Трансляторы, изолирующие посредством чередования

Трансляторы, изолирующие посредством чередования

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

[0001] По настоящей заявке испрашивается приоритет в соответствии с 35 U.S.C. § 119(e) предварительной патентной заявки США с серийным № 61/754339, зарегистрированной 18 января 2013 года, и в соответствии с 35 U.S.C. § 120 предварительной патентной заявки США с серийным № 13/801762, зарегистрированной 13 марта 2013 года, содержание каждой из которых полностью включено в настоящий документ в качестве ссылки.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

[0002] Получение молекулярных компьютеров с наноразмерами обещает значительный потенциал, отчасти потому, что такие компьютеры могут очень хорошо подходить для решения определенных задач по обработке информации. В частности, компьютеры с использованием биомолекул могут быть совместимыми с биологическими средами, что делает их пригодными для применения в диагностике комплексных заболеваний или даже в лекарственных средствах.

[0003] Способность транслировать одну последовательность нуклеиновой кислоты в другую теоретически позволяет построение логических вентилей и схем с использованием нуклеиновых кислот. Эти вентили и схемы находятся под управлением двух процессов, гибридизации и замещения цепей, которые, как правило, оба являются термодинамически выгодными, например, они включают переход из более высокого в более низкое энергетическое состояние. Таким образом, оба процесса в системе могут происходить спонтанно.

[0004] В гибридизации участвуют свободные одноцепочечные участки нуклеиновых кислот. Таким образом, систему нуклеиновых кислот можно регулировать доступностью этих свободных цепей.

[0005] "Процесс изоляции" позволяет определенным последовательностям быть доступными для остальной системы в зависимости от определенных условий. Такие процессы дают возможность конструировать трансляторы, которые преобразуют одну одноцепочечную последовательность нуклеиновой кислоты в другую одноцепочечную последовательность нуклеиновой кислоты. Эти трансляторы являются основанием, на котором с использованием нуклеиновых кислот можно строить основные логические операторы, такие как AND, NOT, OR, NAND, NOR, XOR и XNOR. На основе этих и других логических компонентов можно конструировать более крупные схемы, которые включают такие компоненты, как амплификаторы. Таким образом, эти процессы трансляции важны для обработки информации с использованием нуклеиновых кислот и молекулярных вычислений.

СУЩНОСТЬ

[0006] По одному из аспектов настоящего изобретения предоставлена композиция, содержащая первый и второй комплексы нуклеиновых кислот, каждый из которых содержит первую, вторую, третью и четвертую цепи нуклеиновых кислот, где каждая из цепей содержит последовательно первый, второй и третий фрагменты, где цепи нуклеиновых кислот определены как B-X-D, --, -- и F-Y-C для первой, второй, третьей и четвертой цепей первого комплекса, соответственно, и --, E-Y-D, F-Z-G, -- для первой, второй, третьей и четвертой цепей второго комплекса, соответственно, где каждая буква означает фрагмент, а каждая последовательность букв, соединенных "-", означает цепь, и где: каждый из первого и второго комплексов содержит первую область дуплекса, сформированную между вторыми фрагментами первой и второй цепей (X::и ::Y, в первом и втором комплексах, соответственно), вторую область дуплекса, сформированную между вторыми фрагментами третьей и четвертой цепей (Y:: и Z::), третью область дуплекса, сформированную между третьим фрагментом первой цепи и первым фрагментом третьей цепи (D:: и ::F), и четвертую область дуплекса, сформированную между первым фрагментом второй цепи и третьим фрагментом четвертой цепи (::C и E::); в каждом из первого и второго комплексов первый фрагмент (B и в первом и втором комплексах, соответственно) первой цепи, третий фрагмент ( и D) второй цепи, третий фрагмент ( и G) третьей цепи и первый фрагмент (F и ) четвертой цепи являются одноцепочечными; третья цепь первого комплекса (--) обладает подходящей комплементарностью последовательности со второй цепью второго комплекса (E-Y-D) для обеспечения связывания между ними в условиях гибридизации; и четвертая цепь первого комплекса (F-Y-C) обладает подходящей комплементарностью последовательности с первой цепью второго комплекса (--) для обеспечения связывания между ними в условиях гибридизации.

