Слитые белки и способы лечения, профилактики или облегчения боли

Слитые белки и способы лечения, профилактики или облегчения боли

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Настоящее изобретение относится к нецитотоксическим слитым белкам и к их терапевтическому применению в качестве анальгетических молекул.

Токсины можно, в целом, разделить на две группы в зависимости от типа воздействия, которое они оказывают на клетку-мишень. Более конкретно, токсины первой группы убивают свои естественные клетки-мишени и поэтому известны как цитотоксические молекулы токсинов. Данная группа токсинов представлена, среди прочего, растительными токсинами, такими как рицин и абрин, и бактериальными токсинами, такими как дифтерийный токсин и экзотоксин A псевдомонад. Цитотоксические токсины привлекли большой интерес в области разработки «волшебных пуль» (например, иммуноконъюгатов, которые содержат компонент цитотоксического токсина и антитело, которое связывается с определенным маркером на клетке-мишени) для лечения клеточных заболеваний и состояний, таких как рак. Цитотоксические токсины, как правило, убивают свои клетки-мишени путем ингибирования процесса белкового синтеза клеток.

Токсины второй группы, которые известны как нецитотоксические токсины, не убивают (как следует из их названия) свои естественные клетки-мишени. Нецитотоксические токсины с коммерческой точки зрения представляют меньший интерес, чем их цитотоксические аналоги, и проявляют свое действие на клетку-мишень путем ингибирования иных клеточных процессов, нежели белковый синтез. Нецитотоксические токсины продуцируются различными растениями и разнообразными микроорганизмами, такими как Clostridium sp. и Neisseria sp.

Клостридиальные нейротоксины представляют собой белки, как правило, имеющие молекулярную массу порядка 150 кДа. Они продуцируются бактериями различных видов, особенно из рода Clostridium, главным образом, C. tetani и некоторыми штаммами C. botulinum, C. butyricum и C. argentinense. В настоящее время известны восемь различных классов клостридиальных нейротоксинов, а именно: столбнячный токсин и ботулинические нейротоксины серотипов A, B, C1, D, E, F и G, и все они имеют сходные структуры и механизмы действия.

Клостридиальные нейротоксины представляют собой основную группу нецитотоксических молекул токсинов и синтезируются бактерией-хозяином в виде одиночных полипептидов, которые модифицируются посттрансляционно путем протеолитического расщепления, с образованием двух полипептидных цепей, связанных вместе дисульфидной связью. Две цепи носят названия «тяжелая цепь» (H-цепь), которая имеет молекулярную массу примерно 100 кДа, и «легкая цепь» (L-цепь или LC), которая имеет молекулярную массу примерно 50 кДа.

L-цепи имеют протеазную функцию (цинк-зависимая эндопептидазная активность) и проявляют высокую субстратную специфичность в отношении связанных с везикулярными и/или плазматическими мембранами белков, вовлеченных в процесс экзоцитоза. L-цепи из разных видов или серотипов клостридий могут гидролизовать разные, но определенные пептидные связи в одном из трех субстратных белков, а именно в синаптобревине, синтаксине или SNAP-25. Эти субстраты являются важными компонентами нейросекреторной системы.

Бактерии Neisseria sp., главным образом из вида N. gonorrhoeae, продуцируют функционально сходные нецитотоксические протеазы. Примером такой протеазы является IgA-протеаза (смотрите WO 99/58571).

В данной области существует много документальных подтверждений того, что молекулы токсина могут быть перенаправлены в клетку, которая не является естественной клеткой-мишенью для токсина. Будучи таким образом перенаправленным, модифицированный токсин способен связываться с нужной клеткой-мишенью и после перемещения в цитозоль может оказывать свое действие на клетку-мишень. Такое перенаправление достигается путем замены природного направляющего фрагмента (TM) токсина другим TM. В этом отношении, TM выбирают таким образом, чтобы он связывался с нужной клеткой-мишенью и делал возможным последующее прохождение модифицированного токсина в эндосомы внутри клетки-мишени. Модифицированный токсин также содержит домен транслокации для проникновения нецитотоксической протеазы в цитозоль клетки. Домен транслокации может быть природным доменом транслокации токсина или может быть другим доменом транслокации, полученным из микробного белка с транслокационной активностью.

