Композиция для предотвращения запахов, содержащая не имеющие запах микроорганизмы, и ее применение

Композиция для предотвращения запахов, содержащая не имеющие запах микроорганизмы, и ее применение

Иллюстрации

Показать все

Реферат

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

(a) Область техники

Изобретение относится к композиции для предотвращения запахов, содержащей не имеющие запах микроорганизмы или их культуру, и способу предотвращения запахов с их применением.

(b) Уровень техники изобретения

Чистый воздух признан неотъемлемым компонентом для здоровья и благосостояния человека. Неприятно пахнущий или загрязненный воздух значительно портит приятную атмосферу. Например, неудовлетворительное качество воздуха в помещении при условиях герметичности обусловлено двумя важными факторами. Одним из них являются загрязнители воздуха, генерируемые непосредственно материалами, которые составляют воздухонепроницаемую среду (например, здание, транспортное средство и т.д.), а другой - это запах, генерируемый в результате деятельности человека или обусловленный внешними веществами системы кондиционирования воздуха.

Система кондиционирования воздуха относится к системе, разработанной для снижения температуры внутри помещения и оптимизации атмосферы внутри помещения в зданиях, транспортных средствах, поездах, кораблях, воздушных суднах и т.д. с целью кондиционирования температуры, влажности, скорости потока и чистоты воздуха. С улучшением уровня жизни применение системы кондиционирования воздуха постепенно увеличивается. Несмотря на большое количество улучшений в основной функции системы кондиционирования воздуха еще предстоит решить много проблем в экологическом аспекте качества воздуха в помещениях.

Причиной запаха в системе кондиционирования воздуха, в частности кондиционере, как известно, являются метаболиты, продуцируемые плесневыми грибами и бактериями. Однако конкретно еще не идентифицировано, какие плесневые грибы и бактерии продуцируют какое количество данных метаболитов.

В системе кондиционирования воздуха весь воздух, который проходит через вентилятор, проходит сердцевину испарителя. Во время теплообмена между холодным охлаждающим веществом и воздухом на поверхности сердцевины испарителя вследствие разницы температур происходит конденсация воды. Когда конденсации воды продолжается, создается окружающая среда, благоприятная для заселения и пролиферации плесневых грибов и бактерий на сердцевине испарителя. Если плесневые грибы и бактерии размножаются на сердцевине испарителя, на которую воздействует наружный воздух, микроорганизмы продуцируют в качестве метаболитов микробные летучие органические соединения (mVOC). Таким образом, когда воздух, который проходит через сердцевину испарителя, дует внутри помещений, внутренняя часть помещения может подвергаться неприятному запаху вследствие летучих органических соединений, продуцируемых плесневыми грибами и бактериями после длительного использования.

После длительного использования поверхность сердцевины испарителя покрыта биопленкой, которая состоит из бактерий, скоплений клеток и внеклеточных полимерных веществ (EPS). EPS включают в себя различные компоненты, такие как белки, полисахариды, полиуроновые кислоты, нуклеиновые кислоты, липиды и т.д. На поверхности сердцевины испарителя различные бактерии и плесневые грибы пролиферируют вместе с биопленкой в качестве питательной среды и продуцируют различные микробные летучие органические соединения (mVOC) в качестве метаболитов, которые известны как причины скверного запаха кондиционера воздуха.

Хотя различные типы ароматических веществ являются коммерчески доступными для устранения данного неприятного запаха, они не устраняют коренным образом плесневые грибы и бактерии, пролиферирующие на сердцевине испарителя, а всего лишь временно разбавляют неприятный запах. Также антибактериальные агенты, которые являются коммерчески доступными в настоящее время, не разработаны для действия конкретно на отдельные плесневые грибы или бактерии, пролиферирующие на сердцевине испарителя, но их применяют, потому что считается, что они обладают антибактериальным действием против основных патогенных микроорганизмов.

Авторы представленного изобретения раскрыли в патентной публикации Кореи № 10-2012-0020309 способ изготовления сердцевины испарителя, покрытой биопленкой, образованной специальными микроорганизмами, которые не имеют запаха или аромата для предотвращения прикрепления и роста бактерий и плесневых грибов, которые вызывают неприятный запах на сердцевине испарителя.