[0007] В одном из аспектов композиция дополнительно содержит третий комплекс нуклеиновых кислот, содержащий первую и вторую цепи нуклеиновых кислот, где каждая из цепей содержит последовательно первый, второй и третий фрагменты, где первая и вторая цепи определены как E-Z-H и --, соответственно, где третий комплекс нуклеиновых кислот содержит область дуплекса, сформированную между вторыми фрагментами первой и второй цепей (Z::), а первый фрагмент (E) первой цепи и третий фрагмент второй цепи () являются одноцепочечными, и где:

третья цепь второго комплекса (F-Z-G) обладает подходящей комплементарностью последовательности со второй цепью третьего комплекса (--) для обеспечения связывания между ними в условиях гибридизации; а четвертая цепь второго комплекса (--) обладает подходящей комплементарностью последовательности с первой цепью третьего комплекса (E-Z-H) для обеспечения связывания между ними в условиях гибридизации.

[0008] В определенных аспектах третий фрагмент () третьей цепи первого комплекса и первый фрагмент (E) первой цепи третьего комплекса обладают комплементарностью последовательностей, но в нормальных условиях гибридизации стабильно друг с другом не связываются вследствие химической модификации любого из двух или обоих фрагментов; и первый фрагмент (F) четвертой цепи первого комплекса и третий фрагмент () первой цепи третьего комплекса обладают комплементарностью последовательностей, но в нормальных условиях гибридизации стабильно друг с другом не связываются вследствие химической модификации любого из двух или обоих фрагментов.

[0009] Химические модификации, подходящие для практического осуществления технологии по настоящему изобретению, в качестве неограничивающих примеров включают замену сахарофосфатного каркаса фрагмента нуклеиновой кислоты конъюгированной с мини-ПЭГ получаемой из серина гамма-ПНК. В определенных аспектах химическая модификация включает замену азотистого основания по меньшей мере одного нуклеозида во фрагменте нуклеиновой кислоты на трициклический аналог цитозина. В одном из аспектов химическая модификация включает введение гетероатома в 2'-положение сахарной группы в нуклеотиде.

[0010] Иллюстрации комплексов и их взаимосвязи можно найти на ФИГ. 6A, где транслятор 102 соответствует первому комплексу, транслятор 103 соответствует второму комплексу, а транслятор 104 соответствует третьему комплексу. Подобным образом, на ФИГ. 10-13, 14A-D и 15-16 также проиллюстрированы трансляторы (комплексы нуклеиновых кислот) в объеме настоящего изобретения, включающие каждый отдельный транслятор и их комбинации в виде наборов трансляторов (или в форме композиции).

[0011] В одном из аспектов длина каждого фрагмента составляет от приблизительно 5 оснований до приблизительно 50 оснований. В другом аспекте длина каждого фрагмента, который является одноцепочечным, составляет от приблизительно 5 оснований до приблизительно 30 оснований.

[0012] Также в объем изобретения входит то, что каждая композиция может дополнительно необязательно содержать фармацевтически приемлемый носитель. В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения дополнительно предоставлена клетка, содержащая композицию или комплекс по настоящему изобретению.

[0013] Также в настоящем документе предоставлены компьютерно-реализованные способы и энергонезависимые считываемые компьютером носители, подходящие для моделирования, проектирования, регистрации, представления или анализа определенных аспектов описываемой технологии.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

[0014] В качестве вариантов осуществления настоящего изобретения предоставлены чертежи, которые являются только иллюстративным примером и не являются ограничением, где:

[0015] на ФИГ. 1A проиллюстрировано осуществление транслятора на основе нуклеиновых кислот посредством изоляции на твердой фазе, где отдельные отрезки (A, B и т.д.) представляют собой участки олигонуклеотидов произвольной длины и последовательности;

[0016] на ФИГ. 1B проиллюстрировано, как осуществление транслятора на основе нуклеиновых кислот посредством изоляции на твердой фазе изолирует участки олигонуклеотидов;

[0017] на ФИГ. 2A проиллюстрировано осуществление транслятора на основе нуклеиновых кислот посредством изоляции посредством "фиксаторов". Снова, отдельные отрезки представляют собой участки олигонуклеотидов произвольной длины и последовательности;

[0018] на ФИГ. 2B проиллюстрировано, как посредством осуществления на основе изолирования фиксаторами, представленного на ФИГ. 2A, изолировать участки олигонуклеотидов;

[0019] на ФИГ. 3A представлена система из трех изолированных фиксаторами трансляторов на основе нуклеиновых кислот. Все приведенные реакции представляют собой реакции замещения цепей, проходящие по тому же механизму, что миграции цепи, что и на ФИГ. 2A;

