Линейка биологически активных генно-терапевтических субстанций на основе гена gpx1 для коррекции патологических состояний клеток органов и тканей и органов и тканей человека, связанных с оксидативным стрессом, способ получения и использования

Линейка биологически активных генно-терапевтических субстанций на основе гена gpx1 для коррекции патологических состояний клеток органов и тканей и органов и тканей человека, связанных с оксидативным стрессом, способ получения и использования

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область, к которой относится изобретение

Изобретение относится к молекулярной биологии, биотехнологии, генной инженерии и медицине и может быть использовано для усиления защиты клеток различных органов и тканей, а также собственно органов и тканей человека от оксидативного стресса, в частности, в терапевтических целях.

Предшествующий уровень.

Оксидативный стресс - нарушение баланса между процессами образования активных форм кислорода (свободных радикалов) и процессами их нейтрализации. Он приводит к повреждениям клеток, тканей и органов живого организма, в частности, к преждевременному старению кожи, поскольку из всех систем живого организма именно кожа наиболее подвержена воздействию активных форм кислорода.

Кроме того, наиболее предрасположены к оксидативному стрессу дыхательная система (воздействие большого количества кислорода), мозг (высокая метаболическая активность и низкий уровень эндогенных антиоксидантов), глаза (постоянное УФ-облучение), система кровообращения (колебания уровней кислорода и оксида азота) и репродуктивная система (высокая метаболическая активность сперматозоидов).

Активные формы кислорода могут быть эндогенными, т.е. продуктами различных метаболических процессов в организме. Например, наиболее распространенный окислитель в организме - гидроксид-анион (ОН-) - образуется при многих аэробных процессах. Также активные формы кислорода могут иметь экзогенное происхождение. Они образуются под воздействием ультрафиолетового, ионизирующего и электромагнитного излучения, а также в результате взаимодействия с окислителями из окружающей среды, например, с озоном.

Другой распространенной активной формой кислорода является супероксид-анион (O₂.-). В отличие от гидроксильного радикала, супероксид-анион менее активен, но обладает большим временем жизни. Кроме того, он сам может быть источником образования гидроксид-анионов. В нормальных условиях супероксид-анион, как и другие свободные радикалы, быстро нейтрализуется естественными антиоксидантами - внутриклеточными, мембранными и внеклеточными. К внутриклеточным антиоксидантам относятся белки супероксиддисмутазы, пероксидазы и белок каталазы.

Супероксиддисмутазы катализируют превращение супероксид-аниона в кислород и перекись водорода, которая затем утилизируется глутатионпероксидазами и каталазой.

Следовательно, при сниженной активности глутатионпероксидазы, в частности - глутатионпероксидазы-1, или при повышенной скорости образования активных форм кислорода повышается вероятность и интенсивность оксидативного повреждения клеток и тканей.

Для усиления нейтрализации действия активных форм кислорода и снижения влияния оксидативного стресса существует несколько подходов.

Известно использование органических веществ природного происхождения, обладающих антиоксидантной активностью. Этот принцип положен в основу при производстве косметических средств.

В патенте US 8926965, было предложено использовать белок рекомбинантной супероксиддисмутазы-2, который является родственным белком по отношению к глутатионпероксидазе и значимым в такой же степени в аспекте снижения оксидативного стресса в клетках, тканях и органах.

В этом патенте было заявлено использование рекомбинантного модифицированного варианта супероксиддисмутазы-2, у которой за счет созданных мутаций в нуклеотидной последовательности произошли изменения аминокислотной структуры белка. Была показана ферментативная активность модифицированной супероксиддисмутазы-2. Было заявлено, что модифицированный пептид можно использовать для уменьшения оксидативного стресса и/или окислительного повреждения клетки как собственно лекарственное средство, так и в композиции с другими активными и вспомогательными компонентами.

Известно также использование в качестве лекарственных средств собственно белков - антиоксидантов.

Так в патенте US 6045809 для нейтрализации токсического действия активных форм кислорода было предложено использовать композиции фермента - антиоксиданта супероксиддисмутазы и, по крайней мере, одного из липидов (на примере керамидов) или белков (на примере проламинов). Новые фармацевтические композиции предназначены для перорального введения. Недостаток данного подхода состоит в том, что при данном методе введения желаемый терапевтический эффект может оказаться недостигнутым, а также - при недостаточной степени очистки возможны побочные реакции.

