Лечение воспалительных, аутоиммунных и нейродегенеративных нарушений иммуннодепрессивными полипетидами, являющимися производными тат

Лечение воспалительных, аутоиммунных и нейродегенеративных нарушений иммуннодепрессивными полипетидами, являющимися производными тат

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

По настоящей заявке испрашивается приоритет предварительных патентных заявок США 61/734135, поданной 6 декабря 2012 года, и 61/881266, поданной 23 сентября 2013 года, содержание обеих из которых включено в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме.

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящая заявка относится к иммунодепрессивным полипептидам, являющимся производным трансактиватора (Tat) вируса иммунодефицита человека (ВИЧ), для лечения заболеваний, характеризующихся аберрантными иммунными ответами, таких как нейродегенеративные и аутоиммунные заболевания и обусловленные воспалением заболевания.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Трансактиватор транскрипции (Tat) вируса иммунодефицита человека (HIV) опосредует по меньшей мере два независимых вида активности: опосредуемое рецептором инициирующее событие на клеточной поверхности и внутриклеточная активность транс-активации, которая контролирует дифференцировку антигенпредставляющих клеток (APC). Опосредуемое рецептором инициирующее событие, обусловленное Tat, является специфичным к APC, побуждая их к активации и дифференцировке в высоко иммунодепрессивные макрофаги, регулирующие антигенпредставляющие клетки, (AReg) или в дендритные клетки (DC), которые стимулируют специфические цитотоксические T-лимфоциты.

Антигенпредставляющие клетки, макрофаги и дендритные клетки являются критическими в патогенезе или ответе на различные заболевания, нарушения и нежелательные иммунные ответы. Tat запускает дифференцировку моноцитов в антигенпредставляющие макрофаги, экспрессирующие молекулы, которые специфически подавляют иммунный ответ на представляемый антиген(-ы). При аутоиммунных заболеваниях определенные собственные эндогенные молекулы организма неправильно распознаются как чужеродные, что приводит к чрезмерному воспалению и повреждению ткани. В одном примере деградация коллагена типа II на иммуногенные пептиды может запускать ревматоидный артрит (RA) у животных, и она ассоциирована с RA человека. Существенное исследование было сосредоточено на уменьшении иммунного ответа на эти белки. Индуцируемое антигенспецифическими макрофагами подавление, свойственное Tat, можно использовать для уменьшения нежелательного иммунного ответа на чужеродные и эндогенные молекулы, ассоциированные с воспалением и нейродегенерацией.

Попытки лечить воспаление и аутоиммунные нарушения имеют ограниченный успех. Это частично является следствием того факта, что этиология воспалительных и аутоиммунных нарушений состоит в комплексном ответе, основанном, частично, на различных индуцирующих воспаление молекулах и множестве опосредующих воспаление и сенсибилизирующих к воспалению молекул, которые, по-видимому, индуцируют воспаление через дублирующие механизмы. Таким образом, соединения, композиции и способы, которые могут лечить воспаление, нейродегенеративное заболевание или аутоиммунное нарушение, являются высокожелательными.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В настоящем описании описаны соединения, композиции и способы лечения индивидуума, страдающего заболеваниями, ассоциированными с аберрантными иммунными ответами, такими как нейродегенеративные или аутоиммунные нарушения или ассоциированные с воспалением заболевания. Это осуществляется путем введения терапевтически эффективного количества иммунодепрессивного полипептида, являющегося производным Tat, или композиции, содержащей такие полипептиды, индивидууму, страдающему заболеванием. Как описано в настоящем описании, описанные иммунодепрессивные полипептиды, являющиеся производными Tat, продемонстрировали иммунодепрессивную активность.

В настоящем описании описаны иммунодепрессивные полипептиды, являющиеся производными трансактиватора транскрипции (Tat), имеющие аминокислотную последовательность, содержащую следующие домены в указанном порядке: домен фактора транскрипции (TF), содержащий последовательность из иммунодепрессивного вируса иммунодефицита человека (ВИЧ), Tat-белок SIV, последовательность hairless или искусственная иммунодепрессивная последовательность; цистеин-богатая область из лентивирусного Tat или молекулы дефензина; и C-концевая область из лентивирусного Tat-белка.

В другом варианте осуществления иммунодепрессивный полипептид, являющийся производным Tat, дополнительно содержит аргинин-богатый домен из лентивирусного белка Tat. В другом варианте осуществления домен TF дополнительно содержит последовательность повтора, содержащую (PVDPRLEPWKHPGSQP)_n на N-конце, где n=2-10. В другом варианте осуществления по меньшей мере одна из аминокислот в TF-домене модифицирована консервативной аминокислотной заменой.