Вышеупомянутую замену TM можно осуществлять общепринятым методом химической конъюгации, который хорошо известен специалисту в данной области. В этом отношении, можно сослаться на статью Hermanson, G.T. (1996), Bioconjugate techniques, Academic Press, и статью Wong, S.S. (1991), Chemistry of protein conjugation and cross-linking, CRC Press. Альтернативно, можно использовать рекомбинантные методы, такие как те, что описаны в WO 98/07864. Все процитированные выше литературные источники включены в настоящий документ посредством ссылки.

Чувствительные к боли клетки обладают рецепторами самых различных типов. Однако не все типы рецепторов подходят (менее всего желательны) для опосредованного рецепторами эндоцитоза. Аналогично, способность к связыванию может варьироваться в широких пределах у различных TM в отношении одного и того же рецептора, и тем более в случае разных TM и разных рецепторов.

Вследствие этого, существует потребность в разработке модифицированных нецитотоксических слитых белков, которые позволят решить одну или более из вышеуказанных проблем. Особый интерес представляет разработка альтернативного/усовершенствованного нецитотоксического слитого белка для использования в лечении боли.

Настоящее изобретение направлено на решение одной или более из вышеуказанных проблем путем предоставления уникальных слитых белков.

Настоящее изобретение направлено на решение одной или более из вышеуказанных проблем путем предоставления одноцепочечного полипептидного слитого белка, содержащего:

a. нецитотоксическую протеазу, которая расщепляет белок экзоцитозного аппарата слияния ноцицептивного сенсорного афферента;

b. направляющий фрагмент галанина, который связывается с сайтом связывания на ноцицептивном сенсорном афференте, при этом сайт связывания подвергается эндоцитозу, встраиваясь в эндосому в ноцицептивном сенсорном афференте;

c. сайт расщепления протеазой, в котором слитый белок расщепляется протеазой, при этом сайт расщепления протеазой расположен между нецитотоксической протеазой и направляющим фрагментом галанина;

d. домен транслокации, который переносит протеазу из эндосомы через эндосомальную мембрану в цитозоль ноцицептивного сенсорного афферента, при этом направляющий фрагмент расположен между сайтом расщепления протеазой и доменом транслокации;

e. первый спейсер, расположенный между нецитотоксической протеазой и сайтом расщепления протеазой, при этом указанный первый спейсер содержит аминокислотную последовательность из 4-25 аминокислотных остатков;

f. второй спейсер, расположенный между направляющим фрагментом галанина и доменом транслокации, при этом указанный второй спейсер содержит аминокислотную последовательность из 4-35 аминокислотных остатков.

Компонент нецитотоксической протеазы по настоящему изобретению представляет собой нецитотоксическую протеазу, которая способна расщеплять различные, но определенные пептидные связи в одном из трех субстратных белков, а именно синаптобревине, синтаксине или SNAP-25, экзоцитозного аппарата слияния в ноцицептивном сенсорном афференте. Эти субстраты являются важными компонентами нейросекреторной системы. Компонент нецитотоксической протеазы по настоящему изобретению предпочтительно представляет собой IgA-протеазу нейссерии или L-цепь клостридиального нейротоксина. Термин «нецитотоксическая протеаза» охватывает функционально эквивалентные фрагменты и производные указанной нецитотоксической протеазы(протеаз). Особенно предпочтительным компонентом нецитотоксической протеазы является L-цепь ботулинического нейротоксина (BoNT).

Транслокационный компонент по настоящему изобретению делает возможным перемещение нецитотоксической протеазы (или ее фрагмента) в клетку-мишень так, что функциональная экспрессия протеазной активности происходит в цитозоле клетки-мишени. Транслокационный компонент предпочтительно способен образовывать ионопроницаемые поры в липидных мембранах в условиях низкого значения pH. Как установлено, предпочтительно использовать только те части белковой молекулы, которые способны образовывать поры в эндосомальной мембране. Транслокационный компонент можно получать из микробного источника белка, в частности, из бактериального или вирусного источника белка. Таким образом, в одном варианте осуществления транслокационный компонент представляет собой транслоцирующий домен фермента, такого как бактериальный токсин или вирусный белок. Транслокационный компонент по настоящему изобретению предпочтительно представляет собой H-цепь клостридиального нейротоксина или ее фрагмент. Наиболее предпочтительно он представляет собой домен H_N (или его функциональный компонент), при этом H_N означает часть или фрагмент H-цепи клостридиального нейротоксина, приблизительно эквивалентный аминоконцевой половине H-цепи, или домен, соответствующий этому фрагменту в интактной H-цепи.