В патенте US 8916373 было предложено использовать рекомбинантные модифицированные варианты супероксиддисмутазы-1, у которых за счет созданных мутаций в нуклеотидной последовательности произошли изменения аминокислотной структуры белка (степень идентичности модифицированных вариантов белка и нативного белка не менее 80%). Рекомбинантными плазмидами были транфицированы культуры эмбриональных клеток почек человека (HEK клетки, линия HEK293FT) или эмбриональных фибробластов мыши (3T3s, линии NIH 3Т3), в которых наличие модифицированных белков определяли методом иммуноблоттинга, после чего определяли их ферментативную активность. Было выявлено, что активность некоторых вариантов увеличилась более чем в 3 раза по сравнению с белком дикого типа. Недостатком данного подхода является то, что внесение модификаций в аминокислотную последовательность природного белка может привести к образованию структур, являющихся антигенными детерминантами.

За прототип авторами было принято решение по заявке WO 1988007541 А1, в которой предлагается использовать белок рекомбинантной глутатионпероксидазы человека для снижения оксидативного стресса в клетках, тканях и органах. Глутатионпероксидаза катализирует процесс разложения пероксида водорода и органических перекисей с одновременным окислением глутатиона, что и придает этому ферменту первоочередное значение в антиоксидатной защите организма.

Этот белок является одним из немногих белков, известных у высших позвоночных, который содержит селеноцистеин, который находится в активном центре глутатионпероксидазы. Обнаружены несколько изоформ фермента, которые образуются в результате альтернативного сплайсинга. Глутатионпероксидаза формирует высокоактивный интермедиант - селеновую кислоту, селеновая кислота при этом защищена белковым окружением от активных групп внутри самого белка. Механизм действия глутатионпероксидазы базируется на реакции селеновой кислоты с амидами или аминами другого белка, формируя селеноамидные связи.

Продукт гена GPX является фактором в развитии ишемической болезни сердца. Недостаток этого фермента может способствовать возникновению повреждений в эндотелиальной выстилке сосудов, что может привести к преждевременному старению эритроцитов. Снижение активности гена GPX может приводить к формированию катаракты. Глутатионпероксидаза помогает предотвратить нарушение функции сердца в результате реперфузионного синдрома при ишемии. Глутатионпероксидаза человека может быть использована для терапии различных расстройств, обусловленных появлением пероксидов как продуктов метаболизма клетки.

Изобретение по прототипу предлагает способ синтеза глутатионпероксидазы человека в большом количестве с использованием методов рекомбинантной ДНК. В патенте представлен полинуклеотид, с последовательностью кДНК гена GPX человека. Последовательность полинуклеотида или его модифицированные формы были встроены в векторы для экспрессии в эукариотических клетках рекомбинантных продуктов: глутатионпероксидаза человека, фрагменты глутатионпероксидазы человека, аналоги глутатионпероксидазы человека и аналоги фрагментов глутатионпероксидазы человека. Эти рекомбинантные полипептидные продукты имеют потенциальную терапевтическую пользу. Кроме того, они могут быть использованы для получения моноклональных и поликлональных антител к продукту гена GPX человека. Данные антитела применимы для диагностики недостатка продукта гена GPX у человека. Кроме того, аналог глутатионпероксидазы человека, активные фрагменты глутатионпероксидазы человека и моноклональные антитела к глутатионпероксидазе человека могут применяться для определения взаимодействия фермента с различными субстратами на основе взамодействия фермента с гидрофильными и гидрофобными участками.

Недостатком данного подхода является высокая стоимость получения чистого рекомбинантного белка, более частое его введение при терапии (что увеличивает стоимость терапии и повышает риск побочных явлений) и сложность внутриклеточной доставки препарата. Кроме того, внесение модификаций в аминокислотную последовательность природного белка может привести к образованию структур, являющихся антигенными детерминантами. Также при создании терапевтического средства по прототипу не учтены индивидуальные характеристики пациента

Раскрытие изобретения

Задачей данного изобретения является создание линейки высокоэффективных биологически активных генно-терапевтических субстанций, способных препятствовать снижению антиоксидантной активности белка глутатионпероксидазы-1 в клетках органов и тканей и/или органах и тканях человека путем повышения уровня экспрессии гена GPX1 в клетках органов и тканей и/или органах и тканях человека, и/или повышения активности белка глутатионпероксидазы-1, ответственного за поддержание окислительно-восстановительного баланса в клетках органов и тканей и/или органах и тканях организма с учетом индивидуальных особенностей пациента.