[0020] на ФИГ. 3B представлена система с теми же олигонуклеотидами, которые представлены на ФИГ. 3A, но где вместо реакций замещения цепей представлено образование "замыканий" фиксаторов, где фиксатор связывается с последовательностью, которая не может участвовать в реакции замещения цепей. Это событие связывания оккупирует фиксатор так, что желаемая цепь не может связаться;

[0021] на ФИГ. 4a-b продемонстрированы реакции замещения с использованием (a) или без использования (b) фиксаторов в буфере PBS (137 мМ NaCl, 2,7 мМ KCl, 10 мМ Na₂HPO₄, 1,76 мМ KH₂PO₄, pH 7,4) при 37°C. Флуоресцентные сигналы преобразовывали в концентрации посредством использования стандартной кривой. a) 50 нМ [F-(A₂₄)::()-Q]₀ дуплекс инкубировали с титрованием 10-200 нМ [(A₂₄)]₀ с шагом 10 нМ (от синего к красному) и концентрации свободного [F-(A₂₄)]_t контролировали посредством резонансного переноса энергии флуоресценции (FRET). b) 50 нМ [F-(A₂₄)::()-Q]₀ дуплекс смешивали с титрованием 10-200 нМ [(A₂₄)::()]₀ с шагом 10 нМ (от меньшего к большему) и концентрации [F-(A₂₄)::()]_t контролировали посредством FRET;

[0022] на ФИГ. 5 проиллюстрирован подход замены фиксаторов при проектировании трансляторов;

[0023] на ФИГ. 6A-6B проиллюстрированы комплексы нуклеиновых кислот (трансляторы), применяемые в изолирующей посредством чередования системе;

[0024] на ФИГ. 7 представлены модифицированные каркасные структуры аналогов нуклеиновых кислот, где "B" представляет произвольное нуклеиновое основание, и в (a) представлен природный фосфодиэфирный каркас, присутствующий в ДНК, в (b) представлены пептидные нуклеиновые кислоты, в (c) представлены гуанидиниевые пептидные нуклеиновые кислоты, в (d) представлены получаемые из L-серина гамма-ПНК, в (e) представлены фосфородиамидаты (на этом рисунке с морфолиновым сахаром), и в (f) и (g) представлены конъюгированные с мини-ПЭГ, получаемые из серина гамма-ПНК;

[0025] на ФИГ. 8 проиллюстрированы структуры модифицированных сахаров аналогов нуклеиновых кислот, где "B" представляет произвольное нуклеиновое основание, и в (a) представлен природный дезоксирибозный сахар, присутствующий в ДНК, в (b) представлены морфолино, в (c) представлены закрытые нуклеиновые кислоты и в (d) представлены модифицированное фтором производное РНК;

[0026] на ФИГ. 9 проиллюстрированы структуры модифицированных нуклеиновых оснований аналогов нуклеиновых кислот метилцитозина (a), диаминопурина (b), феноксазина (c) и G-зажим (d);

[0027] на ФИГ. 10 представлен адаптер иРНК;

[0028] на ФИГ. 11 представлен адаптер РНКи;

[0029] на ФИГ. 12 представлен антисмысловой адаптер;

[0030] на ФИГ. 13 представлен набор трансляторов с объединением на входе;

[0031] на ФИГ. 14A-14D представлены четыре набора трансляторов с разделением на выходе. Два из этих наборов продуцируют два или более идентичных транслятора, таким образом, работая в качестве амплификаторов (A и B), тогда как другие два набора порождают два или более различных последующих трансляторов (C и D);

[0032] на ФИГ. 15 проиллюстрирован зависимый от соединения набор трансляторов;

[0033] на ФИГ. 16 представлен инвертер;

[0034] на ФИГ. 17A-M представлены результаты имитации систем с изолирующими посредством чередования трансляторами (RST) и систем с трансляторами с изолированными фиксаторами (THST), в отношении основного сигнала и фонового сигнала для различных размеров фиксаторов в диапазоне от 3 нуклеотидов (н.) до 15 н. (как указано). Все имитации проводили со 100 нМ трансляторами в 3 этапа;

[0035] на ФИГ. 18A-D представлены результаты имитации для систем с RST и THST с различными глубинами (т.е. количеством участвующих трансляторов/стадий, как указано) систем. Все имитации проводили с фиксатором длиной 8 н. с концентрациями трансляторов 100 нМ; и

[0036] на ФИГ. 19A-N представлены результаты имитации с системами средних размеров (5 этапов) для длинных (13 н.) и коротких (8 н.) фиксаторов и показано, как изменяется поведение системы при варьировании указанных концентраций трансляторов.