Однако не было идентифицировано, какие бактерии являются не имеющими запаха микроорганизмами. Также не было ясно показано, могут ли они выживать на сердцевине испарителя после нанесения на него и могут ли предотвратить заселение микроорганизмов, вызывающих неприятный запах, и вследствие этого могут ли предотвращать неприятный запах.

Описание выше уровня техники данной области предназначено только для улучшения понимания уровня техники представленного изобретения и не должно истолковываться как признание, что описанные выше методики являются известными рядовым специалистам в области техники, к которой относится представленное изобретение.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Авторы представленного изобретения предприняли усилия, чтобы найти способ эффективного контроля микроорганизмов, вызывающих неприятный запах, с применением не имеющих запаха микроорганизмов. В результате авторы успешно провели скрининг 13 разновидностей микроорганизмов, которые не вызывают неприятный запах в системе кондиционирования воздуха, и подтвердили, что когда биопленку образуют с применением их или их комбинации, рост вызывающих неприятный запах микроорганизмов можно предотвратить, и, таким образом, неприятный запах можно предотвратить.

Представленное изобретение направлено на предоставление композиции для предотвращения запахов, которая содержит не имеющие запаха микроорганизмы или их культуру.

Представленное изобретение также направлено на предоставление сердцевины испарителя, покрытого композицией для предотвращения запахов.

Представленное изобретение также направлено на предоставление способа изготовления не имеющей запаха сердцевины испарителя, которая не вызывает запах в системе кондиционирования воздуха, который включает нанесение композиции для предотвращения запахов на сердцевину испарителя.

Представленное изобретение также направлено на предоставление способа предотвращения запахов из системы кондиционирования воздуха, который включает нанесение композиции для предотвращения запахов на сердцевине испарителя.

Представленное изобретение также направлено на предоставление способа проверки запахов из системы кондиционирования воздуха, который включает нанесение композиции для предотвращения запахов на сердцевину испарителя.

Представленное изобретение также направлено на предоставление не имеющих запаха микроорганизмов для покрытия сердцевины испарителя для предотвращения запахов из системы кондиционирования воздуха.

Другие цели и преимущества представленного изобретения будут очевидны из следующего подробного описания, чертежей и формулы изобретения.

В одном аспекте представленное изобретение предоставляет композицию для предотвращения запахов, которая содержит не имеющие запаха микроорганизмы или их культуру.

Авторы представленного изобретения предприняли усилия, чтобы найти способ эффективного контроля микроорганизмов, вызывающих неприятный запах, с применением не имеющих запаха микроорганизмов. В частности, авторы пытались искоренить принципиальную причину неприятных запахов из системы кондиционирования воздуха. В результате авторы успешно провели скрининг 13 разновидностей микроорганизмов, которые не вызывают неприятный запах в системе кондиционирования воздуха, и подтвердили, что когда биопленку образуют с применением их или их комбинации, рост вызывающих неприятный запах микроорганизмов можно предотвратить, и, таким образом, неприятный запах можно предотвратить.

В представленном изобретении термин «система кондиционирования воздуха» относится к системе, которая поддерживает температуру, влажность, чистоту, поток и т.д. воздуха внутреннего пространства, которое полностью или частично изолировано от внешней среды. В качестве предпочтительного примера, изолированное пространство может являться внутренним пространством, которое полностью или частично изолировано от внешней среды, такое как внутри здания, транспортного средства, поезда, корабля, воздушного судна и т.д. В качестве предпочтительного примера, системой кондиционирования воздуха может быть кондиционер воздуха.

В системе кондиционирования воздуха весь воздух, который проходит через вентилятор, проходит сердцевину испарителя. На поверхности сердцевины испарителя создаются благоприятные условия для роста микроорганизмов в виде конденсации воды вследствие того, что сохраняется разница температур. В результате со временем образуется биопленка. Микроорганизмы метаболизируют различные вещества, витающие в воздухе внутри помещений или вне помещения, в качестве питательных веществ и продуцируют различные микробные летучие органические соединения (mVOC) в виде метаболитов, которые выделяют скверный запах.

