Новые варианты глюкозооксидазы

Новые варианты глюкозооксидазы

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

Технология, представленная в данном документе, относится к новым вариантам микробных глюкозооксидаз с улучшенными свойствами, более специфичным к полипептидам, имеющим глюкозооксидазную активность в качестве их основной ферментативной активности; к молекулам нуклеиновых кислот, кодирующих упомянутые глюкозооксидазы; векторам и клеткам-хозяевам, содержащим нуклеиновые кислоты, и способам продуцирования глюкозооксидазы; композициям, содержащим упомянутую глюкозооксидазу; способам приготовления и получения таких ферментов; и к способам использования таких ферментов для обработки пищи и кормов, для измерения свободной глюкозы в клинических образцах и биореакторах, и разработке миниатюрных биохимических топливных элементов.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Глюкозооксидаза (β-D-глюкоза:кислород 1-оксидоредуктаза; EC 1.1.2.3.4) катализирует окисление β-D-глюкозы до глюконовой кислоты путем использования молекулярного кислорода как акцептора электронов с одновременной продукцией перекиси водорода. Микробной глюкозооксидазе в настоящее время уделяется большое внимание благодаря ее разнообразным применениям в химической, фармацевтической, пищевой промышленности, промышленности безалкогольных напитков, клинической химической, биотехнологической и других отраслях промышленности. В последние годы имеется повышенный запрос на новые применения глюкозооксидазы в биосенсорах. Глюкозооксидазы изолированы из различных микробных источников.

Фермент глюкозооксидаза из Aspergillus niger используется, например, в промышленности пищевой переработки и фармакологической промышленности и как компонент иммуноанализа и биосенсоров в области медицинской диагностике. Фермент также используется в производстве миниатюрных биотопливных элементов, которые могут быть источниками питания биомедицинских имплантов, таких как биосенсоры и дозаторы инсулина. Выход этих устройств ограничен производительностью глюкозооксидазы в анодном отделе.

В частности, три свойства фермента существенны в отношении биотопливных элементов: (1) скорость переноса электронов с электрода на фермент (собственная активность фермента); (2) активность фермента в физиологических условиях (pH 7,4 и 5 мМ глюкозы); и (3) термостабильность фермента.

Патентная заявка W089/126675 описывает продукцию глюкозооксидазы из Aspergillus niger в рекомбинантных системах, а WO 2008/079227 A1 относится к ферменту, полученному из Aspergillus niger и изготовленному в виде композиции, обладающей улучшенной стабильностью при хранении. Также описаны глюкозооксидазы различного происхождения, включая в себя морские водоросли, например, Chondrus crispus (патент США 7544795, патент США 6924366), гифомицеты, например, Cladosporium spp. (патентные заявки WO 95/29996, WO 1998/020136, патент США 5834280) и Talaromyces flavus (патент США 6054318). Патентная заявка WO2012/017008 A1 описывает варианты глюкозооксидазы Aspergillus niger с измененной эффективностью фермента по сравнению с глюкозооксидазой дикого типа.

Однако получение доступа к глюкозооксидазам с улучшенными свойствами для множества применений было бы в высокой степени полезно.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Улучшенные глюкозооксидазы по данному раскрытию могут быть использованы для многочисленных применений, включающих в себя удаление кислорода из пищи и прохладительных напитков, формирование перекиси водорода для консервирования пищи, измерение свободной глюкозы в клинических образцах и биореакторах, и в разработках миниатюрных биотопливных элементов. Многие промышленные процессы могли бы выиграть от использования улучшенных вариантов глюкозооксидаз по данному раскрытию.

В первом аспекте варианты данного раскрытия, предлагают полипептиды, имеющие глюкозооксидазную активность, в которых упомянутый полипептид содержит вариации в положениях, соответствующих аминокислотным остаткам T30, I94 и A162 в глюкозооксидазе дикого типа из Aspergillus niger (SEQ ID NO: 1), и, по меньшей мере, одну или более дополнительных вариаций в положениях, соответствующих аминокислотным остаткам M556, R537, R37, V106, V293 или E310, и в котором аминокислотная последовательность упомянутого полипептида имеет, по меньшей мере, минимальный процент идентичности последовательности и (или) процент гомологии, по меньшей мере, 80% по отношению к аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1.