Указанная задача решается за счет того, что создана линейка биологически активных генно-терапевтических субстанций для коррекции патологических состояний клеток органов и тканей и/или органов и тканей человека, связанных с оксидативным стрессом, каждая из которых представляет собой генетическую конструкцию на основе векторной плазмиды, содержащей нативную кДНК гена GPX1 SEQ ID No:1 или одну из модифицированных кДНК гена GPX1, и содержащей также регуляторные элементы, обеспечивающие транскрипцию этой последовательности в эукариотических клетках, в частности в клетках органов и тканей человека и способную обеспечить высокий уровень экспрессии гена GPX1 и увеличить активность белка глутатионпероксидазы-1 в клетках органов и тканей и/или органах и тканях человека, в частности, в гемопоэтических клетках, или гепатоцитах, или мезенхимальных стволовых клетках, или хондробластах, или клетках поджелудочной железы (например, в клетках панкреатических островков), или миоцитах или фибробластах кожи, или кератоцитах, или эпителиальных клетках роговицы, или в нейронах, ганглиях, Шванновских клетках, астроцитах, олигодендроцитах, микроглии, или в сперматозоидах, или в нефронах, или эндотелиальных клетках, или эпителиальных клетках в сочетании с транспортной молекулой или без нее при трансфекции этими биологически активными генно-терапевтическими субстанциями клеток органов и тканей человека и/или в органах и тканях человека в частности, в коже, суставах, печени, надпочечниках, почках, головном и спинном мозге, легких, сердце, сосудах, желудочно-кишечном тракте, простате, поджелудочной железе, глазе, роговице, слизистой оболочке, хрящевой ткани, мышечной ткани в сочетании с транспортной молекулой или без нее при введении этих биологически активных генно-терапевтических субстанций в органы и ткани человека. При этом генетическая конструкция с кДНК гена GPX1 содержит последовательность нуклеотидов, включающую в себя белок-кодирующую область кДНК гена GPX1, которая несет модификации не затрагивающие структуру белка глутатионпероксидазы-1, а именно: делеции 5' нетранслируемых областей или делеции 3'-нетранслируемых областей, или нуклеотидные замены, не приводящие к аминокислотным заменам или обрыву аминокислотной цепи, или комбинации вышеперечисленных модификаций и, соответственно, не влияющие на кодируемую этой последовательностью аминокислотную последовательность. В качестве модифицированной кДНК гена GPX1 используют SEQ ID No:2. Или в качестве модифицированной кДНК гена GPX1 используют SEQ ID No:3. Или в качестве модифицированной кДНК гена GPX1 используют SEQ ID No:4. Или в качестве модифицированной кДНК гена GPX1 используют SEQ ID No:5. Или в качестве модифицированной кДНК гена GPX1 используют SEQ ID No:6. Или в качестве модифицированной кДНК гена GPX1 используют SEQ ID No:7. При этом в качестве транспортной молекулы используют липосомы или дендримеры 5-го и выше поколений, или амфифильные блоксополимеры.

Способ получения биологически активной генно-терапевтической субстанции для коррекции патологических состояний клеток органов и тканей и/или органов и тканей человека, связанных с оксидативным стрессом, заключающийся в том, что получают кДНК гена GPX1, затем помещают кДНК в векторную плазмиду, способную обеспечить высокий уровень экспрессии этой кДНК в клетках различных органов и тканей человека, наращивают и выделяют необходимое количество генетической конструкции, затем комбинируют генетическую конструкцию с транспортной молекулой для трансфекции полученной биологически активной генно-терапевтической субстанцией клеток органов и тканей и/или введения полученной биологически активной генно-терапевтической субстанции в органы и ткани человека.

Или способ получения биологически активной генно-терапевтической субстанции для коррекции патологических состояний клеток различных органов и тканей человека, связанных с оксидативным стрессом, заключающийся в том, что получают кДНК гена GPX1, модифицируют его по п.п. 3, или 4, или 5 или 6 или 7 или 8, затем помещают модифицированную кДНК в векторную конструкцию, способную обеспечить высокий уровень экспрессии этой кДНК в клетках различных органов и тканей человека, наращивают и выделяют необходимое количество генетической конструкции, затем комбинируют генетическую конструкцию с транспортной молекулой для трансфекции полученной биологически активной генно-терапевтической субстанцией клеток органов и тканей и/или введения полученной биологически активной генно-терапевтической субстанции в органы и ткани человека.