В другом варианте осуществления иммунодепрессивного полипептида, являющегося производным Tat, ВИЧ представляет собой ВИЧ-1 или ВИЧ-2. В другом варианте осуществления лентивирусный Tat происходит из ВИЧ-1, ВИЧ-2, SIV, FIV, BIV или EIAV.

В другом варианте осуществления иммунодепрессивного полипептида, являющегося производным Tat, домен TF имеет аминокислотную последовательность согласно одной из SEQ ID NO: 36, 39, 44, 48, 50, 54, 59, 60 или 61. В другом варианте осуществления цистеин-богатый домен имеет аминокислотную последовательность согласно одной из SEQ ID NO: 37, 40, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 58, 62, 63, 64 или 70. В другом варианте осуществления C-концевой домен содержит аминокислотную последовательность согласно одной из SEQ ID NO: 38, 42, 46, 47, 49, 52, 53, 68 или 71. В другом варианте осуществления как цистеин-богатая область, так и C-концевая область, происходят из одного и того же источника, и аминокислотная последовательность объединенной цистеин-богатой и C-концевой области представляет собой одну из SEQ ID NO: 47, 49 или 53. В другом варианте осуществления иммунодепрессивный полипептид, являющийся производным Tat, имеет более чем 85% идентичность последовательности, более чем 90% идентичность последовательности или более чем 95% идентичность последовательности с одной из SEQ ID NO: 9-11, 13-35 или 69.

Также в настоящем описании описана фармацевтическая композиция, содержащая один или несколько из иммунодепрессивных полипептидов, являющихся производными Tat, и фармацевтически приемлемый эксципиент. В другом варианте осуществления иммунодепрессивный полипептид, являющийся производным Tat, обладает более чем 85% идентичностью последовательности с одной или несколькими из SEQ ID NO: 9-11, 13-35 или 69.

Кроме того, в настоящем описании описан способ лечения заболевания, характеризующегося аберрантным иммунным ответом, причем способ включает: введение терапевтически эффективного количества одного или нескольких иммунодепрессивных полипептидов, являющихся производными Tat, индивидууму, нуждающемуся в этом; и тем самым лечение заболевание путем подавления иммунной системы.

Кроме того, в настоящем описании описан способ увеличения экспрессии Fas-лиганда (FasL) на макрофагах, регулирующих антигенпредставляющие клетки (AReg), причем способ включает: введение терапевтически эффективного количества одного или нескольких иммунодепрессивных полипептидов, являющихся производными Tat, индивидууму; и тем самым повышение экспрессии FasL на AReg.

Кроме того, в настоящем описании описан способ уменьшения воспаления, причем способ включает: введение терапевтически эффективного количества одного или нескольких иммунодепрессивных полипептидов, являющихся производными Tat, индивидууму, нуждающемуся в этом, и тем самым уменьшение воспаления у индивидуума.

В одном варианте осуществления способов, описанных в настоящем описании, иммунодепрессивный полипептид, являющийся производным Tat, имеет более чем 85% идентичность последовательности с одной из SEQ ID NO: 9-11, 13-35 или 69.

В другом варианте осуществления способов, лечение повышает экспрессию Fas-лиганда на макрофагах, регулирующих антигенпредставляющие клетки (AReg). В другом варианте осуществления AReg представляют собой CD14+ макрофаги.

