии в положении АНо 12, серии или треонин в положении АНо 103 и серии или треонин в положении АНо 144.

Линкеры и конструкции VH/VL

В настоящей заявке термины «пептидный линкер 1» и «пептидный линкер 2» относятся к линкерным пептидам, которые соединяют вариабельные домены в конструкции VH/VL друг с другом, или одну или более конструкций scFv вместе. «Конструкцией VH/VL» может быть: конструкция VH-A/VL-B или конструкция VH-B/VL-A, которая содержит домен VH с CDR, которые связываются с конкретным антигеном, и домен VL с CDR, которые связываются с другим антигеном; или конструкция VH-A/VL-A или конструкция VH-B/VL-B, которая содержит домен VH с CDR, которые связываются с конкретным антигеном, и домен VL с CDR, которые связываются с тем же антигеном. Формой таких конструкций может быть VH-L-VL или VL-L-VH, где L обозначает пептидный линкер 1 или 2. Такие пептидные линкеры обладают длиной предпочтительно 20 или менее аминокислот. В частности, такие пептидные линкеры обладают длиной 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 аминокислот. Согласно определенным вариантам реализации пептидные линкеры обладают длиной 3-7 аминокислот. Предпочтительная линкерная последовательность для пептидного линкера 1 и/или пептидного линкера 2 - это GGGGS (SEQ ID №: 1). Другие линкерные последовательности, применимые в качестве пептидного линкера 1 и/или пептидного линкера 2 в антителе, связывающемся с несколькими антигенами, согласно настоящему изобретению включают: GGS и GGGGGGS (SEQ ID №: 2). Согласно определенным вариантам реализации конструкцией VH/VL может быть одноцепочечное антитело. Линкеры в одноцепочечных антителах известны в технике. Предпочтительно линкер для одноцепочечного антитела, который связывает домен VH и домен VL, которые связываются с предпочтительным антигеном в антителе согласно настоящему изобретению, может быть до 20 аминокислот длиной, например, может содержать последовательность SEQ ID №: 4, показанную ниже.

Согласно определенным вариантам реализации конструкция VH/VL соединена с другой конструкцией VH/VL пептидным линкером 3. Согласно другим вариантам реализации вариабельные домены в конструкции VH/VL соединены друг с другом пептидным линкером 3. Пептидный линкер 3 предпочтительно обладает длиной более чем приблизительно 10 аминокислот и менее чем приблизительно 30 аминокислот. В частности, пептидный линкер 3 обладает длиной 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 аминокислот. Согласно определенным вариантам реализации пептидный линкер 3 обладает длиной 10-15 аминокислот. Предпочтительная линкерная последовательность для пептидного линкера 3 - это GSDSNAGRASAGNTS (SEQ ID №: 3). Другая линкерная последовательность для пептидного линкера 3 - это (GGGGS)4 (SEQ ID №: 4). Специалист в данной области техники должен понимать, что в последовательность линкера можно вносить консервативные изменения (например, замены), не влияющие на активность и предпочтительные свойства антитела, связывающегося с несколькими антигенами, согласно настоящему изобретению.

Согласно определенным вариантам реализации, конструкция VH/VL может быть в одной из следующих форм: VH-А-(линкер 1 или 2)-VL-B; VH-В-(линкер 1 или 2)-VL-A; VH-А-(линкер 1 или 2)-VL-A; VH-В-(линкер 1 или 2)-VL-B; VL-А-(линкер 1 или 2)-VH-A; VL-В-(линкер 1 или 2)-VH-B. Специалисты в данной области техники могут предложить другие ориентации доменов VH и VL в конструкции VH/VL. Например, VL-А-(линкер 1 или 2)-VH-B, VL-B-(линкер 1 или 2)-VH-A, VL-А-(линкер 1 или 2)-VH-A, VL-В-(линкер 1 или 2)-VH-B. Согласно конкретным вариантам реализации, где конструкции VH/VL соединены пептидным линкером 3, может быть создана одна из следующих форм: VH-A-(линкер-1)-VL-А-(линкер 3)-VH-В-(линкер 2)-VL-B; VH-А-(линкер-1)-VL-В-(линкер 3)-VH-В-(линкер 2)-VL-A; VL-А-(линкер-1)-VH-В-(линкер 3)-VL-В-(линкер 2)-VH-A, VL-A-(линкер-1)-VH-А-(линкер 3)-VL-В-(линкер 2)-VH-B. Указанные в настоящей заявке формы являются неограничивающими примерами, и следует ясно понимать, что специалисты в данной области техники могут расположить домены VH и VL в разных других ориентациях, при условии, что достигается связывание целевых антигенов, когда указанные конструкции образуются и должным образом сворачиваются.