Компонент TM галанина по настоящему изобретению отвечает за связывание слитого белка по настоящему изобретению с сайтом связывания на клетке-мишени. Таким образом, компонент TM галанина представляет собой лиганд, с помощью которого слитые белки по настоящему изобретению связываются с выбранной клеткой-мишенью.

В контексте настоящего изобретения клетка-мишень представляет собой ноцицептивный сенсорный афферент, предпочтительно основной ноцицептивный афферент (например, A-волокно, такое как Αδ-волокно, или C-волокно). Таким образом, слитые белки по настоящему изобретению способны ингибировать высвобождение нейромедиатора или нейромодулятора [например, глутамата, вещества P, пептида, связанного с геном кальцитонина (CGRP), и/или нейропептида Y] из отдельных популяций ноцицептивных сенсорных афферентных нейронов. На практике слитые белки уменьшают или предотвращают передачу сенсорных афферентных сигналов (например, нейротрансмиттеров или нейромодуляторов) от периферии к центральным болевым волокнам и, таким образом, находят применение в качестве терапевтических молекул для лечения боли, в частности, хронической боли.

Подтверждение того, что TM связывается с ноцицептивным сенсорным афферентом, является обычной процедурой. Например, можно использовать простой эксперимент с вытеснением радиоактивности, в котором ткань или клетки, представляющие собой ноцицептивный сенсорный афферент (например, DRGs), подвергают воздействию меченого (например, меченного тритием) лиганда в присутствии избытка немеченого лиганда. В таком эксперименте можно оценивать относительные пропорции неспецифического и специфического связывания, тем самым подтверждая то, что лиганд связывается с ноцицептивной сенсорной афферентной клеткой-мишенью. Необязательно, анализ может включать один или более связывающихся антагонистов и анализ может дополнительно включать наблюдение исчезновения связывания лиганда. Примеры эксперимента такого типа можно найти в Hulme, E.C. (1990), Receptor-binding studies, a brief outline, pp. 303-311, In Receptor biochemistry, A Practical Approach, Ed. E.C. Hulme, Oxford University Press.

Слитые белки по настоящему изобретению, как правило, демонстрируют сниженную аффинность связывания (примерно вплоть до 10 раз) для рецептора галанина (например, GALR1) при сравнении с соответствующим «свободным» TM (например, gal16). Однако, несмотря на это наблюдение, слитые белки по настоящему изобретению неожиданно демонстрируют хорошую эффективность. Это может быть связано с двумя основными особенностями. Во-первых, компонент нецитотоксической протеазы является каталитическим - таким образом, терапевтический эффект нескольких таких молекул быстро усиливается. Во-вторых, рецепторы галанина, присутствующие на ноцицептивных сенсорных афферентах, должны действовать только в качестве шлюза для поступления внутрь терапевтического средства и не обязательно должны быть стимулированы до уровня, необходимого для достижения опосредованного взаимодействием лиганд-рецептор фармакологического ответа. Соответственно, слитые белки по настоящему изобретению можно вводить в дозе, которая намного ниже, чем та, которая потребовалась бы для анальгетических молекул других типов, таких как НПВС, морфин и габапентин. Последние молекулы, как правило, вводят в количествах от многих микрограмм до миллиграмм (даже до сотен миллиграмм), в то время как слитые белки по настоящему изобретению можно вводить в гораздо меньших дозах, как правило, по меньшей мере в 10 раз в меньших дозах, и более конкретно, в 100 раз в меньших дозах.

TM галанина по изобретению может также представлять собой молекулу, которая действует как «агонист» на один или более рецепторов галанина, находящихся на ноцицептивном сенсорном афференте, более конкретно, на основном ноцицептивном афференте. Обычно агонистом считают любую молекулу, которая может либо повышать, либо снижать активность в клетке, а именно, любую молекулу, которая просто вызывает изменение клеточной активности. Например, общепринятое значение слова «агонист» будет включать химическое вещество, способное объединяться с рецептором на клетке и инициировать реакцию или активность, либо лекарственное средство, которое вызывает активный ответ за счет активации рецепторов, выражается ли ответ в возрастании или снижении клеточной активности.