В другом варианте осуществления способов заболевание представляет собой аутоиммунное, нейродегенеративное или ассоциированное с воспалением нарушение. В одном варианте осуществления аутоиммунное нарушение представляет собой острый диссеминированный энцефаломиелит (ADEM), болезнь Аддисона, аллергию, аллергический ринит, болезнь Альцгеймера, синдром антифосфолипидных антител (APS), артрит, астму, синдром аутоиммунного дефицита, аутоиммунную гемолитическую анемию, аутоиммунный гепатит, аутоиммунное заболевание внутреннего уха, буллезный пемфигоид, глютеновую болезнь, болезнь Шагаса, хроническое обструктивное заболевание легких (COPD), сахарный диабет 1 типа (IDDM), экзему, эндометриоз, желудочно-кишечное нарушение, синдром Гудпасчера, болезнь Грэйвса, синдром Гийена-Барре (GBS), тиреоидит Хашимото, гнойный гидраденит, идиопатическую тромбоцитопеническую пурпуру, воспалительное заболевание кишечника, воспалительное дерматологическое заболевание, интерстициальный цистит, волчанку, очаговую склеродермию, рассеянный склероз (MS), миастению гравис, миопатию, нарколепсию, нейромиотонию, пемфигус обыкновенный, пернициозную анемию, первичный билиарный цирроз, псориаз, рекуррентный диссеминированный энцефаломиелит, ревматическую атаку, шизофрению, склеродермию, синдром Шегрена, нарушение кожи, теносиновит, увеит, васкулит или витилиго. В другом варианте осуществления заболевание, ассоциированное с воспалением, представляет собой угревую сыпь, кислотный рефлюкс/изжогу, аллергию, аллергический ринит, болезнь Альцгеймера, аппендицит, артериит, артрит, астму, атеросклероз, аутоиммунное нарушение, баланит, блефарит, бронхиолит, бронхит, бурсит, рак, кардит, глютеновую болезнь, целлюлит, цервицит, холангит, холецистит, хориоамнионит, хроническое обструктивное заболевание легких (COPD), цирроз, колит, конъюнктивит, цистит, вирусную инфекцию верхних дыхательных путей, дакриоаденит, деменцию, дерматит, дерматомиозит, экзему, эмфизему, энцефалит, эндокардит, эндометрит, энтерит, энтероколит, эпикондилит, эпидидимит, фасциит, фиброзит, гастрит, гастроэнтерит, гингивит, гломерулонефрит, глоссит, заболевание сердца, гепатит, гнойный гидраденит, высокое кровяное давление, илеит, резистентность к инсулину, интерстициальный цистит, ирит, ишемическую болезнь сердца, кератит, кератоконъюнктивит, ларингит, волчанку, мастит, мастоидит, менингит, метаболический синдром (синдром X), мигрень, рассеянный склероз, миелит, миокардит, миопатию, миозит, нефрит, невропатию, ожирение, омфалит, оофорит, орхит, остеохондрит, остеопению, остеопороз, остеит, отит, панкреатит, болезнь Паркинсона, паротит, воспалительное заболевание таза, перикардит, перитонит, фарингит, флебит, плеврит, пневмонит, проктит, простатит, псориаз, пульпит, пиелонефрит, пилефлебит, ревматическую атаку, ринит, сальпингит, сиаладенит, синусит, спастический толстый кишечник, стоматит, синовит, тендинит, тендиноз, теносиновит, тромбофлебит, тонзиллит, тригонит, опухоль, уретрит, увеит, вагинит, васкулит или вульвит. В другом варианте осуществления нейродегенеративное заболевание представляет собой болезнь Александера, болезнь Альперса, болезнь Альцгеймера, амилоидоз, боковой амиотрофический склероз, тревожность, атаксию-телеангиэктазию, дефицит внимания, болезнь Канавана, травмы центральной нервной системы, болезнь Шарко-Мари-Тута, синдром Кокейна, кортикобазальную дегенерацию, болезнь Крейтцфельда-Якоба, депрессию, энцефалит (например, бактериальный, паразитарный, грибковый или вирусный), атаксию Фридрейха, лобно-височную деменцию, наследственный спастический парапарез, синдром Гийена-Барре (и его варианты: острая невропатия аксонов двигательных нервов, острая воспалительная демиелинизирущая полиневропатия и синдром Фишера), ВИЧ/СПИД-дементный комплекс, болезнь Гентингтона, ишемическое повреждение нервной системы, болезнь Кеннеди, болезнь Краббе, деменцию с тельцами Леви, болезнь Мачадо-Джозефа, менингит (например, бактериальный, паразитарный, грибковый или вирусный), рассеянный склероз, множественную системную атрофию, повреждение нервной системы, например, сотрясение головного мозга, травму спинного мозга и травматическое повреждение нервной системы, невропатию, например, такую как индуцированная химиотерапией невропатия, ассоциированная с диабетом невропатия и периферическая невропатия, болезнь Паркинсона, болезнь Пелицеуса-Мерцбахера, болезнь Пика, первичный латеральный склероз, прионные нарушения, прогрессирующий надъядерный паралич, болезнь Рефсума, болезнь Сандхоффа, шизофрению, болезнь Шильдера, спиномозжечковую атрофию, болезнь Стила-Ричардсона-Ольшевского, инсульт, сухотку спинного мозга или сосудистую деменцию.

В другом варианте осуществления способов введение, кроме того, вызывает уменьшение по меньшей мере одного симптома, ассоциированного с аутоиммунным заболеванием, нейродегенеративным заболеванием или заболеванием, ассоциированным с воспалением, и симптомом которого является воспаление, усталость, головокружение, беспокойство, лихорадка и высокая температура тела, чрезмерная чувствительность к холоду в руках и ступнях, слабость и скованность мышц и суставов, изменение массы тела, пищеварительные и желудочно-кишечные проблемы, низкое или высокое кровяное давление, раздражимость, тревожность или депрессия, бесплодие или снижение полового влечения (низкое либидо), изменения уровня сахара в крови и, в зависимости от типа аутоиммунного заболевания, увеличение размера органа или ткани или разрушение органа или ткани.

В другом варианте осуществления способов, индивидуум не имеет иммунодефицита. В другом варианте осуществления иммунная система индивидуума становится дефицитной в результате введения. В другом варианте осуществления в результате введения секреция цитокинов из AReg снижается.