Способ использования каждой из созданных и представленных в линейке биологически активных генно-терапевтических субстанций для коррекции патологических состояний клеток органов и тканей и/или органов и тканей человека, связанных с оксидативным стрессом, заключается в трансфекции созданной биологически активной генно-терапевтической субстанцией, выбранной из линейки с учетом индивидуальных особенностей каждого конкретного пациента на основе предварительного эксперимента по определению наиболее эффективного варианта из созданных и представленных в линейке биологически активных генно-терапевтических субстанций, клеток органов и тканей человека.

Или способ использования каждой из созданных и представленных в линейке биологически активных генно-терапевтических субстанций для коррекции патологических состояний клеток органов и тканей и/или органов и тканей человека, связанных с оксидативным стрессом, заключается во введении одной из созданных биологически активных генно-терапевтической субстанций, выбранной из линейки именно для данного пациента на основе предварительного эксперимента по определению наиболее эффективного варианта из созданных и представленных в линейке биологически активных генно-терапевтических субстанций, в органы и ткани этого пациента, и/или во введении аутологичных клеток пациента, трансфицированных одной из созданных биологически активных генно-терапевтической субстанций, выбранной именно для данного пациента на основе предварительного эксперимента по определению наиболее эффективного варианта из созданных и представленных в линейке биологически активных генно-терапевтических субстанций, в органы и ткани этого пациента.

Перечень фигур

На фиг. 1

Представлена нуклеотидная последовательность немодифицированной кДНК гена GPX1, последовательность которой идентична приводимой в базе даных GenBank под номером М_21304.1 SEQ ID No:1.

На фиг. 2

Представлена нуклеотидная последовательность модифицированной кДНК гена GPX1, SEQ ID No:2, которая

содержит 4 нуклеотидных замены G→C в позициях 80, 95, 191, 461, не приводящие к изменениям в аминокислотной последовательности белка глутатионпероксидазы-1.

На фиг. 3

Представлена нуклеотидная последовательность модифицированной кДНК гена GPX1, SEQ ID No:3, которая

содержит 8 нуклеотидных замен G→C в позициях 80, 95, 98, 104, 191, 395, 401, 461; 2 нуклеотидных замены A→G в позициях 152, 155, не приводящие к изменениям в аминокислотной последовательности белка глутатионпероксидазы-1.

На фиг. 4

Представлена нуклеотидная последовательность модифицированной кДНК гена GPX1, SEQ ID No:4, которая содержит 11 нуклеотидных замен G→C в позициях 62, 65, 80, 95, 98, 104, 191, 395, 401, 461, 497; 2 нуклеотидных замены A→G в позициях 152, 155, не приводящие к изменениям в аминокислотной последовательности белка глутатионпероксидазы-1.

На фиг. 5

Представлена нуклеотидная последовательность модифицированной кДНК гена GPX1, SEQ ID No:5, которая содержит 12 нуклеотидных замен G→C в позициях 62, 65, 80, 95, 98, 104, 173, 191, 395, 401, 461, 497; 3 нуклеотидных замены A→G в позициях 152, 155, 563, не приводящие к изменениям в аминокислотной последовательности белка глутатионпероксидазы-1.

На фиг. 6

Представлена нуклеотидная последовательность модифицированной кДНК гена GPX1, SEQ ID No:6, которая

содержит 14 нуклеотидных замен G→C в позициях 62, 65, 68, 71, 80, 95, 98, 104, 173, 191, 395, 401, 461, 497; 3 нуклеотидных замены A→G в позициях 152, 155, 563, не приводящие к изменениям в аминокислотной последовательности белка глутатионпероксидазы-1.

На фиг. 7

Представлена нуклеотидная последовательность модифицированной кДНК гена GPX1, SEQ ID No:7, которая

не содержит нетранслируемые 5' и 3' области гена и содержит 14 нуклеотидных замен G→C в позициях 62, 65, 68, 71, 80, 95, 98, 104, 173, 191, 395, 401, 461, 497; 3 нуклеотидных замены A→G в позициях 152, 155, 563, не приводящие к изменениям в аминокислотной последовательности белка глутатионпероксидазы-1.

На фиг. 8

С целью последующего корректного определения генно-терапевтического эффекта после трансфекции фибробластов биологически активной генно-терапевтической субстанции с кДНК гена GPX1 проводили анализ эндогенной экспрессии гена GPX1 в культуре первичных фибробластов. На фигуре представлены графики накопления продуктов полимеразной цепной реакции (ПЦР), соответствующих:

1 - кДНК гена GPX1, фибробласты со сниженной экспрессией гена GPX1

2 - кДНК гена GPX1, фибробласты с нормальной экспрессией гена GPX1

3 - кДНК гена В2М, фибробласты со сниженной экспрессией гена GPX1

4 - кДНК гена В2М, фибробласты с нормальной экспрессией гена GPX1

В качестве референтного гена использовали ген В2М (Бета-2-микроглобулин) приведенного в базе данных GenBank под номером NM 004048.2.