Биопленка представляет собой группу живых микроорганизмов, заключенных в мембрану. Мембрана защищает микроорганизмы от внешней среды и снабжает питательными веществами. Мембрана состоит из внеклеточных полимерных веществ (EPS), которые включают в себя различные компоненты, такие как белки, полисахариды, полиуроновые кислоты, нуклеиновые кислоты, липиды и т.д. На поверхности сердцевины испарителя пролиферируют разнообразные микроорганизмы, используя их в качестве питательных веществ, и продуцируют метаболиты, которые выделяют неприятный запах.

Авторы представленного изобретения провели скрининг микроорганизмов, которые не вызывают неприятный запах из сердцевины испарителя, и посредством культивирования выделили доминирующие штаммы, которые образуют колонии микроорганизмов. Доминирующие штаммы могут быть выделены и культивированы, согласно различным способам, известным в предшествующем уровне техники, и можно было провести скрининг доминирующих микроорганизмов, например, основываясь на степени разбавления или морфологических характеристиках, таких как цвет, размер, форма и т.д., колоний.

Доминирующие микроорганизмы включают в себя Methylobacterium, Acinetobacter, Bacillus, Brevibacillus, Deinococcus, Pseudomonas, Sphingomonas или Flavobacterium, конкретно Methylobacterium aquaticum, Methylobacterium brachiatum, Methylobacterium platani, Acinetobacter johnsonii, Bacillus vietnamensis, Brevibacillus invocatus, Deinococcus ficus, Leifsonia soli, Pseudomonas nitroreducens, Sphingomonas aquatilis, Methylobacterium komagatae, Deinococcus apachensis или Flavobacterium oceanosedimentum.

Данные микроорганизмы помещали в Корейский Центр культивирования микроорганизмов 14 ноября 2012 года или 10 декабря 2013 года, и им были даны следующие учетные номера: Methylobacterium aquaticum HKMC-1 (Учетный номер: KCCM11325P), Methylobacterium brachiatum HKMC-2 (Учетный номер: KCCM11326P), Methylobacterium platani HKMC-3 (Учетный номер: KCCM11327P), Acinetobacter johnsonii HKMC-4 (Учетный номер: KCCM11328P), Bacillus vietnamensis HKMC-5 (Учетный номер: KCCM11329P), Brevibacillus invocatus HKMC-6 (Учетный номер: KCCM11330P), Deinococcus ficus HKMC-7 (Учетный номер: KCCM11331P), Leifsonia soli HKMC-8 (Учетный номер: KCCM11332P), Pseudomonas nitroreducens HKMC-9 (Учетный номер: KCCM11333P), Sphingomonas aquatilis HKMC-10 (Учетный номер: KCCM11334P), Methylobacterium komagatae HKMC-11 (Учетный номер: KCCM11335P), Deinococcus apachensis HKMC-12 (Учетный номер: KCCM11499P) и Flavobacterium oceanosedimentum HKMC-13 (Учетный номер: KCCM11500P).

Микроорганизмы могут быть включены в композицию для предотвращения запахов по отдельности или в комбинации с другими микроорганизмами.

Композицию для предотвращения запахов по настоящему изобретению можно применять для предотвращения заселения продуцирующих неприятный запах микроорганизмов и/или неприятных запахов, продуцируемых ими. Другими словами, композицию по настоящему изобретению можно применять для предотвращения заселения продуцирующих неприятный запах микроорганизмов посредством нанесения или распыления на все или отдельные части продуцирующих неприятный запах устройств (например, системы кондиционирования воздуха, блока обработки использованной воды и т.д.), изделий (например, мусорной корзины, туалетного бачка и т.д.), животных (например, загрязненного домашнего скота и т.д.) или тела человека (например, ротовая полость, диабетическая стопа и т.д.).

Композиция для предотвращения запахов по настоящему изобретению может дополнительно содержать различные средовые компоненты, известные в предшествующем уровне техники, для улучшения образования биопленки на различных объектах. Средовые компоненты могут включать в себя, например, агар, желатин, альгинат, каррагинан или пектин. Конкретно, для сердцевины испарителя в системе кондиционирования воздуха можно применять среду PTYG, среду R2A или среду LB.