Однако для целей настоящего изобретения агонист более конкретно определяют как молекулу, которая способна стимулировать процесс экзоцитозного слияния в клетке-мишени, процесс, который подвержен ингибированию протеазой (или ее фрагментом), способной расщеплять белок экзоцитозного аппарата слияния в указанной клетке-мишени.

Соответственно, конкретное определение агониста по настоящему изобретению будет исключать многие молекулы, которые в обычном смысле считались бы агонистами. Например, фактор роста нервов (NGF) является агонистом с точки зрения его способности стимулировать нейрональную дифференциацию посредством связывания с рецептором TrkA. Однако NGF не является агонистом при оценке в соответствии с вышеуказанными критериями, поскольку он не является основным индуктором экзоцитозного слияния. Кроме того, процесс, который NGF стимулирует (то есть клеточная дифференциация), не восприимчив к ингибированию протеазной активностью нецитотоксической молекулы токсина.

В одном варианте осуществления слитые белки по настоящему изобретению демонстрируют предпочтительное связывание с рецептором и/или свойства интернализации. Это, в свою очередь, может приводить к более эффективной доставке протеазного компонента к восприимчивой к боли клетке-мишени.

Использование агониста, такого как TM, имеет собственные ограничения с точки зрения побочных эффектов. Более конкретно, связывание агониста TM с восприимчивой к боли клеткой-мишенью увеличивает экзоцитозное слияние, что может усиливать ощущение боли. Однако процесс экзоцитоза, который стимулируется связыванием агониста, впоследствии уменьшается или ингибируется протеазным компонентом слитого белка.

Агонистические свойства TM, который связывается с рецептором на ноцицептивном афференте, можно подтверждать с помощью методов, описанных в примере 9.

Направляющий фрагмент по настоящему изобретению содержит или состоит из галанина и/или производных галанина. Рецепторы галанина (например, GALR1, GALR2 и GALR3) локализованы пре- и постсинаптически в DRGs (Liu & Hokfelt, (2002), Trends Pharm. Sci., 23(10), 468-74), и их экспрессия повышена во время состояний невропатической боли. В статье Xu et al., (2000) Neuropeptides, 34 (3&4), 137-147 приведена дополнительная информация относительно галанина. Все процитированные выше литературные источники включены в настоящий документ посредством ссылки.

В одном варианте осуществления изобретения мишенью для TM галанина является рецептор GALR1, GALR2 и/или GALR3. Эти рецепторы являются членами класса связанных с G-белками рецепторов и имеют структуру с семью трансмембранными доменами.

В одном варианте осуществления TM галанина представляет собой молекулу, которая связывается (предпочтительно, которая специфически связывается) с рецептором GALR1, GALR2 и/или GALR3. Более предпочтительно, TM галанина является «агонистом» рецептора GALR1, GALR2 и/или GALR3. Термин «агонист» в данном контексте имеет то значение, которое определено выше.

Человеческий пептид галанина дикого типа представляет собой пептид из 30 аминокислот, обозначенный в настоящем документе аббревиатурой «GA30» (представлен SEQ ID NO: 7). В одном варианте осуществления TM галанина содержит или состоит из SEQ ID NO: 7.

Изобретение также охватывает фрагменты, варианты и производные TM галанина, описанного выше. Эти фрагменты, варианты и производные в значительной степени сохраняют свойства, которые приписывают указанному TM галанина (то есть являются функционально эквивалентными). Например, фрагменты, варианты и производные могут сохранять способность связываться с рецептором GALR1, GALR2 и/или GALR3. В одном варианте осуществления TM галанина по изобретению содержит или состоит из 16-аминокислотного фрагмента полноразмерного пептида галанина и называется в настоящем документе GA16 (представлен SEQ ID NO: 8).

В одном варианте осуществления TM галанина содержит или состоит из аминокислотной последовательности, имеющей по меньшей мере 70%, предпочтительно по меньшей мере 80% (например, по меньшей мере 82, 84, 85, 86, 88 или 89%), более предпочтительно по меньшей мере 90% (например, по меньшей мере 91, 92, 93 или 94%) и наиболее предпочтительно по меньшей мере 95% (например, по меньшей мере 96, 97, 98, 99 или 100%) идентичности аминокислотной последовательности с SEQ ID NO: 7 или SEQ ID NO: 8.