Еще один объект - варианты осуществления данного раскрытия, относящиеся к молекулам нуклеиновой кислоты, выбранным из группы, состоящей из:

молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид по любому из пп. 1-15;

молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид по любому из пп. 1-15, в котором один или более аминокислотных остатков консервативно замещены;

молекула нуклеиновой кислоты, которая представляет собой фракцию, вариант, производное или фрагмент молекулы нуклеиновой кислоты, представленной как SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID N0: 12 или SEQ ID NO: 14;

или комплементарная последовательность каких-либо молекул нуклеиновых кислот по пп. a)-c).

Еще один объект - варианты осуществления данного раскрытия, относящиеся к вектору, содержащему молекулу нуклеиновой кислоты по данному раскрытию, и к клеткам-хозяевам, трансформированным, трансдуцированным или трансфецированным упомянутым вектором.

Еще один объект - варианты осуществления данного раскрытия предоставляющие способы получения полипептида, имеющего глюкозооксидазную активность, содержащие стадии: (a) культивирования клеток-хозяев по данному раскрытию в подходящей культуральной среде при подходящих условиях для продуцирования полипептидов, имеющих глюкозооксидазную активность; (b) получение упомянутой продукции полипептидов, и, если требуется, (c) обработка полипептидов.

Еще один объект - некоторые варианты осуществления данного раскрытия относящиеся к композициям, содержащим полипептид по данному раскрытию, в частности к пищевым композициям, фармацевтическим композициям, диагностическим композициям и косметическим композициям.

Еще один объект - некоторые варианты осуществления, предоставляющие способы для анализа глюкозы в образце, в которых образец приведен в контакт с полипептидом, имеющим глюкозооксидазную активность по данному раскрытию, и измерения количества глюкозы, окисленной глюкозооксидазой.

Далее, несколько вариантов осуществления имеют отношение к устройствам и наборам для анализа глюкозы в образце, содержащем полипептид, имеющий глюкозооксидазную активность по данному раскрытию и медиатор транспорта электронов.

Кроме того, некоторые варианты осуществления относятся к ферментным электродам, имеющим полипептид с глюкозооксидазной активностью по данному раскрытию, который иммобилизован на электроде.

Далее, некоторые другие варианты осуществления имеют отношение к ферментным сенсорам для анализа глюкозы, содержащим ферментный электрод по данному раскрытию в качестве рабочего электрода.

Еще один объект - варианты осуществления, относящиеся к использованию полипептида, имеющего глюкозооксидазную активность по данному раскрытию для переработки пищи.

В частности, еще один объект - варианты осуществления данного описания, имеющие отношение к модифицированным глюкозооксидазам, содержащим замены, по меньшей мере, трех аминокислотных остатков в аминокислотной последовательности, встречающейся в природе глюкозооксидазы Aspergillus niger дикого типа, в положениях, соответствующих 556 и 537 или 37 относительно нумерации аминокислотной последовательности глюкозооксидазы дикого типа из Aspergillus niger (SEQ ID NO: 1), и, по меньшей мере, замещения в положениях, соответствующих аминокислотным остаткам 556 и 537 или 37 и 106, и в которых упомянутая модифицированная глюкозооксидаза имеет более высокую собственную активность, чем фермент дикого типа.

Прежде чем раскрытие изобретения будет описано детально, следует понять, что данное раскрытие не ограничено описанными конкретными частями устройств, или стадиями процесса по описанным способам, поскольку такие устройства и способы могут варьировать. Также следует понимать, что терминология, использованная в данном документе, предназначена только для целей описания конкретных вариантов осуществления и не направлена на то, чтобы быть ограничивающей. Надо отметить, что, так как это используется в спецификации и прилагаемой формуле изобретения, формы единственного числа включают в себя и единичные и (или) множественные определяемые объекты, если только контекст ясно не диктует иного. Также следует понимать, что в случае, если диапазон параметра дан в виде определенных числовых значений, полагают, что диапазоны включают в себя эти граничные значения.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Фиг. 1 представляет собой диаграмму, показывающую кинетику вариантов GOx фермента по данному раскрытию при pH 5,5.