Композиция для предотвращения запахов по настоящему изобретению может дополнительно содержать, в дополнение к не имеющим запаха микроорганизмам, ароматическое вещество, стерилизующий агент, противомикробный агент и т.д. для предотвращения неприятных запахов или для предотвращения или устранения продуцирующих неприятный запах микроорганизмов.

В предпочтительном иллюстративном варианте осуществления представленного изобретения композиция представленного изобретения предназначена для предотвращения запахов из системы кондиционирования воздуха.

Система кондиционирования воздуха, к которой применима композиция по настоящему изобретению, может быть установлена в зданиях, транспортных средствах, поездах, кораблях, воздушных суднах и т.д. с целью кондиционирования температуры, влажности, скорости потока или чистоты воздуха.

Объектом, на который наносится биопленка по настоящему изобретению, может быть система кондиционирования воздуха. Система кондиционирования воздуха включает в себя компрессор, вентилятор, сердцевину испарителя и т.д. Конкретно, объектом, на который наносится биопленка по настоящему изобретению, может быть сердцевина испарителя.

В частности, среда, благоприятная для заселения и пролиферации микроорганизмов, создается на поверхности сердцевины испарителя в системе кондиционирования воздуха вследствие теплообмена воздуха. Со временем микроорганизмы, заселившиеся на поверхности, образуют стабильную биопленку, которую трудно удалить. Другими словами, не имеющие запаха микроорганизмы могут пролиферировать заблаговременно, так чтобы можно было предотвратить заселение продуцирующих неприятный запах микроорганизмов.

Авторы представленного изобретения обнаружили, что биопленка, состоящая только из не имеющих запаха микроорганизмов, которые представляют собой доминирующие виды или обладают наилучшей жизнеспособностью, может быть образована на сердцевине испарителя посредством заблаговременного их нанесения на сердцевину испарителя системы кондиционирования воздуха, и, тем самым, неприятные запахи и пролиферацию и заселение других продуцирующих неприятный запах микроорганизмов можно в значительной степени предотвратить (Примеры 9-14).

В еще одном аспекте представленное изобретение предоставляет сердцевину испарителя, покрытую композицией для предотвращения запахов, и способ ее изготовления.

Пластина сердцевины испарителя изготовлена из алюминия или сплава алюминия, а сердцевина испарителя изготовлена с применением обработанного антибактериальным составом алюминия или необработанного антибактериальным составом сплава алюминия. Однако материал сердцевины испарителя не ограничен алюминием или сплавом алюминия. В целом сердцевина испарителя может быть изготовлена из любого металла, обладающего хорошей теплопроводностью и высокой стойкостью к коррозии, такого как медь, в дополнение к алюминию или его сплаву. В электрическом транспортном средстве, например, теплообменник может быть соединен с устройством Пельтье. Подобно этому может быть использован любой материал, пока не будет достигнута структура, делающая возможным легкое осуществление теплообмена.

Композиция для предотвращения запахов, содержащая не имеющие запаха микроорганизмы или их культуру, может быть нанесена на сердцевину испарителя, согласно различным способам, известным в предшествующем уровне техники (например, распыление, покрытие, погружение). Предпочтительно, сердцевина испарителя может быть погружена в культуру не имеющих запаха микроорганизмов, так чтобы не имеющие запаха микроорганизмы могли быть равномерно нанесены на пластину внутри сердцевины испарителя. Покрытие может выполняться однократно или несколько раз.

Культура не имеющих запаха микроорганизмов может иметь оптическую плотность (O.D.), составляющую 0,3-0,9, более предпочтительно 0,4-0,8.

При применении культуры микроорганизмов, имеющей значение O.D., составляющее 0,3-0,9, микроорганизмы могут быть нанесены в концентрации, составляющей 10⁴-10⁸ КОЕ/г. И при применении культуры микроорганизмов, имеющей значение O.D., составляющее 0,4-0,89, микроорганизмы могут быть нанесены в концентрации, составляющей 10⁵-10⁷ КОЕ/г. Учитывая, что концентрация микроорганизмов, представленных на сердцевине испарителя в используемом транспортном средстве, составляет приблизительно 10⁶ КОЕ/г, микроорганизмы можно предпочтительно наносить в концентрации, составляющей 10⁵-10⁷ КОЕ/г, с применением культуры микроорганизмов, обладающей значением O.D., составляющим 0,4-0,8.