В другом варианте осуществления способов, иммунодепрессивный полипептид, являющийся производным Tat, вводят многократными дозами. В другом варианте осуществления иммунодепрессивный полипептид, являющийся производным Tat, вводят раз в сутки, раз в неделю, раз в две недели, раз в месяц или раз в два месяца. В другом варианте осуществления стадия введения включает повторяющиеся курсы введения, где каждый курс включает введение множества доз иммунодепрессивного полипептида, являющегося производным Tat, в определенный период времени, за которым следует период покоя, и где курс повторяют множество раз.

Также в настоящем описании описано применение одного или нескольких иммунодепрессивных полипептидов, являющихся производными Tat, для получения лекарственного средства для лечения заболевания, характеризующегося аберрантным иммунным ответом, у индивидуума, нуждающегося в этом; где один или несколько иммунодепрессивных полипептидов, являющихся производными Tat, по меньшей мере на 85% идентичны иммунодепрессивному полипептиду, являющемуся производным Tat, по п.1, и где введение иммунодепрессивного полипептида, являющегося производным Tat, обеспечивает лечение заболевания путем подавления иммунной системы у индивидуума.

Кроме того, в настоящем описании описано применение одного или нескольких иммунодепрессивных полипептидов, являющихся производными Tat, для получения лекарственного средства для увеличения экспрессии Fas-лиганда (FasL) на макрофагах, регулирующих антигенпредставляющие клетки, (AReg) у индивидуума, где один или несколько иммунодепрессивных полипептидов, являющихся производными Tat, по меньшей мере на 85% идентичны иммунодепрессивному полипептиду, являющемуся производным Tat, по п.1, где введение иммунодепрессивных полипептидов, являющихся производными Tat, увеличивает экспрессию FasL на AReg.

Кроме того, в настоящем описании описано применение одного или нескольких иммунодепрессивных пептидов, являющихся производными Tat, для получения лекарственного средства для уменьшения воспаления у индивидуума, где один или несколько иммунодепрессивных полипептидов, являющихся производными Tat, по меньшей мере на 85% идентичны иммунодепрессивному полипептиду, являющемуся производным Tat, по п.1, и где введение иммунодепрессивных полипептидов, являющихся производными Tat, уменьшает воспаление у индивидуума.

В другом варианте осуществления применения лечение увеличивает экспрессию Fas-лиганда на макрофагах, регулирующих антигенпредставляющие клетки (AReg). В другом варианте осуществления AReg представляют собой CD14+ макрофаги. В другом варианте осуществления секреция цитокинов из AReg снижается. В другом варианте осуществления у индивидуума отсутствует иммунодефицит. В другом варианте осуществления иммунная система индивидуума не становится дефицитной в результате введения.

В другом варианте осуществления применения иммунодепрессивный полипептид, являющийся производным Tat, обладает более чем 85% идентичностью последовательности с одной из SEQ ID NO: 9-11, 13-35 или 69.

