Обогащенная питательная среда для выращивания клеток, извлеченных из ткани пуповины человека

Обогащенная питательная среда для выращивания клеток, извлеченных из ткани пуповины человека

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область применения изобретения

Настоящая заявка на патент относится к питательной обогащенной культурной среде для роста субстратзависимых клеток, например, клеток, извлеченных из ткани пуповины.

Предпосылки создания изобретения

Для аллогенного клеточного терапевтического продукта, клетки и ткани получают от донора, после чего подвергают их дальнейшей обработке до назначения пациентам. В целом, производственный процесс для не-гомологичного клеточного терапевтического продукта включает следующие стадии: размораживание флакона банка клеток и распределение клеток для посева в сосуд для производства; рост клеток в сосуде для производства; удаление нежелательных примесей, использованных во время роста клеток, таких как сыворотка и трипсин; концентрация клеток; формирование клеток в буфер финального формирования; и замораживание клеток. Подобные производственные процессы могут быть весьма сложными и дорогостоящими. Например, клетки для применения в клеточной терапии, как правило, культивируются и разрастаются в ростовой среде, обогащенной сывороткой. Стоимость производства для нужд клеточной терапии может быть очень высокой из-за высокой стоимости сыворотки, среды и прочих материалов, используемых в процессе. Многочисленные факторы могут ограничивать способность клеток к разрастанию до высокой клеточной плотности, в том числе ограничение в питательности, аккумуляция побочных продуктов клеток в культуре, физическая окружающая среда и т.д. Соответственно, желательно увеличить количество волюметрических клеток, произведенных во сосуде для выращивания путем выращивания клеток до высокой клеточной плотности.

Ранее было показано, что субстратзависимые клетки, такие как, к примеру, клетки, извлеченные из тканей человеческой пуповины (hUTC) могут разрастаться до высокой клеточной плотности путем замены среды выращивания клеток, содержащей 15% эмбриональной бычьей сыворотки (FBS) в день 3 процесса. Однако, подобная замена среды менее желательна из-за высокой стоимости сыворотки, высокого уровня использования сыворотки для производства и дополнительных операционных манипуляций. Таким образом, процесс с заменой среды не является коммерчески целесообразным.

Необходим новый способ для выращивания клеток без необходимости замены ростовой среды, который был бы коммерчески целесообразным.

Изложение сущности изобретения

Один из вариантов осуществления изобретения является культуральная среда для выращивания субстратзависимых клеток, которая содержит: (1) аминокислоты L-аргинин; L-цистин; L-цистеин; L-глютамин; глицин; L-гистидин; L-изолейцин; L-лейцин; L-лизин; L-метионин; L-фенилаланин; L-серин; L-треонин; L-триптофан; L-тирозин; L-валин; L-аланин; L-аспарагин, L-аспарагиновая кислота; L-глютаминовая кислота; L-пролин; и L-таурин; (2) витамины D-кальций пантотенат; холина хлорид; фолиевая кислота; I-инозитол; ниацинамид; пиридоксаль; рибофлавин; тиамин; d-биотин; пиридоксин; и витамин B₁₂ (цианокобаламин); (3) соли кальция хлорид; калия хлорид; магнезии сульфат; натрия хлорид; и одна или несколько солей натрия фосфата; (4) нуклеозиды тимидин; аденозин; цитидин; уридин и гуанозин; (5) инсулин; (6) трансферрин; (7) липоевая кислота/тиоктовая кислота; (8) этаноламин; (9) натрия селенит; и (10) один или несколько источников энергии.

В одном варианте осуществления, культурная среда содержит:

по меньшей мере приблизительно 0,05 г/л L-аргинина; по меньшей мере приблизительно 0,02 г/л L-цистина; по меньшей мере приблизительно 0,2 г/л L-глютамина; по меньшей мере приблизительно 0,01 г/л глицина; по меньшей мере приблизительно 0,02 г/л L-гистидина; по меньшей мере приблизительно 0,09 г/л L-изолейцина; по меньшей мере приблизительно 0,09 г/л L-лейцина; по меньшей мере приблизительно 0,09 г/л L-лизина; по меньшей мере приблизительно 0,02 г/л L-метионина; по меньшей мере приблизительно 0,05 г/л L-фенилаланина; по меньшей мере приблизительно 0,03 г/л L-серина; по меньшей мере приблизительно 0,08 г/л L-треонина; по меньшей мере приблизительно 0,009 г/л L-триптофана; по меньшей мере приблизительно 0,08 г/л L-тирозина; по меньшей мере приблизительно 0,08 г/л L-валина; по меньшей мере приблизительно 0,005 г/л L-цистеина; по меньшей мере приблизительно 0,0004 г/л L-аланина; по меньшей мере приблизительно 0,01 г/л L-аспарагина; по меньшей мере приблизительно 0,006 г/л L-аспарагиновой кислоты; по меньшей мере 0,03 г/л L-глютаминовой кислоты; по меньшей мере приблизительно 0,005 г/л L-пролина; и по меньшей мере приблизительно 0,0003 г/л L-таурина;