На фиг. 9

С целью подтверждения увеличения экспрессии гена GPX1 в клеточной культуре фибробластов со сниженной экспрессией гена GPX1 при трансфекции данных клеток биологически активной генно-терапевтической субстанцией с кДНК гена GPX1 представлены графики накопления ПЦР-продуктов, соответствующих:

1 - кДНК гена GPX1 в фибробластах с нормальной экспрессией гена GPX1,

2 - кДНК гена GPX1 в фибробластах со сниженной экспрессией гена GPX1 до трансфекции БАГТС с кДНК гена GPX1.

3 - кДНК гена GPX1 в фибробластах со сниженной экспрессией гена GPX1 после трансфекции БАГТС с кДНК гена GPX1.

4 - кДНК гена GPX1 в фибробластах со сниженной экспрессией гена GPX1 после трансфекции вектором без кДНК гена GPX1.

5 - кДНК гена В2М в фибробластах с нормальной экспрессией гена GPX1.

6 - кДНК гена В2М в фибробластах со сниженной экспрессией гена GPX1 до трансфекции БАГТС с кДНК гена GPX1.

5 - кДНК гена В2М в фибробластах со сниженной экспрессией гена GPX1 после трансфекции БАГТС с кДНК гена GPX1.

8 - кДНК гена В2М в фибробластах со сниженной экспрессией гена GPX1 после трансфекции вектором без кДНК гена GPX1.

Из графиков следует, что в случае трансфекции вектором без вставки кДНК гена GPX1 уровень кДНК гена GPX1 в фибробластах не изменился, а в случае трансфекции вектором с кДНК GPX1-уровень кДНК фибробластов со сниженной экспрессией гена GPX1 многократно увеличился (до уровня выше, чем уровень кДНК гена GPX1 в нормальных фибробластах).

На фиг. 10

С целью подтверждения увеличения активности белка глутатионпероксидазы-1 в клеточной культуре фибробластов с нормальной экспрессией гена GPX1 при трансфекции данных клеток биологически активной генно-терапевтической субстанцией содержащим кДНК GPX1 представлен график изменения активности белка глутатионпероксидазы-1 в зависимости от разведения клеточного лизата нетрансфицированных фибробластов (культура А), трансфицированных вектором pCDNA 3.1 (+) не содержащим кДНК GPX1 (культура В) и трансфицированных биологически активной генно-терапевтической субстанцией на базе вектора pCDNA 3.1, содержащего GPX1 SEQ ID No:1 (культура С). Из графика следует, что при трансфекции фибробластов биологически активной генно-терапевтической субстанцией с кДНК гена GPX1 происходит увеличение активности глутатионпероксидазы-1 в клеточном лизате.

Обозначения:

культура А

культура В

культура С

На фиг. 11

С целью подтверждения увеличения активности глутатионпероксидазы-1 в коже человека при введении в кожу клеточной культуры фибробластов, трансфицированной биологически активной генно-терапевтической субстанцией представлен анализ изменения активности глутатионпероксидазы-1 в коже пациентов. При этом пациентам вводили три варианта культуры аутологичных фибробластов - нетрансфицированные (А), трансфицированные вектором pCMV6-XL5 (Б) и трансфицированные биологически активной генно-терапевтической субстанцией на базе pCMV6- GPX1 SEQ ID No:7 (С) - в кожу предплечья. Также анализировали активность глутатионпероксидазы-1 в интактной коже. Показано повышение активности глутатионпероксидазы-1 в коже пациента в области введения фибробластов, трансфицированных биологически активной генно-терапевтической субстанцией кДНК гена GPX1. (С)

Обозначения:

культура А

культура В

культура С

контрольная биопсия

На фиг. 12

С целью подтверждения увеличения активности глутатионпероксидазы-1 до различного индивидуального уровня в клеточных культурах фибробластов пациентов при трансфекции данных клеток биологически активными генно-терапевтическими субстанциями с модифицированными и нативной кДНК гена GPX1 в зависимости от наличия и типа в них той или иной модификации кДНК гена GPX1 представлен анализ изменения активности глутатионпероксидазы-1 в культурах фибробластов кожи человека в зависимости от наличия и типа модификаций в кДНК гена GPX1, используемой для трансфекции фибробластов.

