Конъюгаты олигонуклеотидов

Конъюгаты олигонуклеотидов

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область изобретения

Изобретение относится к области олигонуклеотидных терапевтических средств и, в частности, к применению конъюгата, направляющей группы или блокирующей группы для улучшения свойств олигонуклеотидов, например, для улучшения терапевтического индекса.

Родственные заявки

Эта заявка претендует на приоритет заявок ЕР 12192773.5, ЕР 13153296.2, ЕР 13157237.2 и ЕР 13174092.0, которые включены в данный документ посредством ссылки.

Уровень техники

Конъюгаты олигонуклеотидов были тщательно изучены для применения в siРНК (киРНК), где они рассматриваются как необходимые для получения достаточной эффективности in vivo. Например, WO 2004/044141 относится к модифицированным олигомерным соединениям, которые модулируют экспрессию гена с помощью пути РНК-интерференции (РНК-интерференции). Олигомерные соединения включают одну или более чем одну конъюгационную группировку, которая может модифицировать или усиливать фармакокинетические и фармакодинамические свойства присоединенного олигомерного соединения.

Напротив, одноцепочечные антисмысловые олигонуклеотиды, как правило, вводят терапевтически без конъюгации или состава. Основными тканями-мишенями для антисмысловых олигонуклеотидов являются печень и почки, хотя для антисмысловой модальности также доступен широкий диапазон других тканей, в том числе лимфатические узлы, селезенка, костный мозг.

WO 2008/113832 раскрывает фосфоротиоатные гэпмерные LNA-олигонуклеотиды (locked nucleic acid; закрытая нуклеиновая кислота, ЗНК), где фланкирующие области содержат по меньшей мере одну фосфодиэфирную связь между или смежно с LNA-нуклеозидом. Олигомеры преимущественно нацелены на почки.

WO 2004/087931 относится к олигонуклеотидам, содержащим расщепляемый в кислой среде гидрофильный полимерный (PEG) конъюгат.

WO 2005/086775 относится к адресной доставке терапевтических агентов к определенным органам с помощью терапевтической химической группировки, расщепляемого линкера и меченого домена. Расщепляемый линкер может быть, например, дисульфидной группой, пептидом или олигонуклеотидным доменом, расщепляемым рестрикционным ферментом.

WO 2009/126933 относится к специфической доставке нуклеиновых кислот siРНК путем объединения направляющих лигандов с эндосомолитическими компонентами.

WO 2011/126937 относится к целевой внутриклеточной доставке олигонуклеотидов через конъюгацию с низкомолекулярными лигандами.

WO 2009/025669 относится к полимерным (полиэтиленгликолевым) линкерам, содержащим пиридилдисульфидные группировки. См. также Zhao et al., Bioconjugate Chem. 2005 16 758-766.

В Chaltin et al., Bioconjugate Chem. 2005 16 827-836 сообщается о холестерин-модифицированных моно-, ди- и тетрамерных олигонуклеотидах, используемых для включения антисмысловых олигонуклеотидов в катионные липосомы, чтобы получать дендримерные системы доставки. Холестерин конъюгирован с олигонуклеотидами через лизиновый линкер.

Другие нерасщепляемые конъюгаты холестерина были использованы для доставки siРНК и антагомиров в печень - см., например, Soutscheck et al., Nature 2004 vol. 432 173-178 и et al., Nature 2005 vol 438, 685-689. Для частично фосфорилированных siРНК и антагомиров было установлено, что применение холестерина в качестве объекта, нацеленного на печень, имеет важное значение для активности in vivo.

Данное изобретение основано на открытии того, что весьма эффективная адресная доставка олигонуклеотидов достигается за счет применения устройства наведения, связанного с олигонуклеотидом посредством короткой области лабильных к нуклеазам нуклеозидов, таких как связанные фосфодиэфирными связями ДНК- или РНК-нуклеозиды.

Сущность изобретения

Данное изобретение предлагает олигомерное соединение, содержащее три области:

i) первую область (область А), которая содержит 7-26 последовательных нуклеотидов;

ii) вторую область (область В), которая содержит 1-10 нуклеотидов, ковалентно связанную с 5'- или 3'-нуклеотидом первой области, например через межнуклеозидную связывающую группу, такую как фосфодиэфирная связь, где или

a. межнуклеозидная связь между первой и второй областями является фосфодиэфирной связью, а нуклеозид второй области, примыкающий (например, непосредственно) к первой области, представляет собой либо ДНК, либо РНК; и/или

b. по меньшей мере один нуклеозид второй области является ДНК- или РНК-нуклеозидом, связанным фосфодиэфирной связью;

iii) третью область (С), которая содержит конъюгационную группировку, направляющую группировку, реакционноспособную группу, активационную группу или блокирующую группировку, где третья область ковалентно связана со второй областью.