от приблизительно 5×10^-6 г/л до приблизительно 0,015 г/л каждого из витаминов;

по меньшей мере приблизительно 0,05 г/л кальция хлорида, обезвоженного, по меньшей мере приблизительно 0,1 г/л калия хлорида; по меньшей мере приблизительно 0,2 г/л магнезии сульфата; по меньшей мере приблизительно 0,08 г/л натрия фосфата, одноосновного, H₂O и по меньшей мере приблизительно 0,0005 г/л натрия фосфата двухосновного гептагидрата (Na₂HPO₄.7H₂O);

по меньшей мере приблизительно 0,0001 г/л тимидина и по меньшей мере приблизительно по 0,005 г/л аденозина, цитидина, уридина и гуанозина; и

по меньшей мере приблизительно 0,003 г/л инсулина; по меньшей мере приблизительно 0,05 г/л трансферрина; по меньшей мере приблизительно 5×10^-6 г/л липоевой кислоты/тиоктовой кислоты; по меньшей мере приблизительно 0,05 г/л этаноламина и по меньшей мере приблизительно 0,00004 г/л натрия селенита.

Другим вариантом вариантов осуществления изобретения является не содержащий сыворотки питательный раствор для выращивания субстратзависимых клеток, который содержит:

аминокислоты L-аргинин; L-цистин; L-цистеин; глицин; L-гистидин; L-изолейцин; L-лейцин; L-лизин; L-метионин; L-фенилаланин; L-серин; L-треонин; L-триптофан; L-тирозин; L-валин; L-аланин; L-аспарагин, L-аспарагиновая кислота; L-глютаминовая кислота; L-пролин; и L-таурин;

витамины D-кальций пантотенат; холина хлорид; фолиевая кислота; I-инозитол; ниацинамид; пиридоксаль; рибофлавин; тиамин; d-биотин; пиридоксин; и витамин B₁₂ (цианокобаламин);

соли натрия фосфата, одноосновная, и натрия фосфата двухосновный гептагидрат;

нуклеозиды аденозин; цитидин; уридин и гуанозин;

инсулин; трансферрин; липоевую кислоту/тиоктовую кислоту; этаноламин и натрия селенит.

Изобретение также представляет наборы для выращивания субстратзависимых клеток. Наборы содержат культурную среду и/или не содержащий сыворотки питательный раствор. Культурная среда, не содержащий сыворотки раствор и наборы могут применяться в способе выращивания субстратзависимых клеток (таких, к примеру, как клетки, извлеченные из тканей пуповины).

Соответственно, другой вариант осуществления изобретения представляет собой способ культивации изолированных клеток, полученных из ткани пуповины, который содержит:

выращивание клеток, извлеченных из тканей пуповины, высеянных на микроносители в культуральной среде, содержащей аминокислоты, витамины, соли, нуклеозиды, липоевую/тиоктовую кислоту, этаноламин, инсулин, трансферрин, натрия селенит, которая дополнена сывороткой на период времени, достаточный для достижения клетками желательной первоначальной плотности популяции;

добавление не содержащего сыворотки питательного раствора, который содержит аминокислоты, витамины, соли, инсулин, трансферрин, этаноламин, липоевую/тиоктовую кислоту, натрия селен, после того, как клетки достигли желательной первоначальной плотности популяции; и

выращивание клеток на протяжении достаточного периода времени, чтобы позволить клеткам достичь желательной финальной плотности популяции.

Способ может также содержать дополнительные стадии. В одном варианте осуществления способ также содержит посев клеток в микроносители. В другом варианте осуществления способ также содержит изоляцию клеток после культивации. В одном варианте осуществления желательная первоначальная плотность популяции достигается через 3-4 дня. Способ не требует замены среды. Способ может быть осуществлен в системе культуры в роллерном флаконе и микроносители могут обладать обработанной аминами поверхностью.