Фиг. 2 представляет собой диаграмму, показывающую кинетику вариантов GOx фермента по данному раскрытию при pH 7,4.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В данном документе раскрыты варианты фермента глюкозооксидазы (β-d-глюкоза:кислород 1-оксидоредуктаза; EC 1.1.2.3.4), в частности варианты глюкозооксидазы дикого типа Aspergillus niger, содержащие аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, и молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие упомянутые варианты глюкозооксидазы, которые могут быть использованы в промышленных применениях, включающих в себя пищевую промышленность и фармацевтическое производство, также как компонент иммуноанализа и биосенсоры в области медицинской диагностики. Варианты фермента могут быть также использованы в производстве миниатюрных биотопливных элементов, которые могут питать биомедицинские импланты, такие как биосенсоры и дозаторы инсулина.

В частности, варианты глюкозооксидазы по данному раскрытию показывают улучшенную каталитическую эффективность по сравнению с диким типом и исходной глюкозооксидазой и (или) улучшенные свойства стабильности, такие как термостабильность и (или) pH-стабильность. Эти характеристики делают их особенно полезными для промышленного и диагностического применений.

В целом, данное раскрытие относится к полипептидам, имеющим глюкозооксидазную активность, причем упомянутые полипептиды содержат вариации в положениях, соответствующих аминокислотным остаткам T30 и I94 в глюкозооксидазе дикого типа из Aspergillus niger (SEQ ID NO: 1), и, по меньшей мере, одну или более других вариаций в положениях, соответствующих аминокислотным остаткам M556, R537, R37, A162, V106, V293 или E310, и в котором аминокислотная последовательность упомянутых полипептидов имеет, по меньшей мере, минимальный процент идентичности последовательности - по меньшей мере, 80% аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1 или ее вариантов, модифицированных форм, гомологов, химерных белков, функциональных эквивалентов и фрагментов.

Например, гомологичный полипептид по данному раскрытию содержит какую-либо активную глюкозооксидазу с процентом идентичности последовательности, по меньшей мере, 70% или предпочтительно, по меньшей мере, 80%, 85%, 90%, 95%, 97% или 99% к SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 или SEQ ID NO: 13 и содержащую вариации в положениях, соответствующих аминокислотным остаткам T30 и I94, и, по меньшей мере, одну или более других вариаций в положениях, соответствующих аминокислотным остаткам M556, R537, R37, A162, V106, V293 или E310.

Данное раскрытие выявляет глюкозооксидазные ферменты с аминокислотной последовательностью, происходящей из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO:1, или их варианты, модифицированные формы, гомологи, химерные белки, функциональные эквиваленты или функциональные фрагменты, имеющие вариации в положениях, соответствующих аминокислотным остаткам T30 и I94 и одном или более положений, выбранных из группы положений, которые соответствуют структурно или по гомологии аминокислотной последовательности положениям M556, R537, R37, A162, V106, V293 или E310.

Так, как это используется в данном документа, термины «клетка», «клеточная линия» и «клеточная культура» могут быть использованы взаимозаменяемо, и все такие обозначения включают в себя потомство. Таким образом, слова «трансформанты» или «трансформированные клетки» включают в себя первичный клеточный объект и происходящие от него культуры, независимо от количества пассажей. Также понятно, что все потомство может не быть в точности идентичным по содержащейся в нем ДНК вследствие направленных или случайных мутаций. Мутантное потомство, которое имеет такую же функциональность, как была обнаружена в исходных трансформированных клетках, также включено.