Согласно одному варианту реализации антитело, связывающееся с несколькими антигенами, согласно настоящему изобретению содержит одноцепочечное антитело со специфичностью к антигену А и одноцепочечное антитело со специфичностью к антигену В в следующей форме: VH-A/VL-A - линкер 3 - VH-B/VL-B, причем линкер 3 обладает последовательностью SEQ ID №: 4.

Согласно одному варианту реализации предпочтительной формой антитела, связывающегося с несколькими антигенами, согласно настоящему изобретению является: VH-A-SEQ ID №: 1-VL-B-SEQ ID №: 4-VH-B-SEQ ID №: 1-VL-A.

В качестве альтернативы, конструкции VH/VL согласно настоящему изобретению могут быть функционально связаны (например, химической связью, генетическим слиянием, нековалентной связью или другим образом) с другой конструкцией с образованием антитела, связывающегося с несколькими антигенами.

Согласно настоящему изобретению предложены антитела, которые связываются с несколькими антигенами. Как описано в настоящей заявке, такие антитела могут связываться с разными молекулами-мишенями (например, биспецифическое антитело, обладающее специфичностью по меньшей мере в отношении двух разных белков) или связывающиеся с разными эпитопами на одной молекуле-мишени (например, бивалентное антитело, обладающее специфичностью в отношении одного белка, но связывающееся с двумя или более сайтами связывания на указанном белке). Специалист в данной области техники может выбрать конкретные молекулы-мишени в зависимости от потребности.

В качестве примера, но не с целью ограничения, согласно настоящему изобретению предложено биспецифическое антитело, которое обладает специфичностью в отношении VEGF и TNFα, как описано в разделе «Примеры» в настоящей заявке. Такое антитело применимо при лечении заболеваний, при которых желательно ингибировать VEGF и TNFα.

Согласно определенным вариантам реализации анти-VEGF/TNFα антитело можно применять при лечении возрастной макулярной дегенерации, неоваскуляризации хороидеи, неоваскулярной глаукомы, диабетической ретинопатии, ретинопатии недоношенных, ретролентальной фиброплазии, рака молочной железы, рака легких, рака желудка, карцином пищевода, рака толстой и ободочной кишки, карцином печени, карцином яичника, комы, арренобластомы, рака шейки матки, карциномы эндометрия, гиперплазии эндометрия, эндометриоза, фибросарком, хориокарциномы, рака головы и шеи, носоглоточной карциномы, карциномы глотки, гепатобластомы, саркомы Капоши, меланомы, карциномы кожи, гемангиомы, кавернозной гемангиомы, гемангиобластомы, карцином поджелудочной железы, ретинобластомы, астроцитомы, глиобластомы, невриномы, олигодендроглиомы, гранулобластомы, остеобластической саркомы, лейомиосаркомы, карцином мочевыводящих путей, рака щитовидной железы, опухоли Вильма, почечно-клеточной карциномы, рака предстательной железы, пролиферации сосудов в брюшной полости, ассоциированной с факоматозом, отеков (таких как отеки, ассоциированные с опухолями головного мозга), синдрома Мейгса, ревматоидного артрита, псориаза, атеросклероза, хронических и/или аутоиммунных состояний воспаления при общих, иммуно-опосредованных воспалительных расстройствах в целом, воспалительных заболеваний ЦНС, воспалительных заболеваний, поражающих глаз, суставы, кожу, слизистые оболочки, центральную нервную систему, желудочно-кишечный тракт, мочевыводящие пути или легкие, состояний увеита в целом, ретинита, HLA-B27+ увеита, синдрома Бехчета, синдрома сухого глаза, глаукомы, синдрома Шегрена, сахарного диабета (включая диабетическую невропатию), резистентности к инсулину, состояний артрита в целом, ревматоидного артрита, остеоартрита, реактивного артрита и синдрома Рейтера, ювенильного артрита, анкилозирующего спондилита, множественного склероза, острого первичного идиопатического полирадикулоневрита, тяжелой миастении, бокового амиотрофического склероза, саркоидоза, гломерулонефрита, хронических заболеваний почек, цистита, псориаза (включая псориатический артрит), гнойного гидраденита, панникулита, гангренозной пиадермии, синдрома SAPHO (синовиит, акне, пустулез, гиперостоз и остеит), акне, синдрома Свита, пузырчатки, болезни Крона (включая внекишечные проявления), язвенного колита, бронхиальной астмы, пневмонита гиперчувствительности, аллергий в целом, аллергического ринита, аллергического синусита, хронической обструктивной болезни легких (ХОБЛ), фиброза легких, грануломатоза Вегенера, синдрома Кавасаки, гигантоклеточного артериита, васкулита Чарг-Стросса, узелкового полиартериита, ожогов, болезни «трансплантат против хозяина», реакций «трансплантат против хозяина», эпизодов отторжения после трансплантации органов или костного мозга, системных и местных состояний васкулитов в целом, системной и дисковидной красной волчанки, полимиозита и дерматомиозита, склеродермии, преэклампсии, острого и хронического панкреатита, вирусного гепатита, алкогольного гепатита, послеоперационного воспаления, такого как после операции (например, операция по удалению катаракты (замена хрусталика глаза) или по борьбе с глаукомой), операции на суставах (включая артроскопическую операцию), операции на связанных с суставом структурах (например, связки), стоматологических операций или операций в полости рта, минимально инвазивных сердечно-сосудистых процедур (например, ЧТКА (чрескожная транслюминальная коронарная ангиопластика), атерэктомия, установка стента), лапароскопических и/или внутрибрюшных и гинекологических процедур, эндоскопических урологических процедур (например, операции на предстательной железе, уретероскопия, цистоскопия, интерстициальный цистит) или периоперационного воспаления (профилактика) в целом, болезни Альцгеймера, болезни Паркинсона, болезни Хантингтона, паралича Белла, болезни Крейцфельда-Якоба, связанного с раком остеолиза, связанного с раком воспаления, связанной с раком боли, связанного с раком истощения, метастазов в костях, острой и хронической формы боли, независимо от того, вызвана она центральными или периферическими эффектами TNFα, и классифицируется ли она как воспалительная, ноцитептивная или невропатическая форма боли, ишиалгии, боли в нижнем отделе спины, синдрома канала запястья, рефлекторной симпатической дистрофии (CRPS), подагры, постгерпетической невралгии, фибромиалгии, состояний местной боли, хронических болевых синдромов в связи с метастазами опухоли, дисменореи, бактериального, вирусного или грибкового сепсиса, туберкулеза, СПИДа, атеросклероза, ишемической болезни сердца, артериальной гипертензии, дислипидемии, сердечной недостаточности и хронической сердечной недостаточности.