В некоторых воплощениях область А и область В формируют единую непрерывную нуклеотидную последовательность длиной 8-35 нуклеотидов.

В некоторых аспектах межнуклеозидная связь между первой и второй областями может рассматриваться как часть второй области.

В некоторых воплощениях между второй и третьей областями есть фосфорсодержащая связывающая группа. Фосфорсодержащая связывающая группа, может, например, представлять собой фосфатную (фосфодиэфирную), фосфоротиоатную, фосфородитиоатную или боранофосфатную группу. В некоторых воплощениях эта фосфорсодержащая связывающая группа расположена между второй областью и линкерной областью, которая присоединена к третьей области. В некоторых воплощениях фосфатная группа является фосфодиэфирной.

Таким образом, в некоторых аспектах олигомерное соединение содержит по меньшей мере две фосфодиэфирные группы, где по меньшей мере одна соответствует приведенной выше сущности изобретении, а другая расположена между второй и третьей областями, возможно, между линкерной группой и второй областью.

В некоторых воплощениях третья область представляет собой активационную группу, такую как активационная группа для применения в конъюгации. В этом отношении изобретение также предусматривает активированные олигомеры, содержащие область А и В и активационную группу, например промежуточный продукт, который подходит для последующего связывания с третьей областью, например, который подходит для конъюгации.

В некоторых воплощениях третья область является реакционноспособной группой, например, реакционноспособной группой для применения в конъюгации. В этом отношении изобретение также предусматривает олигомеры, содержащие область А и В и реакционноспособную группу, например промежуточный продукт, который подходит для последующего связывания с третьей областью, например, который подходит для конъюгации. Реакционноспособная группа может в некоторых воплощениях включать амин спиртовой группы, например аминогруппу.

В некоторых воплощениях область А содержит по меньшей мере одну, например, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 или 24 межнуклеозидные связи, отличные от фосфодиэфирной, такие как межнуклеозидные связи, которые (возможно, независимо) выбраны из группы, состоящей из фосфоротиоатной, фосфородитиоатной, боранофосфатной и метилфосфонатной, например фосфоротиоатной. В некоторых воплощениях область А содержит по меньшей мере одну фосфоротиоатную связь. В некоторых воплощениях по меньшей мере 50%, например по меньшей мере 75%, например по меньшей мере 90% межнуклеозидных связей, например, все межнуклеозидные связи в пределах области А, отличны от фосфодиэфирной, например, являются фосфоротиоатными связями. В некоторых воплощениях все межнуклеозидные связи в области А отличны от фосфодиэфирной.

В некоторых воплощениях олигомерное соединение содержит антисмысловой олигонуклеотид, например, конъюгат антисмыслового олигонуклеотида. Антисмысловой олигонуклеотид может быть или может содержать первую область и, возможно, вторую область. В этом отношении в некоторых воплощениях область В может формировать часть непрерывной нуклеотидной последовательности, которая комплементарна (нуклеиново-кислотной) мишени. В других воплощениях в области В может отсутствовать комплементарность к мишени.

Иначе говоря, в некоторых воплощениях данное изобретение предусматривает олигонуклеотид, связанный нефосфодиэфирными связями, например, связанный фосфоротиоатными связями, (например, антисмысловой олигонуклеотид), который имеет по меньшей мере один концевой (5' и/или 3') ДНК- или РНК-нуклеозид, связанный со смежным нуклеозидом олигонуклеотида через фосфодиэфирную связь, где концевой ДНК- или РНК-нуклеозид также ковалентно связан с конъюгационной группировкой, направляющей группировкой или блокирующей группировкой, возможно, через линкерную группировку.

Данное изобретение предусматривает фармацевтическую композицию, содержащую олигомерное соединение согласно данному изобретению и фармацевтически приемлемый разбавитель, носитель, соль или адъювант.

Изобретение предусматривает олигомерное соединение согласно данному изобретению для применения в ингибировании нуклеиновой кислоты-мишени в клетке. В некоторых воплощениях применение осуществляется in vitro. В некоторых воплощениях применение осуществляется in vivo.

Изобретение предусматривает олигомерное соединение согласно данному изобретению для применения в медицине, например, для применения в качестве лекарственного средства.