Термин «комплементарный», как это используется в данном документе, относится к связи между двумя последовательностями нуклеиновой кислоты. Одна последовательность нуклеиновой кислоты является комплементарной второй последовательности нуклеиновой кислоты, если она способна сформировать двойную спираль со второй нуклеиновой кислотой, в которой каждый остаток в двойной спирали образует пару оснований гуанозин - цитидин (G-C) или аденозин - тимидин (A-T) или эквивалентную пару оснований. Эквивалентные пары оснований могут включать в себя нуклеозиды или аналоги нуклеотидов, иные, чем гуанозин, цитидин, аденозин или тимидин.

Фраза «положение, соответствующее тому-то», как это используется в данном документе, означает положение аминокислотного остатка в ряду аминокислотной последовательности, которая сравнивается с аминокислотным остатком в референтной аминокислотной последовательности с использованием программного обеспечения AlignX Vector NTI со стандартными параметрами (доступным на фирме Invitrogen; см., Lu, G., и Moriyama, E. N. (2004) Vector NTI, a balanced all-in-one sequence analysis suite. Brief Bioinform 5, 378-88). Таким образом, «аминокислотный (AA) остаток в положении, соответствующем положению Y аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: X» означает аминокислотный остаток в ряду аминокислотной последовательности, которая выровнена с аминокислотой Y в SEQ ID NO: X, когда ряд аминокислотной последовательности сравнивается с SEQ ID NO: X с помощью AlignX Vector NTI со стандартными параметрами. Следует отметить, что сама аминокислота Y в SEQ ID NO: X также охватывается этим термином. Мутантная глюкозооксидаза по данному раскрытию демонстрирует повышенную оксидазную активность при сохранении и (или) увеличении стабильности фермента, в частности, термостабильности.

Так, как это используется в данном документе, термин «активность» или «каталитическая активность» количественно описывает преобразование данного субстрата при определенных условиях реакции. Термин «остаточная активность» определен как соотношение каталитической активности фермента при определенном наборе условий к каталитической активности при другом наборе условий. Термин «специфическая активность» или «собственная активность» количественно описывает каталитическую активность на количество фермента при определенных условиях реакции. В частности, активность оксидазы описывает ферментативную активность глюкозооксидазы по катализу окисления глюкозы с образованием глюконолактона, использующую кислород как акцептор электронов. Например, активность оксидазы может быть исследована анализами, описанными в примерах данного раскрытия (см. пример 7). Как упоминалось, «активность» глюкозооксидазы, как это используется в данном документе, может быть направлена на измерение ее способности катализировать реакцию окисления D-глюкоза + О₂ → глюконолактон + H₂O_2, и может быть выражена как скорость, при которой образуется продукт реакции. Например, глюкозооксидазная активность может быть представлена как количество продукта (глюконолактон и (или) H₂О₂), образовавшегося за единицу времени, или на единицу глюкозооксидазы (например, концентрации или веса).

Активность, улучшенная вариантами GOx по данному раскрытию, представляет собой, в частности, собственную активность (специфическую активность), но также общую активность. Так, как это используется в данном документе, «K_cat» означает скорость реакции при высоких концентрациях субстрата (условия насыщения), деленную на концентрацию фермента (на единицу фермента). «K_m» определена как концентрация субстрата, при которой фермент достигает максимальной скорости, но это относится к скорости реакции при условиях ненасыщенного субстрата, то есть при низкой концентрации глюкозы. «K_cat/k_m» представляет собой константу специфичности и суммирует 2 свойства. В выгодных вариантах осуществления все улучшенные варианты GOx по данному раскрытию показывают улучшенный k_cat и лучший k_m (и, следовательно, k_cat/k_m) по сравнению с вариантом дикого типа.

Термин «фермент» по данному изобретению означает какое-либо вещество, состоящее целиком или главным образом из белка или полипептидов, которые катализируют или активизируют более или менее специфически одну или более химическую или биохимическую реакцию. Термин «фермент» может также относиться к каталитическому полинуклеотиду (например, РНК или ДНК).

Термин «реакция окисления» означает в общих терминах химическую или биохимическую реакцию, вовлекающую добавление кислорода к субстрату с образованием оксигенированного или окисленного субстрата или продукта. Реакция окисления обычно сопровождается реакцией восстановления (откуда термин «редокс-реакция» для окисления и восстановления). Соединения является «окисленным», когда оно приобретает кислород или теряет электроны. Как упоминалось выше, глюкозооксидаза обычно катализирует окисление группы первичного спирта до альдегида.