[0037] Некоторые или все фигуры представляют собой схематические представления для иллюстрации; таким образом, на них не обязательно изображены действительные относительные размеры или положения представленных элементов. Фигуры представлены с целью иллюстрации одного или нескольких вариантов осуществления с четким пониманием того, что их не следует использовать для ограничения объема или смысла приведенной ниже формулы изобретения.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ

[0038] Среди различных подходов, которые можно использовать при трансляции последовательностей нуклеиновых кислот для построения логических операторов и схем, находятся изоляция на твердой фазе, изоляция фиксаторов и замена фиксаторов. Более подробно описанные ниже, эти три конкретных подхода проиллюстрированы конфигурациями, в которых использованы реакции трехсторонней, опосредованной фиксаторами миграции цепей. Для реакций миграции цепей возможны дополнительные механизмы, включая в качестве неограничивающих примеров четырехстороннюю миграцию цепей, четырехстороннюю ускоренную миграцию и миграцию комплекса из множества цепей.

[0039] Таким образом, хотя ниже описаны варианты осуществления, где в иллюстративных целях используют трехстороннюю миграцию цепей, настоящее изобретение предусматривает логические вентили и схемы с использованием ДНК, построенные с использованием других способов миграции цепей. И наоборот, варианты осуществления изобретения можно использовать для любой реакции миграции цепи.

[0040] На всем протяжении настоящего описания и на сопровождающих фигурах прописные буквы, например, A, B, C, X, Y, Z, необязательно с подстрочными индексами или надстрочными индексами, используют для обозначения участков, также обозначаемых как "фрагменты", олигонуклеотидов произвольной длины. Соответствующие A', B', C', X', Y', Z' или взаимозаменяемо , , , , , представляют соответствующие обратно комплементарные участки.

[0041] Термины "олигонуклеотиды", "полинуклеотиды" и "нуклеиновые кислоты" используют в настоящем документе для обозначения всех форм молекул нуклеиновых кислот. Без ограничения эта категория включает рибонуклеиновые кислоты (РНК), дезоксирибонуклеиновые кислоты (ДНК), пептидные нуклеиновые кислоты (ПНК) и их производные с модификациями и без, соответственно.

Изоляция на твердой фазе

[0042] Изоляция на твердой фазе включает физическое разделение соответствующих последовательностей/цепей в пространстве посредством гранул, наночастиц или поверхностей. В этом подходе используют принципы изоляции участка, который находит широкое применение в органической химии. Временные рамки этих событий замещения в твердофазных изолирующих конфигурациях можно контролировать посредством регуляции нахождения необходимых цепей в жидкой фазе или в твердой фазе системы.

[0043] На ФИГ. 1A представлена основная для транслятора схема изоляции на твердой фазе, компонент, который позволяет системе замещать одну последовательность нуклеиновой кислоты другой. Для цепи A'-X' каждый из A и X представляет собой участок олигонуклеотида произвольной длины и последовательности, а X' и A' представляют собой соответствующие им участки обратной комплементарности. Являясь связанной с твердой подложкой, цепь A'-X' сначала гибридизуется с Y-B-X, формируя структуру нуклеиновой кислоты в форме дуплекса с неполным спариванием оснований, который может функционировать в качестве транслятора. В этой конфигурации цепь Y-B-X изолирована на твердой фазе и, таким образом, не может взаимодействовать с остальной системой. Однако в присутствии цепи X-A, обозначаемой как "полинуклеотидная замещающая молекула", цепь Y-B-X может быть вытеснена с твердой подложки и экспонирована в жидкую фазу системы, в то время как цепь X-A будет связана с подложкой. Эта операция включает два этапа; первый представляют собой гибридизацию комплементарных последовательностей A и A' (часто обозначаемую как "связывание фиксаторов"). На втором этапе область X цепи X-A связывается с областью X' A'-X', замещая область X Y-B-X и высвобождая эту цепь в раствор, оставляя при этом X-A связанной с твердой подложкой (этот этап часто обозначают как "реакция миграции цепи"). Этот двухэтапный процесс эффективно осуществляет трансляцию свободной цепи X-A в свободную цепь Y-B-X.

