Генетически модифицированные в отношении главного комплекса гистосовместимости мыши

Генетически модифицированные в отношении главного комплекса гистосовместимости мыши

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Ссылки на родственные заявки

Согласно настоящей заявке испрашивается приоритет в соответствии с предварительными заявками на выдачу патента США №№61/552582 и 61/552587, поданными 28 октября 2011 г., и предварительной заявкой на выдачу патента США №61/700908, поданной 14 сентября 2012 г., полное содержание которых включено в настоящий документ посредством ссылки.

Область техники, к которой относится настоящее изобретение

Настоящее изобретение относится к генетически модифицированному не относящемуся к человеку животному, например, грызуну (например, мыши или крысе), которое экспрессирует человеческую или гуманизированную молекулу главного комплекса гистосовместимости (MHC) I класса. Настоящее изобретение также относится к генетически модифицированному не относящемуся к человеку животному, например, мыши или крысе, которое экспрессирует человеческий или гуманизированный белок МНС I (например, α цепь МНС I) и/или человеческий или гуманизированный β2 микроглобулин; а также зародышам, тканям и клеткам, их экспрессирующим. Настоящее изобретение дополнительно относится к способам получения генетически модифицированного не относящегося к человеку животного, которое экспрессирует человеческий или гуманизированный белок МНС I класса (например, α цепь МНС I) и/или β2 микроглобулин. Также предусмотрены способы идентификации и оценки пептидов в контексте гуманизированной клеточной иммунной системы in vitro или у генетически модифицированного не относящегося к человеку животного, и способы модификации локуса МНС I и/или локуса β2 микроглобулина не относящегося к человеку животного, например, мыши или крысы, для экспрессии человеческого или гуманизированного МНС I и/или β2 микроглобулина.

Предшествующий уровень техники настоящего изобретения

В приобретенном иммунном ответе чужеродные антигены распознаются рецепторными молекулами на В-лимфоцитах (например, иммуноглобулинами) и Т-лимфоцитах (например, Т-клеточным рецептором, или TCR). Эти чужеродные антигены презентируются на поверхности клеток в виде пептидных фрагментов специализированными белками, имеющими общее название молекулы главного комплекса гистосовместимости (МНС). Молекулы МНС кодируются множественными локусами, которые встречаются в виде соединенного кластера генов, который охватывает приблизительно 4 м.п.н. У мышей гены MHC находятся на 17 хромосоме, и исторически они называются гены гистосовместимости 2 (Н-2). У людей гены находятся на 6 хромосоме и имеют название гены антигена лейкоцита человека (HLA). Локусы у мышей и людей являются полигенными; они включают в себя три высоко полиморфных класса генов MHC (I, II и III класс), которые проявляют сходную организацию в геноме человека и мыши (смотрите фиг. 2 и фиг. 3, соответственно).

Локусы МНС проявляют самый высокий полиморфизм в геноме; некоторые гены представлены >300 аллелями (например, HLA-DRβ человека и HLA-B человека). Все гены МНС I и II класса могут презентировать пептидные фрагменты, но каждый ген экспрессирует белок с различными характеристиками связывания, отражая полиморфизмы и аллельные варианты. Любой рассматриваемый индивидуум содержит уникальный спектр пептидных фрагментов, которые могут быть презентированы на клеточной поверхности В- и Т-клеткам в ходе иммунного ответа.

Как люди, так и мыши содержат гены МНС I класса (смотрите фигуры 2 и 3). У людей классические гены МНС I называются HLA-A, HLA-B и HLA-C, тогда как у мышей они представляют собой Н-2K, H-2D и H-2L. Молекулы I класса состоят из двух полипептидных цепей: полиморфной α цепи (в некоторых случаях имеющей название тяжелая цепь) и меньшей цепи, которая называется β2 микроглобулин (также известная как легкая цепь), которая в основном не является полиморфной (фиг. 1). Эти две цепи образуют нековалентный гетеродимер на клеточной поверхности. α цепь содержит три домена (α1, α2 и α3). Экзон 1 гена α цепи кодирует лидерную последовательность, экзоны 2 и 3 кодируют α1 и α2 домены, экзон 4 кодирует α3 домен, экзон 5 кодирует трансмембранный домен, и экзоны 6 и 7 кодируют цитоплазматический хвост. α цепь образует пептидсвязывающую бороздку, включающую в себя α1 и α2 домены (которые напоминают Ig-подобные домены), за которыми следует α3 домен, который аналогичен β2 микроглобулину.