Изобретение предусматривает олигомерное соединение согласно данному изобретению для применения в лечении заболевания или нарушения.

Изобретение предусматривает олигомерное соединение согласно данному изобретению для изготовления лекарственного препарата для лечения заболевания или нарушения, такого как метаболическое заболевание или нарушение.

Изобретение предусматривает способ синтеза (или производства) олигомерного соединения, такого как олигомерное соединение согласно изобретению, причем указанный способ включает либо:

a) этап получения подложки для (твердофазного) олигонуклеотидного синтеза, к которой присоединена одна из следующих (третьих) областей:

i) возможно, линкерная группа (-Y-),

ii) группа X, содержащая группу, выбранную из группы, состоящей из конъюгата, направляющей группы, блокирующей группы, реакционноспособной группы (например, амина или спирта) или активационной группы (Х-), или группа -X-Y,

и

b) этап (последовательного) олигонуклеотидного синтеза области В, а затем области А,

и/или:

c) этап (последовательного) олигонуклеотидного синтеза первой области (А) и второй области (В), где после этапа синтеза следует

d) этап добавления третьей области (содержащей фосфорамидит)

i) возможно, линкерной группы (-Y-),

ii) группы X, содержащей группу, выбранную из группы, состоящей из конъюгата, направляющей группы, блокирующей группы, реакционноспособной группы (например, амина или спирта) или активационной группы (Х-), или группы -X-Y,

а затем

e) отщепление олигомерного соединения от (твердофазной) подложки, где, возможно, указанный способ также включает дополнительный этап, выбранный среди следующих:

f) если третья группа является активационной группой, то этап активации активационной группы для получения реакционноспособной группы с последующим добавлением конъюгата, блокирующей или направляющей группы к реакционноспособной группе, возможно, через линкерную группу (Y);

g) если третья область является реакционноспособной группой, то этап добавления конъюгата, блокирующей или направляющей группы к реакционноспособной группе, возможно, через линкерную группу (Y);

h) если третья область является связывающей группой (Y), то этап добавления конъюгата, блокирующей или направляющей группы к линкерной группе (Y),

где этапы f), g) или h) выполняются либо до, либо после отщепления олигомерного соединения от подложки для олигонуклеотидного синтеза. В некоторых воплощениях способ может быть осуществлен с использованием стандартной фосфорамидитной химической реакции, и в качестве такой области X и/или области X или области X и Y перед включением в олигомер может быть предложен фосфорамидит. См. фиг. 5-10, которые иллюстрируют неограничивающие аспекты способа согласно данному изобретению.

Изобретение предусматривает способ синтеза (или производства) олигомерного соединения, такого как олигомерное соединение согласно изобретению, причем указанный способ включает этап (последовательного) олигонуклеотидного синтеза первой области (А) и, возможно, второй области (В), где после этапа синтеза следует этап добавления третьей области (включающей фосфорамидит), области X (также упоминаемой как область С) или Y, например, области, включающей группу, выбранную из группы, состоящей из конъюгата, направляющей группы, блокирующей группы, функциональной группы, реакционноспособной группы [например, амина или спирта] или активационной группы (Х-) или группы -X-Y, с последующим отщеплением олигомерного соединения от (твердофазной) подложки.

Тем не менее, следует знать, что область X или X-Y может быть добавлена после отщепления от твердой подложки. Альтернативно, способ синтеза может включать этапы синтеза первой (А) и, возможно, второй области (В) с последующим отщеплением олигомера от подложки, с последующим этапом добавления к олигомеру третьей области, такой как группа X или X-Y. Добавление третьей области может быть достигнуто, например, путем добавления аминофосфорамидитного звена на конечном этапе синтеза олигомера (на подложке), который может после отщепления от подложки быть использован для соединения с группой X или X-Y, возможно, через активационную группу на группе X или Y (если она присутствует). В воплощениях, когда расщепляемый линкер не является нуклеотидной областью, область В может быть ненуклеотидным расщепляемым линкером, например пептидным линкером, который может формировать часть области X (также называемой областью С) или быть областью Y (или ее частью).

В некоторых воплощениях способа область X (такая как С) или X-Y, например, конъюгат (например, GalNAc-конъюгат), содержит активационную группу (активированную функциональную группу), и в способе синтеза активированного конъюгата (или области X или X-Y) она добавляется к первой и второй областям, например, аминосвязанный олигомер. Аминогруппа может быть добавлена к олигомеру путем стандартной фосфорамидатной химической реакции, например, на финальном этапе синтеза олигомера (который, как правило, будет образовывать аминогруппу на 5'-конце олигомера). Например, на последнем этапе олигонуклеотидного синтеза используется защищенный амино-алкил-фосфорамидит, например, TFA-амино-С6-фосфорамидит (6-(трифторацетиламино)-гексил-(2-цианоэтил)-(N,N-диизопропил)-фосфорамидит).