[0044] На ФИГ. 1B представлена система с входной цепью X-A, взаимодействующей с дуплексом с неполным спариванием оснований, "транслятором 1". Выход включает дуплекс с полностью спаренными основаниями, A'-X'/X-A, который рассматривают в качестве "отработанного" продукта, и выходную цепь Y-B-X, которую обозначают как "выход 1", и ее можно использовать в качестве "входа 2" в дальнейшей реакции. "Вход 2" взаимодействует с "транслятором 2" и продуцирует "выход 2" и другой отработанный продукт. На этой фигуре область B цепи Y-B-X иллюстрирует изоляцию последовательностей в этой системе. В начале Y-B-X не может гибридизоваться с областью B' транслятора 2, так как оба изолированы на разных твердых подложках. Когда вход 1 связывается с транслятором 1 и высвобождает Y-B-X в раствор, тогда Y-B-X может взаимодействовать с транслятором 2. Таким образом, способность Y-B-X и транслятора 2 взаимодействовать обусловлена присутствием входа 1.

[0045] Цепи, связанные на одной твердой поверхности, крайне медленно взаимодействуют с цепями на другой твердой поверхности вследствие пространственных эффектов. Таким образом, компонентами, которые могут взаимодействовать с операторами на твердой фазе, являются только цепи в жидкой фазе.

Изоляция фиксаторов

[0046] Изоляция фиксаторов осуществляет те же операции что и трансляторы на твердой фазе, но функционирует, оставляя участки последовательности связанными в дуплексе. Также как и в трансляторе на твердой фазе, событие замещения могут высвобождать представляющую интерес последовательность. Все цепи могут находиться в растворе вместе, где последовательность их событий замещения регулирует доступность фиксаторов. Здесь термин "фиксатор" относится к коротким участкам одноцепочечных последовательностей нуклеиновых кислот, которые обеспечивают точку старта для события замещения.

[0047] На ФИГ. 2A представлен транслятор с изолированными фиксаторами, сходный с транслятором на ФИГ. 1A, но на основе фиксатора, а не на основе изоляции на твердой фазе. В этом примере область A' транслятора представляет собой фиксатор, который связывается с входной цепью и обеспечивает прохождение реакции замещения цепей.

[0048] На ФИГ. 2B представлена система на основе фиксаторов со входной цепью A-X-B, взаимодействующей с дуплексом с неполным спариванием оснований, "транслятором 1". Выход включает отработанный продукт, например, дуплекс с полностью спаренными основаниями, B'-X'-A'/A-X-B, и "выход 1", цепь X-B-Y-C, которую можно использовать в качестве "входа 2" в дальнейшей реакции. "Вход 2" взаимодействует с "транслятором 2" и продуцирует "выход 2" и другой отработанный продукт. На этой фигуре область B X-B-Y-C изолирована в трансляторе 1 посредством гибридизации с комплементарной областью B' и, таким образом, не может взаимодействовать с областью B' транслятора 2. Способность X-B-Y-C взаимодействовать с транслятором 2 обусловлена присутствием в системе входа 1 (A-X-B).

[0049] Несмотря на очень высокую потенциальную пользу, применения конфигураций фиксаторов до настоящего времени были ограничены скоростью, с которой система, содержащая такие конфигурации фиксаторов, могла передавать информацию. Неотъемлемые ограничения при обычных подходах с изоляцией фиксаторов часто могут замедлять конечную передачу ниже биологически пригодных сроков. Более конкретно, трансляторы с изолированными фиксаторами функционируют с приемлемыми скоростями только в очень узком динамическом диапазоне концентраций, как следствие замыкающих взаимодействий. Регулируя длину фиксаторов, замыкающие взаимодействия при низких концентрациях можно делать обратимыми. Однако по мере роста концентрации образование замыканий будет доминировать, и система прекратит работу. С другой стороны, если концентрацию снизить, опосредованное фиксаторами замещение также прекратится. В связи с этим, следует отметить, что в биологическом окружении концентрации могут широко варьировать; таким образом, такие трансляторы плохо подходят для применения в настоящем биологическом окружении. Полагают, что кинетические "узкие места" приводят к непродуктивным реакциям, обозначаемым в настоящем документе как "замыкание фиксаторов", которое происходит, когда фиксатор связан с молекулой с комплементарной последовательностью или с "замыкающей цепью", которая не может приводить к реакции замещения.