β2 микроглобулин представляет собой негликозилированный 12 кДа белок; одной из его функций является стабилизация α цепи МНС I класса. В отличие от α цепи β2 микроглобулин не пересекает мембрану. Локус β2 микроглобулина человека находится на 15 хромосоме, тогда как локус мыши находится на 2 хромосоме. Ген β2 микроглобулина состоит из 4 экзонов и 3 интронов. Циркулирующие формы β2 микроглобулина присутствуют в сыворотке, моче и других биологических жидкостях; таким образом, нековалентно связанный с МНС I β2 микроглобулин может обмениваться на циркулирующий β2 микроглобулин при физиологических условиях.

Молекулы МНС I класса экспрессируются на всех ядросодержащих клетках, включающих в себя опухолевые клетки. Они экспрессируются специфически на Т- и В-лимфоцитах, макрофагах, дендритных клетках и нейтрофилах, среди прочих клеток, и функционируют для представления пептидных фрагментов (как правило 8-10 аминокислот в длину) на поверхности CD8+ цитотоксическим Т-лимфоцитам (CTL). CTL специализируются на цитолизе любой клетки, которая несет связанный с МНС I пептид, распознанный ее собственным мембраносвязанным TCR. Когда клетка представляет пептиды, происходящие из клеточных белков, не присутствующих в норме (например, вирусного, опухолевого или другого не являющегося собственным происхождения), такие пептиды распознаются CTL, которые активируются и лизируют представляющую пептид клетку.

Как правило, презентация нормальных (т.е., собственных) белков в контексте молекул МНС I не вызывает активации CTL вследствие механизмов толерантности. Тем не менее, при некоторых заболеваниях (например, злокачественной опухоли, аутоиммунных заболеваниях), происходящие из собственных белков пептиды становятся мишенью клеточного компонента иммунной системы, что приводит к разрушению клеток, презентирующих такие пептиды. Несмотря на достигнутый прогресс в распознавании собственных антигенов, которые вызывают клеточный иммунный ответ (например, антигенов, связанных с различными злокачественными опухолями), для улучшения идентификации пептидов, распознаваемых CTL человека посредством молекул МНС I класса, сохраняется потребность в системах как in vivo, так и in vitro, которые имитируют аспекты системы клеточного иммунитета человека. Системы, которые имитируют систему клеточного иммунитета человека, могут использоваться в идентификации связанных с заболеваниями антигенов для разработки терапевтических средств для людей, например, вакцин и других биологических средств. Системы оценки распознавания антигенов в контексте иммунной системы человека могут содействовать в идентификации терапевтически применимых популяций CTL (например, применимых для исследования и борьбы с заболеванием человека). Такие системы также могут содействовать в усилении активности популяций CTL человека для более эффективной борьбы с инфекциями и чужеродными несущими антигены соединениями. Таким образом, существует необходимость в биологических системах (например, генетически сконструированных животных), которые могут создавать иммунную систему, которая проявляет компоненты, имитирующие функцию иммунной системы человека.

Краткое раскрытие настоящего изобретения

Предусмотрена биологическая система для получения или идентификации пептидов, которые ассоциируются с белками МНС I класса человека и их химерами и связываются с CD8+ Т-клетками. Предусмотрены не относящиеся к человеку животные, содержащее не относящиеся к человеку клетки, которые экспрессируют человеческие или гуманизированные молекулы, функционирующие в клеточном иммунном ответе. Также предусмотрены гуманизированные локусы грызуна, которые кодируют человеческие или гуманизированные белки МНС I и β2 микроглобулина. Также предусмотрены гуманизированные клетки грызуна, которые экспрессируют человеческие или гуманизированные молекулы МНС и β2 микроглобулина. Предусмотрены системы in vivo и in vitro, которые содержат гуманизированные клетки грызуна, причем клетки грызуна экспрессируют одну или несколько человеческих или гуманизированных молекул иммунной системы.