Термин «глюкозооксидаза» или «GOx» обозначает белок, который катализирует окисление β-D-глюкозы в D-глюконо-1,5-лактон (D-глюкоза + О₂ → глюконолактон + H₂О₂), который может затем гидролизоваться в глюконовую кислоту. Соответственно, глюкозооксидаза представляет собой фермент. Далее, термин «полипептид, имеющий активность глюкозооксидазы» относится к полипептиду, имеющему упомянутую выше активность. Фермент глюкозооксидаза представляет собой, таким образом, член класса окислительных ферментов, который катализирует реакцию окисления путем добавления, введения, вовлечения или переноса кислорода из источника или от донора к субстрату. Такие ферменты также именуются оксидоредуктазами или редокс-ферментами и охватывают оксигеназы, гидрогеназы или редуктазы, оксидазы и пероксидазы. В этой связи термины «донор кислорода», «окисляющий агент» и «оксидант» означают вещество, молекулу или соединение, которые являются донаторами кислород для субстрата в реакции окисления. Обычно, донатор кислород восстанавливается (акцептирует электроны). Примеры донаторов кислорода, которые не являются ограничивающими, включают в себя молекулярный кислород или дикислород (О₂) и перекиси, включая в себя перекиси алкилов, такие как перекись t-бутила, а наиболее предпочтительно - перекись водорода (H₂О₂). Перекись представляет собой какое-либо соединение, имеющее два атома кислорода, связанные между собой.

Молекула нуклеиновой кислоты по данному раскрытию кодирует полипептид или его фрагмент, который происходит из глюкозооксидазы (GOx) из Aspergillus niger (SEQ ID NO: 1) с улучшенными кинетическими свойствами и (или) стабильностью, в частности, термостабильностью фермента в реакции превращения глюкозы в глюконолактон и H₂О₂. Глюкозооксидаза из Aspergillus niger представляет собой хорошо охарактеризованный белок, образующий димер величиной в 160 кДа с известной кристаллической структурой (Hecht HJ et al. Crystal structure of glucose oxidase from Aspergillus niger refined at 2.3 Angstrom resolution. Journal of Molecular Biology 1993: 229(1) 153-172).

Термин «варианты глюкозооксидазы», «модифицированная глюкозооксидаза» или «мутантная глюкозооксидаза» означает какую-либо глюкозооксидазу, полученную, например, направленным или случайным мутагенезом, вставкой, делецией, рекомбинацией и (или) каким-либо иным способом белковой инженерии, который дает глюкозооксидазу, которая отличается по аминокислотной последовательности от соответствующей глюкозооксидазы дикого типа. Термины «глюкозооксидаза дикого типа», «фермент дикого типа» или «дикий тип» по данному раскрытию описывает фермент глюкозооксидазу с аминокислотной последовательностью, обнаруженной в природе, или ее фрагмент.

Термин «исходная глюкозооксидаза», «родительская» или «исходные GOx» , как это используется в данном документе, означает глюкозооксидазу, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3 с заменами в положениях, соответствующих аминокислотным остаткам T30V, I94V и A162T глюкозооксидазы дикого типа из Aspergillus niger (SEQ ID NO: 1), или глюкозооксидазу, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1 с заменами в положениях, соответствующих аминокислотным остаткам T30V и I94V.

Термин «производное», как это используется в данном документе, относится к молекуле нуклеиновой кислоты, которая имеет сходные характеристики связывания с последовательностью нуклеиновая кислоты-мишени, что и молекула нуклеиновой кислоты по одной из заявляемых последовательностей.

Термин «клон экспрессии» относится к последовательностям ДНК, содержащим желаемую кодирующую последовательность и управляющие последовательности, находящиеся в управляемом взаимодействии, так что хозяин, трансформированный этими последовательностями, способен продуцировать кодируемые белки. Термин «система экспрессии» относится к хозяину, трансформированному клоном экспрессии. Чтобы выполнить трансформацию, клон экспрессии может быть включен в вектор; однако, соответствующая ДНК может также быть интегрирована в хромосому хозяина.