В одном варианте осуществления TM галанина содержит или состоит из аминокислотной последовательности, имеющей по меньшей 70% (например, по меньшей мере 80, 82, 84, 85, 86, 88 или 89%), более предпочтительно по меньшей мере 90% (например, по меньшей мере 91, 92, 93 или 94%) и наиболее предпочтительно по меньшей мере 95% (например, по меньшей мере 96, 97, 98, 99 или 100%) идентичности аминокислотной последовательности с полноразмерной аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 7 или SEQ ID NO: 8, или фрагментом SEQ ID NO: 7 или SEQ ID NO: 8, содержащим или состоящим из по меньшей мере 10 (например, по меньшей мере 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28 или 29) смежных аминокислотных остатков из них.

В одном варианте осуществления направляющий фрагмент галанина содержит или состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 7 или фрагмента, содержащего или состоящего из по меньшей мере 16 (например, по меньшей мере 10, 11, 12, 13, 14 или 15) смежных аминокислотных остатков из нее, или вариантной аминокислотной последовательности указанной SEQ ID NO: 7 или указанного фрагмента, имеющих максимум 6 (например, максимум 5, 4, 3, 2 или 1) консервативных аминокислотных замен.

Сайт расщепления протеазой по настоящему изобретению делает возможным расщепление (предпочтительно контролируемое расщепление) слитого белка в положении между компонентом нецитотоксической протеазы и компонентом TM. Именно эта реакция расщепления преобразует слитый белок из одноцепочечного полипептида в связанный дисульфидной связью двухцепочечный полипептид.

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения TM галанина связывается через домен или аминокислотную последовательность, которая находится далеко от С-конца TM галанина. Например, соответствующий связывающий домен может включать внутренний домен или аминокислотную последовательность, расположенную ближе к середине (то есть линейной пептидной последовательности) TM. Предпочтительно, соответствующий связывающий домен расположен ближе к N-концу TM галанина, более предпочтительно на N-конце или рядом с ним.

В одном варианте осуществления одноцепочечный слитый полипептид может содержать более одного сайта протеолитического расщепления. Однако в случае, когда существуют два или более таких сайтов, они являются разными, тем самым в значительной степени предотвращается множественное расщепление в присутствии одной протеазы. В другом варианте осуществления предпочтительно, чтобы одноцепочечный слитый полипептид имел один сайт расщепления протеазой.

Последовательность(и) расщепления протеазой может быть внесена (и/или любая изначально присутствующая последовательность расщепления удалена) на уровне ДНК общепринятыми методами, такими как сайт-направленный мутагенез. Скрининг для подтверждения присутствия последовательностей расщепления можно выполнять вручную или с помощью компьютерного программного обеспечения (например, программы MapDraw от компании DNASTAR, Inc.).

Хотя можно использовать любой сайт расщепления протеазой, следующие являются предпочтительными:

Энтерокиназа	(DDDDK↓)
Фактор Xa	(IEGR↓/IDGR↓)
TEV (вирус гравировки табака)	(ENLYFQ↓G)
Тромбин	(LVPR↓GS)
PreScission	(LEVLFQ↓GP)

В одном варианте осуществления сайт расщепления протеазой представляет собой сайт расщепления энтерокиназой (DDDDK↓). В одном варианте осуществления протеазу энтерокиназу используют для расщепления в сайте расщепления энтерокиназой и активации слитого белка.

Термин «сайт расщепления протеазой» также охватывает интеин, который представляет собой саморасщепляющуюся последовательность. Реакция самосплайсинга является контролируемой, например, путем изменения концентрации присутствующего восстанавливающего агента.

На практике в сайте расщепления протеазой происходит расщепление и N-концевая область (предпочтительно N-конец) TM обнажается. Полученный полипептид содержит TM с N-концевым доменом или внутренним доменом, который практически свободен от остатка слитого белка. Такое расположение гарантирует, что N-концевой компонент (или внутренний домен) TM может взаимодействовать непосредственно с сайтом связывания на клетке-мишени.