Культуры фибробластов 19 пациентов делили на 8 частей каждую с (А) по (Н); первые части (А) клеточных культур пациентов трансфицировали биологически активной генно-терапевтической субстанцией pCMV6-GPX1 SEQ ID No:1, части (В) трансфицировали биологически активной генно-терапевтической субстанцией pCMV6-GPX1 SEQ ID No:2, части (С) трансфицировали биологически активной генно-терапевтической субстанцией pCMV6-GPX1 SEQ ID No:3, части (D) трансфицировали биологически активной генно-терапевтической субстанцией pCMV6-GPX1 SEQ ID No:4, части (Е) трансфицировали биологически активной генно-терапевтической субстанцией pCMV6-GPX1 SEQ ID No:5, части (F) трансфицировали биологически активной генно-терапевтической субстанцией pCMV6-GPX1 SEQ ID No:6, части (G) трансфицировали биологически активной генно-терапевтической субстанцией pCMV6-GPX1 SEQ ID No:7, части (Н) трансфицировали векторной плазмидой, не содержащей кДНК гена GPX1.

По итогам анализа уровня активности глутатионпероксидазы-1 выбрали показатели, касательно каждой части клеточной культуры от каждого пациента, продемонстрировавшие максимальные уровни активности глутатионпероксидазы-1 и объединили их в семь групп, исходя из следующего критерия:

В группе 1 максимальная активность глутатионпероксидазы-1 наблюдалась при трансфекции pCMV6-GPX1 SEQ ID No:1,

в группе 2 максимальная активность глутатионпероксидазы-1 наблюдалась при трансфекции pCMV6-GPX1 SEQ ID No:2,

в группе 3 максимальная активность глутатионпероксидазы-1 наблюдалась при трансфекции pCMV6-GPX1 SEQ ID No:3,

в группе 4 максимальная активность глутатионпероксидазы-1 наблюдалась при трансфекции pCMV6-GPX1 SEQ ID No:4,

в группе 5 максимальная активность глутатионпероксидазы-1 наблюдалась при трансфекции pCMV6-GPX1 SEQ ID No:5,

в группе 6 максимальная активность глутатионпероксидазы-1 наблюдалась при трансфекции pCMV6-GPX1 SEQ ID No:6,

в группе 7 максимальная активность глутатионпероксидазы-1 наблюдалась при трансфекции pCMV6-GPX1 SEQ ID No:7.

Ни в одной из клеточных культур не наблюдалось того, что максимальная активность глутатионпероксидазы-1 присутствует при трансфекции вектором без вставки кДНК гена GPX1.

На фигуре 12 для каждой группы клеточных культур приведены диаграммы показателей ингибирования цветной реакции (усредненных в рамках группы, в случае, если в группу входит более одной клеточной культуры) применительно ко всем, участвующим в эксперименте активным генно-терапевтическим субстанциям, после трансфекции этих клеточных культур активными генно-терапевтическими субстанциями, содержащими модифицированные и нативную кДНК гена GPX1

Из фигуры следует, что достижение максимальной активности глутатионпероксидазы-1 в культурах фибробластов кожи различных пациентов при их трансфекции биологически активными генно-терапевтическими субстанциями, связано с индивидуальными особенностями пациентов и зависит от наличия и типа модификаций в кДНК гена GPX1, входящих в биологически активные генно-терапевтические субстанции.

Каждая биологически активная генно-терапевтическая субстанция из линейки биологически активных генно-терапевтических субстанций является эффективной в некоторой значительной группе пациентов. Следовательно для выбора наиболее эффективной биологически активной генно-терапевтической субстанции из линейки биологически активных генно-терапевтических субстанций для терапевтических целей необходимо предварительное персонализированное исследование пациента.