Термин «рекомбинантные белки» содержит все белки, происходящие от модифицированной глюкозооксидазы по данному раскрытию путем ковалентной сшивки дополнительных аминокислотных последовательностей на C- и (или) N-конце. Источник и композиция дополнительной аминокислотной последовательности являются либо природными для какого-либо живого организма или вируса, либо не являются природными. В частности, рекомбинантный белок может быть «рекомбинантным» полипептидом, который определяется либо по способу его продукции, либо по его структуре. Что касается способа их получения, рекомбинантные полипептиды производятся путем процесса, вовлекающего использование технологий рекомбинантной нуклеиновой кислоты. Что касается структуры, рекомбинантные полинуклеотиды или полипептиды содержат последовательности из различных источников. В частности, они охватывают полипептиды, полученные путем генерации последовательности, содержащей два или более фрагмента, которые в природе не являются сопряженными или функционально связанными друг с другом. Таким образом, например, охватываются продукты, полученные с помощью трансформированных клеток с каким-либо не встречающимся в природе вектором.

Термин «функциональный фрагмент» или «эффективный фрагмент» означает фрагмент или участок варианта глюкозооксидазы по данному раскрытию, который сохраняет приблизительно ту же самую ферментативную функцию или эффект и (или) ту же самую термостабильность.

Термин «ген» относится к последовательности ДНК, которая содержит управляющую и кодирующую последовательности, необходимые для продукции воспроизводимого биоактивного полипептида или предшественника.

Термин «гомологичный полипептид» или «гомолог» по данному раскрытию содержит какой-либо фермент с последовательностью, идентичной, по меньшей мере, на 70%, или предпочтительно, по меньшей мере, на 80%, 85%, 90%, 95%, 97% или 99% варианту глюкозооксидазы по данному раскрытию, включая в себя их функциональные фрагменты или эффективные фрагменты.

Термин «гомолог молекулы нуклеиновой кислоты» относится к молекуле нуклеиновой кислоты, последовательность которой имеет один или более нуклеотидов, добавленных, делетированных, замененных или химически модифицированных иным образом по сравнению с молекулой нуклеиновой кислоты по одной из заявляемых последовательностей, при том, что всегда гомолог сохраняет практически те же самые ферментативные свойства и (или) свойства стабильности, как у последнего.

Термин «клетка-хозяин» в связи с данным раскрытием включает в себя какую-либо клетку, которая содержит либо молекулу нуклеиновой кислоты или вектор экспрессии, как описано выше, и которая используется в гетерологической продукции фермента, имеющего специфические свойства, как они определены в данном документе или в способах данного раскрытия.

Термин «изолированный» описывает какую-либо молекулу, выделенную из ее природного источника.

Термин «модифицированная форма» или «вариант» означает, что фермент был модифицирован из исходной формы (исходная/дикого типа, wt), но сохраняет, по меньшей мере, те же самые ферментативные характеристики, что и фермент дикого типа.

Термин «модификация» или «вариация», как это используется в данном документе, относится, например, к заменам, вставкам или делециям аминокислотных остатков в специфических положениях в аминокислотной последовательности, также как и фосфорилирование, ацетилирование, пальмитоилирование, метилирование, сульфатирование, гликозилирование, липидизация, изопренилирование, фарнесилирование, присоединение остатка жирной кислоты, гликозилирование добавлением якоря гликозил-фосфатидилинозитола, связывающего белки с липидами посредством гликана, и (или) убиквитинилирование специфических положений в полипептиде или их комбинация. В выгодном варианте осуществления вариация представляет собой замену.