Используемые в данном способе клетки, выделенные из ткани пуповины человека, изолированы от ткани пуповины человека по существу свободными от крови, способны к самообновлению и размножению в культуре, обладающими потенциалом к дифференцированию, экспрессирующими CD13, CD90 и HLA-ABC, а также не экспрессирующими CD34, CD117 и HLA-DR. В одном варианте осуществления клетки не экспрессируют hTERT или теломеразу. Характеристики клеток до и после культивирования по существу одинаковы. В одном варианте осуществления характеристики клеток до и после культивирования по существу одинаковы.

В одном варианте осуществления, культурная среда, применяемая в способе, содержит:

аминокислоты L-аргинин; L-цистин; L-цистеин; L-глютамин; глицин; L-гистидин; L-изолейцин; L-лейцин; L-лизин; L-метионин; L-фенилаланин; L-серин; L-треонин; L-триптофан; L-тирозин; L-валин; L-аланин; L-аспарагин, L-аспарагиновая кислота; L-глютаминовая кислота; L-пролин; и L-таурин;

витамины D-кальций пантотенат; холина хлорид; фолиевая кислота; I-инозитол; ниацинамид; пиридоксаль; рибофлавин; тиамин; d-биотин; пиридоксин; и витамин B₁₂ (цианокобаламин);

соли кальция хлорид; калия хлорид; магнезии сульфат; натрия хлорид; и одна или несколько солей натрия фосфата;

нуклеозиды тимидин, аденозин, цитидин, уридин и гуанозин;

инсулин; трансферрин; липоевая кислота/тиоктовая кислота; этаноламин; натрия селенит; и один или несколько источников энергии (таких как, к примеру, D-глюкоза и натрия пируват).

В другом варианте осуществления, культурная среда, применяемая в способе, содержит:

по меньшей мере приблизительно 0,05 г/л L-аргинина; по меньшей мере приблизительно 0,02 г/л L-цистина; по меньшей мере приблизительно 0,2 г/л L-глютамина; по меньшей мере приблизительно 0,01 г/л глицина; по меньшей мере приблизительно 0,02 г/л L-гистидина; по меньшей мере приблизительно 0,09 г/л L-изолейцина; по меньшей мере приблизительно 0,09 г/л L-лейцина; по меньшей мере приблизительно 0,09 г/л L-лизина; по меньшей мере приблизительно 0,02 г/л L-метионина; по меньшей мере приблизительно 0,05 г/л L-фенилаланина; по меньшей мере приблизительно 0,03 г/л L-серина; по меньшей мере приблизительно 0,08 г/л L-треонина; по меньшей мере приблизительно 0,009 г/л L-триптофана; по меньшей мере приблизительно 0,08 г/л L-тирозина; по меньшей мере приблизительно 0,08 г/л L-валина; по меньшей мере приблизительно 0,005 г/л L-цистеина; по меньшей мере приблизительно 0,0004 г/л L-аланина; по меньшей мере приблизительно 0,01 г/л L-аспарагина; по меньшей мере приблизительно 0,006 г/л L-аспарагиновой кислоты; по меньшей мере 0,03 г/л L-глютаминовой кислоты; по меньшей мере приблизительно 0,005 г/л L-пролина; и по меньшей мере приблизительно 0,0003 г/л L-таурина;

от приблизительно 5×10^-6 г/л до приблизительно 0,015 г/л каждого из витаминов;

по меньшей мере приблизительно 0,05 г/л кальция хлорида, обезвоженного, по меньшей мере приблизительно 0,1 г/л калия хлорида; по меньшей мере приблизительно 0,2 г/л магнезии сульфата; по меньшей мере приблизительно 0,08 г/л натрия фосфата, одноосновного, H₂O и по меньшей мере приблизительно 0,0005 г/л натрия фосфата двухосновного гептагидрата (Na₂HPO₄.7H₂O);

по меньшей мере приблизительно 0,0001 г/л тимидина и по меньшей мере приблизительно по 0,005 г/л аденозина, цитидина, уридина и гуанозина; и

по меньшей мере приблизительно 0,003 г/л инсулина; по меньшей мере приблизительно 0,05 г/л трансферрина; по меньшей мере приблизительно 5×10^-6 г/л липоевой кислоты/тиоктовой кислоты; по меньшей мере приблизительно 0,05 г/л этаноламина и по меньшей мере приблизительно 0,00004 г/л натрия селенита.

Культурная среда, использованная в способе, обогащена от 2 до 20% эмбриональной бычьей сыворотки. В одном варианте осуществления, культурная среда обогащена приблизительно 7,5%, приблизительно 10% или приблизительно 15 % эмбриональной бычьей сыворотки.