Связывание антител согласно настоящему изобретению с их специфическими антигенами-мишенями можно подтвердить, например, при помощи твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA), градиоиммуноанализа (РИА), анализа FACS (флуоресцентной сортировки клеток), биологического анализа (например, ингибирование роста) или при помощи иммуноблоттинга. Каждый из указанных способов анализа в целом позволяет выявить присутствие комплексов белок-антитело, представляющих интерес, путем применения меченных реагентов (например, антитела), специфичных в отношении рассматриваемого комплекса. В качестве альтернативы, комплексы можно выявлять при помощи применения любого из разнообразных способов иммунного анализа. Например, к указанному антителу можно присоединить радиоактивную метку и применять его при радиоиммуноанализе (RIA) (см., например, Weintraub, В., Principles of Radioimmunoassays, Seventh Training Course on Radioligand Assay Techniques, The Endocrine Society, March, 1986, которая включена в настоящую заявку посредством ссылки). Радиоактивный изотоп можно определить такими средствами, как применение γ-счетчика или сцинтилляционного счетчика, или посредством авторадиографии.

Антитела согласно настоящему изобретению применимы для целого ряда целей, включая терапевтические и диагностические цели.

Характеристики доменов VL и VH

Согласно определенным вариантам реализации VL и VH антитела, связывающегося с несколькими антигенами, согласно настоящему изобретению содержат CDR из антитела человека, нечеловеческого антитела (такого как антитело, которое образовалось в организме грызуна, низшего примата, зайцеобразного или любого другого подходящего животного), химерного антитела, гуманизированного антитела и подобного. Согласно конкретному варианту реализации указанные CDR получены из антитела зайцеобразных.

Термин «зайцеобразные» относится к членам таксономического отряда Зайцеобразных, включающего семейства Leporidae (например, зайцевые) и Ochotonidae (пищухи). Согласно наиболее предпочтительному варианту реализации указанным зайцеобразным является кролик. В настоящей заявке термин «кролик» относится к животному, принадлежащему к семейству Leporidae.

Термин «CDR» относится к одному из шести гипервариабельных областей в вариабельных доменах антитела, который вносит главный клад в связывание с антигеном. Одно из наиболее часто применяемых определений для шести CDR было предложено Kabat Ε.A. et al. (1991, Sequences of proteins of immunological interest. NIH Publication 91-3242). В некоторых случаях определение CDR Кабата может применяться только к CDR1, CDR2 и CDR3 вариабельного домена легкой цепи (CDR LI, CDR L2, CDR L3 или L1, L2, L3), а также к CDR2 и CDR3 вариабельного домена тяжелой цепи (CDR Н2, CDR Н3 или Н2, Н3), тогда как CDR1 вариабельного домена тяжелой цепи (CDR H1 or H1) определяется по следующим остаткам (нумерация Кабата): CDR1 тяжелой цепи начинается с положения 26 и заканчивается перед положением 36. Данное определение в основе является сочетанием CDR H1, которые по разному определяются у Кабата и Хотиа.