Обозначения:

части клеточных культур, трансфицированных БАГТС GPX1 SEQ ID No:1 (A)

части клеточных культур, трансфицированных БАГТС GPX1 SEQ ID No:2 (В)

части клеточных культур, трансфицированных БАГТС GPX1 SEQ ID No:3 (С)

части клеточных культур, трансфицированных БАГТС GPX1 SEQ ID No:4 (D)

части клеточных культур, трансфицированных БАГТС GPX1 SEQ ID No:5 (E)

части клеточных культур, трансфицированных БАГТС GPX1 SEQ ID No:6 (F)

части клеточных культур, трансфицированных БАГТС GPX1 SEQ ID No:7 (G)

части клеточных культур, трансфицированных плацебо (Н)

На фиг. 13

С целью подтверждения увеличения экспрессии гена GPX1 в клеточной культуре кератоцитов и эпителиальных клеток глаза при трансфекции данных клеток биологически активной генно-терапевтической субстанцией с кДНК гена GPX1 приведены графики накопления ПЦР-продуктов, соответствующих:

1 - кДНК гена GPX1, кератоциты до трансфекции

2 - кДНК гена GPX1, эпителий роговицы до трансфекции

3 - кДНК гена GPX1, кератоциты после трансфекции

4 - кДНК гена GPX1, эпителий роговицы после трансфекции

5 - кДНК гена В2М, кератоциты до трансфекции

6 - кДНК гена В2М, эпителий роговицы до трансфекции

7 - кДНК гена В2М, кератоциты после трансфекции

6 - кДНК гена В2М, эпителий роговицы после трансфекции

Ген В2М использовали в качестве референтного.

Из фигуры следует, что в результате трансфекции уровень специфической кДНК гена GPX1 в культуре кератоцитов и в культуре эпителия многократно вырос.

На фиг. 14

С целью подтверждения увеличения экспрессии гена GPX1 в клеточной культуре хондробластов при трансфекции данных клеток биологически активной генно-терапевтической субстанцией с кДНК гена GPX1 приведены графики накопления ПЦР-продуктов, соответствующих:

1 - кДНК гена GPX1, до трансфекции

2 - кДНК гена GPX1, после трансфекции

3 - кДНК гена В2М, до трансфекции

4 - кДНК гена В2М, после трансфекции

Ген В2М использовали в качестве референтного.

Из фигуры следует, что в результате трансфекции уровень специфической кДНК гена GPX1 вырос многократно.

На фиг. 15

С целью подтверждения увеличения активности глутатионпероксидазы-1 в коже человека при введении в кожу биологически активной генно-терапевтической субстанции представлен анализ изменения активности глутатионпероксидазы-1 в коже. При этом пациенту вводили биологически активную генно-терапевтическую субстанцию, содержащую векторную плазмиду с кДНК гена GPX1 pCMV6-GPX1 SEQ ID No:4 (В) и параллельно вводили плацебо, представляющее собой комбинацию векторной плазмиды pCMV-XL5 не содержащей кДНК гена GPX1 с транспортной молекулой (А) - в кожу предплечья. Показано увеличение активности глутатионпероксидазы-1 в биоптате кожи пациента 1В, которому вводились биологически активная генно-терапевтическая субстанция, содержащая генетическую конструкцию с кДНК гена GPX1, что говорит об эффективности биологически активной генно-терапевтической субстанции.

Обозначения:

пациент 1А

пациент 1В

пациент 1В до введения БАГТС

На фиг. 16

С целью подтверждения увеличения активности глутатионпероксидазы-1 в слизистой оболочке рта человека при введении в слизистую оболочку рта биологически активной генно-терапевтической субстанции представлен анализ изменения активности глутатионпероксидазы-1 в слизистой оболочке рта. При этом пациенту вводили биологически активную генно-терапевтическую субстанцию, содержащую векторную плазмиду с кДНК гена GPX1 pCDNA 3.1 GPX1 SEQ ID No:5 (В) и параллельно вводили плацебо pCDNA 3.1(+), представляющее собой комбинацию векторной плазмиды не содержащей кДНК гена GPX1 с транспортной молекулой (А) - в слизистую оболочку рта.

Показано увеличение активности глутатионпероксидазы-1 в лизате биоптата слизистой оболочки рта пациента 1В, которому вводились биологически активная генно-терапевтическая субстанция, содержащая генетическую конструкцию с кДНК гена GPX1, что говорит об эффективности биологически активной генно-терапевтической субстанции.

Обозначения:

пациент 1А

пациент 1В

пациент 1В до введения БАГТС

На фиг. 17

С целью подтверждения увеличения активности глутатионпероксидазы-1 в мышечной ткани человека при введении в мышечную ткань биологически активной генно-терапевтической субстанции представлен анализ изменения активности глутатионпероксидазы-1 в мышечной ткани. При этом пациенту вводили биологически активную генно-терапевтическую субстанцию, содержащую векторную плазмиду с кДНК гена GPX1 - pCMV6-Kan/Neo GPX1 SEQ ID No:6 (В) и параллельно вводили плацебо pCMV6-Kan/Neo, представляющее собой комбинацию векторной плазмиды не содержащей кДНК гена GPX1 с транспортной молекулой (А) - в мышечную ткань в зоне предплечья. Показано увеличение активности глутатионпероксидазы-1 в биоптате мышечной ткани пациента 1В, которому вводились биологически активная генно-терапевтическая субстанция, содержащая генетическую конструкцию с кДНК гена GPX1, что говорит об эффективности биологически активной генно-терапевтической субстанции.