В одном варианте осуществления TM и сайт расщепления протеазой отстоят друг от друга в слитом белке не более чем на 10 аминокислотных остатков, более предпочтительно не более чем на 5 аминокислотных остатков и наиболее предпочтительно на ноль аминокислотных остатков. В одном варианте осуществления TM и сайт расщепления протеазой отстоят друг от друга в слитом белке на 0-10 (например, 0-9, 0-8, 0-7, 0-6, 0-5, 0-4, 0-3, 0-2) и предпочтительно 0-1 аминокислотный остаток. Таким образом, после расщепления в сайте расщепления протеазой, получается слитый белок с TM, который имеет N-концевой домен, практически свободный от остатка слитого белка. Такое расположение гарантирует, что N-концевой компонент направляющего фрагмента может взаимодействовать непосредственно с сайтом связывания на клетке-мишени.

Одним из преимуществ, связанных с вышеупомянутым этапом активации, является то, что TM становится восприимчивым к N-концевой деградации только после того, как происходит протеолитическое расщепление слитого белка. Кроме того, выбор определенного сайта расщепления протеазой делает возможной избирательный переход слитого полипептида в двухцепочечную конформацию.

При конструировании слитого полипептида по настоящему изобретению, сайт расщепления протеазой помещают между TM и компонентом нецитотоксической протеазы.

Предпочтительно, чтобы в одноцепочечном слитом белке TM находился между сайтом расщепления протеазой и транслокационным компонентом. Это гарантирует, что ТМ присоединен к домену транслокации (то есть как это происходит в природном клостридиальном голотоксине), хотя в ситуации по настоящему изобретению порядок этих двух компонентов изменен на противоположный по сравнению с природным голотоксином. Еще одним преимуществом такой конструкции является то, что TM находится в области открытой петли слитого белка, которая оказывает минимальное структурное воздействие на конформацию слитого белка. В этом отношении указанную петлю называют по-разному: линкер, петля активации, междоменный линкер или просто экспонированная на поверхности петля (Schiavo et al., 2000, Phys. Rev., 80, 717-766; Turton et al., 2002, Trends Biochem. Sci., 27, 552-558).

Одноцепочечный слитый белок по настоящему изобретению содержит первый спейсер, расположенный между нецитотоксической протеазой и сайтом расщепления протеазой, при этом первый спейсер содержит (или состоит из) аминокислотную последовательность из 4-25 (например, 6-25, 8-25, 10-25, 15-25 или 4-21, 4-20, 4-18, 4-15, 4-12 или 4-10) аминокислотных остатков. В одном варианте осуществления первый спейсер содержит (или состоит из) аминокислотную последовательность из по меньшей мере 4 (например, по меньшей мере 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15) аминокислотных остатков. В одном варианте осуществления первый спейсер содержит (или состоит из) аминокислотную последовательность из не более чем 25 (например, не более чем 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 10) аминокислотных остатков. Указанный первый спейсер делает возможным расщепление слитого белка в сайте расщепления протеазой.

Без первого спейсера по настоящему изобретению расщепление протеазой и активация слитого белка происходят в очень слабой степени. Не желая быть связанными теорией, авторы изобретения предположили, что направляющий фрагмент галанина может пространственно блокировать или взаимодействовать с сайтом расщепления протеазой, что приводит к слабой активации слитых белков, лишенных первого спейсера по настоящему изобретению. Авторы настоящего изобретения считают, что именно гибкость, обеспечиваемая первым спейсером, придает свойство усиленной/улучшенной активации заявленным в настоящем изобретении слитым белкам. Жесткие линкеры, такие как альфа-спиральные линкеры, не допускают необходимую гибкость. Это также верно для слитых белков галанина, имеющих «природные» спейсерные последовательности, содержащие сайт расщепления протеазой, которые могут копировать нежелательные жесткие альфа-спиральные структуры линкеров. Гибкость и подвижность полипептидных доменов можно подтверждать с помощью ряда методов, включая определение рентгеновского кристаллографического B-фактора (смотрите, например, статью Smith et al., 2003 Protein Science, 12: 1060-1072; включенную в настоящий документ посредством ссылки). Специально выбранные спейсерные последовательности по настоящему изобретению обеспечивают усиленную активацию в большей степени, чем любые «природные» спейсерные последовательности. Активация в этом контексте означает, что первый спейсер делает возможным расщепление слитого белка в сайте расщепления протеазой. Особенно предпочтительные аминокислотные остатки для использования в первом спейсере включают глицин, треонин, аргинин, серин, аланин, аспарагин, глутамин, аспарагиновую кислоту, пролин, глутаминовую кислоту и/или лизин. Вышеуказанные аминокислоты считаются наиболее гибкими аминокислотами - смотрите Smith et al. 2003 Protein Science 2003; 12: 1060-1072.