В одном варианте осуществления, не содержащая сыворотки культурная среда, применяемая в способе, содержит:

аминокислоты L-аргинин; L-цистин; L-цистеин; глицин; L-гистидин; L-изолейцин; L-лейцин; L-лизин; L-метионин; L-фенилаланин; L-серин; L-треонин; L-триптофан; L-тирозин; L-валин; L-аланин; L-аспарагин, L-аспарагиновая кислота; L-глютаминовая кислота; L-пролин; и L-таурин;

витамины D-кальций пантотенат; холина хлорид; фолиевая кислота; I-инозитол; ниацинамид; пиридоксаль; рибофлавин; тиамин; d-биотин; пиридоксин; и витамин B₁₂ (цианокобаламин);

соли натрия фосфата, одноосновная, и натрия фосфата двухосновный гептагидрат;

микроэлементы меди (II) сульфат пентагидрат (CuSO₄.5H₂), цинка сульфат, гептагидрат (ZnSO₄.7H₂O);

нуклеозиды аденозин; цитидин; уридин и гуанозин;

инсулин; трансферрин; этаноламин, липоевая кислота/тиоктовая кислота и натрия селенит.

Культурная среда и не содержащий сыворотки питательный раствор могут также содержать другие компоненты. Например, культурная среда и/или не содержащий сыворотки питательный раствор могут далее содержать путресцин, стабилизатор и/или пенообразующий агент.

Другие характеристики и преимущества настоящего изобретения станут им понятны после изучения следующего подробного описания и примеров.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В приведенном ниже подробном описании примерных вариантов осуществления содержатся ссылки на соответствующие рисунки, которые являются частью настоящего изобретения. Такие варианты осуществления описаны достаточно подробно, чтобы дать возможность специалистам в данной области практически использовать настоящее изобретение, и следует понимать, что могут использоваться и другие варианты осуществления и что логические структурные, механические, электрические и химические изменения можно вносить без отступления от сущности и объема настоящего изобретения. С тем чтобы исключить чрезмерную детализацию, которая не требуется для практического использования специалистами в данной области описанных в настоящем документе вариантов осуществления, в описании может быть опущена определенная информация, известная специалистам в данной области. Поэтому приведенное ниже подробное описание не следует рассматривать как ограничивающее.

В одном аспекте изобретение предоставляет собой процесс выращивания субстратзависимых клеток, таких как, например, клетки, извлеченные из ткани человеческой пуповины, («hUTC»), закрепленных на микроносителях, в содержащей сыворотку среде до высокой клеточной плотности без замены среды путем подпитки культуры не содержащим сыворотки питательным раствором в процессе выращивания. Процесс позволяет рост клеток до высокой клеточной плотности без воздействия на биологическую функцию клеток. Поскольку изобретение увеличивает урожайность производственного биореактора, изобретение предоставляет экономические и коммерческие преимущества.

В другом аспекте изобретение предоставляет культурную среду и питательные растворы, которые пригодны для выращивания субстратзависимых клеток в центрифужных пробирках, предпочтительно без необходимости замены среды.

В одном из вариантов осуществления, изобретение раскрывает композицию обогащенной среды и концентрированного не содержащего сыворотки питательного раствора для выращивания клеток hUTC до высокой плотности в центрифужных пробирках без замены среды. Этот способ снижает потребление сыворотки и увеличивает волюметрическую производительность для снижения стоимости производства. В частности, способ позволяет повысить удвоение популяции с заменой среды.

В другом варианте осуществления изобретение предоставляет не содержащий сыворотки питательный раствор, который содержит: аминокислоты (для восполнения потребленных аминокислот в культуре); витамины; соли (для достижения осмотического баланса в культуре); нуклеозиды; инсулин; трансферрин; и не обязательно, но желательно этаноламин; и натрия селений. Данное изобретение позволяет масштабировать процесс для крупномасштабных биореакторов. В еще одном варианте осуществления, изобретение предоставляет культурную среду, содержащую аминокислоты, витамины, соли, нуклеозиды, инсулин, трансферрин и не обязательно, но предпочтительно этаноламин и натрия селен. Перед применением данная культурная среда может быть дополнена сывороткой.

Другим аспектом изобретения является способ выращивания hUTC, подсоединенных к микроносителям, до высокой клеточной плотности во взвешенной культуре в центрифужных пробирках путем обогащения сыворотки, содержащей среду для выращивания с питательными веществами, и питание культуры не содержащими сыворотки питательными веществами также раскрыто. Этот способ ликвидирует необходимость замены среды для выращивания hUTC до высокой плотности.