Область X (или область С, упоминаемая в данном документе), такая как конъюгат (например, GalNac-конъюгат), может быть активирована с помощью NHS-эфирного способа, а затем добавляется аминосвязанный олигомер. Например, N-гидроксисукцинимид (NHS) может быть использован в качестве активирующей группы для области X (или области С), такой как конъюгат, например, группировка GalNac-конъюгата.

Изобретение предусматривает олигомер, полученный согласно способу данного изобретения.

В некоторых воплощениях область X и/или область X или области X и Y могут быть ковалентно соединены (связаны) с областью В с помощью фосфатнуклеозидной связи, такой как описана в данном документе, включая фосфодиэфирную или фосфоротиоатную, или с помощью альтернативной группы, такой как триазол-группа.

Изобретение предусматривает способ лечения заболевания или нарушения у субъекта, нуждающегося в лечении, причем указанный способ включает этапы введения указанному субъекту фармацевтической композиции, содержащей олигомерное соединение согласно данному изобретению, в терапевтически эффективном количестве.

Данное изобретение предусматривает способ ингибирования экспрессии гена-мишени в клетке, включающий введение олигомерного соединения согласно изобретению в клетку, которая экспрессирует указанный ген-мишень, предпочтительно в количестве, эффективном для снижения экспрессии гена-мишени в указанной клетке. В некоторых воплощениях способ осуществляется in vitro (т.е. не в организме, но может осуществляться в клетке или ткани (например, ex vivo)). В некоторых воплощениях способ осуществляется in vivo.

Изобретение также предусматривает LNA-олигомер, содержащий непрерывную область из 8-24 связанных фосфоротиоатными связями нуклеозидов, а также содержащий от 1 до 6 ДНК-нуклеозидов, которые являются смежными с LNA-олигомером, где межнуклеозидные связи между ДНК и/или смежные с ДНК-нуклеозидом(ами) являются физиологически лабильными, например, являются фосфодиэфирными связями. Такой LNA-олигомер может находиться в форме конъюгата, как описано в данном документе, или может быть, например, промежуточным продуктом, используемым в последующем этапе конъюгации. В случае конъюгации конъюгат может, например, представлять собой или содержать стерин, такой как холестерин или токоферол, или может представлять собой или содержать (ненуклеотидный) углевод, такой как GalNac-конъюгат, такой как GalNac-кластер, например triGalNac, или другой конъюгат, описанный в данном документе.

Изобретение предусматривает антисмысловой LNA-олигомер (который может упоминаться в данном документе как область А), содержащий антисмысловой олигомер и конъюгационную группировку с группировкой, нацеленной на рецептор асиалогликопротеина, такую как GalNAc-группировка, которая может формировать часть дополнительной области (именуемой областью С). Антисмысловой LNA-олигомер может содержать 7-30, например, 8-26 нуклеозидов в длину, и он содержит по меньшей мере одно LNA-звено (нуклеозид).

Данное изобретение предусматривает антисмысловой LNA-олигомер, ковалентно присоединенный к (например, связанный с) (ненуклеозидной) углеводной группировке, такой как углеводная конъюгационная группировка. В некоторых воплощениях углеводная группировка не является линейным углеводным полимером. Углеводная группировка может, тем не менее, быть многовалентной, например, 2, 3, 4 или 4 одинаковые или неодинаковые углеводные группировки могут быть ковалентно присоединены к олигомеру, возможно, через линкер или линкеры.

Данное изобретение предусматривает антисмысловой LNA-олигомер (конъюгат), содержащий антисмысловой олигомер и конъюгационную группировку, которая содержит углевод, например, углеводную конъюгационную группировку.

Данное изобретение предусматривает фармацевтическую композицию, содержащую олигомерное LNA-соединение согласно данному изобретению и фармацевтически приемлемый разбавитель, носитель, соль или адъювант.

Данное изобретение предусматривает олигомерное соединение согласно данному изобретению для применения в ингибировании нуклеиновой кислоты-мишени в клетке. В некоторых воплощениях применение осуществляется in vitro. В некоторых воплощениях применение осуществляется in vivo.