В настоящем документе предусмотрено не относящееся к человеку животное, например, грызун (например, мышь или крыса), содержащее в своем геноме нуклеотидную последовательность, кодирующую химерный человеческий/не относящийся к человеку (например, человеческий/относящийся к грызуну, например, человеческий/мышиный или человеческий/крысиный) полипептид МНС I, причем человеческая часть химерного полипептид содержит внеклеточный домен полипептид МНС I человека. В частности, в настоящем документе предусмотрено не относящееся к человеку животное, содержащее на эндогенном локусе МНС I нуклеотидную последовательность, кодирующую химерный человеческий/не относящийся к человеку полипептид МНС I, причем человеческая часть химерного полипептид содержит внеклеточный домен полипептида МНС I человека, и причем животное экспрессирует химерный человеческий/не относящийся к человеку полипептид МНС I. Согласно одному аспекту животное не экспрессирует внеклеточный домен эндогенного не относящегося к человеку полипептида МНС I из эндогенного не относящегося к человеку локуса МНС I. Согласно одному аспекту настоящего изобретения не относящееся к человеку животное (например, грызун, например, мышь или крыса) содержит две копии локуса МНС I, содержащего нуклеотидную последовательность, кодирующую химерный человеческий/не относящийся к человеку (например, человеческий/относящийся к грызуну, например, человеческий/мышиный или человеческий/крысиный) полипептид МНС I. Согласно другому аспекту настоящего изобретения животное содержит одну копию локуса МНС I, содержащего нуклеотидную последовательность, кодирующую химерный человеческий/не относящийся к человеку полипептид МНС I. Таким образом, животное может являться гомозиготным или гетерозиготным в отношении локуса МНС I, содержащего нуклеотидную последовательность, кодирующую химерный человеческий/не относящийся к человеку полипептид МНС I. Согласно различным вариантам осуществления нуклеотидная последовательность, кодирующая химерный человеческий/не относящийся к человеку полипептид МНС I, содержится в зародышевой линии не относящегося к человеку животного (например, грызуна, например, крысы или мыши).

Согласно одному аспекту нуклеотидная последовательность, кодирующая химерный человеческий/не относящийся к человеку МНС I, функционально связана с эндогенными не относящимися к человеку регуляторными элементами, например, промотором, энхансером, сайленсером и т.д. Согласно одному варианту осуществления человеческая часть химерного полипептид содержит лидерную последовательность человека. Согласно дополнительному варианту осуществления человеческая часть химерного полипептид содержит α1, α2 и α3 домены полипептида МНС I человека. Полипептид МНС I человека может быть выбран из группы, состоящей из HLA-A, HLA-B и HLA-C. Согласно одному варианту осуществления полипептид МНС I человека представляет собой полипептид HLA-A2, например, полипептид HLA-A2.1.

Согласно одному аспекту генетически сконструированное не относящееся к человеку животное представляет собой грызуна. Согласно одному варианту осуществления грызун представляет собой мышь. Таким образом, согласно одному варианту осуществления эндогенный не относящийся к человеку локус представляет собой локус мыши, например, локус Н-2K, H-2D или H-2L мыши. Согласно одному варианту осуществления не относящаяся к человеку часть химерного человеческого/не относящегося к человеку полипептида МНС I содержит трансмембранный и цитоплазматический домены эндогенного не относящегося к человеку полипептида МНС I. Таким образом, согласно варианту осуществления, в котором не относящееся к человеку животное представляет собой мышь, эндогенный не относящийся к человеку локус МНС I может представлять собой локус Н-2K (например, локус Н-2Kb), и эндогенный не относящийся к человеку полипептид МНС I может представлять собой полипептид Н-2K; следовательно, химерный человеческий/не относящийся к человеку полипептид МНС I может содержать трансмембранный и цитоплазматический домены полипептида Н-2K. Согласно другому варианту осуществления, в котором не относящееся к человеку животное представляет собой мышь, эндогенный не относящийся к человеку локус МНС I может представлять собой локус H-2D, и эндогенный не относящийся к человеку полипептид МНС I может представлять собой полипептид H-2D; следовательно, химерный человеческий/не относящийся к человеку полипептид МНС I может содержать трансмембранный и цитоплазматический домены полипептида H-2D. Аналогично, согласно другому варианту осуществления эндогенный не относящийся к человеку МНС I локус может представлять собой локус H-2L, и эндогенный не относящийся к человеку полипептид МНС I может представлять собой полипептид H-2L; следовательно, химерный человеческий/не относящийся к человеку полипептид МНС I может содержать трансмембранный и цитоплазматический домены полипептида H-2L.