Термин «мутация» относится к замене или замещению одиночного или множественных нуклеотидов, вставкам или делециям одного или более триплетов/кодонов, гомологичных или гетерологичных рекомбинаций между различными генами, присоединение дополнительных кодирующих последовательностей либо на конце кодирующей последовательности, либо вставка дополнительной кодирующих последовательностей или какая-либо комбинация этих способов, которые дают последовательность полинуклеиновой кислоты, кодирующую желаемый белок. Таким образом, термин «мутации» также относится ко всем изменениям полипептидной последовательности, кодируемой последовательностью полинуклеиновой кислоты, модифицированной одной или более вышеописанными изменениями. Аббревиатуры аминокислотных остатков в нижеследующей Табл. 1 представляют собой либо одно-, либо трехбуквенный код.

Термин «молекула нуклеиновой кислоты» или «нуклеиновая кислота» направлен на то, чтобы указать на какую-либо одно- или двухнитевую молекулу нуклеиновой кислоты, происходящую от кДНК, геномной ДНК, синтетической ДНК или РНК, пептид-нуклеиновой кислоты (PNA) или LNA.

Термин «олигонуклеотид», как это используется в данном документе, определяется как молекула, содержащая два или более дезоксирибонуклеотидов или рибонуклеотидов. Конкретный размер зависит от многих факторов, которые, в свою очередь, зависят от основной функции или применения олигонуклеотида. Олигонуклеотиды могут быть изготовлены с помощью какого-либо способа, включающего в себя, например, клонирование и рестрикции соответствующих последовательностей и прямой химический синтез таким способом, как фосфотриэфирный способ, диэтилфосфорамидитный способ и способом твердой подложки. Обзор способов синтеза представлен в Goodchild J, Bioconjug. Chem. (1990) 165-187.

Термин «плазмида», «векторная система», «вектор» или «вектор экспрессии» означает конструкт, способный к экспрессии in vivo или in vitro. В контексте данного раскрытия, эти конструкты могут быть использованы для введения генов, кодирующих ферменты в клетки-хозяева.

«Процент идентичности последовательности» в отношении двух аминокислотных или полинуклеотидных последовательностей означает процент остатков, которые идентичны в двух последовательностях, когда последовательности выровнены оптимально. Таким образом, 80% идентичность аминокислотных последовательностей означает, что 80% аминокислот в двух оптимально выровненных полипептидных последовательностях идентичны. Процент идентичности может быть определен, например, прямым сравнением информации о последовательностях между двумя молекулами выравниванием последовательностей, подсчетом точного количества совпадений между двумя выровненными последовательностями, делением на длину более короткой последовательности и умножением результата на 100. Чтобы облегчить анализ, могут быть использованы легкодоступные компьютерные программы, такие как ALIGN, Dayhoff, M.O. в "Atlas of Protein Sequence and Structure", M.O. Dayhoff et., Suppl. 3:353-358, National Biomedical Research Foundation, Washington, DC, которая использует алгоритм локальной гомологии по Smith and Waterman (1981) Advances in Appl. Math. 2:482-489 для анализа пептидов. Программы для определения идентичности нуклеотидной последовательности доступна в Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 (доступны на фирме Genetics Computer Group, Madison, WI), например, программы BESTFIT, FASTA и GAP, которые также опираются на алгоритм Smith и Waterman. Эти программы легко использовать с параметрами по умолчанию 5, рекомендованными производителем и описанными в Wisconsin Sequence Analysis Package, упомянутом выше. Пример алгоритма, который пригоден для определения сходства последовательностей - это алгоритм BLAST, который описан у Altschul, et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990). Программное обеспечение для проведения анализов BLAST доступно для публики через Национальный Центр биотехнологической информации (National Center for Biotechnology Information) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/).

Термин «полинуклеотид» соответствует какому-либо генетическому материалу какой-либо длины и какой-либо последовательности, содержащим однонитевую или двухнитевую молекулы ДНК и РНК, включающие в себя регуляторные элементы, структурные гены, группы генов, плазмиды, целые геномы и его фрагменты.

Термин «положение» в полинуклеотиде или полипептиде относится к специфическому одиночному основанию или аминокислотному остатку в последовательности полинуклеотида или полипептида, соответственно.