В одном варианте осуществления аминокислотные остатки первого спейсера выбраны из группы, состоящей из глицина, треонина, аргинина, серина, аспарагина, глутамина, аланина, аспарагиновой кислоты, пролина, глутаминовой кислоты, лизина, лейцина и/или валина. В одном варианте осуществления аминокислотные остатки первого спейсера выбраны из группы, состоящей из глицина, серина, аланина, лейцина и/или валина. В одном варианте осуществления аминокислотные остатки первого спейсера выбраны из группы, состоящей из глицина, серина и/или аланина. Глицин и серин являются особенно предпочтительными. В одном варианте осуществления первый спейсер содержит или состоит из одного или более пентапептидов, содержащих остатки глицина, серина и/или треонина. Один из способов оценки того, обладает ли необходимой гибкостью первый спейсер в заявленных по настоящему изобретению слитых белках, заключается в проведении простого анализа расщепления протеазой. Для специалиста в данной области будет несложно оценить расщепление/активацию слитого белка - стандартная методология описана, например, в примере 1.

В одном варианте осуществления первый спейсер можно выбирать из спейсеров GS5, GS10, GS15, GS18, GS20, FL3 и/или FL4. Последовательность указанных спейсеров приведена в таблице 1 ниже.

Таблица 1

В одном варианте осуществления первый спейсер допускает по меньшей мере 45% (например, по меньшей мере 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 90, 95, 98, 99 или 100%) активацию слитого белка за счет расщепления протеазой. В одном варианте осуществления первый спейсер допускает по меньшей мере 70% активацию слитого белка за счет расщепления протеазой.

В одном варианте осуществления первый спейсер не является природной спейсерной последовательностью. В одном варианте осуществления первый спейсер не содержит или не состоит из аминокислотной последовательности, свойственной природному (то есть дикого типа) клостридиальному нейротоксину, такому как ботулинический нейротоксин. Иными словами, первый спейсер может представлять собой неклостридиальную последовательность (то есть не встречающуюся в природном клостридиальном нейротоксине). В одном варианте осуществления слитый белок не содержит или не состоит из аминокислотной последовательности GIITSK (BoNT/A); VK (BoNT/B); AIDGR (BoNT/C); LTK (BoNT/D); IVSVK (BoNT/E); VIPR (BONT/F); VMYK (BoNT/G) и/или IIPPTNIREN (TeNT) в качестве первого спейсера.

В одном варианте осуществления первый спейсер начинается на третьем аминокислотном остатке после консервативного остатка цистеина в L-цепи клостридиального нейротоксина (смотрите таблицу 3 ниже). В одном варианте осуществления первый спейсер начинается после аминокислотных остатков VD L-цепи клостридиальной нецитотоксической протеазы, сконструированной с сайтом sal1, после консервативного остатка цистеина. В одном варианте осуществления первый спейсер заканчивается аминокислотным остатком, отмечающим начало сайтов расщепления протеазой, упомянутых выше.

В одном варианте осуществления одноцепочечный слитый белок содержит второй спейсер, который расположен между направляющим фрагментом галанина и доменом транслокации. Указанный второй спейсер может содержать (или состоять из) аминокислотную последовательность из 4-35 (например, 6-35, 10-35, 15-35, 20-35 или 4-28, 4-25, 4-20 или 4-10) аминокислотных остатков. Авторы настоящего изобретения неожиданно обнаружили, что слитые белки по настоящему изобретению могут демонстрировать улучшенную связывающую способность, если размер второго спейсера выбирают так, что (на практике) C-конец TM и N-конец транслокационного компонента отделены друг от друга на 40-105 ангстрем, предпочтительно на 50-100 ангстрем и более предпочтительно на 50-90 ангстрем.