Нанесенные не имеющие запаха микроорганизмы могут образовывать биопленку, которая является стабильной в течение длительного времени (30 дней или долее, 60 дней или долее, или 90 дней или долее), будучи равномерно распределенной и заселяющей поверхность сердцевины испарителя (Примеры 11-13).

В еще одном аспекте представленное изобретение предоставляет способ предотвращения запахов из системы кондиционирования воздуха, включающий нанесение композиции для предотвращения запахов на сердцевине испарителя.

Авторы представленного изобретения провели эксперименты после установки стенда на крыше транспортного средства, а затем монтажа на ней сердцевины испарителя, покрытого композицией представленного изобретения, для того чтобы исследовать, может ли сердцевина испарителя сохранять популяцию не имеющих запаха микроорганизмов в условиях внешнего воздуха, и предотвратить заселение других продуцирующих неприятный запах микроорганизмов. В результате было обнаружено, что популяция не имеющих запаха микроорганизмов, нанесенная первоначально, сохранялась в течение 60 дней, а экзогенные микроорганизмы, которые способны продуцировать неприятный запах, не были выявлены (Пример 14).

Соответственно, когда биопленка образована посредством нанесения композиции для предотвращения запахов, содержащей не имеющие запаха микроорганизмы по настоящему изобретению, приток и заселение экзогенных микроорганизмов, которые способны продуцировать неприятные запахи, могут быть в значительной степени предотвращены, и, таким образом, неприятные запахи из системы кондиционирования воздуха могут быть в значительной степени предотвращены.

В еще одном аспекте представленное изобретение предоставляет способ, контролирующий запахи из системы кондиционирования воздуха, включающий нанесение композиции для предотвращения запахов на сердцевину испарителя.

Продуцируют ли микроорганизмы, содержащиеся в композиции для предотвращения запахов, запахи, фактически может зависеть от компонентов источника питания, которые метаболизируют микроорганизмы. Вследствие этого, является важным, чтобы микроорганизмы не продуцировали запахи при снабжении источниками питания в смежных промышленных областях.

В случае системы кондиционирования воздуха микроорганизмы метаболизируют различные вещества, витающие в воздухе внутри помещений и вне помещений в качестве питательных веществ. Другими словами, источниками питания микроорганизмов являются загрязнители внутреннего и наружного воздуха или компоненты отработанных газов (нефтяное топливо, такое как бензин, дизельное топливо, сжиженный углеводородный газ и т.д.). Соответственно, можно проверить заранее, будут ли выделяться запахи из системы кондиционирования воздуха в реальной промышленной установке, посредством введения данных источников питания в сердцевину испарителя с нанесенными микроорганизмами.

В еще одном аспекте представленное изобретение предоставляет Methylobacterium aquaticum HKMC-1 (Учетный номер: KCCM11325P), Methylobacterium brachiatum HKMC-2 (Учетный номер: KCCM11326P), Methylobacterium platani HKMC-3 (Учетный номер: KCCM11327P), Acinetobacter johnsonii HKMC-4 (Учетный номер: KCCM11328P), Bacillus vietnamensis HKMC-5 (Учетный номер: KCCM11329P), Brevibacillus invocatus HKMC-6 (Учетный номер: KCCM11330P), Deinococcus ficus HKMC-7 (Учетный номер: KCCM11331P), Leifsonia soli HKMC-8 (Учетный номер: KCCM11332P), Pseudomonas nitroreducens HKMC-9 (Учетный номер: KCCM11333P), Sphingomonas aquatilis HKMC-10 (Учетный номер: KCCM11334P), Methylobacterium komagatae HKMC-11 (Учетный номер: KCCM11335P), Deinococcus apachensis HKMC-12 (Учетный номер: KCCM11499P) или Flavobacterium oceanosedimentum HKMC-13 (Учетный номер: KCCM11500P) в качестве микроорганизмов для покрытия сердцевины испарителя для предотвращения запахов из системы кондиционирования воздуха.

Данные микроорганизмы можно применять для покрытия сердцевины испарителя для предотвращения запахов из системы кондиционирования воздуха либо по отдельности, либо в комбинации.