В приведенном ниже описании и формуле изобретения применяются различные термины. Такие термины должны иметь смысл, который они обычно имеют в этой области, если только не указано иное. Другие явно определенные термины следует толковать согласно приведенным в настоящем документе определениям.

В одном из вариантов осуществления, клетки, применяемые в настоящем изобретении, обычно называют постнатальными клетками или клетками, полученными в постнатальный период (PPDC). Более конкретно, данные клетки являются «клетками, полученными из пупка», «клетками, полученными из пуповины» (UDC) или «клетками, полученными из ткани пуповины» (UTC). Кроме того, клетки могут быть описаны как являющиеся стволовыми клетками или клетками-предшественниками, причем последний термин применяется в широком смысле. Термин «полученный из» применяется для указания того, что клетки были получены из их биологического источника и были выращены или иным образом обработаны in vitro (например, культивированы в ростовой среде для размножения популяции и/или получения клеточной линии). Манипуляции in vitro с пуповинными стволовыми клетками и уникальные характеристики клеток, полученных из пуповины, составляющих предмет настоящего изобретения, более подробно описаны ниже.

Стволовые клетки представляют собой недифференцированные клетки, определяющиеся по способности на уровне единичной клетки как самообновляться, так и дифференцироваться для получения клеток-потомков, включая самообновляющиеся клетки-предшественники, необновляющиеся клетки-предшественники и окончательно дифференцированные клетки. Стволовые клетки также характеризуются своей способностью дифференцироваться in vitro в функциональные клетки различных клеточных линий из множества зародышевых листков (энтодермы, мезодермы и эктодермы), также как и давать начало тканям после трансплантации, и способствовать образованию по существу большинства, если не всех, тканей после инъекции в бластоцисты.

По своему потенциалу развития стволовые клетки разделяются на: (1) тотипотентные; (2) плюрипотентные; (3) мультипотентные; (4) олигопотентные; и (5) унипотентные. Тотипотентные клетки способны преобразовываться во все виды эмбриональных и внеэмбриональных клеток. Плюрипотентные клетки способны преобразовываться во все виды эмбриональных клеток. Мультипотентные клетки включают в себя клетки, способные преобразовываться в подмножество клеточных линий дифференцировки, но только в пределах конкретной ткани, органа или физиологической системы. Например, гемопоэтические стволовые клетки (HSC) могут порождать клетки-потомки, которые включают в себя HSC (самообновление), рестриктированные олигопотентные клетки-предшественники клеток крови и все типы и элементы клеток (например, тромбоциты), представляющие собой стандартные компоненты крови. Клетки, которые являются олигопотентными, способны преобразовываться в более ограниченное подмножество клеточных линий, чем мультипотентные стволовые клетки. Клетки, которые являются унипотентными, способны преобразовываться в единственную клеточную линию (например, сперматогенные стволовые клетки).

Стволовые клетки также классифицируются на основании источника их получения. Взрослая стволовая клетка как правило представляет собой мультипотентную недифференцированную клетку, присутствующую в ткани, содержащей множество дифференцированных видов клеток. Взрослая стволовая клетка способна к самообновлению. В нормальных условиях она также может дифференцироваться для получения специализированных типов клеток ткани, в которой они находятся, а также, возможно, тканей других типов. Эмбриональная стволовая клетка представляет собой плюрипотентную клетку из внутренней клеточной массы эмбриона на стадии бластоцисты. Фетальная стволовая клетка представляет собой клетку, происходящую из фетальных тканей или мембран. Постнатальная стволовая клетка является мультипотентной или плюрипотентной клеткой, которая по существу происходит из внеэмбриональной ткани, доступной после родов, а именно, из пуповины. Обнаружено, что данные клетки обладают признаками, характерными для плюрипотентных стволовых клеток, включая быструю пролиферацию и потенциал дифференцировки в клетки многих линий. Постнатальные стволовые клетки можно получить из крови (например, клетки, полученные из пуповинной крови) или не из крови (например, из отличных от крови тканей пуповины и плаценты).

Для описания клеток в культуре используются различные термины. «Культура клеток» по существу обозначает клетки, взятые из живого организма и выращенные в контролируемых условиях («в культуре» или «культивированные»). «Первичная культура клеток» обозначает культуру клеток, тканей или органов, взятых непосредственно из организма(ов) до первого пересева. Клетки «размножаются» в культуре, когда их помещают в питательную среду в условиях, способствующих росту и/или делению клеток, что приводит к увеличению популяции клеток. При размножении клеток в культуре скорость пролиферации клеток иногда измеряют по количеству времени, которое необходимо клеткам для удвоения численности. Данное время называют «временем удвоения».