В другом варианте осуществления применения заболевание представляет собой аутоиммунное, нейродегенеративное или ассоциированное с воспалением нарушение. В другом варианте осуществления аутоиммунное нарушение представляет собой острый диссеминированный энцефаломиелит (ADEM), болезнь Аддисона, аллергию, аллергический ринит, болезнь Альцгеймера, синдром антифосфолипидных антител (APS), артрит, астму, синдром аутоиммунного дефицита, аутоиммунную гемолитическую анемию, аутоиммунный гепатит, аутоиммунное заболевание внутреннего уха, буллезный пемфигоид, глютеновую болезнь, болезнь Шагаса, хроническое обструктивное заболевание легких (COPD), сахарный диабет 1 типа (IDDM), экзему, эндометриоз, желудочно-кишечное нарушение, синдром Гудпасчера, болезнь Грэйвса, синдром Гийена-Барре (GBS), тиреоидит Хашимото, гнойный гидраденит, идиопатическую тромбоцитопеническую пурпуру, воспалительное заболевание кишечника, воспалительное дерматологическое заболевание, интерстициальный цистит, волчанку, очаговую склеродермию, рассеянный склероз (MS), миастению гравис, миопатию, нарколепсию, нейромиотонию, пемфигус обыкновенный, пернициозную анемию, первичный билиарный цирроз, псориаз, рекуррентный диссеминированный энцефаломиелит, ревматическую атаку, шизофрению, склеродермию, синдром Шегрена, нарушение кожи, теносиновит, увеит, васкулит или витилиго. В другом варианте осуществления заболевание, ассоциированное с воспалением, представляет собой угревую сыпь, кислотный рефлюкс/изжогу, аллергию, аллергический ринит, болезнь Альцгеймера, аппендицит, артериит, артрит, астму, атеросклероз, аутоиммунное нарушение, баланит, блефарит, бронхиолит, бронхит, бурсит, рак, кардит, глютеновую болезнь, целлюлит, цервицит, холангит, холецистит, хориоамнионит, хроническое обструктивное заболевание легких (COPD), цирроз, колит, конъюнктивит, цистит, вирусную инфекцию верхних дыхательных путей, дакриоаденит, деменцию, дерматит, дерматомиозит, экзему, эмфизему, энцефалит, эндокардит, эндометрит, энтерит, энтероколит, эпикондилит, эпидидимит, фасциит, фиброзит, гастрит, гастроэнтерит, гингивит, гломерулонефрит, глоссит, заболевание сердца, гепатит, гнойный гидраденит, высокое кровяное давление, илеит, резистентность к инсулину, интерстициальный цистит, ирит, ишемическую болезнь сердца, кератит, кератоконъюнктивит, ларингит, волчанку, мастит, мастоидит, менингит, метаболический синдром (синдром X), мигрень, рассеянный склероз, миелит, миокардит, миопатию, миозит, нефрит, невропатию, ожирение, омфалит, оофорит, орхит, остеохондрит, остеопению, остеопороз, остеит, отит, панкреатит, болезнь Паркинсона, паротит, воспалительное заболевание таза, перикардит, перитонит, фарингит, флебит, плеврит, пневмонит, проктит, простатит, псориаз, пульпит, пиелонефрит, пилефлебит, ревматическую атаку, ринит, сальпингит, сиаладенит, синусит, спастический толстый кишечник, стоматит, синовит, тендинит, тендиноз, теносиновит, тромбофлебит, тонзиллит, тригонит, опухоль, уретрит, увеит, вагинит, васкулит или вульвит. В другом варианте осуществления, нейродегенеративное заболевание представляет собой болезнь Александера, болезнь Альперса, болезнь Альцгеймера, амилоидоз, боковой амиотрофический склероз, тревожность, атаксию-телеангиэктазию, дефицит внимания, болезнь Канавана, травмы центральной нервной системы, болезнь Шарко-Мари-Тута, синдром Кокейна, кортикобазальную дегенерацию, болезнь Крейтцфельда-Якоба, депрессию, энцефалит (например, бактериальный, паразитарный, грибковый или вирусный), атаксию Фридрейха, лобно-височную деменцию, наследственный спастический парапарез, синдром Гийена-Барре (и его варианты: острая невропатия аксонов двигательных нервов, острая воспалительная демиелинизирущая полиневропатия и синдром Фишера), ВИЧ/СПИД-дементный комплекс, болезнь Гентингтона, ишемическое повреждение нервной системы, болезнь Кеннеди, болезнь Краббе, деменцию с тельцами Леви, болезнь Мачадо-Джозефа, менингит (например, бактериальный, паразитарный, грибковый или вирусный), рассеянный склероз, множественную системную атрофию, повреждение нервной системы, например, сотрясение головного мозга, травму спинного мозга и травматическое повреждение нервной системы, невропатию, например, такую как индуцированная химиотерапией невропатия, ассоциированная с диабетом невропатия и периферическая невропатия, болезнь Паркинсона, болезнь Пелицеуса-Мерцбахера, болезнь Пика, первичный латеральный склероз, прионные нарушения, прогрессирующий надъядерный паралич, болезнь Рефсума, болезнь Сандхоффа, шизофрению, болезнь Шильдера, спиномозжечковую атрофию, болезнь Стила-Ричардсона-Ольшевского, инсульт, сухотку спинного мозга или сосудистую деменцию.

В другом варианте осуществления применение иммунодепрессивного полипептида, являющегося производным Tat, кроме того, вызывает уменьшение по меньшей мере одного симптома, ассоциированного с аутоиммунным заболеванием, нейродегенеративным заболеванием или заболеванием, ассоциированным с воспалением, и симптомом которого является воспаление, усталость, головокружение, беспокойство, лихорадка и высокая температура тела, чрезмерная чувствительность к холоду в руках и ступнях, слабость и скованность мышц и суставов, изменение массы тела, пищеварительные и желудочно-кишечные проблемы, низкое или высокое кровяное давление, раздражимость, тревожность или депрессия, бесплодие или снижение полового влечения (низкое либидо), изменения уровня сахара в крови и, в зависимости от типа аутоиммунного заболевания, увеличение размера органа или ткани или разрушение органа или ткани.