Свойства и преимущества представленного раскрытия можно суммировать в виде следующего:

(i) Представленное изобретение предоставляет композицию для предотвращения запахов, которая содержит не имеющие запаха микроорганизмы или их культуру.

(ii) Представленное изобретение также предоставляет сердцевину испарителя, которая покрыта композицией для предотвращения запахов, и способ ее изготовления.

(iii) В дополнение, представленное изобретение предоставляет способ предотвращения запахов, который включает нанесение композиции для предотвращения запахов на сердцевину испарителя.

(iv) Когда биопленка образована посредством нанесения композиции для предотвращения запахов по настоящему изобретению на объект, который может заселить продуцирующий неприятный запах микроорганизм, неприятные запахи можно в значительной степени эффективно предотвратить посредством предотвращения притока и заселения продуцирующих неприятный запах экзогенных микроорганизмов.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

ФИГ. 1 показывает чашку Петри, в которой стерилизованная алюминиевая пластина погружена в питательную среду для инокуляции не имеющих запаха микроорганизмов.

ФИГ. 2 показывает популяцию колоний различных цветов для комбинации 1 в оценке выживаемости в течение 30 дней.

ФИГ. 3 показывает соотношение колоний различных цветов для комбинации 1 в оценке выживаемости в течение 30 дней.

ФИГ. 4 показывает соотношение штаммов для комбинации 1 в оценке выживаемости в течение 30 дней, измеренной с помощью rep-ПЦР.

ФИГ. 5 показывает соотношение штаммов для комбинации 2 в оценке выживаемости в течение 30 дней, измеренной с помощью rep-ПЦР.

ФИГ. 6 показывает соотношение штаммов для комбинации 3 в оценке выживаемости в течение 30 дней, измеренной с помощью rep-ПЦР.

ФИГ. 7 показывает соотношение штаммов Methylobacterium sp. для комбинации 3 в оценке выживаемости в течение 30 дней, измеренной с помощью rep-ПЦР.

ФИГ. 8 показывает соотношение штаммов для комбинации 4 в оценке выживаемости в течение 30 дней, измеренной с помощью rep-ПЦР.

ФИГ. 9 показывает соотношение штаммов для комбинации 5 в оценке выживаемости в течение 30 дней, измеренной с помощью rep-ПЦР.

ФИГ. 10 показывает соотношение штаммов для комбинации А в оценке выживаемости в течение 30 дней, измеренной с помощью rep-ПЦР.

ФИГ. 11 показывает соотношение штаммов для комбинации B в оценке выживаемости в течение 30 дней, измеренной с помощью rep-ПЦР.

ФИГ. 12 показывает соотношение штаммов для комбинации C в оценке выживаемости в течение 30 дней, измеренной с помощью rep-ПЦР.

ФИГ. 13 показывает соотношение штаммов для комбинации D в оценке выживаемости в течение 30 дней, измеренной с помощью rep-ПЦР.

ФИГ. 14 показывает соотношение штаммов для комбинации E в оценке выживаемости в течение 30 дней, измеренной с помощью rep-ПЦР.

ФИГ. 15 показывает соотношение штаммов для комбинации F в оценке выживаемости в течение 30 дней, измеренной с помощью rep-ПЦР.

ФИГ. 16 показывает популяцию комбинации Methylobacterium aquaticum и Methylobacterium komagatae в оценке выживаемости в течение 90 дней.

ФИГ. 17 показывает соотношение штаммов для комбинации Methylobacterium aquaticum и Methylobacterium komagatae в оценке выживаемости в течение 90 дней, измеренной с помощью rep-ПЦР.

ФИГ. 18 показывает популяцию комбинации Methylobacterium aquaticum и Methylobacterium komagatae на стенде.

ФИГ. 19 показывает изменение в популяции комбинации Methylobacterium aquaticum и Methylobacterium komagatae на стенде, измеренное с помощью rep-ПЦР.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ

Здесь и далее представленное изобретение описано более подробно с помощью примеров. Следующие примеры предназначены только для иллюстративных целей, и квалифицированным или рядовым специалистам в данной области техники должно быть понятно, что объем правовых притязаний данного изобретения не ограничивается примерами.