Данное изобретение предусматривает олигомерное соединение согласно данному изобретению для применения в медицине, например, для применения в качестве лекарственного средства.

Данное изобретение предусматривает олигомерное соединения согласно данному изобретению для применения в лечении заболевания или нарушения.

Данное изобретение предусматривает применение олигомерного соединения согласно данному изобретению для получения лекарственного средства для лечения заболевания или нарушения, такого как метаболическое заболевание или нарушение.

Краткое описание графических материалов

Фиг. 1. Неограничивающая иллюстрация олигомеров изобретения, прикрепленных к активационной группе (т.е. защищенной реакционноспособной группе - в качестве третьей области). Межнуклеозидная связь L может быть, например, фосфодиэфирной, фосфортиоатной, фосфородитиоатной, боранофосфатной или метилфосфонатной, например, фосфодиэфирной. РО представляет собой фосфодиэфирную связь. Соединение а) имеет область В с одной ДНК или РНК, связь между второй и первой областью представляет собой РО. Соединение b) имеет два ДНК/РНК- (например, ДНК-) нуклеозида, соединенных фосфодиэфирной связью. Соединение с) имеет три ДНК/РНК-(например, ДНК-) нуклеозида, соединенных фосфодиэфирной связью. В некоторых воплощениях область В может быть удлинена другой связанной фосфодиэфирной связью ДНК/РНК (например, ДНК-нуклеозидом). Активационная группа показана на левой стороне каждого соединения и, возможно, может быть связана с концевым нуклеозидом области В через фосфорсодержащую нуклеозидную связывающую группу, такую как фосфодиэфирная, фосфортиоатная, фосфородитиоатная, боранофосфатная или метилфосфонатная, или в некоторых воплощениях через триазоловую связь. Соединения d), е) и f) также содержат линкер (Y) между областью В и активационной группой, и область Y может быть связана с областью В, например, с помощью фосфорсодержащей нуклеозидной связывающей группы, такой как фосфодиэфирная, фосфортиоатная, фосфородитиоатная, боранофосфатная или метилфосфонатная, а в некоторых воплощениях с помощью триазоловой связи.

Фиг. 2. Соединения, эквивалентные тем, что показаны на фиг. 1; однако вместо активационной группы используется реакционноспособная группа. Реакционноспособная группа в некоторых воплощениях может быть результатом активации активационной группы (например, результатом удаления защитной группы). Реакционноспособная группа в неограничивающих примерах может быть амином или спиртом.

Фиг. 3. Неограничивающая иллюстрация соединений согласно изобретению. Такая же номенклатура, как на фиг. 1. X в некоторых воплощениях может быть конъюгатом, таким как липофильный конъюгат, например холестериновый, или другой конъюгат, такой как описанные в данном документе. Кроме того или альтернативно, X может быть направляющей группой или блокирующей группой. В некоторых аспектах X может быть активационной группой (см. фиг. 1) или реакционноспособной группой (см. фиг. 2). X может быть ковалентно присоединен к области В через фосфорсодержащую нуклеозидную связывающую группу, такую как фосфодиэфирная, фосфортиоатная, фосфородитиоатная, боранофосфатная или метилфосфонатная, или может быть связан с помощью альтернативной связи, например триазоловой связи (см. L в соединениях d), е), и f)).

Фиг. 4. Неограничивающая иллюстрация соединений изобретения, где соединения содержат возможный линкер между третьей областью (X) и второй областью (область В). Та же номенклатура, как на фиг. 1. Подходящие линкеры описаны в данном документе и включают, например, алкильные линкеры, например, С6-линкеры. В соединениях А, В и С линкер между X и областью В прикреплен к области В через фосфорсодержащую нуклеозидную связывающую группу, такую как фосфодиэфирная, фосфортиоатная, фосфородитиоатная, боранофосфатная или метилфосфонатная, или может быть связан с помощью альтернативной связи, например триазоловой связи (Li). В этих соединениях Lii представляет межнуклеозидную связь между первой (А) и второй (В) областями.

Фиг. 5а и b. 5b показывает неограничивающий пример способа синтеза соединений данного изобретения. US представляет собой подложку для олигонуклеотидного синтеза, которая может быть твердой подложкой. X представляет собой третью область, такую как конъюгат, направляющая группа, блокирующая группа и т.д. В качестве возможного предварительного этапа X добавляют к подложке для олигонуклеотидного синтеза. В противном случае может быть получена подложка с уже присоединенным X (i). На первом этапе синтезируют область В (и), затем область А (iii), а затем проводят отщепление олигомерного соединения согласно данному изобретению от подложки для олигонуклеотидного синтеза (iv). В альтернативном способе предварительный этап включает получение подложки для олигонуклеотидного синтеза с областью X и присоединенной линкерной группой (Y) (см фиг. 5а). В некоторых воплощениях X или Y (если они присутствуют) присоединяются к области В через фосфорсодержащую нуклеозидную связывающую группу, например, фосфодиэфирную, фосфортиоатную, фосфородитиоатную, боранофосфатную или метилфосфонатную, или через альтернативную связь, такую как триазоловая связь.