Обозначения:

пациент 1А

пациент 1В

пациент 1В до введения БАГТС

На фиг. 18

С целью подтверждения увеличения активности глутатионпероксидазы-1 до различного индивидуального уровня при введении в кожу пациентов биологически активных генно-терапевтических субстанций с модифицированными и нативной кДНК гена GPX1 анализировали уровень активности глутатионпероксидазы-1 в коже человека в зависимости от наличия и типа модификаций в кДНК гена GPX1.

Каждому из 16-ти пациентов, отобранных в случайном порядке, вводили в кожу предплечья 7 биологически активных генно-терапевтических субстанций pCMV6- SEQ ID No:1, pCMV6- SEQ ID No:2, pCMV6- SEQ ID No:3, pCMV6- SEQ ID No:4, pCMV6- SEQ ID No:5, pCMV6- SEQ ID No:6, pCMV6- SEQ ID No:7, и плацебо pCMV6- XL5.

По итогам анализа уровня активности глутатионпероксидазы-1 в биоптатах выбрали показатели, касательно каждого биоптата от каждого пациента, продемонстрировавшие максимальные уровни активности глутатионпероксидазы-1 и объединили их в семь групп, исходя из следующего критерия:

В группе 1 максимальная активность глутатионпероксидазы-1 наблюдалась при введении pCMV6-GPX1 SEQ ID No:1.

В группе 2 максимальная активность глутатионпероксидазы-1 наблюдалась при введении pCMV6-GPX1 SEQ ID No:2.

В группе 3 максимальная активность глутатионпероксидазы-1 наблюдалась при введении pCMV6-GPX1 SEQ ID No:3.

В группе 4 максимальная активность глутатионпероксидазы-1 наблюдалась при введении pCMV6-GPX1 SEQ ID No:4.

В группе 5 максимальная активность глутатионпероксидазы-1 наблюдалась при введении pCMV6-GPX1 SEQ ID No:5.

В группе 6 максимальная активность глутатионпероксидазы-1 наблюдалась при введении pCMV6-GPX1 SEQ ID No:6.

В группе 7 максимальная активность глутатионпероксидазы-1 наблюдалась при введении pCMV6-GPX1 SEQ ID No:7.

Ни в одном из биоптатов не наблюдалось того, что максимальная активность глутатионпероксидазы-1 присутствует в случае введения плацебо.

На фигуре 18 для каждой группы биоптатов приведены диаграммы показателей ингибирования цветной реакции (усредненных в рамках группы, в случае, если в группу входит более одного биоптата) применительно ко всем, участвующим в эксперименте активным генно-терапевтическим субстанциям, после введения пациентам этих активных генно-терапевтических субстанций, содержащих модифицированные и нативную кДНК гена GPX1.

Из данного примера следует, что достижение максимальной активности глутатионпероксидазы-1 в биоптатах кожи различных пациентов при введении им в кожу биологически активных генно-терапевтических субстанций, связано с индивидуальными особенностями пациентов и зависит от наличия и типа модификаций в кДНК гена GPX1, входящих в биологически активные генно-терапевтические субстанции.

Каждая биологически активная генно-терапевтическая субстанция из линейки биологически активных генно-терапевтических субстанций является эффективной в некоторой значительной группе пациентов. Следовательно, для выбора наиболее эффективной биологически активной генно-терапевтической субстанции из линейки биологически активных генно-терапевтических субстанций для терапевтических целей, необходимо предварительное персонализированное исследование пациента.

Обозначения:

биопаты пациентов после введения БАГТС GPX1 SEQ ID No:1 (A)

биопаты пациентов после введения БАГТС GPX1 SEQ ID No:2 (В)

биопаты пациентов после введения БАГТС GPX1 SEQ ID No:3 (С)

биопаты пациентов после введения БАГТС GPX1 SEQ ID No:4 (D)

биопаты пациентов после введения БАГТС GPX1 SEQ ID No:5 (E)

биопаты пациентов после введения