ПРИМЕРЫ

Пример 1: Используемые транспортные средства, выделяющие неприятные запахи

Таблица 1
№	Транспортное средство	Тип образца
1	Транспортное средство А	Сердцевина испарителя
2	Транспортное средство B	Сердцевина испарителя
3	Транспортное средство C	Сердцевина испарителя
4	Транспортное средство D	Сердцевина испарителя
5	Транспортное средство E	Сердцевина испарителя

Образцы сердцевин испарителя были взяты из сердцевин испарителей, установленных в 5 используемых транспортных средствах (транспортные средства A-E), выделяющих неприятные запахи.

Пример 2: Подготовка образцов сердцевин испарителей

Образцы сердцевины испарителя, взятые из сердцевин испарителей использовавшихся транспортных средств A-E, хранили в герметичных полиэтиленовых мешках при 4°C до применения. Для выделения и культивирования микроорганизмов 5 г образцов пластин взяли из различных частей каждой сердцевины испарителя, включая передние и задние части, с применением стерилизованных длинноносых плоскогубцев, а затем смешали перед применением.

Пример 3: Выделение микроорганизмов из сердцевин испарителей

Микроорганизмы выделяли из сердцевин испарителей, как указано далее.

1. Образцы, взятые из сердцевины испарителя, смешали и поместили в смеситель.

2. В смеситель добавили 200 мл стерилизованного 1x фосфатно-солевого буферного раствора (PBS).

3. Смешанные образцы и PBS смешивали в течение 30 секунд.

4. Смеситель был оставлен на льду в течение 1 минуты.

5. Стадии 3 и 4 повторяли более 2 раз.

6. Получившуюся в результате суспензию центрифугировали при 4°C в течение 3 минут при 13000 об/мин.

7. Взяли только супернатант и перенесли его в новую пробирку.

8. Поверхность сердцевины испарителя, с которой взяли образцы, протерли несколько раз стерилизованной ватной палочкой, пропитанной супернатантом.

9. Головку ватной палочки поместили в супернатант, а затем перемешали вихревым способом.

10. Осадок, полученный в стадии 6, и смесь, полученную на стадии 9, смешали и применяли в качестве инокуляционного раствора.

Микроорганизмы физически выделили из сердцевин испарителей транспортных средств A-E с помощью стадий 1-10.

Пример 4: Выделение и культивирование микроорганизмов

Аэробные гетеротрофные бактерии, обычно называемые нормальными бактериями, выделили из кондиционера воздуха посредством культивирования на гетеротрофной пластинке. Для выделения нормальных бактерий в качестве комплексных питательных сред применяли агаровую среду PTYG и агаровую среду R2A. Агаровую среду PTYG приготовили путем добавления 0,25 г пептона (Difco), 0,25 г триптона (Difco), 0,5 г дрожжевого экстракта (Difco), 0,5 г глюкозы (Difco), 30 мг MgSO₄ (Sigma), 3 мг CaCl₂ (Sigma) и 15 г бактоагара (Difco) к 980 мл дистиллированной воды и стерилизовали при 121°C в течение 15 минут под высоким давлением после регулирования pH до 7,0. Агаровую среду R2A приготовили путем добавления 0,5 г дрожжевого экстракта (Difco), 0,5 г протеозного пептона № 3 (Difco), 0,5 г казаминовых кислот (Difco), 0,5 г декстрозы (Difco), 0,5 г растворимого крахмала (Difco), 0,3 г натрия пирувата (Difco), 0,3 г дикалийсульфата (Difco), 0,05 г магния сульфата (Difco) и 15 г бактоагара (Difco) к 980 мл дистиллированной воды и стерилизовали при 121°C в течение 15 минут под высоким давлением после регулирования pH до 7,2. Для выделения недоминирующих нормальных бактерий применяли три разновидности антибиотиков (Таблица 2). Каждый антибиотик инокулировали при приблизительно 50°C после стерилизации посредством фильтрации среды до концентрации, составляющей 100 частей на миллион.