Фиг. 6. Неограничивающий пример способа синтеза соединений согласно данному изобретению, которые содержат линкер (Y) между третьей областью (X) и второй областью (В). US представляет собой подложку для олигонуклеотидного синтеза, которая может быть твердой подложкой. X представляет собой третью область, такую как конъюгат, направляющая группа, блокирующая группа и т.д. На возможном предварительном этапе Y добавляют к подложке для олигонуклеотидного синтеза. В противном случае может быть получена подложка с уже присоединенным Y (i). На первом этапе синтезируют область В (и), затем область A (iii), а затем проводят отщепление олигомерного соединения согласно данному изобретению от подложки для олигонуклеотидного синтеза (iv). В некоторых воплощениях (как показано) область X может быть добавлена к линкеру (Y) после этапа отщепления (v). В некоторых воплощениях Y присоединен к области В через фосфорсодержащую нуклеозидную связывающую группу, например, фосфодиэфирную, фосфортиоатную, фосфородитиоатную, боранофосфатную или метилфосфонатную, или через альтернативную связь, такую как триазоловая связь.

Фиг. 7. Неограничивающий пример способа синтеза соединений согласно данному изобретению, которые используют активационную группу. На возможном предварительном этапе активационную группу присоединяют к подложке для олигонуклеотидного синтеза (i) или, в противном случае, получают подложку для олигонуклеотидного синтеза с активационной группой. На этапе и) синтезируют область В, а затем область A (iii). Затем олигомер отщепляют от подложки для олигонуклеотидного синтеза (iv). Затем может быть активирован промежуточный олигомер (содержащий активационную группу) (vi) или (viii) и добавлена третья область (X) (vi), возможно, через линкер (Y) (ix). В некоторых воплощениях X (или Y, если он присутствует) присоединяется к области В через фосфорсодержащую нуклеозидную связывающую группу, такую как фосфодиэфирная, фосфортиоатная, фосфородитиоатная, боранофосфатная или метилфосфонатная, или через альтернативную связь, такую как триазоловая связь.

Фиг. 8. Неограничивающий пример способа синтеза соединений согласно данному изобретению, в котором используется бифункциональная подложка для олигонуклеотидного синтеза (i). В таком способе олигонуклеотид синтезируется в начальной серии этапов (ii)-(iii) с последующим присоединением третьей области (возможно, через линкерную группу Y), а олигомерное соединение согласно данному изобретению затем может быть отщеплено (v). Альтернативно, как показано на этапах (vi)-(ix), третья область (возможно, с линкерной группой (Y)) прикреплена к подложке для олигонуклеотидного синтеза (это может быть дополнительным предварительным этапом) - или, в противном случае, предусмотрена подложка для олигонуклеотидного синтеза с третьей областью (возможно, с Y), а затем синтезируется олигонуклеотид (vii-viii). Затем олигомерное соединение согласно данному изобретению может быть отщеплено (ix). В некоторых воплощениях X (или Y, если он присутствует) прикреплен к области В через фосфорсодержащую нуклеозидную связывающую группу, такую как фосфодиэфирная, фосфортиоатная, фосфородитиоатная, боранофосфатная или метилфосфонатная, или альтернативную связь, такую как триазоловая связь. US в некоторых воплощениях может включать перед способом (например, на предварительном этапе) этап добавления двунаправленной (бифункциональной) группы, которая делает возможным независимый синтез олигонуклеотида и ковалентное присоединение группы X, Y (или X и Y) к подложке (как показано) - это, например, может быть достигнуто с помощью триазоловой или нуклеозидной группы. Затем двунаправленная (бифункциональная) группа с прикрепленным олигомером может быть отщеплена от подложки.