Также в настоящем документе предусмотрена мышь, содержащая на эндогенном локусе Н-2K нуклеотидную последовательность, кодирующую химерный человеческий/мышиный полипептид МНС I, причем человеческая часть химерного полипептида содержит внеклеточный домен HLA-A полипептида человека (например, HLA-A2), и относящаяся к мыши часть содержит трансмембранный и цитоплазматический домены полипептида Н-2K мыши, и причем мышь экспрессирует химерный человеческий/мышиный полипептид МНС I. Согласно некоторым вариантам осуществления мышь не экспрессирует внеклеточный домен полипептида Н-2K мыши из эндогенного локуса Н-2K. Согласно одному аспекту нуклеотидная последовательность, кодирующая химерный человеческий/мышиный полипептид МНС I, функционально связана с эндогенными регуляторными элементами мыши. Человеческая часть химерного полипептида может содержать лидерную последовательность человека. Она также может содержать α1, α2 и α3 домены полипептида МНС I человека. Полипептид МНС I человека может представлять собой полипептид HLA-A, например, полипептид HLA-A2.1. Согласно одному аспекту локус Н-2K мыши представляет собой локус Н-2Kb.

Другой аспект настоящего изобретения относится к не относящемуся к человеку животному, например, грызуну (например, мыши или крысе), содержащему в своем геноме нуклеотидную последовательность, кодирующую человеческий или гуманизированный полипептид β2 микроглобулина. Таким образом, в настоящем документе предусмотрено не относящееся к человеку животное, содержащее на эндогенном не относящемся к человеку локусе β2 микроглобулина нуклеотидную последовательность, кодирующую человеческий или гуманизированный полипептид β2 микроглобулина, причем животное экспрессирует человеческий или гуманизированный полипептид β2 микроглобулина. Согласно одному аспекту животное не экспрессирует функциональный эндогенный не относящийся к человеку полипептид β2 микроглобулина из эндогенного не относящегося к человеку локуса β2 микроглобулина. Согласно одному аспекту животное содержит две копии локуса β2 микроглобулин, кодирующего человеческий или гуманизированный полипептид β2 микроглобулина; согласно другому варианту осуществления животное содержит одну копию локуса β2 микроглобулина, кодирующего человеческий или гуманизированный полипептид β2 микроглобулина. Таким образом, животное может являться гомозиготным или гетерозиготным в отношении локуса β2 микроглобулина, кодирующего человеческий или гуманизированный полипептид β2 микроглобулина. Согласно различным вариантам осуществления нуклеотидная последовательность, кодирующая человеческий или гуманизированный полипептид β2 микроглобулина, содержится в зародышевой линии не относящегося к человеку животного (например, грызуна, например, крысы или мыши). Согласно одному варианту осуществления нуклеотидная последовательность, кодирующая человеческий или гуманизированный полипептид β2 микроглобулина содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид, содержащий аминокислотную последовательность β2 микроглобулина человека. Согласно одному варианту осуществления полипептид способен связываться с белком МНС I.

Согласно некоторым вариантам осуществления нуклеотидная последовательность, кодирующая человеческий или гуманизированный полипептид β2 микроглобулина, функционально связана с эндогенными не относящимися к человеку регуляторными элементами β2 микроглобулина. Согласно одному аспекту нуклеотидная последовательность, кодирующая человеческий или гуманизированный полипептид β2 микроглобулина, содержит нуклеотидную последовательность, представленную в экзоне 2 - экзоне 4 гена β2 микроглобулина человека. Согласно другому аспекту нуклеотидная последовательность, кодирующая человеческий или гуманизированный полипептид β2 микроглобулина, содержит нуклеотидные последовательности, представленные в экзонах 2, 3 и 4 гена β2 микроглобулина человека. Согласно дополнительному аспекту нуклеотидная последовательность также содержит нуклеотидную последовательность, представленную в экзоне 1 не относящегося к человеку гена β2 микроглобулина. Согласно некоторым вариантам осуществления не относящееся к человеку животное представляет собой грызуна (например, мышь или крысу); таким образом, не относящийся к человеку локус β2 микроглобулина представляет собой локус β2 микроглобулина грызуна (например, мыши или крысы).