Подходящие вторые спейсеры можно обычным образом идентифицировать и получать методом, описанным в статье Crasto, C.J. and Feng, J.A. (2000) May, 13(5), pp. 309-312 - смотрите также http://www.fccc/edu/research/labs/feng/limker.html. В одном варианте осуществления второй спейсер выбран из спейсеров GS5, GS10, GS15, GS18, GS20 или HX27. Последовательности указанных спейсеров приведены в таблице 2 ниже.

Таблица 2

Авторы изобретения неожиданно установили, что заявленные в настоящем изобретении слитые белки, имеющие указанные первый и второй спейсеры, демонстрируют улучшенное свойство активации и повышенный выход при рекомбинантной экспрессии. Кроме того, заявленные в настоящем изобретении слитые белки демонстрируют повышенную эффективность по сравнению со слитыми белками, в которых TM галанина является C-концевым для компонента домена транслокации.

В одном варианте осуществления изобретение относится к одноцепочечному полипептидному слитому белку, содержащему (или состоящему из) аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80% (например, по меньшей мере 85, 90, 92, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100%) идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 10, 11, 13, 14, 16, 17, 19, 20, 22, 23, 25, 26, 28, 29, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 53, 56 и/или 59.

В одном варианте осуществления изобретение относится к одноцепочечному полипептидному слитому белку, содержащему (или состоящему из) аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80% (например, по меньшей мере 85, 90, 92, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100%) идентичности последовательности с полноразмерной аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 10, 11, 13, 14, 16, 17, 19, 20, 22, 23, 25, 26, 28, 29, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 53, 56 и/или 59.

В одном варианте осуществления в одноцепочечном полипептиде компонент нецитотоксической протеазы и транслокационный компонент связаны вместе дисульфидной связью. Таким образом, после расщепления в сайте расщепления протеазой полипептид принимает двухцепочечную конформацию, в которой протеазный и транслокационный компоненты остаются связанными друг с другом посредством дисульфидной связи. Для этой цели предпочтительно, чтобы протеазный и транслокационный компоненты были разнесены друг от друга в одноцепочечном слитом белке не более чем на 100 аминокислотных остатков, более предпочтительно не более чем на 80 аминокислотных остатков, особенно предпочтительно не более чем на 60 аминокислотных остатков и наиболее предпочтительно не более чем на 50 аминокислотных остатков.

В одном варианте осуществления компонент нецитотоксической протеазы образует дисульфидную связь с транслокационным компонентом слитого белка. Например, аминокислотный остаток протеазного компонента, который образует дисульфидную связь, находится в числе последних 20, предпочтительно в числе последних 10 C-концевых аминокислотных остатков протеазного компонента. Аналогично, аминокислотный остаток в составе транслокационного компонента, который образует вторую часть дисульфидной связи, может находиться в числе первых 20, предпочтительно в числе первых 10 N-концевых аминокислотных остатков транслокационного компонента.

Альтернативно, в одноцепочечном полипептиде компонент нецитотоксической протеазы и TM могут быть связаны вместе дисульфидной связью. С этой точки зрения, аминокислотный остаток TM, который образует дисульфидную связь, предпочтительно расположен вдали от N-конца TM, более предпочтительно около C-конца TM.

В одном варианте осуществления компонент нецитотоксической протеазы образует дисульфидную связь с компонентом TM слитого белка. С этой точки зрения, аминокислотный остаток протеазного компонента, который образует дисульфидную связь, предпочтительно находится в числе последних 20, более предпочтительно в числе последних 10 C-концевых аминокислотных остатков протеазного компонента. Аналогично, аминокислотный остаток в составе компонента TM, который образует вторую часть дисульфидной связи, предпочтительно находится в числе последних 20, более предпочтительно в числе последних 10 C-концевых аминокислотных остатков TM.

Вышеописанное расположение дисульфидных связей имеет то преимущество, что протеазный и транслокационный компоненты расположены аналогично тому, как это имеет место в природном клостридиальном нейротоксине. Для сравнения, что касается первичной аминокислотной последовательности природного клостридиального нейротоксина, соответствующие аминокислотные остатки цистеина отстоят друг от друга на 8-27 аминокислотных остатков - взято из книги Popoff, MR & Marvaud, J-C, 1999, Structural & genomic features of clostridial neurotoxins, Chapter 9, in The Comprehensive Sourcebook of Bacterial Protein Toxins. Ed. Alouf & Freer:

Таблица 3

1Информация только для протеолитически