Фиг. 9. Неограничивающий пример способа синтеза соединений согласно данному изобретению. На первом этапе синтезируют первую область (A) (ii), а затем область В. Затем в некоторых воплощениях прикрепляют третью область к области В (iii), возможно, через фосфорсодержащую нуклеозидную связь (или, например, триазоловую связь). Затем олигомерное соединение согласно данному изобретению может быть отщеплено (iv). Если используется линкер (Y), то в некоторых воплощениях могут следовать этапы (v)-(viii): после синтеза области В добавляют линкерную группу (Y), а затем либо прикрепляют к (Y), либо на следующем этапе добавляют область X (vi). Затем олигомерное соединение согласно данному изобретению может быть отщеплено (vii). В некоторых воплощениях X (или Y, если он присутствует) прикреплен к области В через фосфорсодержащую нуклеозидную связывающую группу, такую как фосфодиэфирная, фосфортиоатная, фосфородитиоатная, боранофосфатная или метилфосфонатная, или через альтернативную связь, такую как триазоловая связь.

Фиг. 10. Неограничивающий пример способа синтеза соединений согласно данному изобретению. В этом способе используется активационная группа: этапы (i)-(iii) являются такими, как показано на фиг. 9. Тем не менее, после олигонуклеотидного синтеза (этап iii) к области В добавляют активационную группу (или реакционноспособную группу), возможно через фосфатную нуклеозидную связь. Затем олигонуклеотид отщепляют от подложки (v). Затем активационная группа может быть активирована с получением реакционноспособной группы, а затем к реакционноспособной группе добавляют третью область (X), например, конъюгат, блокирующую группу или направляющую группу (которая может быть активированной активационной группой или реакционноспособной группой), с получением олигомера (vi). Как показано в (vii)-(viii), после отщепления добавляют линкерную группу (Y) (vii), а затем либо прикрепляют к (Y), либо на последующем этапе добавляют область X, получая олигомер (viii). Следует признать, что в качестве альтернативы все этапы (ii)-(viii) могут быть выполнены на подложке для олигонуклеотидного синтеза, и в таких случаях может быть проведен последний этап отщепления олигомера от подложки. В некоторых воплощениях реакционноспособная группа или активационная группа прикреплена к области В через фосфорсодержащую нуклеозидную связывающую группу, такую как фосфодиэфирная, фосфортиоатная, фосфородитиоатная, боранофосфатная или метилфосфонатная, или через альтернативную связь, такую как триазоловая связь.

Фиг. 11. Сайленсинг (подавление экспрессии) мРНК (messenger РНК; матричная РНК, мРНК) АроВ (аполипопротеин В) холестериновыми конъюгатами in vivo. Мышам вводили однократную дозу 1 мг/кг неконъюгированного антисмыслового LNA-олигонуклеотида (№3833) или эквимолярные количества антисмысловых LNA-олигонуклеотидов, конъюгированных с холестерином с помощью различных линкеров (таб. 3), и умерщвляли их в дни 1, 3, 7 и 10 после введения дозы. РНК выделяли из печени и почек и подвергали АроВ-специфической RT-qPCR (real-time reverse transcription polymerase chain reaction; полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией в режиме реального времени; ОТ-кПЦР) А. Количество мРНК АроВ из образцов печени нормализовано по GAPDH и показано в процентах от среднего значения эквивалентных контролей с физиологическим раствором В. Количество мРНК АроВ из образцов почек нормализовано по GAPDH и показано в процентах от среднего значения эквивалентных контролей с физиологическим раствором.

Фиг. 12. Показывает холестерин-С6-конъюгат, который может быть использован в качестве X-Y- в соединениях согласно данному изобретению, а также в качестве конкретных соединений, используемых в примерах, включая конкретные соединения согласно данному изобретению.

Фиг. 13. Примеры конъюгатов холестерина, трехвалентного GalNac, FAM, фолиевой кислоты, одновалентного GalNac и токоферола, используемые в экспериментах (например, соединения, показанные на фиг. 12).

Фиг. 14. Сайленсинг мРНК АроВ холестериновыми конъюгатами in vivo. Мышам вводили однократную дозу 1 мг/кг неконъюгированного антисмыслового LNA-олигонуклеотида (№3833) или эквимолярные количества антисмысловых LNA-олигонуклеотидов, конъюгированных с холестерином с помощью различных линкеров (таб. 3), и умерщвляли их в дни 1, 3, 7, 10, 13 и 16 после введения дозы. РНК выделяли из печени и почек и подвергали АроВ-специфической RT-qPCR А. Количество мРНК АроВ из образцов печени нормализовано по GAPDH и показано в процентах от среднего значения эквивалентных контролей с физиологическим раствором В. Количество мРНК АроВ из образцов почек нормализовано по GAPDH и показано в процентах от среднего значения эквивалентных контролей с физиологическим раствором.