Также предусмотрена мышь, содержащая на эндогенном локусе β2 микроглобулина нуклеотидную последовательность, кодирующую человеческий или гуманизированный полипептид β2 микроглобулина, причем мышь экспрессирует человеческий или гуманизированный полипептид β2 микроглобулина. Согласно некоторым вариантам осуществления мышь не экспрессирует функциональный эндогенный β2 микроглобулин мыши из эндогенного локуса β2 микроглобулина. Нуклеотидная последовательность может быть связана с эндогенными регуляторными элементами мыши. Согласно одному аспекту нуклеотидная последовательность содержит нуклеотидную последовательность, представленную в экзоне 2 - экзоне 4 гена β2 микроглобулина человека. Альтернативно, нуклеотидная последовательность, кодирующая человеческий или гуманизированный полипептид β2 микроглобулина, может содержать нуклеотидные последовательности, представленные в экзонах 2, 3 и 4 гена β2 микроглобулина человека. Нуклеотидная последовательность, кодирующая человеческий или гуманизированный полипептид β2 микроглобулина, может дополнительно содержать нуклеотидную последовательность экзона 1 гена β2 микроглобулина мыши. Согласно одному варианту осуществления нуклеотидная последовательность, кодирующая человеческий или гуманизированный полипептид β2 микроглобулина, содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид, содержащий аминокислотную последовательность β2 микроглобулина человека. Согласно одному варианту осуществления полипептид способен связываться с белком МНС I.

Настоящее изобретение дополнительно относится к не относящемуся к человеку животному (например, грызуну, например, мыши или крысе), содержащему в своем геноме нуклеотидную последовательность, кодирующую химерный человеческий/не относящийся к человеку полипептид МНС I, и нуклеотидную последовательность, кодирующую человеческий или гуманизированный полипептид β2 микроглобулина. Согласно одному варианту осуществления настоящее изобретение относится к не относящемуся к человеку животному, содержащему в своем геноме первую нуклеотидную последовательность, кодирующую химерный человеческий/не относящийся к человеку полипептид МНС I, причем человеческая часть химерного полипептида содержит внеклеточный домен полипептида МНС I человека; и вторую нуклеотидную последовательность, кодирующую человеческий или гуманизированный полипептид β2 микроглобулина, причем первая нуклеотидная последовательность расположена на эндогенном не относящемся к человеку локусе МНС I, и вторая нуклеотидная последовательность расположена на эндогенном не относящемся к человеку локусе β2 микроглобулина, и причем животное экспрессирует химерный человеческий/не относящийся к человеку полипептид МНС I и человеческий или гуманизированный полипептид β2 микроглобулина. Согласно одному аспекту животное представляет собой мышь. Таким образом, эндогенный локус МНС I может быть выбран из группы, состоящей из локуса Н-2K, H-2D и H-2L. Согласно одному варианту осуществления эндогенный локус мыши представляет собой локус Н-2K (например, локус Н-2Kb). Согласно одному варианту осуществления полипептид МНС I человека выбран из группы, состоящей из полипептида HLA-A, HLA-B и HLA-C. Согласно одному аспекту полипептид МНС I человека представляет собой HLA-A, например, HLA-A2 (например, HLA-A2.1). Согласно различным вариантам осуществления первая и вторая нуклеотидные последовательности содержатся в зародышевой линии не относящегося к человеку животного (например, грызуна, например, мыши или крысы).

Следовательно, настоящее изобретение относится к мыши, содержащей в своем геноме первую нуклеотидную последовательность, кодирующую химерный человеческий/мышиный МНС I полипептид, причем человеческая часть химерного полипептида содержит внеклеточный домен HLA-A человека (например, HLA-A2), и мышиная часть содержит трансмембранный и цитоплазматический домены Н-2K мыши; и вторую нуклеотидную последовательность, кодирующую человеческий или гуманизированный полипептид β2 микроглобулина, причем первая нуклеотидная последовательность расположена на эндогенном локусе Н-2K, и вторая нуклеотидная последовательность расположена на эндогенном локусе β2 микроглобулина мыши, и причем мышь экспрессирует химерный человеческий/мышиный полипептид МНС I и человеческий или гуманизированный полипептид β2 микроглобулина. Согласно одному варианту осуществления не относящееся к человеку животное (например, мышь), содержащее как химерный полипептид МНС I, так и человеческий или гуманизированный полипептид β2 микроглобулина, не экспрессирует внеклеточный домен эндогенного не относящегося к человеку полипептида МНС I (например, полипептид Н-2K мыши) и/или функциональные эндогенные не относящиеся к человеку (например, мышиные) полипептиды β2 микроглобулина из их соответствующих эндогенных локусов. Согласно одному аспекту животное (например, мышь) содержит две копии каждой из первой и второй нуклеотидной последовательности. Согласно другому аспекту животное (например, мышь) содержит одну копию первой и одну копию второй нуклеотидных последовательностей. Таким образом, животное может являться гомозиготным или гетерозиготным в отношении как первой, так и второй нуклеотидных последовательностей.