Таблица 2
№	Антибиотик	Тип	Изготовитель
1	Канамицин	Аминогликозид	Sigma
2	Ампициллин	бета-лактамный	Sigma
3	Хлорамфеникол	Хлорамфеникол	Sigma

Пример 5: Выделение и культивирование грибов (плесневых грибов)

Грибы (плесневые грибы) выделили из кондиционера воздуха посредством культивирования на аэробной пластине с применением питательных сред. Для выделения грибов (плесневых грибов) применяли картофельно-декстрозный агар и солодово-пептонный агар. Картофельно-декстрозный агар приготовили путем добавления 4 г картофельного крахмала (Difco), 20 г декстрозы (Difco) и 15 г бактоагара (Difco) к 980 мл дистиллированной воды и стерилизовали при 121°C в течение 15 минут под высоким давлением после регулирования pH до 5,1. Солодово-пептонный агар приготовили путем добавления 20 г экстракта из корня солодки (Difco) и 15 г (Difco) бактоагара к 980 мл дистиллированной воды и стерилизовали при 121°C в течение 15 минут под высоким давлением после регулирования pH до 5,0.

Для культивирования грибов использовали чашку Петри 90 мм × 15 мм, а культивированные грибы выделяли, используя чашку Петри 60 мм × 15 мм.

Пример 6: Выделение и культивирование доминирующих штаммов

Доминирующие штаммы выделили и культивировали, основываясь на степени разбавления или морфологических характеристиках, таких как цвет, размер, форма и т.д., колоний, как указано далее.

1. Плесневые грибы и бактерии отделили от культуральной среды.

2. Бактерии, демонстрирующие различные морфологические свойства, отделили посредством инокулирования в сложные среды с использованием петли.

3. Бактериальную культуру из инокулированных сред, показавшую наилучший рост, выделяли и пересевали.

4. Плесневые грибы инокулировали в сложные среды после извлечения концевых частей гифы с помощью скальпеля.

5. Из инокулированных сред культуру плесневых грибов, показавшую наилучший рост, выделяли и пересевали.

Пример 7: Генетическая характеристика доминирующих бактерий

Фингерпринтинг, основанный на анализе образцов rep-ПЦР

rep-ПЦР представляет собой метод молекулярного биологического фингерпринтинга для структурного анализа бактериальных хромосом, который позволяет распознавать различные штаммы бактерий. Получение генетической характеристики выполняли с применением REP-ПЦР, как указано далее.

(1) Лизис клеток

1. 2,5 мкл Lyse-N-Go PCR reagent (Thermo) добавили в пробирку для ПЦР.

2. Колонию пипеткой переместили в пробирку на чистом столе. При пипетировании обращали внимание на то, чтобы получившийся в результате раствор не стал мутным.

3. Культивирование проводили на оборудовании для ПЦР согласно инструкциям изготовителя.

4. Лизис клеток осуществляли согласно протоколу лизиса, описанному в таблице 3. На 9-ом цикле температуру удерживали на 80°C.

Таблица 3
Цикл	Температура (°C)	Время (секунды)
1	65	30
2	8	30
3	65	90
4	97	180
5	8	60
6	65	180
7	97	60
8	65	60
9	80	удерживали

(2) Реакция ПЦР

Используя реагент для ПЦР, приготовленный, как описано в таблице 4, ПЦР-амплификацию выполняли путем проведения предварительной денатурации при 94°C в течение 7 минут и повторяя 33 цикла предварительной денатурации при 92°C в течение 1 минуты, отжигая при 51,5°C в течение 1 минуты и продолжая при 65°C в течение 8 минут, как описано в таблице 5.

Таблица 4
1	дНТФ (2,5 мм каждый)	12,5 мкл
2	Буфер Гитчера	5,0 мкл
3	Диметилсульфоксид (ДМСО) (100%)	2,5 мкл
4	Автоклавированный 3° D.W.	0,3 мкл
5	Праймер BOXA1R (50 пмоль/мкл)	1,0 мкл
5'CTACGGCAAGGCGACGCTGACG
6	BSA (10 мг/мл)	0,4 мкл
7	Бактериальная ДНК	2,5 мкл
8	ДНК-полимераза Taq (Roche) (5 Ед/мкл)	0,8 мкл

Таблица 5
Стадия 1	94°C	7 мин
Стадия 2	92°C	1 мин
Стадия 3	51,5°C	1 мин