Согласно одному варианту реализации VL в антителе scFv, связывающемся с несколькими антигенами, согласно настоящему изобретению содержит последовательность, которая по меньшей мере на 65% идентична, более предпочтительно по меньшей мере на 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, более предпочтительно на 99% идентична следующей последовательности (SEQ ID №: 5):

EIVMTQSPSTLSASVGDRVIITC (X)_n=1-50 WYQQKPGRAPKLLIY (X)_n=1-50

GVPSRFSGSGSGAEFTLTISSLQPDDFATYYC(X)_n=1-50 FGQGTKLTVLG

Согласно другому варианту реализации VH антитела scFv, связывающегося с несколькими антигенами, согласно настоящему изобретению содержит последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична, более предпочтительно по меньшей мере на 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, более предпочтительно на 99% идентична следующей последовательности (SEQ ID №: 6):

ΕVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCTAS (X)_n=1-50 WVRQAPGKGLEWVG (X)_n=1-50

RFTISRDTSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCAR (X)_n=1-50 WGQGTLVTVSS

В настоящей заявке под Х-остатками понимают сайты встраивания CDR. X может быть существующей в природе аминокислотой; по меньшей мере могут присутствовать три и до 50 аминокислот. Подразумевается, что каркасные последовательности SEQ ID №: 5 и SEQ ID №: 6 - это последовательности без Х-остатков.

Подходящие каркасные области антител, применимые для антитела, связывающегося с несколькими антигенами, согласно настоящему изобретению включают без ограничений: вариабельную область легкой цепи человека из семейства Vkappal, вариабельную область легкой цепи человека из семейства Vlambda 1, вариабельную область легкой цепи человека из семейства Vkappa3, вариабельную область тяжелой цепи человека из семейства VH3, вариабельную область тяжелой цепи человека из семейства VH1a и вариабельную область тяжелой цепи человека из семейства VH1b, причем указанная вариабельная область легкой цепи содержит или разработана так, чтобы содержать (например, путем замены существующей в природе аминокислоты) аргинин в положении АНо 47 и/или 50, а указанная вариабельная область тяжелой цепи содержит или разработана так, чтобы содержать (например, путем замены существующей в природе аминокислоты) серии в положении АНо 12, серии или треонин в положении АНо 103 и серии или треонин в положении АНо 144.

Неограничивающие примеры каркасных областей, которые можно применять для генерирования антитела, связывающегося с несколькими антигенами, согласно настоящему изобретению, включают каркасные области, раскрываемые в международной заявке на патент WO 2008/004834, международной заявке на патент WO 2009/155726 и в международной заявке на патент WO 03/097697, полное содержание которых включено в настоящую заявку посредством ссылки. В таких примерах вариабельная область легкой цепи может быть модифицирована с включением аргинина в положении АНо 47 и/или 50, а вариабельная область тяжелой цепи может быть модифицирована с включением серина в положении АНо 12, серина или треонина в положении АНо 103, и/или серина или треонина в положении АНо 144.

В настоящей заявке термин «каркасная область антитела» или «каркасная область» относится к части вариабельного домена, VL или VH, которые служат каркасом для антиген-связывающих петель (CDR) данного вариабельного домена. По существу это вариабельный домен без CDR.

В настоящей заявке термин «идентичность» относится к соответствию последовательностей двух полипептидов, молекул или нуклеиновых кислот. Когда определенное положение в обеих из двух сравниваемых последовательностей занято мономером одного и того же основания или аминокислоты (например, если положение в двух молекулах ДНК занято аденином или положение в каждом из двух полипептидов занято лизином), то соответствующие молекулы идентичны по данному положению. «Процент идентичности» между двумя последовательностями является функцией числа соответствующих положений, общих для двух последовательностей, разделенного на число сравниваемых положений ×100. Например, если 6 из 10 положений в двух последовательностях соответствуют друг другу, то такие две последовательности обладают идентичностью 60%. В качестве примера последовательности ДНК CTGACT и CAGGTT идентичны на 50% (3 из полных 6 положений соответствуют друг другу). Как правило, сравнение проводят, когда две последовательности выровнены для получения максимальной идентичности. Такого выравнивания можно достичь, например, пр