Согласно одному аспекту первая нуклеотидная последовательность функционально связана с эндогенными не относящимися к человеку (например, мышиными) регуляторными элементами МНС I, и вторая нуклеотидная последовательность функционально связана с эндогенными не относящимися к человеку (например, мышиными) элементами β2 микроглобулина. Человеческая часть химерного полипептида может содержать α1, α2 и α3 домены полипептида MHC I человека. Вторая нуклеотидная последовательность может содержать нуклеотидную последовательность, представленную в экзоне 2 - экзоне 4 гена β2 микроглобулина человека. Альтернативно, вторая нуклеотидная последовательность может содержать нуклеотидные последовательности, представленные в экзонах 2, 3 и 4 гена β2 микроглобулина человека. Согласно одному аспекту мышь, содержащая как химерный полипептид МНС I, так и человеческий или гуманизированный полипептид β2 микроглобулина, может быть такой, чтобы экспрессия человеческого или гуманизированного β2 микроглобулина увеличивала экспрессию химерного человеческого/мышиного полипептида МНС I по сравнению с экспрессией химерного человеческого/мышиного полипептида МНС I при отсутствии экспрессии человеческого или гуманизированного полипептида β2 микроглобулина.

Также предусмотрены способы получения описанных в настоящем документе генетически сконструированных не относящихся к человеку животных (например, грызунов, например, мышей или крыс). Таким образом, согласно одному варианту осуществления предусмотрен способ модификации локуса МНС I грызуна (например, мыши или крысы) для экспрессии химерного человеческого/относящегося к грызуну (например, человеческого/мышиного или человеческого/крысиного) полипептида МНС I, причем способ предусматривает замещение на эндогенном локусе МНС I нуклеотидной последовательности, кодирующей внеклеточный домен полипептида МНС I грызуна, нуклеотидной последовательностью, кодирующей внеклеточный домен полипептида МНС I человека. Согласно другому варианту осуществления предусмотрен способ модификации локуса β2 микроглобулина грызуна (например, мыши или крысы) для экспрессии человеческого или гуманизированного полипептида β2 микроглобулина, причем способ предусматривает замещение на эндогенном локусе β2 микроглобулина грызуна (например, мыши или крысы) нуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид β2 микроглобулина грызуна (например, мыши или крысы), нуклеотидной последовательностью, кодирующей человеческий или гуманизированный полипептид β2 микроглобулина. Согласно таким способам замещение может быть проведено в одной ES (эмбриональной стволовой) клетке, и одна ES клетка может быть введена грызуну (например, мыши или крысе) для получения зародыша. Полученный грызун (например, мышь или крыса) может подвергаться скрещиванию для получения дважды гуманизированного животного.

Таким образом, настоящее изобретение также относится к способам получения дважды гуманизированных животных, например, грызунов (например, мышей или крыс).

Согласно одному варианту осуществления предусмотрен способ получения генетически модифицированной мыши, предусматривающий (а) модификацию локуса МНС I первой мыши для экспрессии химерного человеческого/мышиного полипептида МНС I, предусматривающую замещение на эндогенном локусе МНС I мыши нуклеотидной последовательности, кодирующей внеклеточный домен полипептида МНС I мыши, нуклеотидной последовательностью, кодирующей внеклеточный домен полипептида МНС I человека, (b) модификацию локуса β2 микроглобулина второй мыши для экспрессии человеческого или гуманизированного полипептида β2 микроглобулина, предусматривающую замещение на эндогенном локусе β2 микроглобулина мыши нуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид β2 микроглобулина мыши, нуклеотидной последовательностью, кодирующей человеческий или гуманизированный полипептид β2 микроглобулина; и (с) скрещивание первой и второй мыши для получения генетически модифицированной мыши, содержащей в своем геноме первую нуклеотидную последовательность, кодирующую химерный человеческий/мышиный полипептид МНС I, и вторую нуклеотидную последовательность, кодирующую человеческий или гуманизированный полипептид β2 микроглобулина, причем генетически модифицированная мышь экспрессирует химерный человеческий/мышиный полипептид МНС I и человеческий или гуманизированный полипептид β2 микроглобулина. Согласно некоторым вариантам осуществления локус МНС I выбран из Н-2K, H-2D и H-2L; согласно некоторым вариантам осуществления полипептид МНС I человека выбран из HLA-A, HLA-B и HLA-C. Согласно одному варианту осуществления локус МНС I представляет собой локус Н-2K, полипептид МНС I человека представляет собой HLA-A (например, HLA-A2), и мышь экспрессирует химерный полипептид HLA-А/Н-2K (например, полипептид HLA-A2/H-2K). Согласно одному аспекту химерный полипептид HLA-A2/H-2K содержит внеклеточный домен полипептида HLA-A2 и цитоплазматический и трансмембранный домены полипептида Н-2K. Согласно одному аспекту вторая нуклеотидная последовательность содержит нуклеотидные последовательности, представленные в экзонах 2, 3 и 4 (например, экзоне 2 - экзоне 4) гена β2 микроглобулина человека, и нуклеотидную последовательность, представленную в экзоне 1 гена β2 микроглобулина мыши.