Термин «клеточная линия» по существу относится к популяции клеток, полученной в результате одного или более пересевов первичной клеточной культуры. Каждый цикл пересева называют пассажем. Когда клетки пересеиваются, их называют «пассированными». Конкретная популяция клеток или клеточная линия иногда описывается или характеризуется количеством выполненных с ней пересеваний (пассажей). Например, пересеянная 10 раз культивируемая популяция клеток может описываться как культура десятого пассажа, или культура P10. Первичная культура, т.е. первая культура после изолирования клеток из ткани, обозначается P0. После первого пересева клетки описываются как вторичная культура (P1, или культура первого пассажа). После второго пересева клетки превращаются в третичную культуру (P2, или культура второго пассажа) и т.п. Специалист в данной области определит, что за промежуток времени между последовательными пассированиями популяция клеток может удваиваться многократно; поэтому количество удвоений популяций в культуре превышает количество пассажей. Степень размножения клеток (т.е. число удвоений популяции) за промежуток времени между пассированиями зависит от многих факторов, включая, без ограничений, плотность посева, тип подложки, тип среды, условия роста и продолжительность времени между пассированиями.

«Дифференцировка» представляет собой процесс, при помощи которого неспециализированная («некоммитированная») или малоспециализированная клетка приобретает свойства специализированной клетки, как, например, нервной или мышечной клетки. «Дифференцированная» клетка представляет собой клетку, занявшую более специализированное («коммитированное») положение в линии дифференцировки клетки. Термин «коммитированная» применительно к процессу дифференцирования относится к клетке, дошедшей в ходе процесса дифференцирования до стадии, с которой в нормальных условиях она продолжит дифференцироваться до конкретного типа клеток или подмножества типов клеток и не сможет в нормальных условиях дифференцироваться в иной тип клеток или вернуться к менее дифференцированному типу. «Дедифференцировка» обозначает процесс, в ходе которого клетка возвращается к менее специализированной (или коммитированной) позиции в клеточной линии дифференцировки. Используемый в настоящем документе термин «клеточная линия дифференцировки» определяет наследственность клетки, т.е. определяет, из какой клетки произошла данная клетка и каким клеткам она может дать начало. В клеточной линии дифференцировки клетка помещается в наследственную схему развития и дифференцировки.

В широком смысле «клетка-предшественник» представляет собой клетку, обладающую способностью образовывать клетки-потомки, которые будут более дифференцированы по сравнению с ней, и при этом сохраняющую способность к восполнению пула клеток-предшественников. По данному определению, сами стволовые клетки также являются прогениторными клетками, поскольку являются ближайшими предшественниками окончательно дифференцированных клеток. В отношении клеток из настоящего изобретения, которые более подробно описываются ниже, может использоваться это широкое значение клеток-предшественников. В более узком смысле клетку-предшественника часто определяют как клетку, которая является промежуточным предшественником в процессе дифференцировки, т.е. она происходит из стволовой клетки и является промежуточным звеном при выработке зрелого вида клеток или подмножества видов клеток. Клетки-предшественники этого типа по существу не способны к самообновлению. Соответственно, при отсылке к клетке данного типа в настоящем документе она будет называться «необновляющейся клеткой-предшественником» или «промежуточной клеткой-предшественником».

По существу, «трофический фактор» определяют как вещество, стимулирующее выживаемость, рост, пролиферацию и/или созревание клетки или стимулирующее повышенную активность клетки.

Применяемый в настоящем документе термин «стандартные условия роста» относится к культивированию клеток при 37°C в стандартной атмосфере, содержащей 5% CO₂, и при относительной влажности приблизительно 100%. Хотя описанные выше условия можно применять при культивировании клеток, следует понимать, что специалист в данной области, принимая во внимание возможности культивирования клеток, известные в данной области, вполне может варьировать такие условия.

Применяемый в настоящем документе термин «выделенная» по существу относится к клетке, которая была отделена от ее естественной среды. Данный термин включает грубое физическое отделение от естественной среды, например, путем удаления у животного-донора. В предпочтительных вариантах осуществления выделенная клетка не находится в ткани, т.е. клетка отделена или разобщена с соседними клетками, с которыми она контактирует в нормальных условиях. Предпочтительно вводить клетки в виде клеточной суспензии. Применяемый в настоящем документе термин «клеточная суспензия» включает в себя клетки, которые контактируют со средой и были разобщены, например, путем осторожного измельчения фрагмента ткани.