В другом варианте осуществления применения иммунодепрессивный полипептид, являющийся производным Tat, вводят многократными дозами. В другом варианте осуществления иммунодепрессивный полипептид, являющийся производным Tat, вводят раз в сутки, раз в неделю, раз в две недели, раз в месяц или раз в два месяца. В другом варианте осуществления стадия введения включает повторяющиеся курсы введения, где каждый курс включает введение множества доз иммунодепрессивного полипептида, являющегося производным Tat, в определенный период времени, за которым следует период покоя, и где курс повторяют множество раз.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

На фиг.1 представлен анализ с помощью активируемого флуоресценцией клеточного сортера (FACS) результатов активации моноцитов посредством Tat. Моноциты периферической крови человека коммитировали на дифференцировку в дендритные клетки (DC) путем культивирования в течение пяти суток с GM-CSF и IL-4. Коммитированные DC культивировали в течение ночи либо в среде отдельно (контроль), либо с липополисахаридом (LPS), либо с Tat, после чего их окрашивали антителом против CD86 и анализировали с помощью FACScan в отношении индукции (левая панель) или генерализованной активации (правая панель, увеличение в рамке R2, показанное для Tat-стимулированных клеток) по CD86, специфическому маркеру активации DC.

На фиг.2 представлено усиление антигенспецифической активации цитотоксических T-лимфоцитов (CTL) комплексами Tat*-антиген (Ag). Активность CTL количественно определяли в качестве числа секретирующих γ-интерферон образующих пятна колоний (SFC)/10⁶ посеянных клеток с использованием анализа ELISPOT.

На фиг.3 представлена средняя флуоресценция моноцитов, культивированных в течение шести суток, либо без стимула (0), либо с фактором некроза опухоли альфа (TNF-α), либо с LPS, либо со снижающимися концентрациями C-Tat (общепринятый нативный иммунодепрессивный Tat из ВИЧ), либо с окисленным C-Tat (ox-C-Tat) и окрашенных моноклональным антителом (Mab) против Fas-лиганда (FasL), а затем флуоресцеинированным поликлональным антителом козы против антител мыши.

На фиг.4A-B представлен титр антител к иммуногенному антигену в присутствии иммунодепрессивного Tat (PT) или неиммунодепрессивного ox-Tat* (Ag) через две недели (фиг.4A) или шесть недель (фиг.4B).

На фиг.5 представлен FACS-анализ перитонеальных макрофагов мыши, которые были выделены либо после стимуляции тиогликолятом in vivo (стимулированные + адъювант), либо без стимуляции in vivo (покоящиеся). Перитонеальные макрофаги мыши культивировали в течение пяти суток в отсутствие дополнительной стимуляции (C), с LPS или с Tat. Активацию определяли в качестве процента увеличенных клеток (фракция M1).

На фиг.6 представлено стабильное подавление стимулированных антигеном T-лимфоцитов комплексами Tat-Ag через две недели после иммунизации иммунодепрессивным Tat.

На фиг.7 представлена антигенная специфичность подавления Tat. Мышей иммунизировали на 0 сутки и подвергали вспомогательной иммунизации на 7 сутки адъювантной эмульсией, содержащей либо Tat (Ag+Tat), либо Ag отдельно в качестве контроля. На 14 сутки клетки дренирующих лимфатических узлов собирали и стимулировали либо специфическим, либо неспецифическим антигеном и измеряли пролиферацию по захвату ³H-тимидина (CPM) после культивирования в течение четырех суток.

На фиг.8 представлен FACS-анализ моноцитов периферической крови человека, культивированных в течение четырех суток в контрольной среде (контроль), или в среде, содержавшей Tat или LPS. Собранные клетки подвергали двойному окрашиванию флуоресцеинированным Mab против FasL (αFasL-FITC) и меченным родамином Mab против CD14. Клетки анализировали с помощью FACScan в отношении активации (малоугловое рассеяние), экспрессии CD14 (% макрофаги, R2) и индукции FasL (MFI). Популяция T-клеток обозначена как R1.

На фиг.9A-B представлены характеристики регуляции и иммуносупрессии Tat-активированных макрофагов. (A) Мононуклеарные клетки периферической крови (PBMC) человека от одного индивидуума (PBMC #3), культивированные в течение пяти суток либо в среде со столбнячным антигеном (Ag), либо с антигеном с последующим добавлением Tat (Ag+Tat), либо Ag с Tat и рекомбинантным белком sFas (Ag+Tat+sFas). Результаты представлены на графике в качестве индекса стимуляции (среднее значение cpm в стимулированной культуре/среднее значение cpm в контрольной среде). (B) Пролиферацию PBMC, культивированных в течение 6 суток либо со столбнячным антигеном, либо с антигеном Candida отдельно (Ag), сравнивают с культурами, в которые добавляли Tat (Ag+Tat) или Tat и антагонистическое антитело против Fas ZB4 (Ag+Tat+αFas).

На фиг.10 представлена стимуляция моноцитов человека производными Tat.

На фиг.11 представлена кривая доза-эффект для стимуляции моноцитов человека производными Tat.