Также в настоящем документе предусмотрены клетки, например, выделенные антигенпрезентирующие клетки, полученные от описанных в настоящем документе не относящихся к человеку животных (например, грызунов, например, мышей или крыс). Также предусмотрены ткани и зародыши, полученные от описанных в настоящем документе не относящихся к человеку животных.

Согласно другому варианту осуществления настоящее изобретение относится к способам идентификации антигенов или антигенных эпитопов, которые вызывают иммунный ответ, способам оценки кандидатной вакцины, способам идентификации высокоаффинных Т-клеток к патогенам человека или антигенам злокачественных опухолей.

Любой из описанных в настоящем документе вариантов осуществления и аспектов может использоваться совместно друг с другом, если иное не указано или не очевидно из контекста. Другие варианты осуществления станут очевидными специалистам в настоящей области техники из обзора последующего подробного раскрытия. Последующее подробное раскрытие включает в себя иллюстративные представления различных вариантов осуществления настоящего изобретения, которые не ограничивают заявленное настоящее изобретение. Прилагаемые фигуры составляют часть настоящего описания изобретения и вместе с описанием служат исключительно для иллюстрации вариантов осуществления, а не для ограничения настоящего изобретения.

Краткое описание графических материалов

На фиг. 1 представлено схематическое изображение четырех доменов молекулы MHC I класса: α цепь, содержащая α1, α2 и α3 домены и нековалентно связанный четвертый домен, β2 микроглобулин (β2m). Серый кружок представляет пептид, связанный в пептидсвязывающей бороздке.

На фиг. 2 представлено схематическое представление (без соблюдения масштаба) относительной геномной структуры HLA человека, показывающее гены I, II и III класса.

На фиг. 3 представлено схематическое представление (без соблюдения масштаба) относительной геномной структуры МНС мыши, показывающее гены I, II и III класса.

На фиг. 4 проиллюстрирована вирусная векторная конструкция, содержащая кДНК, кодирующую химерный полипептид HLA-A/H-2K с репортером IRES-GFP (А); и гистограммы, на которых сравнивают экспрессию HLA-A2 человека в MG87 клетках, трансдуцированных с HLA-A2 (пунктирная линия), HLA-A2/H-2K (точечная линия) или без трансдукции (сплошная линия) или отдельно (слева), или котрансдуцированных с гуманизированным β2 микроглобулином (справа) (В). Данные из горизонтальных интервалов, представленных графически в (В), показаны как процент клеток, экспрессирующих конструкцию в таблице в (С).

На фиг. 5 представляет собой схематическую диаграмму (без соблюдения масштаба) стратегии нацеливания, используемой для получения химерного локуса Н-2K, который экспрессирует внеклеточную область белка HLA-A2 человека.

Последовательности мыши представлены черным цветом, а последовательности человека представлены белым цветом. L = лидерная последовательность, UTR = нетранслируемая область, ТМ = трансмембранный домен, CYT = цитоплазматический домен, HYG = гигромицин.

На фиг. 6А показана экспрессия (% от числа всех клеток) HLA-A2 (слева) и Н-2K (справа) в клетках, выделенных либо из мыши дикого типа (WT), либо из гетерозиготной (НЕТ) мыши, несущей химерный локус HLA-A2/H-2K (HLA-A/H-2K НЕТ).

На фиг. 6 В представляет собой точечную диаграмму экспрессии in vivo химерного белка HLA-A2/H-2K у гетерозиготной мыши, несущей химерный белок HLA-A2/H-2K.