Фиг. 15. Содержание специфического LNA-олигонуклеотида в печени и почках in vivo. Мышам вводили однократную дозу 1 мг/кг неконъюгированного антисмыслового LNA-олигонуклеотида (№1) или эквимолярные количества антисмысловых LNA-олигонуклеотидов, конъюгированных с холестерином с помощью различных линкеров (таб. 4), и умерщвляли их в дни 1, 3, 7, 10, 13 и 16 после введения дозы. Содержание LNA-олигонуклеотид измеряли с помощью ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay; иммуноферментный анализ, ИФА) "сэндвич"-формата на основе LNA.

Фиг. 16. Сайленсинг мРНК PCSK9 с холестериновыми конъюгатами in vivo. Мышам вводили однократную дозу 10 мг/кг неконъюгированного антисмыслового LNA-олигонуклеотида (№7) или эквимолярные количества антисмысловых LNA-олигонуклеотидов, конъюгированных с холестерином с помощью различных линкеров (табл. 5), и умерщвляли их в дни 1, 3, 7 и 10 после введения дозы. РНК выделяли из печени и почек и подвергали PCSK9-специфической RT-qPCR А. Количество мРНК PCSK9 из образцов печени нормализовано по ВАСТ и показано в процентах от среднего значения эквивалентных контролей с физиологическим раствором В. Количество мРНК PCSK9 из образцов почек нормализовано по ВАСТ и показано в процентах от среднего значения эквивалентных контролей с физиологическим раствором.

Фиг. 17. Примеры три-GalNac-конъюгатов, которые могут быть использованы. Конъюгаты 1-4 иллюстрируют 4 соответствующие GalNac-конъюгационные группировки, а конъюгаты 1а-4а обозначают те же самые конъюгаты с дополнительной линкерной группировкой (Y), которая используется для связывания конъюгата с олигомером (с областью А или с биорасщепляемым линкером, таким как область В). Волнистая линия представляет ковалентную связь с олигомером. Также показаны примеры холестериновых и токофероловых конъюгированных группировок (5а и 6а). Волнистая линия представляет ковалентную связь с олигомером.

Фиг. 18. Пример 7а: уровни белка FVII в сыворотке крови.

Фиг. 19. Пример 7а: уровни мРНК FVII в печени на 4-й день.

Фиг. 20. Пример 7а: содержание олигонуклеотидов в печени и почках на 4-й день.

Фиг. 21. Пример 7b: уровни белка FVII в сыворотке крови.

Фиг. 22. Уровни мРНК FVII в печени на 24-й день.

Фиг. 23. Содержание олигонуклеотидов в печени и почках на 4-й день.

Фиг. 24. Сайленсинг мРНК АроВ различными конъюгатами и РО-линкером in vivo.

Мышам вводили 1 мг/кг ASO с различными конъюгатами либо без биорасщепляемого линкера, с дитио-линкером (SS), либо с ДНК/РО-линкером (РО). РНК выделяли из образцов печени (А) и почек (В) и анализировали на нокдаун мРНК АроВ. Данные показаны в сравнении с физиологическим раствором (=1).

Фиг. 25. Сайленсинг мРНК мишени X посредством ASO образующей петлю LNA (looped LNA) с РО-линкером.

Клетки Neuro 2а обрабатывали ASO образующей петлю LNA с РО-линкером или без него, соответственно. Через 6 дней гимнозис-мРНК выделяли и анализировали на нокдуаун мРНК мишени X. Экспрессия мРНК показана как процент контрольных (ложно обработанных) образцов.

Описание изобретения

Данное изобретение относится к олигомерным соединениям, таким как антисмысловые олигонуклеотиды, которые ковалентно связаны с конъюгационной группой, направляющей группой, реакционноспособной группой, активационной группой или блокирующей группой через короткую область, содержащую (например, 1-10) связанные фосфодиэфирными связями ДНК- или РНК-нуклеозиды.

Олигомер

Данное изобретение использует олигомерные соединения (также называемые в данном документе олигомерами) для модуляции, например ингибирования, нуклеиновой кислоты-мишени в клетке. Олигомеры могут иметь 8-35 последовательных нуклеотидов в длину и содержат первую область из 7-25 последовательных нуклеотидов и вторую область из 1-10 последовательных нуклеотидов, где, например, либо межнуклеозидная связь между первой и второй областями является фосфодиэфирной связью с первым (или единственным) ДНК- или РНК-нуклеозидом вт