[0050] Например, на ФИГ. 3A представлена система из трех трансляторов на основе нуклеиновых кислот с изолированными фиксаторами, подобных транслятору на ФИГ. 2A. Однако если все три цепи находятся в растворе вместе, существуют другие события связывания, которые могут происходить. На ФИГ. 3B проиллюстрированы некоторые из событий непродуктивного связывания или замыканий, которые могут происходить. Вовлекая "полинуклеотидную замыкающую молекулу", эти события не приводят к реакции замещения, а могут замедлять систему, поскольку образование замыкающей цепи блокирует связывание цепей, которое может приводить к реакции замещения. Такие события замыкания могут становиться все более преобладающими по мере роста концентраций трансляторов на основе нуклеиновых кислот в системе.

[0051] Другим ограничением этого подхода является потенциальная токсичность, являющаяся результатом доступности длинных одноцепочечных областей трансляторов. Например, когда одноцепочечная область связывается с эндогенной ДНК или РНК в клетке, она может изменять транскрипцию, трансляцию или другую функцию молекулы ДНК или РНК. Такое "побочное" событие может приводить к нежелательным последствиям в клетке.

[0052] Другим ограничением является потенциальная постоянная утечка сигнала вследствие фоновых реакций трансляторов в отсутствие открытых фиксаторов, что также может приводить к нежелательным последствиям. Например, на ФИГ. 4a представлено, что химическая активность между транслятором и фиксатором с увеличением концентрации фиксатора возрастает. Однако в отсутствие фиксатора фоновую химическую активность также наблюдают (ФИГ. 4b).

[0053] Одним из предлагаемых решений является получение коротких фиксаторов для ослабления действия замыканий на систему: чем более коротким является фиксатор, тем быстрее может быть скорость прямой/обратной реакций с комплементарной последовательностью. Таким образом, обычными являются фиксаторы длиной пять или шесть нуклеотидов, так как при этих длинах, если происходит событие непродуктивного связывания, время, проведенное в двухцепочечном "замкнутом" состоянии, является коротким.

[0054] Однако этот подход создает указанное выше кинетическое "узкое место", так как событие продуктивного связывания ограничено теми же термодинамическими параметрами; таким образом, входящая цепь также с этими фиксаторами прочно не связывается. Таким образом, при корректном связывании входящей цепи желаемое замещение происходит не всегда, так как для инициации реакции замещения необходимо, чтобы она была в связанном состоянии достаточно долго. Таким образом, использование коротких фиксаторов увеличивает период, необходимый для осуществления данной операции и получения выходящей цепи. Другими словами, реакция замещения не может происходить без наступления множества событий связывания с замыкающими цепями и желаемыми цепями. Эта неэффективность ограничивает пользу системы, замедляя передачу информации до сроков, которые являются слишком длительными, чтобы являться пригодными.

[0055] Более короткие фиксаторы, наряду с более короткими одноцепочечными областями на трансляторах, также могут помочь в уменьшении токсичности. Однако более короткие фиксаторы не решают проблемы с утечкой сигнала.

Замена фиксаторов

[0056] При "замене фиксаторов" используют сходные взаимодействия спаривания, как и при изоляции фиксаторов, но с другими конфигурациями. При замене фиксаторов делают попытку разрешить проблему замыкания фиксаторов, возникающую при подходе изоляции фиксаторов. Со ссылкой на ФИГ. 5, исходный фиксатор, A-B, только частично комплементарен одноцепочечной области в дуплексе справа от фиксатора (например, A::). Подобным образом, когда получают фиксатор B-C-D посредством реакции замещения фиксатором A-B, фиксатор B-C-D также только частично комплементарен одноцепочечной области дуплекса за ним. По существу, замыкания фиксаторов происходить не может.

[0057] Однако у подхода замены фиксаторов также существуют свойственные ему ограничения. Во-первых, также как и при изоляции фиксаторов, длинные одноцепочечные области трансляторов могут вызывать нежелательное токсическое действие вследствие побочного связывания с эндогенными нуклеиновыми кислотами в клетке.

[0058] Другая проблема относится к динамическому диапазону трансляции, что сходно, хотя и не одинаково с проблемами, с которыми сталкиваются при замыкании фиксаторов. Однако эта проблема при замене фиксаторов является менее тяжелой, так как она больше влияет на скорость трансляции, чем на выход. В этом случае длины фиксаторов определяют скорость спонтанной диссоциации, которая является более высокой при более коротких фиксаторах. С другой стороны, они также определяют скорость прямого замещения, но прямое замещение более быстрым делают более длинные фиксаторы. Таким образом, между этими ограничениями существует зависимый от концентрации баланс.