Один из вариантов осуществления изобретения является способом культивирования изолированных субстратзависимых клеток с применением ростовой среды и не содержащего сыворотки питательного раствора данного изобретения. Способ культивирования изолированных субстратзависимых клеток (таких как, к примеру, клеток ткани пуповины) предполагает культивирование клеток на по меньшей мере одной частице-носителе, например, микроносителе. Микроноситель может состоять их материалов натурального или синтетического происхождения. Примерами являются микроносители на основе коллагена, декстрана, или целлюлозы, а также стекла, керамики, полимеров (таких как полистирол), или металлов. Микроноситель может не содержать белков или иметь белковое покрытие, например, из коллагена. В дополнительном аспекте микроноситель может состоять или иметь покрытие из соединений, улучшающих связывание клетки с микроносителем и улучшающих отделение клетки от микроносителя, включая, помимо прочего, такие соединения, как натрия гиалуронат, поли(моностеароилглицерид-ко-янтарная кислота), поли-D,L-лактид-ко-гликолид, фибронектин, ламинин, эластин, лизин, n-изопропилакриламид, витронектин и коллаген. Дальнейшие примеры включают микроносители, обладающие микротоком, такие как микроносители с частичной гальванической парой цинка и меди, которая производит низкие уровни биологически релевантного электричества; или микроносители, являющиеся парамагнетическими, такие как парамагнетические кальций-альгинатные микроносители. Эти способы можно осуществить в системе роллерных флаконов.

Необходимо понимать, что это изобретение не ограничивается конкретными способами, реагентами, соединениями, композициями или биологическими системами, которые, конечно, могут варьироваться. Следует также иметь в виду, что применяемые в настоящем документе термины используются только в целях описания конкретных вариантов осуществления настоящего изобретения и не носят ограничительного характера. При использовании в этом описании и в прилагаемой формуле изобретения, формы единственного числа включают и множественное число, если только содержание текста ясно не указывает на иное. Так, например, обозначение «клетка» включает в себя сочетание двух или более клеток, и подобное.

«Микроносителями» называются частицы, сферы или гранулы, которые могут использоваться для связывания и культивирования субстратзависимых клеток. Микроносители обладают следующими свойствами: (a) они имеют достаточно малые размеры, чтобы их можно было использовать в суспензионных культурах (при скорости перемешивания, не приводящей к заметным сдвиговым повреждениям микроносителей или клеток); (b) они являются цельными или имеют цельное ядро и пористое покрытие на поверхности; и (c) их поверхности (внешняя и внутренняя, в случае пористых носителей) могут иметь положительный или отрицательный заряд. В одном аспекте изобретения общий диаметр частицы находится в диапазоне от приблизительно 150 до 350мкм, а плотность положительного заряда - в диапазоне от приблизительно 0,8 до 2,0 мг-экв/г. Примеры используемых микроносителей включают Cytodex® 1, Cytodex® 2, или Cytodex® 3 (GE Healthcare Life Sciences).

В другом аспекте микроноситель представляет собой цельный носитель. Цельные носители хорошо подходят для адгезионных клеток, например, для субстратзависимых клеток. Частица носителя может также представлять собой пористый микроноситель. Дальнейшие примеры включают микроносители, обладающие микротоком, такие как микроносители с частичной гальванической парой цинка и меди, которая производит низкие уровни биологически релевантного электричества; или микроносители, являющиеся парамагнетическими, такие как парамагнетические кальций-альгинатные микроносители.

Термин «пористые микроносители» относится к частицам, которые могут использоваться для связывания и культивирования субстратзависимых клеток. Пористые микроносители обладают следующими свойствами: (a) они имеют достаточно малые размеры, чтобы их можно было использовать в суспензионных культурах (при скорости перемешивания, не приводящей к сдвиговым повреждениям микроносителей или клеток); (b) они имеют поры и внутренние лакуны, размеры которых достаточны для миграции клеток в лакуны; (c) их поверхности (внешняя и внутренняя) могут иметь положительный или отрицательный заряд. В одной серии вариантов осуществления носители: (a) имеют общий диаметр частицы от приблизительно 150 до 350μмкм; (b) имеют поры с диаметром отверстия от приблизительно 15 до приблизительно 40μмкм; (c) имеют плотность положительного заряда от приблизительно 0,8 до 2,0 мг-экв/г. В некоторых вариантах осуществления, группы DEAE (N, N,-диэтиламиноэтил) предоставляют положительный заряд. К применимым пористым микроносителям относятся, помимо прочего, Cytopore 1^® и Cytopore 2^® (GE Healthcare Life Sciences, Piscataway, Нью-Джерси, США).