На фиг. 7 показана стратегия нацеленного воздействия (без соблюдения масштаба) для гуманизации гена β2 микроглобулина на локусе β2 микроглобулина мыши. Последовательности мыши представлены черным цветом, а последовательности человека представлены белым цветом. NEO = неомицин.

На фиг. 8 показана репрезентативная точечная диаграмма экспрессии HLA I класса и β2 микроглобулина человека в клетках, выделенных из крови мышей дикого типа (WT), мышей, гетерозиготных в отношении химерного HLA-A2/H-2K, и мышей, гетерозиготных в отношении химерного HLA-A2/H-2K и гетерозиготных в отношении гуманизированного β2 микроглобулина (двойные гетерозиготы; НЕТ в отношении I класса /β2m).

На фиг. 9 показана репрезентативная гистограмма экспрессии HLA I класса человека (Х-ось) в клетках, выделенных из крови мышей дикого типа (WT), мышей, гетерозиготных в отношении химерного HLA-A2/H-2K (НЕТ I класса) и двойных гетерозиготных в отношении химерного HLA-А2/H2K/гуманизированного β2 микроглобулина (НЕТ I класса/β2m).

На фиг. 10 показаны результаты анализа методом иммуноферментных пятен IFNγ Т-клеток человека, подвергнутых воздействию антигенпрезентирующих клеток (АПК) от мышей дикого типа (АПК WT) или мышей, гетерозиготных в отношении как химерного HLA-A2/H-2K, так и гуманизированного β2 микроглобулина (двойные НЕТ АПК) в присутствии пептидов гриппа (слева) или ЭБВ (вируса Эпштейна-Барра) (справа). Статистический анализ проводили с использованием однофакторного дисперсионного анализа с апостериорным критерием множественного сравнения Тьюки.

Подробное раскрытие настоящего изобретения

Определения

Настоящее изобретение относится к генетически модифицированным не относящимся к человеку животным (например, мышам, крысам, кроликам и т.д.), которые экспрессируют человеческие или гуманизированные полипептиды МНС I и/или β2 микроглобулина; зародышам, клеткам и тканям, их содержащим; способам их получения; а также способам их применения. Если не указано иное, все используемые в настоящем документе термины и фразы включают в себя значения, которые подразумеваются под терминами и фразами в настоящей области техники, если противоположное ясно не указано или ясно не следует из контекста, в котором используется термин или фраза.

Термин "консервативная", используемый для описания консервативной аминокислотной замены, включает в себя замену аминокислотного остатка другим аминокислотным остатком с R-группой боковой цепи со сходными химическими свойствами (например, зарядом или гидрофобностью). Консервативные аминокислотные замены могут быть достигнуты путем модификации нуклеотидной последовательности так, чтобы ввести изменение нуклеотида, которое будет кодировать консервативную замену. Как правило, консервативная аминокислотная замена не будет существенно изменять представляющие интерес функциональные свойства белка, например, способность МНС I к презентации представляющего интерес пептида. Примеры групп аминокислот, которые содержат боковые цепи со сходными химическими свойствами, включают в себя такие алифатические боковые цепи глицин, аланин, валин, лейцин и изолейцин; такие алифатические гидроксильные боковые цепи серин и треонин; такие амидсодержащие боковые цепи, как аспарагин и глутамин; такие ароматические боковые цепи, как фенилаланин, тирозин и триптофан; такие основные боковые цепи, как лизин, аргинин и гистидин; такие кислотные боковые цепи, как аспарагиновая кислота и глутаминовая кислота; и такие серосодержащие боковые цепи, как цистеин и метионин. Группы консервативных аминокислотных замен включают в себя, например, валин/лейцин/изолейцин, фенилаланин/тирозин, лизин/аргинин, аланин/валин, глутамат/аспартат, и аспарагин/глутамин. Согласно некоторым вариантам осуществления консервативная аминокислотная замена может представлять собой замену любого нативного остатка в белке на аланин, что используется, например, в сканирующем аланином мутагенезе. Согласно некоторым вариантам осуществления проводят консервативную замену, которая характеризуется положительным значением в матрице логарифмического правдоподобия РАМ250, раскрытой в Gonnet et al. ((1992) Exhaustive Matching of the Entire Protein Sequence Database, Science 256: 1443-45), включенной в настоящий документ посредством ссылки. Согласно некоторым вариантам осуществления представляет собой умеренно консервативную замену, причем замена характеризуется неотрицательным значением в матрице логарифмического правдоподобия РАМ250.

Таким образом, та