[0059] Важным ограничением подхода замены фиксаторов является низкий выход, так как все реакции являются двунаправленными, что приводит к отсутствию предпочтительного конечного продукта за исключением случаев, когда, например, вся трансляция связана с необратимой реакцией в конце.

Изолирующие посредством чередования трансляторы

[0060] В настоящем изобретении предоставлен ряд трансляторов, которые решают проблемы, с которыми сталкиваются в подходах, подробно описанных выше. С использованием этих трансляторов минимизировано токсическое побочное действие и фоновая реактивность, можно избежать замыканий фиксаторов, общий выход близок к полному и скорость трансляции все еще значительно повышена.

[0061] На ФИГ. 6A проиллюстрированы некоторые основные компоненты системы "изолирующего посредством чередования транслятора". Наверху представлен комплекс нуклеиновых кислот (101), формируемый между двумя цепями, A-X-C и --. Вследствие комплементарности их последовательностей, формируется область дуплекса X::, тогда как A, C, и остаются одноцепочечными. Такой частичный дуплекс далее обозначают как "двойной фиксатор".

[0062] Второй комплекс нуклеиновых кислот (102), представленный на ФИГ. 6A, состоит из четырех цепей нуклеиновых кислот, B-X-D, --, -- и F-Y-C. Как показано, эти цепи формируют между собой четыре области дуплексов, а на концах остаются четыре одноцепочечных области. Одна из этих четырех цепей, --, комплементарна одной из цепей, A-X-C, в первом комплексе, тогда как другая цепь, B-X-D, комплементарна --, другой цепи первого комплекса.

[0063] Вследствие комплементарности последовательностей в свисающих одноцепочечных областях, первый комплекс (101) обладает подходящей комплементарностью последовательности так, чтобы быть способным к связыванию со вторым комплексом (102), что инициирует реакцию замещения цепей, в которую вовлечены шесть цепей. Продукт реакции замещения цепей на выходе включает два полностью отожженных дуплекса (105 и 106) и новый двойной фиксатор (107), содержащий в середине область дуплекса и четыре разделенных одноцепочечных области (ФИГ. 6B).

[0064] На ФИГ. 6B представлено, что полученные комплексы нуклеиновых кислот (105, 106 и 107) находятся в более низком энергетическом состоянии вследствие двух полных дуплексов, A-X-C::-- (105) и B-X-D::-- (106). Другими словами, такое замещение цепей с большим предпочтением проходит в прямом направлении и, таким образом, не так легко обратимо.

[0065] Затем вновь сформированный двойной фиксатор, состоящий из -- и F-Y-C (107), может инициировать другую реакцию замещения цепей с третьим комплексом нуклеиновых кислот (103) на ФИГ. 6A (см. стрелки), продолжая процесс трансляции. Подобным образом, новый двойной фиксатор, получаемый после этой реакции замещения, может взаимодействовать с четвертым комплексом (104) и так далее.

[0066] Как объяснено выше, реакции замещения цепей в этом подходе достигают высокой скорости выхода, так как в каждой из этих реакций продукты на выходе образуются в намного меньшем энергетическом состоянии, чем молекулы нуклеиновых кислот на входе. Кроме того, как проиллюстрировано в таблице 1, экспериментальные данные демонстрируют, что такие опосредованные двойными фиксаторами реакции также могут быть очень быстрыми. Следует сравнить столбец "двойные фиксаторы" со столбцами под заголовками "3'-фиксатор" или "5'-фиксатор".

Таблица 1Сравнение скорости реакции у опосредованных одиночными фиксаторами и двойными фиксаторами реакций замещения цепей
	Наблюдаемое время полужизни реакции [50 нМ]0
	Замещение цепей	Замещение дуплексов
Длина фиксаторов (н.)	3'-фиксатор	5'-фиксатор	3'-фиксатор	5'-фиксатор	Двойные фиксаторы
25	≈30 минут	≈30 минут	≈2 часа	≈1 час	≈15 минут
20	≈45 минут	≈30 минут	≈2 часа	≈1 час	≈15 минут
15	≈30 минут	≈30 минут	≈2 часа	≈1 час	≈15 минут