Термин «обязательные условия» относится к условиям, при которых зонд будет гибридизоваться со своей последовательностью-мишенью, но не с другими последовательностями. Обязательные условия являются зависимыми от последовательности и различаются при разных обстоятельствах. Более длинные последовательности специфически гибридизуются при более высоких температурах.

В целом, обязательные условия выбираются так, чтобы они были на около 5°C ниже, чем термическая температура плавления (Tm) для специфической последовательности при определенной ионной силе и pH. Tm представляет собой температуру (при определенной ионной силе, pH и концентрации нуклеиновой кислоты), при которой 50% зонда, кoмплементарного последовательности-мишени, гибридизуется с последовательностью-мишенью при равновесии. (Поскольку последовательности-мишени в целом присутствует в избытке при Tm, 50% зонда при равновесии захватывается). Обычно, обязательные условия таковы, при которых концентрация соли составляет менее чем около 1,0 M иона Na, обычно около 0,01 до 1,0 M иона Na (или других солей) при pH 7,0-8,3 и температуре, по меньшей мере, около 30° C для коротких зондов (например, 10-50 нуклеотидов) и, по меньшей мере, около 60° C для более длинных зондов. Обязательные условия могут также быть достигнуты путем добавления дестабилизирующих агентов, таких как формамид.

Термин «термостабильный фермент», «термостабильная глюкозооксидаза» или «термостабильный полипептид», как это используется в данном документе, относится к ферменту, который стабилен при нагревании и поддерживает высокую активность после воздействия повышенной температуры. «Термическая стабильность» или «термостабильность» мутантной глюкозооксидазы или варианты по данному описанию определялись путем инкубирования фермента в 50 мМ ацетатном буфере (pH 5,5) при 60°C в отсутствии субстрата и измерения остаточной активности повторяющихся аликвот с использованием анализа ABTS (см. пример 8).

Термин «вариант молекулы нуклеиновой кислоты» относится в данном документе к молекуле нуклеиновой кислоты, которая в основном сходна по структуре и биологической активности с молекулой нуклеиновой кислоты по одной из заявляемых последовательностей.

Таблица 1Сокращения для аминокислот
Сокращения	Аминокислота
A	Ala	Аланин
C	Cys	Цистеин
D	Asp	Аспарагиновая кислота
E	Glu	Глютаминовая кислота
D	Phe	Фенилаланин
G	Gly	Глицин
H	His	Гистидин
I	Ile	Изолейцин
K	Lys	Лизин
L	Leu	Лейцин
M	Met	Метионин
N	Asn	Аспарагин
P	Pro	Пролин
Q	Gin	Глютамин
R	Arg	Аргинин
S	Ser	Серин
T	Thr	Треонин
V	Val	Валин
W	Trp	Триптофан
Y	Tyr	Тирозин

Мутации или вариации описаны путем использования следующей номенклатуры: положение; замененный аминокислотный остаток (остатки). В соответствии с этой номенклатурой замена, например, остатка аланина на остаток глицина в положении 20 обозначается как 20G. Когда остаток аминокислоты в конкретном положении заменен двумя или более альтернативными аминокислотными остатками, эти остатки отделяются запятой или знаком дроби. Например, замена аланина в положении 20 глицином или глютаминовой кислотой показана как 20G/E или 20G, 20E.

Кроме того, может быть также использована следующая номенклатура: аминокислотный остаток в каркасном белке; положение; замененный аминокислотный остаток (остатки). В соответствии с этой номенклатурой замена, например, остатка аланина на остаток глицина в положении 20 обозначается как Ala20Gly или A20G, или 20G. Делеция аланина в том же положении показана как Ala20* или A20*. Вставка дополнительного аминокислотного остаток (например, глицина) показана как Ala20AlaGly или A20AG. Делеция последовательного участка аминокислотных остатков (например, между аланином в положении 20 и глицином в положении 21) обозначается как Δ(Ala20-Gly21) или Δ(A20-G21). Когда последовательность, содержащая делецию по сравнению с исходным белком, используется для нумерации, вставка в таком положении (например, аланин в делетированном положении 20) обозначается как *20Ala или *20A. Множественные мутации раздел