«Субстратзависимыми клетками» являются клетки, в том числе клетки млекопитающих, которым необходимо сцепление с поверхностью, например, поверхностью сосуда для тканевой культуры или поверхностью частицы-микроносителя, для реплицирования в культуре ткани.

При использовании в настоящем документе, термин «приблизительно», когда он относится к измеряемому значению, такому как количество, длительность времени и тому подобное, означает колебания в пределах ±20% или ±10%, более предпочтительно ±5%, еще более предпочтительно ±1%, и еще более предпочтительно ±0,1% от указанного значения, в зависимости от того, какие колебания подходят для осуществления раскрываемых способов.

I. Культурная среда и не содержащий сыворотки питательный раствор

Данное изобретение представляет обогащенную среду и концентрированный питательный раствор, не содержащие сыворотки. Питательная среда и не содержащий сыворотки питательный раствор применяются для выращивания клеток до высокой плотности. В предпочтительном варианте осуществления среда и не содержащий сыворотки питательный раствор могут быть использованы для выращивания субстратзависимых клеток, таких как, например, hUTC, до высокой плотности в центрифужных пробирках при более низком потреблении сыворотки.

В одном из вариантов осуществления культурная среда и не содержащий сыворотки питательный раствор применяются для выращивания клеток, извлеченных из тканей пуповины человека. В другом варианте осуществления культурная среда и не содержащий сыворотку питательный раствор пригодны для выращивания прогениторных клеток, включая, но не ограничиваясь ими, мезенхимальные стволовые клетки, стволовые клетки костного мозга, клетки, извлеченные из плацентарной ткани, адгерентные клетки, извлеченные из не-костомозговых тканей, таких как, например, жировая ткань, мускульная ткань, клетки, извлеченные из кровеносных сосудов, в том числе из грудной артерии, клетки, извлеченные из дентальной пульпы зубов, клетки, извлеченные из амниотической жидкости и фибробласты, в том числе неонатальные фибробласты крайней плоти.

А. Культуральная среда

Одним из аспектов изобретения является культурная среда, содержащая аминокислоты, витамины, соли, нуклеозиды, инсулин, трансферрин, этаноламин и натрия селен, D-глюкоза и натрия пируват.

В одном из вариантов осуществления культуральная среда содержит общие L-аминокислоты. В другом варианте осуществления культуральная среда содержит следующие аминокислоты: L-аргинин; L-цистин; L-глютамин; глицин; L-гистидин; L-изолейцин; L-лейцин; L-лизин; L-метионин; L-фенилаланин; L-серин; L-треонин; L-триптофан; L-тирозин; L-валин; и не в обязательном порядке L-цистеин; L-аланин; L-аспарагин, L-аспарагиновая кислота; L-глютаминовая кислота; L-пролин; и L-таурин. В альтернативном варианте осуществления культуральная среда содержит от приблизительно 0,0006 г/л до приблизительно 0,1 г/л каждой из аминокислот.

В еще одном варианте осуществления культуральная среда включает по меньшей мере приблизительно 0,1 г/л L-аргинина; по меньшей мере приблизительно 0,05 г/л L-цистина; по меньшей мере приблизительно 0,3 г/л L-глютамина; по меньшей мере приблизительно 0,02 г/л глицина; по меньшей мере приблизительно 0,03 г/л L-гистидина; по меньшей мере приблизительно 0,08 г/л L-изолейцина; по меньшей мере приблизительно 0,08 г/л L-лейцина; по меньшей мере приблизительно 0,1 г/л L-лизина; по меньшей мере приблизительно 0,1 г/л L-метионина; по меньшей мере приблизительно 0,05 г/л L-фенилаланина; по меньшей мере приблизительно 0,03 г/л L-серина; по меньшей мере приблизительно 0,08 г/л L-треонина; по меньшей мере приблизительно 0,01 г/л L-триптофана; по меньшей мере приблизительно 0,09 г/л L-тирозина; по меньшей мере приблизительно 0,07 г/л L-валина; по меньшей мере приблизительно 0,007 г/л L-цистеина; по меньшей мере приблизительно 0,0005 г/л L-аланина; по меньшей мере приблизительно 0,02 г/л L-аспарагина; по меньшей мере приблизительно 0,006 г/л L-аспарагиновой кислоты; по меньшей мере 0,03 г/л L-глютаминовой кислоты; по меньшей мере приблизительно 0,01 г/л L-пролина; и по меньшей мере приблизительно 0,0006 г/л L-таурина.

В альтернативном варианте осуществления культуральная среда содержит приблизительно 0,09705 г/л L-аргинин