На фиг.12A-C представлено окрашивание клеток Jurkat посредством Hoechst-NucBlue и меченного Alexa488 производного Tat SEQ ID NO: 9 (фиг.12A), меченного Alexa488 производного Tat SEQ ID NO: 11 (фиг.12B) или контроля (без производного Tat, фиг.12C). Левая колонка соответствует окрашиванию ядра Hoechst-NucBlue, центральная колонка соответствует окрашиванию Alexa488 и в правой колонке представлено наложение левого и правого изображений.

На фиг.13A-C представлено окрашивание клеток U937 посредством Hoechst-NucBlue и меченного Alexa488 производного Tat SEQ ID NO: 9 (фиг.13A), меченного Alexa488 производного Tat SEQ ID NO: 11 (фиг.13B) или контроля (без производного Tat, фиг.13C). Левая колонка соответствует окрашиванию ядер посредством Hoechst-NucBlue, центральная колонка соответствует окрашиванию Alexa488, и в правой колонке представлено наложение левого и центрального изображений.

На фиг.14A-C представлена активация мононуклеарных клеток периферической крови (PBMC) человека при измерении по экспрессии FasL без стимула (фиг.14A), с LPS (фиг.14B) или с производным Tat SEQ ID NO: 9 (фиг. 14C).

На фиг.15 представлена пролиферация CD14+ PBMC человека при измерении по экспрессии CD14 на клеточной поверхности без стимула, с LPS или с производным Tat SEQ ID NO: 9.

На фиг.16 представлен процент CD14+ клеток в трехдневных культурах PBMC, обработанных LPS, производным Tat SEQ ID NO: 9 или без стимула.

На фиг.17A-E представлены PBMC, экспрессирующие как FasL, так и CD14, после обработки TNF-альфа (фиг.17B), LPS (фиг.17C), производным Tat SEQ ID NO: 9 (фиг.17D) или без стимуляции (фиг.17A) после культивирования в течение пяти суток. На фиг.17E представлены данные с фиг.27A-D в графическом формате.

ОПИСАНИЕ

Настоящее описание относится к соединениям, композициям и способам для лечения индивидуума, страдающего заболеваниями, ассоциированными с аберрантными иммунными ответами, такими как аутоиммунные нарушения, включающие нейродегенеративные нарушения или ассоциированные с воспалением нарушения. Это осуществляют путем введения терапевтически эффективного количества иммунодепрессивного полипептида, являющегося производным Tat, или композиции, содержащей такие полипептиды, индивидууму, страдающему такими заболеваниями. Как описано в настоящем описании, описанные иммунодепрессивные полипептиды, являющиеся производными Tat, обладают противовоспалительной активностью. Иммунодепрессивные пептиды-производные в объеме настоящего изобретения являются иммунодепрессивными.

Как используют в рамках изобретения, термин "аберрантные иммунные ответы" относится к увеличенным, нежелательным, чрезмерным или ненадлежащим иммунным ответам, при которых иммунный ответ на антигены, такие как собственные антигены, увеличивается так, что наблюдают воспаление и/или аутоиммунное заболевание или нейродегенеративное заболевание. Аберрантные иммунные ответы, как используют в рамках изобретения, характеризуются иммунным каскадом, приводящим к разрушению ткани организма. Как правило, аберрантный иммунный ответ не наблюдают при нормальном ответе на инфекцию, однако он может запускаться инфекцией

Белок Tat ВИЧ представляет собой вариабельный РНК-связывающий пептид длиной 86-110 аминокислот, который кодируется на двух отдельных экзонах генома ВИЧ. Исходя из молекулярного анализа, белок Tat (SEQ ID NO: 2) кодирует индивидуальные и связанные виды активности пептидов. В настоящем описании описаны полипептидные композиции, которые являются такими производными канонической структуры Tat ВИЧ-1 по меньшей мере в первой или N-концевой части, в которых усиливается иммунотерапевтический потенциал полипептида. N-концевая часть Tat включает короткую пептидную область из ядерного фактора транскрипции (TF), как правило, фланкированную остатками пролина. Эта область определяет, по меньшей мере частично, насколько стимулирующим или насколько подавляющим является полипептид Tat для клеток иммунной системы, в частности, клеток врожденной иммунной системы, таких как дендритные клетки (DC) и макрофаги (антигенпредставляющие клетки или APC). Следовательно, прогнозируется, что модификации в области TF могут делать полипептиды более активными при терапии заболевания.

Предшествующие исследования показали, что Tat ВИЧ является иммунодепрессивным в большинстве штаммов ВИЧ. Однако у индивидуумов с длительным отсутствием прогрессирования (LTNP) - подгруппы ВИЧ-инфицированных индивидуумов с высокой вирусной нагрузкой, которые не имеют существенного уменьшения количества T4-клеток и которые не прогрессируют в синдром приобретенного иммунодефицита (СПИД) - белок Tat ВИЧ является иммуностимулирующим. Белок Tat, встречающийся у LTNP, способен трансактивировать вирусную РНК; однако Tat LTNP (обозначаемый в настоящем описании как "IS-Tat" от иммуностимулирующего Tat) не индуцирует апоптоз в клетках T4 или макрофагах и не является иммунодепрессивным. Более того, клетки T4, инфицированные ex vivo ВИЧ, выделенным из LTNP (такие клеточные линии обозначают "TcL Tat ") сверхэкспрессируют белки IS-Tat, часто практически исключая другие вирусные белки, которые являются в высокой степени стимулирующими рост, а не проапоптотическими. Гены tat, клонированные с этих TcL Tat проявляют изменения последовательности в двух областях tat, на N-конце и в первой части второго экзона.

Исходя из молекулярного анализа, белок Tat ВИЧ (SEQ ID NO: 2) содержит три различных представляющих интерес области. Первая представляющая интерес область представляет собой домен передачи сигнала на N-конце Tat (аминокислоты 3-19). Вторая представляющая интерес область представляет собой цистеин-богатый лигандсвязывающий домен (аминокислоты 22-37), который содержит семь консервативных остатков цистеина. Третья представляющая интерес область представляет собой последовательность транслокации через мембрану (MTS), которая охватывает аминокислоты 47-57.

Пролин-богатый участок вблизи N-конца (аминокислоты 3-19) Tat ВИЧ-1 и ВИЧ-2 в домене передачи сигнала представляет собой SH3-связыващий домен, обладающий значительной гомологией с SH3-связывающим доменом гена hairless (hr) (SEQ ID NO: 72) мышей. SH3-связывающий домен представляет собой важную мишень для фармацевтической разработки, обладающую потенциалом в диагностике, профилактике и лечении нежелательных клеточных процессов, таких как аутоиммунитет.

Неожиданно, у мышей, экспрессирущих мутацию в гене hr, развивается СПИД-подобный синдром, характеризующийся низкой функцией CTL, сдвигом хелперных T-лимфоцитов от T-лимфоцитов, регулирующих клеточно-опосредуемый иммунитет (TH1), к T-лимфоцитам, регулирующим антитело-опосредуемый иммунитет (TH2), и увеличенной чувствительностью к индуцируемому химически и ультрафиолетовым светом раку кожи. Кроме того, варианты Tat встречаются у инфицированных ретровирусом обезьян, у которых не развивается иммунодефицит и которые не обладают эпидемической инфекцией. Однако эти варианты Tat не обладают SH3-связывающим доменом, а вместо этого имеется замена на отличающуюся последовательность, также имеющую остатки пролина на каждом конце последовательности, в домене трансдукции. Таким образом, SH3-связывающий домен является центральным для иммунодепрессивной активности Tat. Генетические данные указывают на то, что SH3-связывающий домен регулирует дифференцировку моноцитов в макрофаги, регулирующие антигенпредставляющие клетки (AReg). Tat-белки, которые не содержат SH3-домен или в которых этот домен является мутантным, направляют моноциты на дифференцировку в DC, которые стимулируют ответы CTL.

Область MTS позволяет Tat свободно проходить через эндосомальную мембрану в цитоплазму после связывания с рецептором, где она трансактивирует экспрессию генов, включая, но не ограничиваясь этим, гены ВИЧ-1. Было неверно предположено, что MTS способствует вхождению Tat в клетку, что может происходить только при высоких концентрациях, которые не могут достигаться in vivo.

В отличие от современных способов иммунодепрессивной терапии, описанные композиции на основе Tat, иммунодепрессивные полипептиды, являющиеся производными Tat, обладают потенциалом к подавлению антигенспецифических иммунных ответов, не вызывая иммунодефицита у пациента. Они сохраняют иммунодепрессивную активность общепринятого Tat ВИЧ в отсутствие вируса, и, таким образом, иммунодепрессивные производные Tat модулируют специфичность иммунного ответа, ключевого компонента для естественной защиты организма. Это является особенно важным, когда требуется длительная иммунодепрессивная терапия, такая как при аутоиммунных, нейродегенеративных и ассоциированных с воспалением заболеваниях.

Иммунодепрессивные эффекты Tat опосредуются макрофагами. При стимуляции Tat, либо при естественной инфекции ВИЧ-1, либо при захвате Tat, макрофаги индуцируют Fas-лиганд (FasL), который в свою очередь индуцирует запрограммированную клеточную гибель (апоптоз) реагирующих с антигеном экспрессирующих Fas хелперных T-клеток (фиг.3). Tat повышает жизнеспособность культивируемых макрофагов мыши, если макрофаги были первоначально активированы in vivo, по сравнению с отсутствием предшествующей стимуляции, и стимулированы относительно высокими концентрациями Tat. Для сравнения, LPS увеличивает жиз